發(fā)明背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及適于癌癥治療的痘病毒，尤其包含溶瘤痘苗病毒。

2.背景

正常組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是一種細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間高度受控的過程。細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間失去平衡就會(huì)致癌(Solyanik等，1995；Stokke等，1997；Mumby和Walter，1991；Natoli等，1998；Magi-Galluzzi等，1998)。例如，宮頸癌、腎癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和腦癌只是可能發(fā)生的多種癌中的幾種(Erlandsson，1998；Kolmel，1998；Mangray和King，1998；Mougin等，1998)。事實(shí)上，癌癥的發(fā)生率相當(dāng)高，僅在美國每年就有超過500,000的人死于癌癥。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的維持至少部分是由原癌基因和腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)的。原癌基因或腫瘤抑制基因可編碼誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)(如sis、erbB、src、ras和myc)、抑制細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)(如Rb、p16、p19、p21、p53、NF1和WT1)或調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡的蛋白質(zhì)(如bcl-2)(Ochi等，1998；Johnson和Hamdy，1998；Liebermann等，1998)。但是，基因重排或這些原癌基因和腫瘤抑制基因的突變都會(huì)導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)化為致癌的癌基因或使腫瘤抑制因子變成無活性的多肽。一般來說單一點(diǎn)突變就足以完成這種轉(zhuǎn)化。例如，腫瘤抑制蛋白p53上的點(diǎn)突變就可以導(dǎo)致其完全失去野生型p53的功能(Vogelstein和Kinzler，1992)。

到目前為止，只有幾種有效的方法用于治療多種常見類型的癌。對(duì)于單個(gè)個(gè)體來說，選用何種治療措施要根據(jù)診斷結(jié)果、疾病分期以及其他因素如年齡、性別及患者的健康狀況。最常用的癌癥治療方法是手術(shù)、放療和化療。手術(shù)在腫瘤的診斷和治療中扮演主要角色。通?；顧z和去除癌性生長物都需要通過手術(shù)方法。但是，如果腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，則手術(shù)就不可能使患者痊愈，因此需要采用其他治療措施。

放療和化療是手術(shù)治療措施的最常見的替代方法(Mayer，1998；Ohara，1998；Ho等，1998)。放療是指通過高能射線精確照射以摧毀癌細(xì)胞，與手術(shù)很相似，主要用于治療未轉(zhuǎn)移的局域化的癌細(xì)胞。放療的副作用包括皮膚刺激、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、脫發(fā)和無力(Curran，1998；Brizel，1998)?；熓侵咐每拱┧幹委煱┌Y，是另一種癌癥治療模式，最常用的化療方法包括多種抗癌藥的聯(lián)合化療，這種方法被證實(shí)可以提高多種癌的反應(yīng)率(美國專利5,824,348；美國專利5,633,016和美國專利5,798,339，本文已納入作為參考)。然而，化療藥物的主要副作用是這些藥物也可以影響正常組織細(xì)胞，最可能受影響的是那些在某些情況下快速分裂的細(xì)胞(如骨髓、胃腸道、生殖系統(tǒng)和毛囊)?；熕幬锏钠渌拘孕?yīng)包括口瘡、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、嘔吐、疲乏、出血、脫發(fā)和感染。

復(fù)制選擇性的溶瘤病毒具有可用于癌癥治療的前景(Kirn等，2001)。這些病毒可通過直接的復(fù)制依賴性和/或病毒基因表達(dá)依賴性溶瘤效應(yīng)引起腫瘤細(xì)胞的死亡(Kirn等，2001)。另外，該病毒還可以增強(qiáng)誘導(dǎo)宿主內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)(Todo等，2001；Sinkovics等，2000)。這些病毒經(jīng)改造后還可以在腫瘤內(nèi)表達(dá)治療性目的基因以增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)(Hermiston，2000)。但是這種治療方法還存在一些主要的限制。

因此，需要找到更多的癌癥治療措施。使用溶瘤病毒進(jìn)行治療是一個(gè)潛在的開發(fā)領(lǐng)域。

發(fā)明概述

本發(fā)明的實(shí)施方式涉及的方法包括給予胸腺嘧啶激酶缺陷的痘苗病毒。所述方法包括以升高的病毒濃度給予痘苗病毒。在某些方面，所述方法包括在具有腫瘤的對(duì)象中誘導(dǎo)溶瘤或腫瘤血管的崩解，包括給予所述對(duì)象至少1×10⁸個(gè)足以誘導(dǎo)腫瘤中細(xì)胞溶瘤的TK缺陷型、表達(dá)GM-CSF、可復(fù)制的痘苗病毒載體的病毒顆粒。在本發(fā)明的另一方面，所述方法可排除用痘苗預(yù)處理對(duì)象，例如在進(jìn)行本文所述療法前1、2、3、4、5或更多天、周、月或年，對(duì)象無需接種疫苗。在一些方面，治療性病毒能夠感染非注射的腫瘤或癌，因此能夠通過局部給予和全身散播對(duì)患者進(jìn)行治療。

在某些方面，向?qū)ο蠼o予至少2×10⁸、5×10⁸、1×10⁹ 2×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹、1×10¹²、5×10¹²或更多的病毒顆?；蚴砂咝纬蓡挝?pfu)，也包括其間的各種值和范圍。給予的病毒劑量可以是0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多毫升，包括其間的所有值和范圍。在一個(gè)方面，所述劑量足以在患者血清中產(chǎn)生可檢測(cè)的GM-CSF水平，如至少約、最多約或約5、10、40、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000、15,000至20,000pg/mL，包括其間所有值和范圍?？紤]到，病毒的單劑量指在1、2、5、10、15、20或24小時(shí)期間對(duì)對(duì)象或腫瘤給予的量。該劑量可隨時(shí)間散布于或通過多次注射散布。通常，對(duì)同一通用靶區(qū)域給予多個(gè)劑量，如在腫瘤附近，或當(dāng)進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥時(shí)，在對(duì)象血流或淋巴系統(tǒng)的特定進(jìn)入點(diǎn)進(jìn)行給藥。在某些方面，病毒劑量由注射設(shè)備進(jìn)行遞送，該設(shè)備包括提供多端口的單個(gè)針頭或與注射器連接的多個(gè)尖頭或其組合。在另一方面，給予痘苗病毒載體2、3、4、5或更多次。在另一方面，在1、2、3、4、5、6、7或更多天或周中給予痘苗病毒。

在某些實(shí)施方式中所述對(duì)象是人。所述對(duì)象患有癌癥和/或腫瘤。在某些實(shí)施方式中，所述腫瘤是治療前不可切除的并在治療后可切除的。在某些方面腫瘤位于肝臟上或肝臟中。在其它的方面，所述腫瘤可以是腦癌腫瘤、頭頸癌腫瘤、食道癌腫瘤、皮膚癌腫瘤、肺癌腫瘤、胸腺癌腫瘤、胃癌腫瘤、結(jié)腸癌腫瘤、肝癌腫瘤、卵巢癌腫瘤、子宮癌腫瘤、膀胱癌腫瘤、睪丸癌腫瘤、直腸癌腫瘤、乳腺癌腫瘤或胰腺癌腫瘤。在其它實(shí)施方式中，所述腫瘤是膀胱腫瘤。在另一實(shí)施方式中，所述腫瘤是黑色素瘤。所述腫瘤可為復(fù)發(fā)的、原發(fā)的、轉(zhuǎn)移的和/或多藥耐藥的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是肝細(xì)胞腫瘤或源自其它組織或位置的轉(zhuǎn)移性腫瘤。在一些實(shí)施例中，腫瘤位于肝臟中。

在一些方面，所述方法還包括給予對(duì)象第二種癌癥療法。第二種癌癥療法可為化療、生物治療、放療、免疫治療、激素治療、抗血管治療、冷凍治療、毒素治療和/或手術(shù)，包括其組合。在另一方面，化療(藥物)可為泰素(taxol)或索拉非尼(sorafenib)。在另一方面，手術(shù)包括經(jīng)動(dòng)脈栓塞化療(TACE方案，參見Vogl等，European Radiology 16(6):1393，2005)。所述方法還可包括第二次給予痘苗病毒載體。本發(fā)明的方法還可包括在治療之前、期間、之后或其組合評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞活力。在某些實(shí)施方式中，通過血管內(nèi)途徑、瘤內(nèi)途徑或其組合給予病毒。在另一方面，向瘤塊內(nèi)注射給藥。在另一實(shí)施方式中，向腫瘤血管或在腫瘤血管區(qū)域內(nèi)注射給藥。在另一實(shí)施方式中，對(duì)所述腫瘤局部的淋巴或血管內(nèi)注射給藥。在一些方面，所述方法包括在給藥之前或期間進(jìn)行腫瘤成像。在一些方面，用痘苗病毒疫苗預(yù)先免疫或不預(yù)先免疫患者。在另一方面，患者可以是天然或臨床無免疫應(yīng)答的。

在一些方面，給予病毒的量足以誘導(dǎo)所注射腫瘤內(nèi)至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％細(xì)胞的溶解。

在一些實(shí)施方式中，所述痘苗病毒包括一種或多種修飾的病毒基因。所述一種或多種修飾的病毒基因可包括以下一種或多種：(a)干擾素調(diào)節(jié)多肽；(b)補(bǔ)體控制多肽；(c)TNF或趨化因子調(diào)節(jié)多肽；(d)絲氨酸蛋白酶抑制劑；(e)IL-1β調(diào)節(jié)多肽；(f)非感染性EEV形式多肽；(g)抑制感染性病毒從細(xì)胞中釋放的病毒多肽(抗感染性病毒形式多肽)或其組合。

本發(fā)明的實(shí)施方式靶向常見的關(guān)鍵癌癥通路。靶向這些通路涉及調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞機(jī)制(如細(xì)胞胸腺嘧啶激酶水平：E2F的響應(yīng)；EGF-R通路的激活；免疫保護(hù)區(qū)(sanctuary)、抗病毒IFN反應(yīng)(ras，p53))；VEGF誘導(dǎo)的血管孔徑大?。撼练eIV)，導(dǎo)致多種功效機(jī)制，如溶瘤性的：壞死、血管關(guān)閉、CTL攻擊誘導(dǎo)、系統(tǒng)性的：IT、IV；腫瘤特異性CTL。

