本發(fā)明有關于蟬花活性物質的開發(fā)，特別是指蟬花活性物質于預防物理性傷害或化學性傷害所誘導的干眼癥相關病變的
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：干眼癥(Xerophthalmia)“干眼癥”是眼科門診相當常見的疾病之一(占成人人口比例的10-15％)，主要是由于眼球表面缺乏淚液或淚液質量不佳所引起，常見的癥狀包括眼睛干澀、容易疲倦、想睡、會癢、有異物感、痛灼熱感、眼皮緊繃沉重、分泌物黏稠、怕風、畏光、對外界刺激敏感以及暫時性視力模糊等；有時眼睛太干、基本淚液不足反而刺激反射性淚液分泌而造成常常流眼淚的癥狀；較嚴重的患者，眼睛會紅、腫、充血、角質化，角膜上皮破皮而有絲狀物黏附，長期的傷害則會造成角結膜病變，并會影響視力。而造成淚液分泌不正常的原因有許多可能，包含過度用眼、長時間配戴隱形眼鏡、眼表炎癥、老化、荷爾蒙失衡、自體免疫疾病、糖尿病以及一些外來因素造成眼表的受損等。由于許多因素都會導致干眼癥狀，因此干眼癥又可稱為干眼癥候群(Dryeyesyndrome)。淚液的組成及功用正常的眼睛表面有一層淚液層，經由眨眼的動作而均勻分布，覆蓋在眼角膜及結膜上，形成一個潤滑保護膜，最后經由鼻淚管排除掉，具有滋潤及保護的功能；淚液層由外而內又可分為3層：(1)油脂層：由眼瞼的皮脂腺所分泌，在最外層，主要功用是增加淚液膜的表面張力，延緩水層液的蒸發(fā)，潤滑眼瞼及眼球表面。(2)水液層：由淚腺所分泌，在中間層，占淚液膜的絕大部分，含營養(yǎng)素維生素及抗菌物質；主要功用是提供眼睛潤滑清晰的表面、提供角膜氧氣、有殺菌作用、以及清除代謝產物的作用。(3)黏液素層：由結膜的杯狀細胞所分泌，在最內層，主要作用是和角結膜上 皮細胞接觸，使之變成親水性，而使得淚液水層能均勻分布在角結膜表面。這3層淚液的組成如果有一層分泌不足或是分布不均勻，都會造成干眼的癥狀。干眼癥屬于慢性疾病，根治并不容易。目前治療法可分為內科性療法及外科性療法：干眼癥病患的內科性療法1.人工淚液：人工淚液除了提供潤濕功能、添加水分等功能外，尚有稀釋發(fā)炎物質、降低淚液滲透壓等作用，因此為干眼癥病患最常使用的療法。如果對防腐劑過敏或使用頻率較高(1天超過4到6次眼劑，含非人工淚液的其他藥物)，建議改用不含防腐劑的潤滑用眼藥水。2.自體血清：血清中具有類似淚液的成分，此外也富含生長因子，因此可用以治療嚴重的干眼癥病患。每次制備后的血清可以冷凍保存3-6個月，因此病患不必太過頻繁抽血。3.化痰劑(黏液溶解劑):用以治療呼吸道疾病的黏液溶解劑局部使用時，可以減少眼表面絲狀綴生物、黏液、或黏液斑塊的形成。4.植入型人工淚液:此為放置在下眼結膜深處的固體人工淚液，它可以慢慢地釋放出潤滑劑，在24小時內保持眼睛的濕潤。但缺點是放置不易(需眼科醫(yī)師示范)，且病患感覺眼表濃稠，視力稍微受到影響。5.抗發(fā)炎療法:干眼癥不單單只是淚液分泌量不足，揮發(fā)太快，或是淚液成分失常而已；目前已知眼表的發(fā)炎反應也扮演重要的角色。因此，局部使用類固醇，或Restasis(環(huán)孢靈表cyclosporine眼用藥水)也是治療的另一個方針。Restasis已在2002年經過美國藥品食品檢驗局(FDA)認證用以治療慢性干眼癥，它是目前市面上所有干眼癥藥物中唯一證實對淚液分泌量有增加效果的藥物。6.抗生素：口服四環(huán)霉素或其相關藥物(doxyclcine)對于眼瞼板發(fā)炎，尤其有酒糟鼻體質的病患特別有效。然而這類的病患最好能夠同時注意眼瞼清潔和熱療法輔助。局部施用維他命A藥膏：可用于睡前使用，但其效果目前仍有爭議。7.若伴有全身免疫系統(tǒng)疾病的病患，則需配合風濕免疫專科醫(yī)師共同治療。干眼癥病患的外科性療法以外科療法治療干眼癥一般用于重度、內科療法治療成效不彰的病患。常用的方法可以分為以下幾類:1.淚小管填塞：以栓塞法將淚小管開口加以阻塞，其作用原理類似水槽的塞子，只讓少量的淚液流出，讓更多的淚液可以留在眼表面，幫助維持眼球上的淚膜穩(wěn)定。一般而言，眼科醫(yī)師會先使用暫時性、可溶解的栓塞以測試治療效果；如果暫時性的栓塞法能改善干眼癥的癥狀，醫(yī)師才會放置永久性的栓塞。接受淚小管填塞的病患須注意術前是否有嚴重發(fā)炎現(xiàn)象，以避免手術后因發(fā)炎物質長期留置眼表而造成眼表傷害。2.眼瞼縫合術：極嚴重的干眼患者、合并其他角膜病變或眼瞼愈合不全的患者，可施行“眼瞼縫合術”，以避免進一步惡化。干眼癥的診斷眼科醫(yī)師可由臨床癥狀和一些檢查來診斷干眼癥；包括淚液分泌試驗、角膜結膜染色試驗、淚液層瓦解時間、以及其他淚腺的檢查、結膜功能的檢查等等；此外一些免疫疾病相關的檢查也可以幫助找出病因。