一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蟬花的方法，所述方法包括如下步驟：從野生蟬花中分離篩選出蟬花菌株，將其接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至長出菌絲體，再進行明暗交替培養(yǎng)，待長滿孢子后，將孢子洗下，制成孢子懸液；以柞蠶活體蠶蛹為寄主，采用注射、浸泡或體噴的方法使用蟬花孢子懸液將柞蠶活體蠶蛹感染；將已感染的柞蠶蠶蛹，培養(yǎng)至蠶蛹變硬，進行明暗交替培養(yǎng)。本發(fā)明采用活體蠶蛹為寄主培育蠶蛹蟬花，營養(yǎng)成分豐富、無毒，可以開發(fā)成各種食品及保健品，食用安全可靠；本發(fā)明以柞蠶蠶蛹培育蟬花的方法，培養(yǎng)周期短，技術(shù)工藝簡便，適用于大規(guī)模化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于培育蟬花的方法，具體涉及一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蝴花(Cordycepscicadae)為麥角菌科大蝴草(Cordyceps cicadae Shing)寄生在蟬科昆蟲山蟬若蟲上的子座及若蟲尸體的復(fù)合體，是我國傳統(tǒng)的一種名貴中藥材。在中國，蟬花被用作傳統(tǒng)的中藥材和食物已經(jīng)有1500多年，遠遠早于冬蟲夏草。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明蟬花含多種活性成分，具有治療小兒抽搐、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜、改善腎功能、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等功用，是一種與冬蟲夏草相近的珍貴藥材，可作為冬蟲夏草的替代品。
[0003]蟬花市場需求量日益增大，然而蟬花生長需要特定的生態(tài)環(huán)境和寄主昆蟲，自然出產(chǎn)率較低，再加上人們長期大量采挖，資源日趨減少。為了滿足市場和臨床的需求，近年來，科研人員開展了蟬花的人工培育研究，并取得了一定的進展。目前，國內(nèi)外已有一些關(guān)于蟬花人工培養(yǎng)技術(shù)的公開報道。例如，“一種蟬花的培養(yǎng)方法(CN103392500A)”，將蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)活化后接種于培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)至長出菌蕾后，避光進行通風(fēng)培養(yǎng)，培養(yǎng)40天左右即可收獲子實體。“以蟬幼蟲為寄主的蟬花子實體及其培育方法(CN102763560A)”，將蛹蟲草子實體在固體培養(yǎng)基上經(jīng)孢子分離提純復(fù)壯，得到蛹蟲草菌絲體，經(jīng)用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，制成液體菌種，對金蟬幼蟲進行處理，在蟬幼蟲身體上用無菌針扎小洞，用無菌注射器吸入液體菌種注入蟬幼蟲體后背，將已注射感染的蟬幼蟲置于無菌的組培瓶內(nèi)，用注射器將0.1ml液體菌種注入蟬幼蟲外體，蓋上瓶蓋，培養(yǎng)至蟬花子實體長至3cm長。“一種蟬花仿生的培養(yǎng)方法(CN103975765A)”，以蟬花的生態(tài)環(huán)境和生長規(guī)律為依據(jù)，采用微生物工程技術(shù)、生態(tài)學(xué)和栽培學(xué)的方法，進行蟬花仿生培養(yǎng)栽培技術(shù)系統(tǒng)研究，確立蟬花在天然竹林下仿生栽培技術(shù)操作規(guī)程，建立仿生態(tài)體系，從而獲得優(yōu)質(zhì)蟬花原料?！耙环N人工金蟬花的生產(chǎn)方法(CN103598014A)”，將野生金蟬花低溫除濕，進行干燥，收集蟬花孢子粉，按照孢子粉與培養(yǎng)基以重量比為I: 1000比例混合，將混合后的培養(yǎng)基在15-25°C下培養(yǎng)20-30天獲得蟬花。“一種蟬擬青霉人工培養(yǎng)的方法及其培養(yǎng)產(chǎn)物的應(yīng)用(CN102242070A)”經(jīng)過菌種制備、配料裝盒、滅菌、接種、固體發(fā)酵、采收等步驟大規(guī)模人工培養(yǎng)蟬擬青霉，采用玉米粉、麩皮、小麥、大麥、大米、粟、高粱等谷物與甘蔗渣、蔗糖、貝殼粉、蠶蛹粉、硝酸鉀為培養(yǎng)基培養(yǎng)蟬擬青霉?！耙环N蟬花的人工培養(yǎng)方法(CN101225362A)”，選擇蟬擬青霉異核體菌株，經(jīng)用培養(yǎng)基培養(yǎng)蟬擬青霉I周后，用0.05%吐溫80水將蟬擬青霉孢子洗下并稀釋成蟬擬青霉孢子液，將感染體(家蠶老熟幼蟲)置于蟬擬青霉孢子液中感染后，20 °C-28 °C培養(yǎng)2-3周獲得蟬花。
[0004]柞蠶蠶蛹營養(yǎng)成分高，富含蛋白質(zhì)、脂類和活性物質(zhì)，含有賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸等8種人體必需氨基酸。柞蠶蛹能烹調(diào)色香味倶全的風(fēng)味食品，是東北人招待親朋好友的上等美味，通過精加工可制作出許多別具風(fēng)味的高級菜肴。因柞蠶蛹個體大，蛹期時間長，近年來，柞蠶蛹作為基質(zhì)培養(yǎng)蛹蟲草逐漸成為柞蠶業(yè)多用途利用領(lǐng)域的研究熱點。但是，迄今為止，還沒有采用柞蠶蠶蛹培育蟬花的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法。本發(fā)明采用柞蠶活體蠶蛹為寄主培育蠶蛹蟬花，營養(yǎng)成分高、無毒，可以開發(fā)成各種食品及保健品，食用安全可靠;本發(fā)明以柞蠶蠶蛹培育蟬花的方法，培養(yǎng)周期短，技術(shù)工藝簡便，適用于大規(guī)?；a(chǎn)。
[0006]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，包括如下步驟:
[0007](I)從野生蟬花中分離篩選出蟬花菌株，將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體，再進行明暗交替培養(yǎng)，待長滿孢子后，將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液；
[0008](2)對柞蠶活體蠶蛹體表進行消毒;通過蟬花孢子懸液對柞蠶蠶蛹進行感染；
[0009](3)將已感染的柞蠶蠶蛹，培養(yǎng)至蠶蛹變硬，且節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體；
[0010](4)將變硬的蠶蛹，放在無菌環(huán)境中，進行明暗交替培養(yǎng)。
[0011 ]進一步地，步驟(I)所述將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體為將蟬花菌株接種于TOA固體培養(yǎng)基上，20-22 °C暗培養(yǎng)8-10天至長出菌絲體。
[0012]進一步地，步驟(I)所述將孢子洗下為通過0.03-0.07%吐溫80的無菌水將孢子洗下。