本發(fā)明的實(shí)施方式建立在I期臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，該試驗(yàn)展示了痘苗病毒用作癌癥治療的安全性和有效性。雙周給藥的劑量遞增研究使用瘤內(nèi)注射對(duì)7名預(yù)期生存期小于6個(gè)月的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)。該試驗(yàn)表明痘苗病毒安全、耐受性好，并且在5名患者中(71％)中引起了腫瘤反應(yīng)，并且有兩名患者無病長期生存。

I/II期試驗(yàn)的初步結(jié)果也表明JX-594的持續(xù)安全。在5-8天中觀察到類似流感的癥狀。還觀察到血小板(plt)、淋巴和絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(ANC)(通常為Gr1-2)的短時(shí)間降低。第8天有一例死亡，但檢測(cè)得到與治療無關(guān)。總體上，JX-591病毒血癥耐受性好，給予后立即(15-30min)(反應(yīng))：血液中最高3×10⁸總基因組；以及復(fù)制峰(第5-8天)：血液中最高10¹⁰總基因組。

本申請(qǐng)討論了本發(fā)明的其它實(shí)施方式。任何關(guān)于本發(fā)明一個(gè)方面的實(shí)施方式也可應(yīng)用于本發(fā)明的其它方面，反之亦然。實(shí)施例部分的實(shí)施方式可理解為適用于本發(fā)明所有方面的本發(fā)明的實(shí)施方式。

術(shù)語“抑制”、“減少”或“預(yù)防”或這些術(shù)語的其它變形，用于權(quán)利要求書和/或說明書中時(shí)，包括任何可檢測(cè)的減少或完全抑制達(dá)到期望的結(jié)果。

在權(quán)利要求書和/或說明書中，術(shù)語“一個(gè)”與術(shù)語“包含”連用時(shí)意為“一個(gè)”(one)，但也包含“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”以及“一個(gè)或一個(gè)以上”的意思。

考慮到，本文討論的任何實(shí)施方式可與本發(fā)明的任何方法或組合物一起實(shí)施，反之亦然。而且，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法。

本申請(qǐng)中術(shù)語“約”表明包含測(cè)定某數(shù)值的設(shè)備或方法的標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)值。

權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“或”用于表明“和/或”，除非明確表明僅僅指代候選物或候選物是互斥的，盡管本公開文本支持指唯一候選物和“和/或”的定義。

本說明書和權(quán)利要求書中所用術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包含性或開放式的，并不排除其它未敘述的元素或方法步驟。

本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳細(xì)描述可以變得更加明晰。但是應(yīng)當(dāng)理解，闡述本發(fā)明具體實(shí)施方案的詳述和具體實(shí)施例只是以說明的方式提供，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)這些詳細(xì)描述可以很容易地想到包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改。

附圖簡述

附圖構(gòu)成本說明書的一部分，可用于進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)再結(jié)合具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。

圖1.瘤內(nèi)注射JX-594治療肝腫瘤的臨床試驗(yàn)研究設(shè)計(jì)。

圖2.瘤內(nèi)注射JX-594治療黑色素瘤的臨床試驗(yàn)研究設(shè)計(jì)。

圖3.具有多種新穎的癌癥根除機(jī)制的靶向溶瘤病毒療法。

圖4.對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤進(jìn)行JX-594I期臨床試驗(yàn)后的長期無病生存者?；颊?，上方，32歲女性：難治性：DITC，IL-2；注射腫瘤：CR；非注射轉(zhuǎn)移灶：-皮膚：CR；乳腺：手術(shù)CR。存活，無病1.5+年?；颊?，下方，75歲男性：多個(gè)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)(n＝24)；注射腫瘤：CR；非注射轉(zhuǎn)移灶：-CR；存活，無病3+年。

圖5.注射和非注射腫瘤中的JX-594臨床I期試驗(yàn)反應(yīng)。

圖6. JX594IT-hep001-患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和治療狀態(tài)-組1和組2。

圖7. JX594IT-hep001-患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和治療狀態(tài)-組3。

圖8.在血流中靜脈內(nèi)散播JX-594：從腫瘤中早期流出量對(duì)應(yīng)于劑量，至6小時(shí)大多被清除。

圖9. 80％患者顯示出JX-594復(fù)制的病毒血癥。第1-7個(gè)周期血液中出現(xiàn)JX-594的第二個(gè)峰，(+)輸入劑量清除后，(-)檢測(cè)限以下的水平，方塊＝脫離研究的患者，(p)＝未決數(shù)據(jù)。檢測(cè)限＝700個(gè)基因組/毫升。

圖10. 80％患者顯示JX-594復(fù)制的病毒血癥。第1-7個(gè)周期，第3-22天血液中出現(xiàn)JX-594的第二個(gè)峰。

圖11. JX-594復(fù)制相關(guān)性血管閉合的急性治療誘導(dǎo)血管壞死(患者1，胃癌)。

圖12. JX-594鱗狀細(xì)胞癌對(duì)照(肺-組2)的長期穩(wěn)定疾病。

圖13.代謝(PET)反應(yīng)：JX-594注射2個(gè)周期后注射JX-594的腫瘤黑色素瘤的反應(yīng)(組3)。

圖14.代謝(PET)反應(yīng)：JX-594注射9個(gè)月后注射JX-594的腫瘤肝癌長期對(duì)照的反應(yīng)(組2)。

圖15.腫瘤標(biāo)記物反應(yīng)：血液標(biāo)記物表明AFP快速肝癌破壞中減少99.9％。

圖16. JX-594 10％的體重增加(6kg；14lb.)表明耐受性和療效。

圖17.全身性病毒血癥和腫瘤反應(yīng)：JX-594相關(guān)病毒血癥，導(dǎo)致整體療效(HCC-組2)：AFP減少40％。

圖18.將JX-594全身遞送至腫瘤及其反應(yīng)：肝臟met注射后，在遠(yuǎn)端非注射腫瘤中的療效。2個(gè)周期后2個(gè)非注射腫瘤的PET代謝反應(yīng)(患者304，群組3)。

圖19.治療、療效和生存數(shù)據(jù)：CT和PET(檢測(cè)的)長期存活者的腫瘤反應(yīng)。

圖20.試驗(yàn)圖解。

圖21A-21B.關(guān)鍵血液學(xué)檢測(cè)和肝功能檢測(cè)(誤差棒：平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。(A)ANC的增加與JX-594劑量以及hGM-CSF的表達(dá)增加相關(guān)。實(shí)心棒：ANC，空心棒：GM-CSF。X軸：患者識(shí)別號(hào)。(B)第1周期中，組3和組4患者的ALT水平。大多數(shù)患者ALT水平隨時(shí)間未發(fā)生顯著變化，也觀察到輕微短暫的轉(zhuǎn)氨酶升高(transaminitis)。

圖22A-22C.血液學(xué)檢測(cè)的變化。(A)劑量依賴的血小板減少，(B)血小板減少的程度與周期無關(guān)，(C)與后續(xù)周期相比，周期1中ANC、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的變化程度更為顯著。白色棒：ANC，灰色棒：嗜酸性粒細(xì)胞，黑色棒：單核細(xì)胞。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖23A-23F. JX-594的藥代動(dòng)力學(xué)、血源性傳播以及對(duì)遠(yuǎn)端腫瘤的感染。(A)循環(huán)中急性基因組濃度。注射后15分鐘即檢測(cè)JX-594的基因組。組1－3中急性清除率一致。(B)顯示了組1和3在周期1中的JX-594基因組濃度。JX-594基因組的濃度，包括第二病毒血癥峰值的水平，與劑量相關(guān)。LOQ：定量限。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。(C)周期1中代表性JX-594的基因組濃度。(D)黑色素瘤患者(組3)的JX-594回收和hGM-CSF表達(dá)。在循環(huán)和惡性體液中檢測(cè)到高水平的JX-594基因組和GM-CSF(組3，黑色素瘤患者)。星號(hào)：未能檢測(cè)到；PE：胸膜滲出液。(E)惡性滲出液中細(xì)胞表達(dá)lac-Z，表明感染性JX-594的存在。(F)非注射肝癌轉(zhuǎn)移(頸部)的活檢樣品顯示痘苗病毒B5R染色(箭頭，棕色)。

圖24A-24B.抗腫瘤效果。(A)非小細(xì)胞肺癌靶腫瘤的代表性CT掃描圖和腫瘤測(cè)量值。圓圈：腫瘤。箭頭：JX-594開始注射的時(shí)間。注意腫瘤截面積隨時(shí)間的變化。(B)代表性的生理、CT和PET-CT掃描結(jié)果表明頸部轉(zhuǎn)移瘤的目標(biāo)腫瘤反應(yīng)(4個(gè)周期后)，在誘導(dǎo)高滴度JX-594中和抗體后注射。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及用溶瘤痘病毒治療癌癥。具體說是描述使用表達(dá)GM-CSF的痘苗病毒達(dá)到特定溶瘤程度。在另一實(shí)施方式中，可改造表達(dá)GM-CSF的痘病毒使其可以更有效地或更高效地殺傷癌細(xì)胞和/或?qū)Ψ前┘?xì)胞的毒性更低或損傷更小，具體是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行突變或修飾，該改變可以使病毒更好地感染宿主、對(duì)宿主細(xì)胞毒性更小和/或更好感染癌細(xì)胞。一個(gè)具體的修飾是使病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)功能缺陷。

I.痘病毒

對(duì)痘病毒已有數(shù)個(gè)世紀(jì)的了解，其特征是天花病毒(天花)產(chǎn)生的痘印，該病毒由此而得名。2000多年前天花可能首先出現(xiàn)在中國和遠(yuǎn)東。幸運(yùn)的是，這種經(jīng)常致命的病毒現(xiàn)在已經(jīng)被根除，最后一次自然爆發(fā)發(fā)生在1977年的索馬里。