蟬花(Cordycepscicadae)蟬花型態(tài)與分布蟬花又名土蟬花、蟲花、蟬草、胡蟬、蟬菌、蟬蛹草、金蟬花、蟬茸或蠶茸等，為子囊菌亞門(Ascomycotina)，麥角菌目(Claricipiyales)，麥角菌科(clavicipitaceae)，蟲草屬(Cordyceps)真菌，由感染蟬蛹或蟬科山蟬(Cicadaflammate)、螻蛄(Platypleurakaempferi)、黑蚱(Crytotympanapustulata)及竹蟬(Platylomiapieli)等幼蟲身上使其死亡，后于蟬蛹前端或蟲體頭部形成花蕾狀子座而成，故名蟬花。為一種菌蟲復合體。蟬花可依不同的寄主及感染菌種分類為大蟬花或金蟬草(C.cicadae)、小蟬花(C.sobolifera)及蟬草或蟬生蟲草(C.cicadicola)三種。蟬花多產于長江以南熱帶和亞熱帶地區(qū)，在中國為福建、浙江、四川、云南及江蘇等地。在中國臺灣部分山區(qū)亦有野生蟬花子實體蹤跡。蟬擬青霉的有性階段，被認為是大蟬草(Cordycepscicadae)，大蟬草俗名獨角龍，子座棒狀或角狀，從寄主頭部發(fā)出，單生或叢生，褐色。在自然界廣為分布的是蟬擬青霉(蟬花)，大蟬草稀少。蟬花功效蟬花為名貴傳統(tǒng)中藥材，性寒、味甘、無毒，曬干后可入藥，有散風熱、鎮(zhèn)驚、明目、退翳障、透疹的功效。主治小兒天吊、驚癇、心悸、夜啼《本草綱目》。蟬花入藥已有一千多年歷史，且野生蟬花的歷史記載比冬蟲夏草早了800年。蟬花之名最早見于南北朝劉宋時代的《雷公炮制論》，其中記載：凡使蟬花要白花全者。收得后于屋下懸干，去甲土后用漿水煮一日，至夜焙干，研細用之。根據(jù)宋朝蘇頌的傳統(tǒng)醫(yī)書《圖經草本》記載“山蜀中，其蟬上有一角，如花冠狀，謂之蟬花?！?；北宋唐慎微所著《證類草本》記載“蟬花味甘、性寒、無毒，具疏散風熱、定驚解痙之效，主治小兒夜啼、心悸等癥狀?！保弧侗静菥V目》亦記載“蟬花功同蟬蛻，又止瘧疾?！?；亦有中醫(yī)藥書記載主治翳膜遮睛，如：《景岳全書》“蟬花散：治肝經風熱，毒瓦斯上攻，眼目赤痛，及一切內外翳障?！钡壳叭詿o相關科學論證或發(fā)表。其他傳統(tǒng)常用方劑如“萬應蟬花散”、“蟬花明目方”及“蟬花清熱方”等皆可見于《中華藥物大全》及《中華藥?！酚涊d。而現(xiàn)今亦有文獻報導“蟬花五味散”及“萬應蟬花散”應用于眼部相關疾病的研究。河南醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科的彭廣華等曾以中藥生液散和“蟬花五味散”配合西藥治療外傷性低眼壓。外傷性低眼壓是眼外傷的一種常見并發(fā)癥，嚴重影響視功能。結果顯示中西藥治療組14人達正常眼壓(>1.33kPa)，有效率占46.67％，平均提高眼壓0.76kPa，西藥治療組30人中8人達正常眼壓，有效率占26.67％，平均提高眼壓0.41kPa；中國新鄉(xiāng)市中醫(yī)院徐大梅等觀察“萬應蟬花散”加減內服外洗治療春季結膜炎100例臨床觀察，并與西藥治療做對比觀察。結果治療組治愈率為78％，對照組為26％。一年后，治療組復發(fā)率為22％，對照組為88％。以上二例皆為添加蟬花子實體的復方應用，分別于眼壓及春季結膜炎的臨床觀察，并無明確表示單方蟬花或蟬花液態(tài)發(fā)酵菌絲體活性物質制備方法及其對角膜損傷或干眼癥狀的預防用途和效果。蟬花與冬蟲夏草同屬蟲生真菌復合體，蟬花的功能性與應用性不亞于冬蟲夏草和蛹蟲草，具相近醫(yī)療保健功效，且含有相近的化學成分，所以常作為冬蟲夏草的代用品。而天然冬蟲夏草產量日趨減少，且天然蟬花子實體亦不多，限制了大量的使用，可以人工培養(yǎng)作為天然蟬花的替代品，人工培養(yǎng)物的主要生物活性成分、藥理學作用均和天然蟬花相似或超出天然蟬花。天然蟬花的產生需依賴于寄主，而寄主又受自然環(huán)境的制約，特別是受氣候因子或人為因素的影響。以人工培養(yǎng)品來替代日益枯竭的自然資源，為一條理想的途徑，因此蟬花液態(tài)發(fā)酵菌絲體具高度經濟應用價值。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的為提供一種蟬花活性物質及該活性物質的制備方法，以及其用于預防或治療物理性傷害或化學性傷害所誘導的角膜傷害或干眼癥及其所導致的病變的用途。相較一般西藥治療或眼藥水，本發(fā)明的制備方法更為安全、簡便，其活性物質更天然、安全，并達到預防和/或治療眼睛病變的效果。