[0013]進一步地，步驟(I)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為22_24°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12-14h，光照強度250-350LX，濕度85%-95%，培養(yǎng)時間為10-12d;步驟(4)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為20-25°C明暗交替培養(yǎng)，周期為10-14h，光照強度150-400LX，濕度85%-95%，培養(yǎng)時間為15-30d。該生長條件模擬野生蟬花自然生長條件，得到的蟬花不僅外形與野生蟬花相似，而且質(zhì)量與野生蟬花相當。
[OOM]進一步地，步驟(I)所述蝴花孢子懸液濃度為14-1O7個/mL。
[0015]進一步地，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進行感染為用注射器在蠶蛹皮下組織注射ΙΟ-? 5ul蝴花孢子懸液 ，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中 。
[0016]進一步地，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進行感染為將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡10-15min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。
[0017]進一步地，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進行感染為通過噴霧的方法在蠶蛹體表噴射蟲單花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。
[0018]進一步地，步驟(3)所述培養(yǎng)至蠶蛹變硬為20-25 °C暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬。
[0019]進一步地，步驟(4)所述無菌環(huán)境為煮沸0.5-1.5h滅菌的沙子或者無菌塑料盒。
[0020]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法具有如下優(yōu)點:柞蠶蛹為蛹滯育，蛹期時間長，用來培育蟬花不受季節(jié)限制;采用柞蠶活體蠶蛹為寄主培育蠶蛹蟬花，營養(yǎng)成分高、無毒，可以開發(fā)成各種食品及保健品，食用安全可靠;本發(fā)明的培育方法，培養(yǎng)周期短，技術(shù)工藝簡便，適用于大規(guī)?；a(chǎn);本發(fā)明一方面為柞蠶蛹資源高附加值的開發(fā)利用提供了新途徑，有利于提高柞蠶業(yè)的經(jīng)濟效益;另一方面，近年來由于蟲草需求量大增，導(dǎo)致冬蟲夏草價格直線上升，進而推動了對蟬花的需求，同時隨著蟬花生態(tài)環(huán)境破壞，蟬花資源即將面臨枯竭的問題，因此，本發(fā)明對保護蟬花野生資源、維持生態(tài)平衡具有潛在的社會效益。
【附圖說明】
[0021]圖1為實施例1條件下培育的蟬花樣本；
[0022]圖2為實施例2條件下培育的蟬花樣本；
[0023]圖3為實施例3條件下培育的蟬花樣本；
[0024]圖4為實施例4條件下培育的蟬花樣本。
【具體實施方式】
[0025]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0026]實施例1
[0027]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于TOA固體培養(yǎng)基上，20°C暗培養(yǎng)10天至長出菌絲體后，再進行24°C明暗交替培養(yǎng)，周期為14h，光照強度350Lx，濕度95 %，培養(yǎng)時間為1d。待長滿孢子后，用
0.03%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為14個/mL。
[0028]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進行消毒，用微量注射器在柞蠶蠶蛹皮下組織注射1ul的蟬花孢子懸液，接種后迅速放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進行感染。
[0029]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在20°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為1d。
[0030]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，埋入煮沸0.5h滅菌的沙子中，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進行25°C明暗交替培養(yǎng)，周期為14h，光照強度400Lx，濕度95%，培養(yǎng)15d得到圖1所示的蟬花樣本。
[0031]實施例2
[0032]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于PDA固體培養(yǎng)基上，21°C暗培養(yǎng)9天至長出菌絲體后，再進行23°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強度300Lx，濕度90%，培養(yǎng)時間為I Id。待長滿孢子后，用0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為16個/mL。
[0033]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進行消毒，將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡1min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進行感染。
[0034]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在22°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為15d。
[0035]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，放入無菌塑料盒中，并覆蓋一層保鮮膜，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進行220C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強度300Lx，濕度90 %，培養(yǎng)20d得到圖2所示蟬花樣本。
[0036]實施例3
[0037]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于PDA固體培養(yǎng)基上，22°C暗培養(yǎng)8天至長出菌絲體后，再進行22°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強度250Lx，濕度85 %，培養(yǎng)時間為12d。待長滿孢子后，用0.07 %吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為15個/mL。
[0038]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進行消毒，用微量注射器在柞蠶蠶蛹皮下組織注射15ul的蟬花孢子懸液，接種后迅速放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進行感染。