痘病毒顆粒為卵圓形或磚塊形狀，長約200-400nm。外表面褶皺成平行排列，有時(shí)成螺旋狀排列。這種顆粒相當(dāng)復(fù)雜，含有超過100種的不同蛋白。胞外形式包含兩層膜(EEV-胞外包膜病毒體)，而胞內(nèi)形式僅含有內(nèi)膜(IMV-胞內(nèi)成熟病毒體)。外表面由環(huán)繞核心的脂質(zhì)和蛋白構(gòu)成，核心由緊密壓縮的核蛋白構(gòu)成。作為抗原，痘病毒也很復(fù)雜，同時(shí)誘導(dǎo)特異性和交叉反應(yīng)抗體。顆粒中至少出現(xiàn)10種酶，多數(shù)與核酸代謝/基因組復(fù)制有關(guān)。

痘病毒的基因組是130-300Kbp的線裝雙鏈DNA?；蚪M的末端具有含數(shù)個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的末端發(fā)夾環(huán)。已測(cè)序數(shù)種痘病毒基因組，多數(shù)必需基因位于基因組中部，而非必需基因則位于末端。痘病毒基因組中有約250種基因。

復(fù)制發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中，因?yàn)樵摬《咀銐驈?fù)雜已具有基因組復(fù)制的所有必需功能。有些細(xì)胞功能參與其中，但其參與的本質(zhì)尚未可知。然而，盡管在除核細(xì)胞中可發(fā)生痘病毒基因表達(dá)和基因組復(fù)制，但其成熟被阻斷，表明細(xì)胞具有某種作用。

痘病毒的受體一般未知，但可能有很多種類且因細(xì)胞類型而不同，對(duì)于牛痘，一種可能的受體是EGF受體(McFadden，2005)。其穿透也可能涉及不止一種機(jī)制。脫殼發(fā)生在兩個(gè)階段：(a)顆粒進(jìn)入細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)時(shí)去掉外膜，以及(b)顆粒進(jìn)一步脫殼，核心進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與核心相關(guān)的病毒酶開始進(jìn)行基因表達(dá)。表達(dá)分為兩個(gè)時(shí)期：在基因組復(fù)制前表達(dá)的早期基因，占基因組約50％，以及在基因組復(fù)制后表達(dá)的晚期基因。活性依賴于DNA復(fù)制的晚期啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)的時(shí)間調(diào)控。基因組的復(fù)制被認(rèn)為是自我啟動(dòng)的，引起高分子量串聯(lián)子的形成，隨后這些串聯(lián)子被切割修復(fù)形成病毒基因組。病毒的組裝發(fā)生于細(xì)胞骨架中，可能包括與細(xì)胞骨架蛋白(如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)的相互作用。包涵體產(chǎn)生于細(xì)胞質(zhì)中，并最終成熟為病毒顆粒。細(xì)胞到細(xì)胞的傳播為感染傳播提供了另一機(jī)制。總體上，這種大的復(fù)雜病毒的復(fù)制很快，平均需要12小時(shí)。

至少有9種不同痘病毒能在人體中引起疾病，但對(duì)天花病毒和痘苗病毒最為了解。天花毒株分為重型天花(25-30％致死率)以及輕型天花(癥狀相同但死亡率小于1％)。兩種病毒的自然感染都通過呼吸道進(jìn)行，并且是全身性的，產(chǎn)生一系列的癥狀，但最值得注意的天花特征是皮膚的膿包和疤痕。

A.痘苗病毒

痘苗病毒是一種大的、包膜復(fù)雜的病毒，具有約190Kbp的線性雙鏈DNA基因組，編碼約250種基因。痘苗病毒被人熟知的角色是作為根除天花的疫苗。在根除天花后，科學(xué)家們尋求使用痘苗病毒作為將基因遞送到生物學(xué)組織的工具(基因治療和遺傳學(xué)改造)。痘苗病毒僅在宿主細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，這在DNA病毒中是獨(dú)一無二的。因此，需要大的基因組編碼病毒DNA復(fù)制所需的不同的酶和蛋白。復(fù)制期間，痘苗病毒產(chǎn)生外膜不同的數(shù)種感染形式：胞內(nèi)成熟病毒體(IMV)、胞內(nèi)包膜病毒體(IEV)、細(xì)胞相關(guān)包膜病毒體(CEV)以及胞外包膜病毒體(EEV)。IMV是最豐富的感染形式，并被認(rèn)為負(fù)責(zé)宿主間傳播。另一方面，CEV被認(rèn)為參與細(xì)胞到細(xì)胞的傳播，EEV則對(duì)于宿主有機(jī)體內(nèi)長距離播散具有重要作用。

痘苗病毒編碼數(shù)種使病毒具有干擾素抗性的蛋白。K3L是與eIF-2有同源性的蛋白質(zhì)。K3L蛋白抑制干擾素激活劑PKR的作用。E3L是另一個(gè)抑制PKR激活的痘苗病毒蛋白，也能與雙鏈RNA結(jié)合。

痘苗病毒與引起牛痘的病毒非常相近。痘苗病毒的準(zhǔn)確來源未知，但最常見的觀點(diǎn)是痘苗病毒、牛痘病毒和天花病毒(天花的病原體)均來源于共同的祖先病毒。也有推測(cè)認(rèn)為痘苗病毒起先分離自馬。痘苗病毒的感染是溫和的，健康個(gè)體通常沒有癥狀，但可引起輕微的皮疹和發(fā)熱，死亡率極低。對(duì)痘苗病毒感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以保護(hù)人體免遭致死性的天花感染?；谶@個(gè)原因，使用痘苗病毒作為活病毒疫苗對(duì)抗天花。痘苗病毒疫苗不含天花病毒因此是安全的，但偶爾也會(huì)產(chǎn)生某些并發(fā)癥和/或疫苗副作用，尤其當(dāng)疫苗無免疫應(yīng)答時(shí)。

如上文所討論的，將痘苗病毒改造以表達(dá)數(shù)種外源蛋白。一種此類蛋白是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，或GM-CSF。GM-CSF是一種由巨噬細(xì)胞分泌的蛋白，刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞。人GM-CSF在23位氨基酸殘基(亮氨酸)、27位氨基酸殘基(天冬氨酸)和39位氨基酸殘基(谷氨酸)上糖基化(參見美國專利號(hào)5,073,627，通過引用納入本文)。GM-CSF也稱作莫拉司亭(molgramostim)，或者當(dāng)?shù)鞍自诮湍讣?xì)胞中表達(dá)時(shí)，稱作沙格司亭(sargramostim)(商品名)，是一種化療后用作刺激白細(xì)胞尤其是粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的藥物。曾經(jīng)報(bào)道過表達(dá)GM-CSF的痘苗病毒。然而，它并非作為溶瘤劑遞送，而僅僅是作為GM-CSF的遞送載體。同樣，其給予患者的劑量低于達(dá)到顯著溶瘤效果的劑量。在本文的一些實(shí)施方式中，使用表達(dá)GM-CSF的痘苗病毒，其給藥濃度大于1×10⁸pfu或顆粒。

B.修飾的痘病毒

病毒經(jīng)常被免疫調(diào)節(jié)分子如干擾素(-α、-β、-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF)滅活、抑制或清除(Moss，1996)。病毒感染后宿主組織和炎癥/免疫細(xì)胞通常可分泌這些分子。

這些分子具有直接的抗病毒效應(yīng)，和/或通過補(bǔ)充和/活化炎癥細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生間接的效應(yīng)。由于這些免疫清除機(jī)制的重要性，因此病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)抑制這些細(xì)胞因子/趨化因子和干擾素誘導(dǎo)和/或功能的基因產(chǎn)物。例如，痘苗病毒(VV；以及其他一些痘病毒)可編碼結(jié)合并抑制CC趨化因子(如RANTES，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，MIP-1-α)的分泌蛋白vCKBP(B29R)(Alcami等，1998)。某些VV病毒株還可以表達(dá)可結(jié)合并滅活TNF的分泌型病毒蛋白(如ListerA53R)(Alcami等，1999)。大多數(shù)痘病毒株具有編碼結(jié)合并抑制干擾素α/β(如B18R)或干擾素(B8R)的分泌蛋白的基因。vC12L是一種IL-18結(jié)合蛋白，可抑制IL-18誘導(dǎo)IFN-γ分泌和NK細(xì)胞/細(xì)胞毒T細(xì)胞活化。

大多數(shù)痘病毒的毒力研究都是在小鼠體內(nèi)進(jìn)行的。這些蛋白中的許多，但不是全部(如B18R在小鼠體內(nèi)是無活性的)在小鼠體內(nèi)是有活性的。當(dāng)這些蛋白具有抗鼠靶細(xì)胞因子的活性時(shí)，這些基因的缺失將導(dǎo)致其毒力減弱、安全性提高，產(chǎn)生出這些基因缺失或功能突變的VV突變株。另外，對(duì)這些突變株的炎癥反應(yīng)/免疫反應(yīng)及對(duì)這些突變株的清除通常要比表達(dá)抑制蛋白的親本病毒株高。例如，痘病毒分泌蛋白的T1/35kDa家族(趨化因子結(jié)合/抑制蛋白)的缺失可導(dǎo)致侵潤到病毒感染組織內(nèi)的白細(xì)胞顯著增加(Graham等，1997)。VV內(nèi)vC12L基因的缺失可導(dǎo)致病毒在接種到小鼠鼻內(nèi)后的滴度/毒性下降；另外，NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的活性隨IFN-γ的誘導(dǎo)而升高(Smith等，2000)。

粘液瘤病毒T7基因(可結(jié)合IFN-γ和多種趨化因子)的缺失可導(dǎo)致病毒毒力下降，毒性模型內(nèi)的組織炎癥/侵潤顯著增高(Upton等，1992；Mossman等，1996)。粘液瘤病毒M-T2基因的缺失也可以導(dǎo)致病毒在兔模型內(nèi)的毒力下降(Upton等，1991)。B18R抗干擾素α/-β基因產(chǎn)物的缺失也可以導(dǎo)致病毒對(duì)IFN介導(dǎo)的清除的敏感性升高，在正常組織內(nèi)的滴度降低、毒力下降(Symons等，1995；Colamonici等，1995；Alcami等，2000)?？傊?，這些病毒基因產(chǎn)物具有降低抗病毒免疫反應(yīng)和減少炎癥細(xì)胞侵潤到病毒感染組織內(nèi)的功能。通過缺失/突變使蛋白功能喪失可導(dǎo)致病毒在宿主組織內(nèi)的毒力降低和/或原炎癥特性升高。