本發(fā)明提供一種用于預防和/或治療干眼癥的蟬花活性物質的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：(a)取蟬花菌絲體于平板培養(yǎng)基上，于15-35℃培養(yǎng)5-14天；(b)將步驟(a)培養(yǎng)后的蟬花菌絲體接種至燒瓶內，于15-35℃、pH2-8的條件培養(yǎng)數(shù)天；(c)將步驟(b)培養(yǎng)后的蟬花菌絲體接種至發(fā)酵槽內，于15-35℃、pH2-8、槽壓0.5-1.0kg/cm2且通氣速率0.01-1.5VVM的條件培養(yǎng)3-5天，形成蟬花菌絲體發(fā)酵液；(d)將所述蟬化菌絲體發(fā)酵液冷凍干燥后磨粉，形成蟬花菌絲體凍干粉；(e)將所述蟬花菌絲體凍干粉以至少一種溶劑萃取，形成蟬花菌絲體萃取液；及(f)將蟬花菌絲體萃取液干燥后，獲得所述蟬花活性物質。一實施例中，上述步驟(b)的燒瓶培養(yǎng)采用振蕩培養(yǎng)，且振蕩速率為10-250rpm。一實施例中，上述步驟(c)內通入發(fā)酵槽的氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合。一實施例中，上述步驟(a)、(b)及(c)的培養(yǎng)溫度為25℃，且步驟(b)及(c)的pH值為4-7。一實施例中，上述步驟(b)及(c)的培養(yǎng)pH值為4.5。一實施例中，上述步驟(b)及步驟(c)使用相同的培養(yǎng)基，且此培養(yǎng)基包括谷類、豆類、無機鹽類、糖類、酵母提取物(Yeastextract)、麥芽提取物或其組合。一實施例中，上述步驟(e)內所述溶劑的數(shù)量為兩種，包括水及醇類。一實施例中，上述步驟(e)的醇類為甲醇和/或乙醇。一實施例中，上述步驟(f)內以水作為溶劑的蟬花菌絲體萃取液干燥后形成水萃物，以醇類作為溶劑的蟬花菌絲體萃取液干燥后形成醇萃物，所述蟬花活性物質為將水萃物及醇萃物混合而成。一實施例中，蟬花活性物質是由等重的蟬花菌絲體水萃物及蟬花菌絲體醇萃物混合而成。另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療和/或預防干眼癥的蟬花活性物質，其是由以前述的制備方法制成。另一方面，本發(fā)明所述蟬花活性物質可用于制備治療和/或預防干眼癥的藥物。即，本發(fā)明提供所述的蟬花活性物質在制備治療和/或預防干眼癥的藥物中的應用。另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療和/或預防干眼癥醫(yī)藥組合物。此醫(yī)藥組合物包括所述蟬花活性物質，以及藥學上可接受的載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。另一方面，本發(fā)明所述醫(yī)藥組合物的可用于制備治療和/或預防干眼癥藥物。即，本發(fā)明提供所述的醫(yī)藥組合物在制備治療和/或預防干眼癥的藥物中的應用。為使本發(fā)明的特征及優(yōu)點能更加清楚，以下配合附圖說明本發(fā)明的具體實施方式。附圖說明圖1A至圖1D為根據(jù)小鼠淚液測試的結果繪制的示意圖(分別對應表3-1至表3-4)。圖1A為根據(jù)UVB小鼠組淚液分泌改變量繪制的示意圖；圖1B為根據(jù)BAC小鼠組淚液分泌改變量繪制的示意圖；圖1C為根據(jù)UVB小鼠組淚液分泌量繪制的示意圖；圖1D為根據(jù)BAC小鼠組淚液分泌量繪制的示意圖。圖2A及圖2B為根據(jù)小鼠角膜平滑度分析的結果繪制的示意圖(分別對應表4-1及表4-2)。圖2A為根據(jù)UVB小鼠角膜平滑度的平均分級繪制的示意圖；圖2B為根據(jù)BAC小鼠角膜平滑度的平均分級繪制的示意圖。圖3A及圖3B為根據(jù)小鼠角膜清澈度分析的結果繪制的示意圖(分別對應表5-1及表5-2)。圖3A為根據(jù)UVB小鼠角膜清澈度的平均分級繪制的示意圖；圖3B為根據(jù)BAC小鼠角膜清澈度的平均分級繪制的示意圖。圖4A及圖4B為根據(jù)小鼠角膜地圖分析的結果繪制的示意圖(分別對應表6-1及表6-2)。圖4A為根據(jù)UVB小鼠角膜地圖的平均分級繪制的示意圖；圖4B為根據(jù)BAC小鼠角膜地圖的平均分級繪制的示意圖。圖5A及圖5B為根據(jù)小鼠角膜損傷染色分析的結果繪制的示意圖(分別對應表7-1及表7-2)。圖5A為根據(jù)UVB小鼠角膜損傷染色的平均分級繪制的示意圖；圖5B為根 據(jù)BAC小鼠角膜損傷染色的平均分級繪制的示意圖。