[0039]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為8d。
[0040]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，埋入煮沸1.5h滅菌的沙子中，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進行20°C明暗交替培養(yǎng)，周期為10h，光照強度150LX，濕度85%，培養(yǎng)30d得到圖3所示的蟬花樣本。
[0041 ] 實施例4
[0042]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于PDA固體培養(yǎng)基上，22°C暗培養(yǎng)9天至長出菌絲體后，再進行22°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強度300Lx，濕度90%，培養(yǎng)時間為1d。待長滿孢子后，用0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為17個/mL。
[0043]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進行消毒，將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡15min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進行感染。
[0044]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在23°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為15d。
[0045]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，放入無菌塑料盒中，并覆蓋一層保鮮膜，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進行23°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強度200Lx，濕度90%，培養(yǎng)23d得到圖4所示的蟬花樣本。
[0046]實施例5
[0047]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于TOA固體培養(yǎng)基上，21°C暗培養(yǎng)10天至長出菌絲體后，再進行23°C明暗交替培養(yǎng)，周期為13h，光照強度300Lx，濕度90 %，培養(yǎng)時間為12d。待長滿孢子后，用
0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為15個/mL。
[0048]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進行消毒，在通過噴霧的方法在蠶蛹體表噴射蟬花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進行感染。
[0049]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在22°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為12d。
[0050]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，放入無菌塑料盒中，并覆蓋一層保鮮膜，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進行22°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強度250Lx，濕度90%，培養(yǎng)時間為25d。
【主權(quán)項】
1.一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)從野生蟬花中分離篩選出蟬花菌株，將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體，再進行明暗交替培養(yǎng)，待長滿孢子后，將孢子洗下，制成蝴花孢子懸液； (2)對柞蠶活體蠶蛹體表進行消毒;通過蟬花孢子懸液對柞蠶蠶蛹進行感染； (3)將已感染的柞蠶蠶蛹，培養(yǎng)至蠶蛹變硬，且節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體； (4)將變硬的蠶蛹，放在無菌環(huán)境中，進行明暗交替培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(I)所述將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體為將蟬花菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，20-22Γ暗培養(yǎng)8-10天至長出菌絲體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(I)所述將孢子洗下為通過質(zhì)量分數(shù)為0.03-0.07 %吐溫80的無菌水將孢子洗下。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(I)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為22-240C明暗交替培養(yǎng)，周期為12-14h，光照強度250-350Lx，濕度85%-95%，培養(yǎng)時間為10-12d;步驟(4)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為20-25°C明暗交替培養(yǎng)，周期為10_14h，光照強度150-400Lx，濕度85%-95%，培養(yǎng)時間為15-30d。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(1)所述蟬花孢子懸液濃度為14-1O7個/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進行感染為用注射器在蠶蛹皮下組織注射10-15ul蟬花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進行感染為將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡10-15min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進行感染為通過噴霧的方法在蠶蛹體表噴射蟬花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(3)所述培養(yǎng)至蠶蛹變硬為20-25°C暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(4)所述無菌環(huán)境為煮沸0.5-1.5h滅菌的沙子或者無菌塑料盒。
【文檔編號】A01G1/04GK105940956SQ201610395291
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】唐順明, 沈興家, 魏兆軍, 曾光遠, 劉莉萍, 張有做, 趙巧玲, 趙珊珊, 張偉
【申請人】江蘇科技大學(xué)