細(xì)胞因子和趨化因子具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性效應(yīng)(Vicari等，2002；Homey等，2002)。這些效應(yīng)可直接作用于腫瘤細(xì)胞(如TNF)，或者通過對(duì)非腫瘤細(xì)胞的作用間接發(fā)揮效應(yīng)。后者的例子是TNF，它是通過對(duì)腫瘤相關(guān)血管的毒性而發(fā)揮抗腫瘤活性的；這樣可導(dǎo)致腫瘤失去血液供應(yīng)而發(fā)生壞死。另外，趨化因子可補(bǔ)充(在某些情況下可活化)免疫效應(yīng)細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞。這些免疫效應(yīng)細(xì)胞可通過多種機(jī)制殺傷腫瘤。這些機(jī)制包括表達(dá)抗腫瘤的細(xì)胞因子(如TNF)，表達(dá)fas配基，表達(dá)穿孔素和粒酶，補(bǔ)充自然殺傷細(xì)胞等。炎癥反應(yīng)最終可誘導(dǎo)出全身的腫瘤特異性免疫反應(yīng)。最后，許多這些細(xì)胞因子(如TNF)或趨化因子可協(xié)同化療或放療措施來破壞腫瘤。

通過全身給予重組的免疫刺激蛋白產(chǎn)生臨床療效是不可行的，因?yàn)?1)全身給藥會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)以及(2)刺激局部侵潤和抗腫瘤效應(yīng)需要在腫瘤組織內(nèi)的局部表達(dá)。我們需要的是找到方法使這些分子在腫瘤塊內(nèi)達(dá)到局部高濃度，而循環(huán)中的濃度達(dá)到最低。病毒可以經(jīng)改造后使其表達(dá)細(xì)胞因子或趨化因子基因以增強(qiáng)其效應(yīng)。這些基因從復(fù)制選擇性載體中的表達(dá)與從非復(fù)制選擇性載體中的表達(dá)相比具有潛在的優(yōu)勢(shì)。從復(fù)制病毒中的表達(dá)可使其在腫瘤塊內(nèi)達(dá)到局部較高的濃度；另外，復(fù)制病毒有助于通過腫瘤細(xì)胞的破壞/溶解及在原炎癥環(huán)境中釋放腫瘤抗原來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。但是這種方法也有幾個(gè)不足。如果病毒在局部高濃度表達(dá)，攜帶毒性基因的復(fù)制完整型病毒(即使是腫瘤特異性的)就有可能釋放到環(huán)境中，從而引起人們對(duì)其安全性的嚴(yán)重關(guān)注。因而，基因組內(nèi)表達(dá)有強(qiáng)原炎癥基因的病毒可能會(huì)對(duì)患者和公眾產(chǎn)生安全性風(fēng)險(xiǎn)。另外，病毒大小限制了利用病毒如腺病毒來表達(dá)多個(gè)基因和/或大基因；這些分子在聯(lián)合使用時(shí)的效率肯定更高。最后，現(xiàn)在使用的許多溶瘤病毒表達(dá)抗炎癥蛋白，因此這些病毒將會(huì)在其感染的腫瘤組織內(nèi)誘導(dǎo)出炎癥環(huán)境。結(jié)果會(huì)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)、抗血管效應(yīng)和化療/放療增敏性的誘導(dǎo)。

C修飾的痘苗病毒

1.干擾素調(diào)節(jié)多肽

干擾素α/-β可通過幾種機(jī)制阻斷病毒的復(fù)制。干擾素-γ直接的病毒抑制效應(yīng)較弱，但是它可以通過幾種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)中和干擾素抗病毒效應(yīng)的分泌型基因產(chǎn)物。例如，痘苗病毒(及其他痘病毒)編碼可分別結(jié)合干擾素-γ和-α/-β的B8R和B18R(Smith等，1997；Symons等，1995；Alcami等，2000)。另外的一種可抑制干擾素產(chǎn)生的牛痘苗病毒基因產(chǎn)物是caspase-1抑制因子B13R，它可以抑制干擾素-γ-誘導(dǎo)因子IL-18的活化。干擾素調(diào)節(jié)蛋白包括而不限于B18R，在其他的病毒株如痘苗病毒的Copenhagen株中被稱為B19R；B8R；B13R；vC12L；A53R；E3L以及其他具有相似活性或特性的病毒多肽。IFN調(diào)節(jié)多肽還可以非排他性地分為優(yōu)先調(diào)節(jié)IFNα和/或β通路的一類(如B18R、B8R、B13R或vC12L)和調(diào)節(jié)IFNγ通路的一類(例如的B8R、B13R或vC12L)。

癌細(xì)胞通常對(duì)干擾素耐受。多種機(jī)制參與其中。這些機(jī)制包括ras轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化(如ras突變，上游生長因子受體過表達(dá)/突變等)，這是癌細(xì)胞的一個(gè)常見特征，會(huì)導(dǎo)致PKR抑制。另外，腫瘤組織內(nèi)的淋巴細(xì)胞通常通過各種機(jī)制被抑制，如腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和fas-L。由于淋巴細(xì)胞是干擾素-γ產(chǎn)生的主要來源，因此淋巴細(xì)胞的抑制會(huì)導(dǎo)致腫瘤內(nèi)干擾素-γ的分泌減少。因而干擾素?zé)o法對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生效應(yīng)。另外，干擾素自身具有抗腫瘤效應(yīng)。例如，IFN-γ可增強(qiáng)MHC I類分子相關(guān)抗原的提呈；這將使CTL可以更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。例如，IFN-α/β可阻止腫瘤組織內(nèi)的血管形成，從而抑制腫瘤的生長。

2.補(bǔ)體控制多肽

病毒克隆被清除的主要機(jī)制是通過補(bǔ)體依賴的機(jī)制殺傷宿主內(nèi)被感染的細(xì)胞或肌體內(nèi)的病毒顆粒。被感染的細(xì)胞死亡后就不可能再產(chǎn)生有感染性的病毒了。另外，在調(diào)亡過程中細(xì)胞內(nèi)可釋放降解DNA的酶。這些酶可使病毒DNA降解，使病毒滅活。調(diào)亡可被各種機(jī)制誘導(dǎo)，其中包括活化的補(bǔ)體與補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物的結(jié)合。痘病毒如痘苗病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)基因產(chǎn)物抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的病毒和/病毒感染細(xì)胞的清除。因此這些基因可阻止調(diào)亡的發(fā)生，抑制通過補(bǔ)體依賴的機(jī)制清除病毒，因此病毒感染得以進(jìn)行，病毒的毒力升高。例如，痘苗病毒補(bǔ)體控制蛋白(VCP；如C21L)可阻止補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和/或病毒滅活(Isaacs等，1992)。

VCP還具有抗炎癥效應(yīng)，因?yàn)樗谋磉_(dá)可使侵潤到病毒感染組織內(nèi)的白細(xì)胞減少。補(bǔ)體控制多肽包括而不限于VCP，也被稱為C3L或C21L。

癌細(xì)胞通常過表達(dá)細(xì)胞抗補(bǔ)體蛋白；這將使癌細(xì)胞在受補(bǔ)體攻擊時(shí)得以存活。因此，那些由于其自身對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷具有耐受性的優(yōu)先作用于腫瘤細(xì)胞的藥物對(duì)各種人源腫瘤具有選擇性和較高的活性(Durrant等，2001)。另外，癌細(xì)胞的標(biāo)志之一就是失去了正常的調(diào)亡機(jī)制(Gross等，1999)。凋亡抗性促進(jìn)癌發(fā)生以及對(duì)抗腫瘤劑的抗性，這些抗腫瘤劑包括免疫試劑、化療劑和放療劑(Eliopoulos等，1995)。促凋亡分子(如bax)功能的喪失、抗凋亡分子(如bcl-2)水平/功能的增加和最后補(bǔ)體敏感性的喪失，均可介導(dǎo)凋亡的抑制。

3. TNF調(diào)節(jié)多肽

在各種病毒顆粒清除機(jī)制中有一種機(jī)制就是通過誘導(dǎo)如上所述的調(diào)亡殺傷宿主內(nèi)被感染的細(xì)胞。調(diào)亡可由各種機(jī)制所介導(dǎo)，其中包括TNF和淋巴毒素α(LTα)與細(xì)胞TNF受體的結(jié)合，這種結(jié)合可激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TNF受體被活化后可參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡(Wallach等，1999)。

痘病毒的各種病毒株，包括某些痘苗病毒株，經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)基因產(chǎn)物抑制TNF介導(dǎo)的病毒和/和病毒感染細(xì)胞的清除。這些基因所編碼的蛋白質(zhì)通過結(jié)合及隔絕細(xì)胞內(nèi)的TNF來抑制炎癥反應(yīng)和TNF的調(diào)亡誘導(dǎo)活性，結(jié)果導(dǎo)致病毒的清除被抑制。由于病毒不能被清除，因此病毒的感染得以繼續(xù)，病毒的毒力增強(qiáng)。許多痘病毒科成員都可以表達(dá)分泌型病毒TNF受體(vTNFR)。例如，有幾種痘病毒可編碼vTNFRs，如粘液瘤病毒(T2蛋白)、牛痘病毒株和痘苗病毒株，如Lister可編碼CrmB、CrmC(A53R)、CrmD、CrmE、B28R蛋白和/或其等價(jià)物。

這些vTNFRs具有抑制TNF介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和/或病毒滅活的功能(Saraiva和Alcami，2001)。TNF調(diào)節(jié)蛋白包括而不限于A53R、B28R(這個(gè)蛋白是存在的，但是在痘苗病毒的Copenhagen株中可能是無活性的)以及具有相似活性或特性的其他多肽。

癌細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志是異常的基因表達(dá)，這可導(dǎo)致其對(duì)多種生長調(diào)節(jié)分子機(jī)制的敏感性喪失，如對(duì)TNF抗腫瘤活性的敏感性。因此，對(duì)于病毒在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的傳播來說病毒免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是不需要的。