圖6A及圖6B為根據(jù)小鼠HE染色分析的結果繪制的示意圖。圖6A為根據(jù)UVB小鼠HE染色繪制的示意圖；圖6B為根據(jù)BAC小鼠角膜HE染色繪制的示意圖。圖7A至圖7D為根據(jù)小鼠淚膜破裂時間試驗的結果繪制的示意圖(分別對應表8-1至表8-4)。圖7A為根據(jù)UVB小鼠的角膜破裂時間繪制的示意圖；圖7B為根據(jù)BAC小鼠的角膜破裂時間繪制的示意圖；圖7C為根據(jù)UVB小鼠的角膜破裂相對時間繪制的示意圖；圖7D為根據(jù)BAC小鼠的角膜破裂相對時間繪制的示意圖。圖8A及圖8B為根據(jù)小鼠角膜敏感性分析的結果繪制的示意圖(分別對應表9-1及表9-2)。圖8A為根據(jù)UVB小鼠角膜敏感性分析的結果繪制的示意圖；圖8B為根據(jù)BAC小鼠角膜敏感性分析的結果繪制的示意圖。用于專利程序的微生物保存：保藏日期：2015年05月04日；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101保藏編號：CGMCCNo.10486；分類命名：蟬花Cordycepscicadae。具體實施方式實驗原理角膜是人體內神經最密集，感覺最靈敏的組織之一，是眼睛最前端部分，直接和空氣接觸，無血管組織，并透過淚液及房水獲取養(yǎng)分及氧氣，易損傷并造成疾病。因此本發(fā)明中的部分實施例即通過物理性或化學性誘導角膜損傷并評估蟬花活性物質用于預防或治療其所導致的干眼癥及其他眼部疾病的效果及用途。紫外線(UV:Ultraviolet)在地球上無所不在，依其波長區(qū)段不同可分為UVA(315-380nm)、UVB(280-315nm)及UVC(100-280nm)。紫外線的過度照射會造成光化學傷害，尤以UVB對眼球的傷害最明顯。會引發(fā)自由基的形成，使眼角膜上的抗氧化酶失去活性。UVB會被角膜所吸收，主要會導致眼表(Ocularsurface)與眼角膜的光損傷，造成結膜的結締組織增生，眼瞼皮膚也會因為曝曬造成角質增生， 使眼角膜結膜及眼瞼組織傷害及加速老化。長期照射會使眼睛有異物感及刺痛感，亦會產生角膜發(fā)炎、上皮脫落以及眼角膜的退化性傷害等癥狀。一般民眾除了配戴太陽眼鏡之外較少做到眼睛防護，因此在不知不覺中忽略UVB對眼表的傷害而導致慢性發(fā)炎甚至干眼癥的發(fā)生。氯化苯二甲羥銨(benzalkoniumchloride；BAC、BAK)是一種陽離子界面活性劑，屬非氧化性的廣效殺菌劑，可用于殺菌、消毒、防腐、乳化、去垢、增溶等功能。早期常被添加于眼藥水中作為防腐用途，但近來研究顯示該化合物會導致淚膜不穩(wěn)定性、杯狀細胞的流失、結膜鱗狀上皮化生(Metaplasia)和凋亡(Apoptosis)、角膜上皮屏障的破壞及更深層眼睛組織的損傷，輕度癥狀會導致眼睛發(fā)炎與干眼癥，嚴重者甚至會造成眼表的永久傷害而影響視力。BAC造成上述影響的機制尚未厘清，但目前的研究已證實其會造成前趨炎癥細胞激素(Proinflammatorycytokine)的釋放、細胞凋亡以及氧化應激(Oxidativestress)而導致免疫炎癥反應發(fā)生，此外也會與淚膜及細胞膜上的脂質成分有直接的交互作用(Interaction)。因此本發(fā)明根據(jù)上述原理，設計兩種小鼠動物模式(UVB及BAC模式)來觀察蟬花活性物質對于物理性或化學性誘導眼表損傷而導致的干眼癥的預防效果及其應用于眼睛保健的相關用途。實驗步驟蟬花活性物質的制備蟬花菌絲體來源本發(fā)明的實施例所用的蟬花(Cordycepscicadae)菌絲體由采集而得的中國臺灣野生蟬花子實體，經分離而得其菌絲，并繼代保存于平板培養(yǎng)基上，經中國臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所做鑒定證實其基因序列為蟬花(Cordycepscicadae)，此菌株現(xiàn)已公開寄存于財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源研究中心(BCRC)，寄存編號為MU30106。此菌株亦于2015年05月04日保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，該保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101，保藏編號：CGMCCNo.10486；該菌株分類命名：蟬花Cordycepscicadae。但本發(fā)明所述的蟬花活性物質不限于由此菌種所得。液體培養(yǎng)蟬花液態(tài)發(fā)酵菌絲體活性物質的制備及蟬花菌絲體液體培養(yǎng)，其是將菌絲體接種于平板培養(yǎng)基上，于適當溫度15-35℃(較佳為25℃)下培養(yǎng)5天至2周后，刮取菌絲接種于燒瓶內；在15-35℃(較佳為25℃)，pH2-8，較佳為pH4-7，更佳者約pH4.5，振蕩速率10-250rpm之下培養(yǎng)約3天，培養(yǎng)時間可依培養(yǎng)條件及菌絲生長情形進行調整；然后將燒瓶培養(yǎng)物接種于發(fā)酵槽培養(yǎng)基(參下表1)，(同燒瓶培養(yǎng)基)內，在15-35℃(較佳為25℃)，槽壓0.5-1.0kg/cm2，pH2-8下，10-150rpm攪拌速度或不攪拌(airlift)情況，以0.01-1.5VVM通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣、二氧化碳與氮氣的混合物，較佳者為空氣，培養(yǎng)時間為3-5天內，即得蟬花菌絲體液體培養(yǎng)發(fā)酵液，包括菌絲體與澄清液。此發(fā)酵液內即含本發(fā)明的蟬花活性物質。蟬花菌絲體液體培養(yǎng)發(fā)酵液可進一步通過干燥步驟制備為發(fā)酵液凍干粉。培養(yǎng)基配方如下表1：表1、培養(yǎng)基配方成分含量(重量％)綜合性碳氮源0.01～5動植物來源蛋白及其水解物0.01～2酵母或麥芽提取物(粉、膏)0.001～2無機鹽類0.0001～0.05糖類0.01～10上述培養(yǎng)基配方中，綜合性碳氮源可為谷類(如：麥粉類)或豆類(如：黃豆粉、綠豆粉、大豆粉等)；無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鐵等；糖類可為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等。特別說明的是，上述培養(yǎng)基配方僅為一范例，使用時成分可依需求調整，或搭配市售培養(yǎng)基使用，并無特別限制。干燥干燥包含但不限于：噴霧干燥、熱風干燥、滾筒干燥、冷凍干燥、減壓濃縮或其他適合的干燥方法，將發(fā)酵液制備成發(fā)酵液凍干粉。萃取1.水萃取發(fā)酵液經干燥法制備而得的發(fā)酵液凍干粉加入蒸餾水回溶，以90℃-121℃溫度加熱數(shù)分鐘，待冷卻后經減壓濃縮法或上述的任一干燥法進行干燥，即得蟬花菌絲體水萃物。2.醇萃取蟬花菌絲體液體培養(yǎng)發(fā)酵液經干燥法制備而得的發(fā)酵液凍干粉加入醇類溶劑(1％-100％重量或體積百分濃度的甲醇和/或乙醇)回溶，萃取數(shù)分鐘(包含但不限于浸泡、攪拌、振蕩或超音波萃取法)，之后經減壓濃縮法或上述的任一干燥法進行干燥，即得蟬花菌絲體醇萃物。3.萃取物混合物(任何比例)由上述的水萃物與醇萃物混合的混合物，可包含任何混合的比例，不受特別的限制。實施例1蟬花液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)及活性物質的制備菌絲體菌株：平板培養(yǎng)：將蟬花菌絲體接種于平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為馬鈴薯糊精培養(yǎng)基(PotatoDextroseAgar,PDA)，于25℃下培養(yǎng)約5天。燒瓶培養(yǎng)：刮取平板上的菌絲接種于燒瓶內，用下表2的培養(yǎng)基，在約25℃，pH4.5下，于振蕩機上以轉速120rpm振蕩培養(yǎng)3天；表2、培養(yǎng)基配方發(fā)酵槽培養(yǎng)：培養(yǎng)基同表2，將燒瓶培養(yǎng)物接種于發(fā)酵槽培養(yǎng)基內，在25℃，槽壓0.5-1.0kg/cm2，pH4.5下，10-150rpm攪拌速度或不攪拌(airlift)情況，以0.5-1.0VVM通氣速率通入空氣，培養(yǎng)3天，得菌絲體與澄清液，稱為蟬花菌絲體發(fā)酵液。發(fā)酵液內含本發(fā)明的蟬花活性物質。將蟬花菌絲體發(fā)酵液經冷凍干燥可得發(fā)酵液凍干粉。萃取物制備：水萃取取蟬花菌絲體發(fā)酵液凍干粉加入20倍體積蒸餾水溶解，以溫度100℃加熱三十分鐘，待冷卻后經冷凍干燥法進行干燥，得蟬花菌絲體水萃物。醇萃取取蟬花菌絲體發(fā)酵液凍干粉加入20倍體積乙醇回溶，利用超音波振蕩萃取1小時，萃取懸浮液離心后取上清液經減壓濃縮，得蟬花菌絲體醇萃物。萃取物混合物取上述等重的水萃物與醇萃物均勻混合并以冷凍干燥法使其完全干燥，得水/醇萃取混合物。