4.絲氨酸蛋白酶抑制劑

病毒顆粒被清除的一個(gè)主要機(jī)制是誘導(dǎo)宿主內(nèi)被感染的細(xì)胞調(diào)亡。感染細(xì)胞死亡后就無法繼續(xù)產(chǎn)生有感染性的病毒了。另外，在調(diào)亡過程中細(xì)胞可以釋放出降解DNA的酶。這些酶可降解病毒DNA使病毒滅活。各種機(jī)制都可以誘導(dǎo)調(diào)亡，其中包括細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子)的結(jié)合、細(xì)胞毒T細(xì)胞或fas配基結(jié)合而導(dǎo)致的粒酶表達(dá)；級(jí)聯(lián)活化是常見的調(diào)亡通路的關(guān)鍵部分。病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)基因產(chǎn)物抑制細(xì)胞內(nèi)由某些分子所誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些分子包括fas配基或腫瘤壞死因子(TNF)/TNF相關(guān)分子(如腺病毒的E3 10.4/14.5、14.7基因(Wold等，1994)；腺病毒的E1B-19kD(Boyd等，1994)；牛痘病毒的crmA；痘苗病毒的B13R)(Dobbelstein等，1996；Kettle等，1997))。這些基因產(chǎn)物可抑制調(diào)亡誘導(dǎo)分子所誘導(dǎo)的調(diào)亡，因此即使存在抗病毒調(diào)亡誘導(dǎo)細(xì)胞因子、fas、粒酶或其他調(diào)亡刺激因子，病毒的復(fù)制也可以進(jìn)行。

VV SPI-2/B13R與牛痘病毒CrmA高度同源；SPI-1(VV)與CrmA的同源性較低(Dobbelstein等，1996)。這些蛋白是serpins(絲氨酸蛋白酶抑制劑)，CrmA和SPI-2都具有阻止各種形式的調(diào)亡的功能。

例如對(duì)白細(xì)胞介素-1β-轉(zhuǎn)化酶(ICE)和粒酶的抑制可阻止感染細(xì)胞的調(diào)亡。這些蛋白可抑制IL-18的活化進(jìn)而降低IL-18所誘導(dǎo)的IFN-γ釋放。因而IFN-γ對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的免疫刺激效應(yīng)被抑制(Kettle等，1997)。SPIs包括而不限于B13R、B22R以及其他具有相似活性或特性的多肽。

癌細(xì)胞的標(biāo)志之一就是失去了正常的調(diào)亡機(jī)制(Gross等，1999)。對(duì)調(diào)亡的耐受促使其形成腫瘤并且對(duì)抗腫瘤藥物，如免疫治療藥物、化療藥物和放療耐受(Eliopoulos等，1995)。調(diào)亡抑制可由前調(diào)亡分子(如bax)功能的丟失、抗調(diào)亡分子(如bcl-2)表達(dá)水平的增加/功能的增強(qiáng)所介導(dǎo)。

5. IL-1β-調(diào)節(jié)多肽

IL-1β是一種具有局部和全身生物學(xué)活性的因子。已有的研究結(jié)果表明IL-1β和IL-1α之間的功能差異只有幾種。IL-1β的許多生物學(xué)活性是用描述IL-1的許多不同縮寫來描述的。除了在豬細(xì)胞內(nèi)無活性外IL-1無種屬特異性。IL-1的某些生物學(xué)活性是通過誘導(dǎo)其他介質(zhì)的合成來間接介導(dǎo)的，其中包括ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)、PGE2(前列腺素E2)、PF4(血小板因子-4)、CSF(集落刺激因子)、IL-6和IL-8。

IL-1的合成可被其他細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，其中包括TNF-α、IFN-α、IFN-β和IFN-γ以及細(xì)菌內(nèi)毒素、病毒、絲裂原和抗原。IL-1的主要生物學(xué)活性是刺激T輔助細(xì)胞，該細(xì)胞被誘導(dǎo)后可分泌IL-2并表達(dá)IL-2受體。病毒感染巨噬細(xì)胞后可產(chǎn)生大量的IL-1抑制因子，這些抑制因子支持T細(xì)胞成熟缺陷患者體內(nèi)細(xì)胞的機(jī)會(huì)感染和轉(zhuǎn)化。IL-1可直接作用于B細(xì)胞，促使其增殖并合成免疫球蛋白。IL-1也可以作為啟動(dòng)因子使B細(xì)胞對(duì)IL-5發(fā)生反應(yīng)。IL-1可刺激NK細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞的增殖和活化。

病毒蛋白阻斷IL-1β的合成是病毒抑制或消除IL-1激發(fā)的系統(tǒng)抗病毒反應(yīng)的一種策略。研究發(fā)現(xiàn)可有效阻斷IL-1功能的結(jié)合蛋白也可由牛痘病毒的基因編碼，這些蛋白的活性與B15R相似。痘苗病毒還可以編碼被稱為B8R的另外一種蛋白，該蛋白的功能類似于細(xì)胞因子的受體(Alcami和Smith,1992；Spriggs等，1992)。IL-1調(diào)節(jié)多肽包括而不限于B13R、B15R以及其他具有相似活性或特性的多肽。

癌細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志是異常的基因表達(dá)，這可導(dǎo)致其對(duì)多種生長調(diào)節(jié)分子機(jī)制的敏感性喪失，如對(duì)IL-1抗腫瘤活性的敏感性。因此，對(duì)于病毒在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的傳播來說病毒免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是不需要的。

6. EEV形式

病毒傳播到轉(zhuǎn)移瘤部位、甚至固體瘤內(nèi)的效率一般不高(Heise等，1999)。靜脈內(nèi)給予的病毒通常會(huì)被抗體(如腺病毒)(Kay等，1997)和/或補(bǔ)體系統(tǒng)(如HSV)(Ikeda等，1999)清除或滅活。除了這些免疫反應(yīng)介導(dǎo)的機(jī)制之外，這些病毒的生物分布也會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)病毒沉淀在正常組織而不是腫瘤組織內(nèi)。例如，靜脈內(nèi)給予腺病毒主要集中在肝臟和脾臟內(nèi)；只有低于0.1％的病毒可以進(jìn)入腫瘤內(nèi)，即使是免疫缺陷小鼠(Heise等，1999)。因此，雖然在免疫缺陷小鼠腫瘤模型內(nèi)用極高劑量的病毒可以達(dá)到適度的抗腫瘤效果，但是靜脈內(nèi)遞送的效率極低，并且對(duì)功效有嚴(yán)重影響。

痘苗病毒可在固體瘤內(nèi)復(fù)制并引起腫瘤的壞死。另外，胸苷激酶缺失突變可使病毒具有感染腫瘤塊和卵巢組織的能力，并且在小鼠腫瘤模型系統(tǒng)內(nèi)可很好地表達(dá)標(biāo)記基因(Gnant等，1999)。

但是，由于這些研究一般都是基于5天后標(biāo)記基因表達(dá)的情況來確定腫瘤的變化，因此還不清楚病毒是否可以在腫瘤/卵巢組織內(nèi)良好地沉淀、表達(dá)基因和復(fù)制(Puhlmann等，2000)。無論通過何種機(jī)制，不含其他目的基因的病毒所得到的抗腫瘤效果都是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的(Gnant等，1999)。相反，瘤內(nèi)注射病毒可以得到顯著的抗腫瘤效果(McCart等，2000)。因此，如果提高靜脈內(nèi)遞送到腫瘤內(nèi)的病毒量則可以改善靜脈內(nèi)給予的效果。

痘苗病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可產(chǎn)生胞內(nèi)病毒(IMV，胞內(nèi)成熟病毒；IEV，胞內(nèi)包裝病毒)和胞外病毒(REV，胞外包裝病毒；CEV，細(xì)胞相關(guān)的胞外病毒)(Smith等，1998)。野生型痘苗病毒株復(fù)制后所產(chǎn)生的病毒中有約99％的是IMV。該病毒形式在環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，因此是個(gè)體之間傳播的主要形式；但是，該形式的病毒在感染宿主內(nèi)無法有效傳播，因?yàn)椴《緹o法從細(xì)胞內(nèi)有效釋放以及對(duì)補(bǔ)體和/或抗體中和反應(yīng)的敏感性。與此相反的是，EEV可釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，這種形式的病毒一般只占病毒產(chǎn)量的約1％(Smith等，1998)。EEV負(fù)責(zé)病毒在感染宿主內(nèi)的傳播，在宿主外則容易被降解。更重要的是，EEV進(jìn)化出了幾種機(jī)制來避免其在血液內(nèi)被中和。首先，EEV對(duì)補(bǔ)體相對(duì)耐受(Vanderplasschen等，1998)；這一特性歸功于宿主細(xì)胞將補(bǔ)體抑制劑插入到外膜包被內(nèi)以及痘苗病毒可將補(bǔ)體控制蛋白(VCP)分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。其次，EEV與IMV相比對(duì)中和抗體的耐受性相對(duì)要高(Smith等，1997)。EEV還可以在感染后比IMV更早(如4-6小時(shí))釋放(IMV只在細(xì)胞死亡過程中或死亡后釋放)，因此EEV形式的病毒傳播更快(Blasco等，1993)。

但是，不幸的是野生型痘苗病毒只能產(chǎn)生極少量的EEV。另外，用痘苗病毒治療(即病毒的輸入劑量)到目前為止只限于細(xì)胞內(nèi)病毒。常規(guī)的痘苗病毒(VV)制備和純化方法都可以導(dǎo)致EEV被滅活(Smith等，1998)，病毒的制備一般用非人源細(xì)胞系；非人源細(xì)胞來源的EEV不能耐受補(bǔ)體介導(dǎo)的清除作用(EEV所產(chǎn)生的補(bǔ)體抑制蛋白具有種屬特異性)。因此，痘苗病毒的療效受IMV形式的病毒對(duì)中和反應(yīng)的相對(duì)敏感性及病毒在實(shí)體瘤組織內(nèi)的傳播效率低下的限制；這種傳播一般是指從一個(gè)細(xì)胞到臨近的細(xì)胞內(nèi)。IMF通過血流或淋巴系統(tǒng)傳播到遠(yuǎn)端腫瘤組織內(nèi)的效率也不高。