結果：20噸發(fā)酵槽培養(yǎng)完畢的蟬花菌絲體液體培養(yǎng)發(fā)酵液經冷凍干燥后，可得約110公斤發(fā)酵液凍干粉。經由萃取步驟可取得較高濃度的用以預防和/或治療物理性傷害或化學性傷害所誘導的干眼癥及其所導致的病變的蟬花活性物質。蟬花活性物質包含蟬花菌絲體發(fā)酵液(菌絲體與澄清液)、發(fā)酵液凍干粉、水/醇萃取液混合物或其他劑型。以下實施例2中，其為以水/醇萃取液混合物作為蟬花活性物質。實施例2干眼癥動物模式及相關指針的分析1.干眼癥小鼠動物模式的建立實驗動物：品系ICR雌性小鼠購自樂斯科公司(中國臺灣)，年齡7～10周，體重25～33克，飼養(yǎng)于中山醫(yī)學大學實驗動物中心，提供正常潔凈飼料及飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為12小時照光及12小時黑暗的循環(huán)光照，溫度控制在20±2℃，濕度控制在50±5％。(1)紫外燈UVB誘導干眼癥紫外燈購自Vilberlourmat公司，燈管型號為VL-6MC，波長設定為280nm～320nm范圍，主要波峰在312nm。試驗進行前將小鼠隨機分為4組，每組6只，分別為對照組(喂食生理食鹽水，未喂食蟬花活性物質、無UVB處理)、UVB處理組(經UVB處理)、低劑量試驗組(喂食10mg/kg·bw蟬花活性物質，經UVB處理)及高劑量試驗組(喂食100mg/kg·bw蟬花活性物質，經UVB處理)。其中，單位mg/kg·bw指每千克體重給多少毫克藥物，bw代表的是體重(bodyweight)。本試驗共進行10天，試驗組每日皆管喂試驗設計劑量的蟬花活性物質(水/醇萃取液混合物)，UVB處理組及試驗組由第4天開始，每日將小鼠以2.5％Avertin麻醉后置于暗箱中，眼球朝上照射0.72J/cm2強度的UVB90秒，使小鼠眼表受到損傷。所有組別進行小鼠淚液測試(第4、7及10天)，淚膜破裂時間及角膜敏感性測試(第4、7及10天)，角膜外觀評估及犧牲后的眼球組織染色分析(第10天)以評估蟬花活性物質是否能改善由UVB造成的眼表損傷及干眼癥狀。數(shù)據(jù)表明(詳述如后)，蟬花活性物 質對紫外燈UVB物理性傷害誘導眼表損傷造成的干眼癥具保護效果。(2)BAC誘導干眼癥試驗進行前將小鼠隨機分為4組，每組6只，分別為對照組(喂食生理食鹽水，未喂食蟬花活性物質、無BAC處理)、BAC處理組(經BAC處理)、低劑量試驗組(喂食10mg/kg·bw蟬花活性物質，經BAC處理)及高劑量試驗組(喂食100mg/kg·bw蟬花活性物質，經BAC處理)。本試驗共進行14天，試驗組由第1天至第13天每日皆管喂試驗設計劑量的蟬花活性物質，第4天起至第13天為止，BAC處理組及試驗組的小鼠，每日取體積5μL0.2％BAC點于眼球，使小鼠眼表受到損傷。所有組別進行小鼠淚液測試(第4、7、10及13天)，淚膜破裂時間及角膜敏感性測試(第4、7、10及13天)，角膜外觀評估及犧牲后的眼球組織染色分析(第14天)以評估蟬花活性物質是否能改善由BAC造成的眼表損傷及干眼癥狀。數(shù)據(jù)結果顯示(詳述如后)，蟬花活性物質對化學物質BAC化學性傷害誘導眼表損傷造成的干眼癥具保護效果。2.眼表損傷程度檢測項目及干眼癥評估相關指針分析本試驗采用兩種小鼠動物模式(UVB與BAC傷害模式)來觀察蟬花活性物質對于眼表的保護效果。根據(jù)試驗設計，分別在試驗中途及試驗結束后取樣進行眼表損傷程度及干眼癥評估。相關指標分析采用與臨床干眼癥評估診斷相似的項目，包含淚液測試、角膜外觀分析、HE染色組織學分析、淚膜破裂時間及角膜敏感性；其中角膜外觀分析共進行角膜平滑度、角膜清澈度、角膜地圖及角膜損傷染色4項評估。(1)淚液測試(Tearproduction)淚液測試可反應淚液的基礎分泌量。使用石蕊試紙測試小鼠淚液的分泌量。將其置入已麻醉小鼠靠耳側的眼窩中吸取淚液，數(shù)秒后取出試紙并測量試紙濕潤長度，以評估小鼠是否有淚液分泌量改變的情形。(2)角膜外觀分析分為角膜平滑度(Cornealsmoothness)、角膜清澈度(Cornealopacity)、角膜地圖(Cornealtopography)及角膜損傷染色(Cornealstaining)4項進行測試，評級分數(shù)越高表示角膜受損程度越高。(2.1)角膜平滑度分析：以環(huán)形光源照射眼球表面，根據(jù)角膜反射光源環(huán)形影 像的完整度做分級，分為0級到5級；0級影像為完整無扭曲環(huán)形，1-3級依序為1/4、1/2、3/4部分的環(huán)形出現(xiàn)扭曲，4級為整個環(huán)形皆出現(xiàn)扭曲，最嚴重的5級則為極度扭曲到無法辨識環(huán)形線條。(2.2)角膜清澈度分析：以光源照射眼球，觀察角膜的清澈度，依不透明程度分為0級到4級；0級為正常的角膜透明度，1-3級分別為輕度、中度、中度(虹膜不清楚)的不透明變性，而4級則為重度不透明變性，可觀察到明顯白色混濁并伴隨著角膜潰瘍。(2.3)角膜地圖分析：角膜地圖分析是以5重環(huán)形圖形投射眼表，可觀察較大范圍的角膜平滑程度。評估方法為將眼表以十字等分成4區(qū)，每區(qū)皆有5重環(huán)形的5條圓弧線，每當1條圓弧線扭曲或無法判讀時計數(shù)1分，全眼共20分；分數(shù)越高表示角膜不平滑程度越高，依程度分為0-5級，得分0分定為0級，1-4分為1級、5-9分為2級、10-14分為3級、15-19分為4級，最嚴重的20分定為5級。(2.4)角膜損傷染色分析：因受損的角膜會被染劑上色，故可通過染色面積來評估角膜受損的程度。依面積大小將分析結果定為0-5級，未被染色者為0級、25％以下為1級、25-50％為2級、50-75％為3級、75％-99％為4級，全角膜皆被染色則定為5級。(3)HE染色(Hematoxylinandeosinstain、H&Estain)此為組織學最常用的染色方法之一，染料蘇木紫(Hematoxylin)可將嗜堿性結構染成藍紫色，如核內染色質與胞內核糖體等，而伊紅(Eosin)為酸性染料，可使細胞質及胞外基質呈現(xiàn)紅色，以利組織學判讀。在本試驗的最后一天結束后，將小鼠犧牲，取出其眼球組織經3％福爾馬林浸泡及正丁醇脫水后進行石蠟包埋、切片及HE染色，觀察中央角膜的細胞層數(shù)、型態(tài)與厚薄度，評估給予蟬花活性物質的效果。(4)淚膜破裂時間(Tearbreak-uptime，TBUT)淚膜質量亦是影響干眼癥是否發(fā)生的原因之一。淚膜破裂時間可評估淚液質量，可反應淚膜的穩(wěn)定性。將1μL之0.1％液體熒光劑鈉滴入結膜囊，經三次眨眼后以秒為單位記錄淚膜破裂時間。90秒后，角膜上皮損傷程度分級由裂隙燈顯微鏡經鈷藍色濾光片評估。將角膜分成四象限，分別計分，四組分數(shù)相加取得總分(滿分為16分)。未染色得0分；輕微點狀染色并小于30點得1分；點狀染色超過30點并無擴散現(xiàn)象得2分；嚴重點狀染色并擴散，但無明顯斑塊得3分；有明顯熒光斑塊得4分。(5)角膜敏感性(Cornealsensitivity，CS)利用柯-博二氏感覺測量器(CochetandBonnetaesthesiometer)評估角膜敏感性，測量角膜中央知覺及敏感度。經物理性或化學性傷害后未麻醉的小鼠在不同時間點由頸背抓住固定并利用可調整長度的單絲纖維垂直觸碰角膜表面，直至使線變彎曲到可觀察到的彎度(大約偏斜5°)。如小鼠無出現(xiàn)眨眼反應，再依序縮短單絲纖維的長度，直到小鼠有眨眼反應。單絲纖維單位間隔0.5公分，依序使用長度6.0-0.5公分的單絲纖維觸碰角膜表面測試，單絲纖維愈長，愈容易彎曲，角膜表面所承受的頂端壓力愈小。眨眼反應以單絲纖維不相差大于5mm為正常。每支不同長度的單絲纖維以垂直角膜表面方向觸碰，至少4次才可記為無眨眼反應。在0.5公分單絲纖維觸碰的眨眼數(shù)計分為0。每次操作測量必須為同一操作者。上述實驗結果皆以第18版SPSS軟件進行無母數(shù)檢定Mann-WhitneyU統(tǒng)計分析。在以下的測試結果中，星號(*)表示p<0.05，即兩者間具有顯著差異。實施例3蟬花活性物質對于預防干眼癥及相關指標的效果評估1.淚液測試本試驗使用裁切成1mm寬的石蕊試紙(ToyoRoshiKaisha,Ltd)，將其置入已麻醉小鼠靠耳側的眼窩中吸取淚液，待20秒后取出試紙并測量試紙濕潤長度(mm)，測試小鼠淚液的分泌量，以評估小鼠是否有淚液分泌量改變的情形。試驗結果列于下表3-1至表3-4(分別對應圖1A至圖1D)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，蟬花活性物質可減少淚液分泌量改變情形并增加淚液分泌量，有助于預防干眼癥癥狀產生和/或治療干眼癥。表3-1、UVB小鼠組淚液分泌改變量(mm)(對應圖1A)表3-2、BAC小鼠組淚液分泌改變量(mm)(對應圖1B)表3-3、UVB小鼠組淚液分泌量(mm)(對應圖1C)表3-4、BVC小鼠組淚液分泌量(mm)(對應圖1D)2.角膜外觀分析(1)角膜平滑度分析：以環(huán)形光源照射眼球表面，根據(jù)角膜反射光源環(huán)形影像的完整度無扭曲至嚴重扭曲依序分為0級到5級。