因此，EEV形式的痘苗病毒天然具有優(yōu)于目前所用形式(IMV)的痘苗病毒的特征；EEV適于在實(shí)體瘤的局部及其臨近或遠(yuǎn)端腫瘤位點(diǎn)內(nèi)快速而有效地傳播。由于EEV對(duì)補(bǔ)體效應(yīng)相對(duì)耐受，因此當(dāng)EEV從同一物種的細(xì)胞內(nèi)制備時(shí)，通過血管內(nèi)給予后該病毒形式在血液中的穩(wěn)定性要比標(biāo)準(zhǔn)方法制備的痘苗病毒(只含IMV)高、并且維持活性的時(shí)間要更長(Smith等，1998)。由于EEV對(duì)抗體介導(dǎo)的中和反應(yīng)耐受，因此該病毒形式通過血管內(nèi)給予后在血液中維持活性的時(shí)間要比標(biāo)準(zhǔn)方法制備的痘苗病毒(只含IMV)長(Vanderplasschen等，1998)。這個(gè)特性對(duì)于在中和抗體升高的情況下需要重復(fù)給予時(shí)特別重要；所有被認(rèn)可的抗癌療法都需要重復(fù)給予。因此，痘苗病毒及其他痘病毒的EEV形式能高效地將治療性病毒及其攜帶的基因通過血流轉(zhuǎn)移到腫瘤內(nèi)，與標(biāo)準(zhǔn)的痘病毒制備物相比其系統(tǒng)效應(yīng)會(huì)提高。最后，病毒在大眾中傳播的危險(xiǎn)會(huì)顯著降低，因?yàn)镋EV在體外是很不穩(wěn)定的。

參與病毒EEV形式調(diào)節(jié)的多肽包括而不限于A34R、B5R以及可影響痘病毒EEV形式產(chǎn)生的其他各種蛋白。A34R上的密碼子151突變可使賴氨酸殘基變成天冬氨酸殘基(K151D)，這樣A34R蛋白就不能將EEV形式的病毒定位到細(xì)胞膜上。B5R是一種可結(jié)合補(bǔ)體的EEV膜結(jié)合多肽。A34R的完全缺失可導(dǎo)致EEV的釋放增加，但是病毒的感染性會(huì)大大降低，而K151D突變可增加EEV的釋放，同時(shí)也能保持釋放病毒的感染活性。B5R的序列與VCP(抗補(bǔ)體)同源，但是還未發(fā)現(xiàn)它具有補(bǔ)體抑制活性。

一種鑒定增強(qiáng)型EEV形式的方法簡述如下。EEV稀釋到冷MEM中，與含活性血清或熱滅活血清(56℃，30min，對(duì)照)的冷MEM混合(1:1)(血清的最終稀釋度為1/10、1/20或1/30)。在7℃孵育75分鐘后，樣品在冰上冷卻，將mAb5B4/2F2加到新鮮的EEV樣品中中和所有的污染物(IMV和破裂的EEV)。然后使病毒顆粒與RK13細(xì)胞在冰上結(jié)合1小時(shí)，將補(bǔ)體和未結(jié)合的病毒顆粒洗去，2天后計(jì)數(shù)形成的噬菌斑。噬菌斑的數(shù)量越多說明對(duì)補(bǔ)體的耐受性約高(Vanderplasschen等，1998，通過引用納入本文)。描述分離EEV形式的痘苗病毒的示例性方法參見Blasco等，1992(本文已納入作為參考)。

7.其他多肽

其他病毒免疫調(diào)節(jié)多肽包括可結(jié)合免疫反應(yīng)的其他介質(zhì)的多肽和/或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)相關(guān)分子通路的多肽。例如，趨化因子結(jié)合多肽如B29R(在痘苗病毒的Copenhagen株中雖然存在該蛋白，但是無活性)、C23L、vCKBP、A41L以及具有相似活性或特性的多肽。其他痘苗病毒蛋白，如痘苗病毒生長因子(如C11L)是一種病毒EGF樣生長因子，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中也是修飾的靶位?？杀环Q為病毒免疫調(diào)節(jié)因子的其他多肽包括而不限于B7R、N1L或具有提高痘病毒毒力活性或特征的其他多肽。

8.痘苗病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，A56R或K2L編碼核酸的修飾、缺失或突變可導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞的融合或VV感染所誘導(dǎo)的合胞體(syncitia)形成。痘苗病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合常常會(huì)增強(qiáng)VV的抗腫瘤效應(yīng)，因?yàn)閂V可在腫瘤內(nèi)傳播。由于細(xì)胞融合而導(dǎo)致的腫瘤內(nèi)病毒傳播通常可使病毒逃過中和抗體和免疫反應(yīng)的攻擊。這些基因中的一個(gè)或兩個(gè)都發(fā)生突變的VV可以更有效地殺傷和感染臨近的未感染細(xì)胞(即“旁觀者效應(yīng)”)，這樣就可以提高病毒的局部抗腫瘤效應(yīng)。

D.其他痘病毒

痘苗病毒是痘病毒科、脊椎動(dòng)物痘病毒、正痘病毒屬的一員。正痘病毒屬與脊椎動(dòng)物痘病毒亞科的其他屬相比其成員具有更高的同源性，正痘病毒屬包括11個(gè)不同但是又密切相關(guān)的種，其中有牛痘病毒、天花病毒(天花致病原)、牛痘病毒、水牛痘病毒、猴痘病毒、鼠痘病毒和馬痘病毒以及其他病毒(見Moss，1996)。如本文所描述，本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以延伸到正痘病毒屬以及副痘病毒屬、禽痘病毒屬、羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬軟疣痘病毒屬和亞塔痘病毒屬的其他成員。痘病毒家族的一個(gè)屬通常用血清學(xué)方式來定義，其中包括在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的中和反應(yīng)和交叉反應(yīng)。正痘病毒屬的各個(gè)成員及Chordovirinae亞科的其他成員利用免疫調(diào)節(jié)分子，如本文所描述的那些調(diào)節(jié)分子來抑制宿主的免疫反應(yīng)。因此，本文所描述的發(fā)明并不限于痘苗病毒，而是適用于多種病毒。

E.病毒制備

痘苗病毒可用Earl和Moss描述的方法制備，參見Ausubel等，1994，通過引用納入本文。

II.蛋白和核酸組合物

本發(fā)明涉及痘病毒，包括那些經(jīng)改造后與野生型相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的痘病毒，這樣的病毒具有可用于治療癌細(xì)胞的優(yōu)良特性，并且對(duì)非癌細(xì)胞來說是低毒的或無毒的。下文以實(shí)施例的方式描述了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法和組合物的各種方法，如利用重組DNA技術(shù)制備突變病毒的方法。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備缺乏一種或多種功能性多肽或蛋白的方法和/或制備能更好釋放的特殊形式病毒，如具有感染性的EEV形式病毒的方法。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及痘病毒以及和作為藥用制劑一部分的蛋白質(zhì)性組合物聯(lián)合使用。

本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“多肽”是指至少含一個(gè)氨基酸殘基的分子。在某些實(shí)施方案中使用的是野生型的蛋白質(zhì)或多肽，而在本發(fā)明的多數(shù)實(shí)施方案中，病毒蛋白或多肽是缺失的或者是經(jīng)過修飾的，這樣就可以使病毒更適用于治療癌細(xì)胞或癌癥患者。上述術(shù)語在本文中可以交互使用?！靶揎椀鞍住被颉靶揎椂嚯摹笔侵富瘜W(xué)結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型蛋白或多肽發(fā)生改變的蛋白或多肽。在某些實(shí)施方案中，修飾蛋白或多肽至少具有一個(gè)改變的活性或功能(假設(shè)蛋白或多肽有多種活性或功能)。相對(duì)于野生型蛋白或多肽的活性或功能來說，改變的活性或功能可以是以某些其他方式(如特異性)降低、消失、消除、增強(qiáng)、提高或改變的活性或功能。需要特別說明的是修飾蛋白或多肽的一種活性或功能發(fā)生改變但是卻保留了野生型蛋白或多肽的其他活性或功能。另外，修飾蛋白可以是完全失去功能的，或者其編碼核酸序列被改變從而使其根本不再表達(dá)該多肽、因移碼突變而表達(dá)截短的多肽或者表達(dá)不同的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，突變蛋白或多肽的長度可以包含但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500或更多個(gè)氨基酸殘基，以及上述數(shù)值之間的任何數(shù)目的氨基酸殘基。需要說明的是多肽可通過截短而發(fā)生突變，使其比相應(yīng)的野生型多肽短。

本文所用的術(shù)語“氨基分子”是指任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸類似物，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在某些實(shí)施方案中，蛋白分子的殘基是連續(xù)的，其間無任何非氨基分子將氨基分子殘基的序列中斷。在其他的實(shí)施方案中，序列可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基分子部分。在一些特殊的實(shí)施方案中，蛋白分子的殘基序列可被一個(gè)或多個(gè)非氨基分子部分中斷。

相應(yīng)的，術(shù)語“蛋白質(zhì)性組合物”包含氨基分子序列，該序列內(nèi)至少含有一個(gè)含20個(gè)天然合成蛋白質(zhì)中常見氨基酸的序列，或者至少含有一個(gè)修飾的或不常見的氨基酸。

蛋白組合可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何技術(shù)制備，其中包括通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽，從天然材料中分離蛋白化合物，或者用蛋白材料化學(xué)合成。各種基因的核苷酸和蛋白質(zhì)、多肽和肽序列已經(jīng)被鑒定出來，可在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的電子數(shù)據(jù)庫中找到。一個(gè)這樣的數(shù)據(jù)庫是生物技術(shù)信息基因庫國家中心(National Center for Biotechnology Information's Genbank)和GenPept數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)。這些已知基因的編碼區(qū)可用本文所描述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他方法擴(kuò)增和/或表達(dá)。

A.功能方面

當(dāng)本申請(qǐng)?zhí)峒安《镜鞍谆蚨嚯牡墓δ芑蚧钚詴r(shí)，除非特別說明，是指該病毒蛋白或多肽在生理?xiàng)l件下的活性或功能。例如，干擾素調(diào)節(jié)多肽是指可直接或間接影響至少一種干擾素及其活性的多肽。多肽可直接或間接誘導(dǎo)、增強(qiáng)、提高、增加、消除、減弱、降低、抑制或屏蔽干擾素的活性。在某些實(shí)施方案中，直接影響干擾素的例子包括可特異性結(jié)合干擾素的干擾素調(diào)節(jié)多肽。確定哪個(gè)分子具有這種活性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的試驗(yàn)方法實(shí)現(xiàn)。例如，將編碼調(diào)節(jié)干擾素或其突變體的產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)移到可誘導(dǎo)出干擾素活性的細(xì)胞內(nèi)，然后與轉(zhuǎn)移這種基因的細(xì)胞進(jìn)行比較，通過確定其對(duì)干擾素反應(yīng)水平的不同就可以確定哪些分子具有干擾素調(diào)節(jié)功能。