試驗結果列于下表4-1及表4-2(分別對應圖2A及圖2B)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經喂食蟬花活性物質的組別其反射光源環(huán)形影像的扭曲程度平均等級皆低于對照組，有效減少角膜平滑度傷害，有助于預防干眼癥的癥狀產生和/或治療干眼癥。表4-1、UVB小鼠角膜平滑度平均分級表(對應圖2A)表4-2、BAC小鼠角膜平滑度平均分級表(對應圖2B)(2)角膜清澈度分析：以光源照射眼球，觀察角膜的清澈度，依不透明程度分為0級到4級。試驗結果列于下表5-1及表5-2(分別對應圖3A及圖3B)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經喂食蟬花活性物質的組別其混濁變性程度平均等級皆低于對照組，有效減少角膜混濁變性傷害，有助于預防干眼癥的癥狀產生和/或治療干眼癥。表5-1、UVB小鼠角膜清澈度平均分級表(對應圖3A)表5-2、BAC小鼠角膜清澈度平均分級表(對應圖3B)(3)角膜地圖分析：以五重環(huán)形圖形投射眼表，觀察較大范圍的角膜平滑程度。評估方法為將眼表以十字等分成4區(qū)，每區(qū)皆有五重環(huán)形的5條圓弧線，每當1條圓弧線扭曲或無法判讀時計數(shù)1分，全眼共20分，依角膜不平滑程度分為0-5級。試驗結果列于下表6-1及表6-2(分別對應圖4A及圖4B)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經喂食蟬花活性物質的組別其環(huán)形圓弧線扭曲程度平均等級皆低于對照 組，有效減少角膜不平滑程度，有助于預防干眼癥的癥狀產生和/或治療干眼癥。表6-1、UVB小鼠角膜地圖平均分級表(對應圖4A)表6-2、BAC小鼠角膜地圖平均分級表(對應圖4B)(4)角膜損傷染色分析：因受損的角膜會被染劑上色，故可通過染色面積來評估角膜受損的程度。依被染色的面積大小程度輕微至嚴重結果定為0-5級。試驗結果列于下表7-1及表7-2(分別對應圖5A及圖5B)。此結果顯示，試驗結果表明，不論是物理性或化學性誘導傷害，經喂食蟬花活性物質的組別其被染色面積大小平均等級皆低于對照組，有效減少角膜受損程度，有助于預防干眼癥的癥狀產生和/或治療干眼癥。表7-1、UVB小鼠角膜染色平均分級表(對應圖5A)表7-2、BAC小鼠角膜染色平均分級表(對應圖5B)3.HE染色(HistologyandH-Estain)利用HE染色法，觀察角膜的細胞層數(shù)、形態(tài)與厚薄度。試驗結果如圖6A及圖6B，其顯示不論是物理性UVB或化學性BAC誘導傷害，喂食蟬花活性物質的組別經HE染色后可看出角膜的細胞層數(shù)、形態(tài)與厚薄度皆大于受誘導損傷的組別，有效減少角膜受損程度，有助于預防干眼癥的癥狀產生和/或治療干眼癥。4.淚膜破裂時間TBUT(Tearfilmbreakuptime)利用熒光劑滴入結膜囊，并用裂隙燈觀察淚膜破裂時間評估淚膜質量。試驗結果列于下表8-1至表8-4(分別對應圖7A至圖7D)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經喂食蟬花活性物質的組別其淚膜破裂時間及淚膜破裂相對時間皆高于誘導傷害組，有效延長淚膜破裂時間及降低角膜受損程度，有助于預防干眼癥的癥狀產生和/或治療干眼癥。表8-1、UVB小鼠淚膜破裂時間(秒)(對應圖7A)表8-2、BAC小鼠淚膜破裂時間(秒)(對應圖7B)表8-3、UVB小鼠淚膜破裂相對時間(秒)(對應圖7C)表8-4、BAC小鼠淚膜破裂相對時間(秒)(對應圖7D)5.角膜敏感性CS(Cornealsensitivity)利用柯-博二氏測量器評估角膜敏感性。試驗結果列于下表9-1及表9-2(分別對應圖8A及圖8B)。此結果顯示，不論是物理性或化學性誘導傷害，經喂食蟬花活性物質的組別其角膜敏感度皆低于誘導傷害組，有效減少角膜損傷程度即減少角膜敏感性，有助于預防干眼癥的癥狀產生和/或治療干眼癥。表9-1、UVB小鼠角膜敏感性(mm)(對應圖8A)表9-2、BAC小鼠角膜敏感性(mm)(對應圖8B)上述實施例3的試驗證明，以實施例1制備方法制成的蟬花活性物質，對于物理性UVB及化學性BAC誘導的角膜損傷具有治療效果，可改善其受損情形。故蟬花活性物質可應用于眼睛保健、干眼癥治療和/或預防的領域。上述實施方式是針對本發(fā)明的數(shù)個可行實施例的具體說明，但這些實施例并非用以限制本發(fā)明。本領域的技術人員在不脫離本發(fā)明技藝精神的范疇內，當可對這些實施例進行等效實施或變更。當前第1頁1 2 3