需要特別說明的是調(diào)節(jié)因子可以是影響蛋白質(zhì)性組合物表達(dá)的分子，這些蛋白質(zhì)性組合物參與靶分子通路，如通過結(jié)合干擾素編碼的轉(zhuǎn)錄子。確定哪個(gè)分子是干擾素、IL-1β、TNF或其他具有療效的分子的調(diào)節(jié)因子可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法實(shí)現(xiàn)，本文中已經(jīng)描述了一些，例如利用天然的和/或重組的病毒蛋白。

B.病毒多肽的突變體

本發(fā)明的多肽氨基酸序列的改變可以是替代、插入或缺失突變體。與野生型相比，編碼病毒多肽的基因發(fā)生突變可影響1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個(gè)多肽的非連續(xù)或連續(xù)氨基酸。痘苗病毒編碼的各種多肽可通過參考Rosel等，1986，Goebel等，1990和GenBank登錄號(hào)NC_001559來確定，本文都已納入作為參考。

缺失突變體缺少天然或野生型蛋白的一個(gè)或多個(gè)殘基。每個(gè)殘基都可以缺失，一個(gè)區(qū)(如催化區(qū)或結(jié)合區(qū))的全部或部分也可以缺失。終止密碼子被引入(通過替代或插入)到核酸編碼序列中時(shí)可產(chǎn)生出截短的蛋白。插入突變一般是指在多肽的非終止點(diǎn)上插入殘基，包括插入一個(gè)免疫原性表位或者僅僅插入一個(gè)或多個(gè)殘基。也可以制備末端添加產(chǎn)物，這被稱為融合蛋白。

替代突變體一般是指在蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上將一個(gè)氨基酸替換成另一個(gè)氨基酸，這樣可以使多肽的一個(gè)或多個(gè)特性發(fā)生改變而不會(huì)丟失其他的功能或活性。替代可以是保守替代，即一個(gè)氨基酸用另外一個(gè)具有相似形狀或電荷的氨基酸替代。保守替代是本領(lǐng)域所熟知的，例如其中包括如下交換：丙氨酸到絲氨酸；精氨酸到賴氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到絲氨酸；谷胺酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；組氨酸到天冬酰胺或谷胺酰胺；異亮氨酸到亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸到纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；絲氨酸到蘇氨酸；蘇氨酸到絲氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及纈氨酸到異亮氨酸或亮氨酸。另外，替代也可以是非保守的，這樣多肽的功能或活性會(huì)受到影響。非保守的替代一般是指用一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的殘基來替代另一個(gè)殘基，如極性氨基酸或帶電荷的氨基酸替代非極性氨基酸或不帶電荷的氨基酸，反之亦然。

本文所用術(shù)語“功能等同的密碼子”是指編碼相同氨基酸的密碼子(見下表1)。

表1

密碼子列表

還應(yīng)當(dāng)理解的是氨基酸和核酸序列還可以包含附加的殘基，如附加的N-或C-末端氨基酸或者5’或3’序列，這在本文所描述的上述序列中是必需的，只要該序列復(fù)合上述標(biāo)準(zhǔn)，包括保持所表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性。添加末端序列特別適合于那些包含各種非編碼序列的核酸序列，其中非編碼序列位于編碼區(qū)的5’或3’端，或者那些包含各種內(nèi)部序列，即內(nèi)含子的核酸序列，內(nèi)含子是大家所熟知的包含在基因內(nèi)的序列。

下面的討論是基于蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生交換而產(chǎn)生等價(jià)的或者是改進(jìn)的第二代分子。例如，蛋白質(zhì)內(nèi)的某些氨基酸被其他氨基酸所替代，但是蛋白質(zhì)與某些結(jié)構(gòu)，如抗體上的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力并沒有顯著下降。由于蛋白質(zhì)的相互結(jié)合能力和性質(zhì)決定了蛋白質(zhì)的生物功能活性，因此某些氨基酸替代可在蛋白質(zhì)序列內(nèi)或者其DNA編碼序列內(nèi)發(fā)生，但是卻可以產(chǎn)生出具有相似特性的蛋白質(zhì)。因此發(fā)明者認(rèn)為在基因的DNA序列上進(jìn)行的各種改變可以使其生物功能或活性不丟失，如下面所討論的。表1顯示的是編碼特定氨基酸的密碼子。

在進(jìn)行這些改變時(shí)，需要考慮氨基酸的水性指數(shù)。氨基酸水性指數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)生物功能的重要性在本領(lǐng)域中是被普遍認(rèn)知的(Kyte和Doolittle，1982)。氨基酸的相對(duì)水性特征可影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而也就決定了蛋白質(zhì)與其他分子，如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。

還應(yīng)當(dāng)理解的是在本領(lǐng)域中相似氨基酸的替代可在親水性指數(shù)的基礎(chǔ)上有效進(jìn)行。美國專利4,554,101闡明一個(gè)蛋白質(zhì)的局部最大平均親水性指數(shù)是由其相鄰的氨基酸所決定的，并且與蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性相關(guān)，本文已納入作為參考。如美國專利4,554,101所詳細(xì)描述的，下列親水性指數(shù)值被賦予了各個(gè)氨基酸殘基：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷胺酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸^*-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

應(yīng)當(dāng)理解的是一個(gè)氨基酸被另外一個(gè)具有相似親水性指數(shù)的氨基酸替代后可以得到一個(gè)生物等價(jià)和免疫等價(jià)的蛋白質(zhì)。在這種替代中，親水性指數(shù)值差異在±2之內(nèi)的氨基酸替代是優(yōu)選的，差異在±1之內(nèi)的氨基酸替代是更優(yōu)選的，差異在±0.5之內(nèi)的氨基酸替代是尤其優(yōu)選的。

如上面所指出的，氨基酸替代一般都是根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性來進(jìn)行，如其疏水性、親水性、電荷、側(cè)鏈長度等。考慮了上述各種特征的典型替代是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其中包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷胺酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。

III.核酸分子

A.編碼天然蛋白或修飾蛋白的多核苷酸

本發(fā)明涉及可從細(xì)胞中分離的多核苷酸，該多核苷酸可表達(dá)全長的或部分的蛋白或多肽。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，涉及被特異性突變的病毒基因組，這種突變可使病毒缺乏某些功能性病毒多肽。多核苷酸可編碼含全部或部分病毒氨基酸序列的肽或多肽，這些多核苷酸也可以被改造使之不編碼這種病毒多肽，或者編碼至少有一個(gè)功能或活性降低、消除或缺失的病毒多肽。重組蛋白可從產(chǎn)生活性蛋白的表達(dá)細(xì)胞內(nèi)純化?；蚪M及痘苗病毒編碼區(qū)的定義見于Rosel等，1986，Goebel等，1990和/或GenBank登錄號(hào)NC_001559，本文都已納入作為參考。

本文所用的術(shù)語“DNA節(jié)段”是指從特定物種的基因組DNA中分離出來的游離形式的DNA分子。因此，編碼多肽的DNA節(jié)段是指含野生型、多態(tài)性或突變多肽編碼序列的DNA節(jié)段，可以從哺乳動(dòng)物或人的基因組總DNA內(nèi)分離或純化。多肽、比多肽短的DNA節(jié)段以及重組載體，如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等也包含在術(shù)語“DNA節(jié)段”內(nèi)。

本申請(qǐng)所使用的術(shù)語“痘病毒多核苷酸”是指編碼痘病毒多肽的核酸分子，可從基因組總核酸中分離。

同樣，“痘苗病毒多核苷酸”是指編碼痘苗病毒多肽的核酸分子，可從基因組總核酸中分離。“痘病毒基因組”或“痘苗病毒基因組”是指在存在或不存在輔助病毒的情況下可使宿主細(xì)胞產(chǎn)出病毒顆粒的核酸分子。與野生型病毒相比，基因組可以是重組突變的，也可以不是。

術(shù)語“cDNA”是指以信使RNA(mRNA)為模板制備的DNA。與基因組DNA或基因組非或部分處理的RNA模板來源的DNA多聚物不同的是，利用cDNA的優(yōu)點(diǎn)在于cDNA主要包含相應(yīng)蛋白的編碼序列。有時(shí)也需要使用全部或部分基因組序列，比如要獲得最佳表達(dá)需要非編碼區(qū)時(shí)或者非編碼區(qū)如內(nèi)含子是反義策略的靶位時(shí)。

還需要說明的是一個(gè)給定物種的特定多肽可由天然突變體代表，該突變體的核酸序列有些許不同，但是所編碼的蛋白是相同的(見上述表1)。

同樣，含分離的或純化的野生型或突變多肽基因的多核苷酸是指包含野生型或突變多肽編碼序列的DNA節(jié)段，在某些情況下也包含調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列是從天然基因或蛋白編碼序列中分離出來的。在這種情況下，術(shù)語“基因”也可以簡單地指功能蛋白、多肽或肽編碼單位(包括正確轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾或定位所需要的任何序列)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，這個(gè)功能術(shù)語包含可表達(dá)或適于表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽、結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白和突變體的基因組序列、cDNA序列和人工基因小片段。編碼全長的或部分的天然或修飾多肽的核酸含有編碼該多肽的全部或部分的連續(xù)核酸序列，其長度可以是：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000或更多個(gè)核苷酸、核苷或堿基對(duì)。

本發(fā)明的某些特殊實(shí)施方案涉及分離的DNA節(jié)段以及含DNA插入序列的重組載體，其中DNA插入序列編碼野生型或突變的痘病毒多肽或肽，這些多肽或肽的氨基酸序列內(nèi)包含與天然多肽一致或基本一致的連續(xù)氨基酸序列。因此，分離的DNA節(jié)段或含DNA節(jié)段的載體可編碼抑制或降低INF活性的INF調(diào)節(jié)因子或TNF調(diào)節(jié)多肽。術(shù)語“重組的”可與多肽聯(lián)用或作為特異性多肽的名稱，一般是指在體外經(jīng)改造的核酸分子編碼的多肽或這種分子的復(fù)制產(chǎn)物所編碼多肽。

本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及分離的DNA節(jié)段以及含DNA插入序列的重組載體，其中DNA插入序列編碼多肽或肽，這些多肽或肽的氨基酸序列內(nèi)包含與多肽一致或基本一致的連續(xù)氨基酸序列。

本發(fā)明所用的核酸片段不論其編碼序列的長度如何都可以和其他的核酸序列連接，如啟動(dòng)子、多聚腺苷酸信號(hào)、額外的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼序列等，這樣其全長的變化就會(huì)相當(dāng)大。因此需要說明的是幾乎任何長度的核酸片段都可以使用，但是優(yōu)選的核酸片段長度受制備方法及其在重組DNA技術(shù)中的用途限制。

需要說明的是本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可編碼任何物種的全長多肽，也可以編碼截短的多肽，如截短的痘苗病毒多肽，這時(shí)編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄子代表了截短的版本。截短的轉(zhuǎn)錄子被翻譯成截短的蛋白。另外，核酸序列可編碼帶有其他異源編碼序列的全長多肽序列，這樣有利于多肽的純化、運(yùn)輸、分泌、轉(zhuǎn)錄后修飾或多肽的療效如靶向性和活性。如上面所討論的，修飾多肽編碼序列可添加上標(biāo)簽或其他異源多肽，其中“異源的”是指與修飾多肽不一樣的多肽。

在一個(gè)非限定性例子中，一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體可制備成包含與特定基因，如B18R基因一致或互補(bǔ)的一段連續(xù)核苷酸的構(gòu)建體。核酸構(gòu)建體可以至少含有20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、100,000、250,000、500,000、750,000到1,000,000核苷酸，或者更長的構(gòu)建體，甚至可以達(dá)到和包含染色體的長度(包括所有的中間長度和中間范圍)，假設(shè)核酸構(gòu)建體如酵母人工染色體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。很容易理解的是本文所用的“中間長度”和“中間范圍”是指包含上述數(shù)值或上述數(shù)值之間的任意長度或范圍(即包含這些數(shù)值和這些數(shù)值之間的所有整數(shù)值)。

本發(fā)明所用的DNA節(jié)段包含生物功能等價(jià)的修飾多肽和肽，如修飾的白樹素毒素。這種序列的產(chǎn)生可能是密碼子簡并性和功能等價(jià)的結(jié)果，已知在天然狀態(tài)下核酸序列及其編碼的蛋白序列都可能發(fā)生。另外，功能等價(jià)的蛋白或肽可利用重組DNA技術(shù)制備，其中可根據(jù)修飾氨基酸的特性人工改變蛋白的結(jié)構(gòu)。通過定點(diǎn)突變技術(shù)可將人為設(shè)計(jì)的改變引入到蛋白序列內(nèi)，如可以提高蛋白質(zhì)的抗原性、降低蛋白質(zhì)對(duì)受體的體內(nèi)毒性效應(yīng)、或提高含蛋白的治療藥物的療效。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及分離的DNA節(jié)段和序列內(nèi)包含本文所描述的序列(和/或參考文獻(xiàn)所描述的序列)來源的連續(xù)核酸序列的重組載體。但是，這種序列可被突變以制備活性不同于野生型蛋白的蛋白產(chǎn)物。

還應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并不局限于這些已知序列的特定核酸序列和氨基酸序列。重組載體和游離DNA節(jié)段可以包含不同序列，包括痘病毒編碼區(qū)自身、在基礎(chǔ)編碼區(qū)上具有特定改變或修飾的編碼區(qū)，或者可以編碼包含痘病毒編碼區(qū)在內(nèi)的更長的多肽、或編碼具有突變氨基酸序列的生物等價(jià)蛋白或肽。

本發(fā)明的DNA節(jié)段包含生物等價(jià)的痘病毒蛋白和肽。這種序列的產(chǎn)生可能是密碼子簡并性和功能等價(jià)的結(jié)果，已知在天然狀態(tài)下核酸序列及其編碼的蛋白序列都可能發(fā)生。另外，功能等價(jià)的蛋白或肽可利用重組DNA技術(shù)制備，其中可根據(jù)修飾氨基酸的特性人工改變蛋白的結(jié)構(gòu)。通過定點(diǎn)突變技術(shù)可將人為設(shè)計(jì)的改變引入到蛋白序列內(nèi)，如可以提高蛋白質(zhì)的抗原性。

B.誘導(dǎo)痘病毒多核苷酸發(fā)生突變

在各種實(shí)施方案中，痘病毒多核苷酸都可以被改變或突變。

改變或突變包括插入、缺失、點(diǎn)突變、顛換等，結(jié)果可導(dǎo)致某些通路或分子機(jī)制的調(diào)節(jié)、活化和/或滅活，或者改變基因產(chǎn)物的功能、定位或表達(dá)，特別是使基因產(chǎn)物失去功能。編碼全長或部分痘病毒的多核苷酸的突變可用各種標(biāo)準(zhǔn)的突變方法完成(Sambrook等，1989)。突變是生物的量或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程。突變包括單個(gè)基因的核苷酸序列的修飾、基因或整個(gè)染色體的阻斷。單個(gè)基因的改變可以是點(diǎn)突變的結(jié)果，其中包括DNA序列內(nèi)單個(gè)核苷酸的去除、添加或替代，也可以是插入或缺失多個(gè)核苷酸的結(jié)果。

突變可在接觸化學(xué)或物理突變劑后被誘導(dǎo)。這些突變誘導(dǎo)劑包括離子輻射、紫外線和化學(xué)物質(zhì)的不同組合，如烷化劑和多環(huán)芳香烴，這些物質(zhì)都可以直接或間接(一般發(fā)生在經(jīng)代謝生物轉(zhuǎn)化后)與核酸發(fā)生相互作用。當(dāng)被影響的DNA復(fù)制或修飾時(shí)這種誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的DNA損傷可導(dǎo)致堿基序列的改變，從而發(fā)生突變。也可以通過特殊的靶向性方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。

為了在痘病毒基因組內(nèi)引入突變，天然和修飾多肽可由包含在載體內(nèi)的核酸分子編碼。本文所用的術(shù)語“載體”是指攜帶核酸分子的載體，其中載體內(nèi)插入的外源核酸分子可通過載體被導(dǎo)入到可以復(fù)制載體的細(xì)胞內(nèi)。核酸序列是“外源性的”是指對(duì)于載體導(dǎo)入的細(xì)胞來說該核酸是外源的，或者該序列雖然與細(xì)胞內(nèi)的序列同源但是其在宿主細(xì)胞核酸內(nèi)的位置通常不包含該核酸。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)以及人工染色體(如YACs)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)構(gòu)建這種載體，這些方法在Sambrook等，(1989)和Ausubel等，1994中有描述，本文已納入作為參考。除了可以編碼修飾多肽如白樹素以外，載體還可以編碼未修飾的多肽序列，如標(biāo)記物或靶向性分子?？梢跃幋a這種融合蛋白的載體包括pIN載體(Inouye等，1985)、編碼一組組氨酸的載體和用于制備谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)可溶性融合蛋白的pGEX載體以利于以后的純化和分離或切割。靶向性分子是一種可以使修飾多肽特異性地定位到特定器官、組織、細(xì)胞或受體其他位置的分子。

術(shù)語“表達(dá)載體”是指含有核酸序列的載體，其中的核酸序列至少編碼部分能被轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)物。在某些情況下，RNA分子隨后被翻譯成蛋白、多肽或肽。在另外一些情況下，這些序列不翻譯，而是轉(zhuǎn)錄出反義分子或核酶。表達(dá)載體含有各種“調(diào)控序列”，調(diào)控序列是指操作連接的編碼序列在特定宿主內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯所需要的核酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列外，載體和表達(dá)載體還可以包含具有其他功能的核酸序列，這些序列將在下文描述。

1.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子

“啟動(dòng)子”是一種調(diào)控序列，是核酸序列上一個(gè)控制轉(zhuǎn)錄起始和速率的區(qū)域。可以包含調(diào)節(jié)蛋白和分子結(jié)合的元件如RNA聚合酶及其他轉(zhuǎn)錄因子。術(shù)語“操作位置的”、“操作連接的”、“控制下的”和“轉(zhuǎn)錄控制下的”是指相對(duì)于核酸序列來說啟動(dòng)子位于正確的功能位置和/或方向，可以調(diào)控該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)。啟動(dòng)子可以連接有“增強(qiáng)子”，也可以不連接，增強(qiáng)子是指參與核酸序列轉(zhuǎn)錄活化的順式調(diào)節(jié)序列。

啟動(dòng)子可以是與某個(gè)基因或序列天然相連的序列，如通過分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼序列而得到的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子被稱為“內(nèi)源性的”。同樣，增強(qiáng)子也可以是與某個(gè)序列天然相連、位于該序列上游或下游的序列。另外，將編碼核酸片段置于重組的或異源的啟動(dòng)子控制之下也有某些優(yōu)勢(shì)，重組的或異源的啟動(dòng)子是指在天然狀態(tài)下該序列不是與核酸序列相聯(lián)系的。重組的或異源的增強(qiáng)子也是指在天然狀態(tài)下不是與核酸序列相聯(lián)系的增強(qiáng)子。這種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子包括其他基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、從其他原核細(xì)胞、病毒或真核細(xì)胞中分離出的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子以及非“天然的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和/或改變表達(dá)的突變的不同元件。除了可以通過合成方法制備啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列外，還可以利用重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)，其中包括PCR^TM，結(jié)合本文所描述的組合物來制備序列(見美國專利4,683,202，5,928,906，本文都已納入作為參考)。另外，需要說明的是可控制無核細(xì)胞器如線粒體、葉綠體內(nèi)的序列轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的調(diào)控序列也可以使用。

很顯然，利用啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子來有效地控制DNA節(jié)段在細(xì)胞、細(xì)胞群和生物體內(nèi)的表達(dá)是十分重要的。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員一般都熟悉如何使用啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，知道如何選擇細(xì)胞以表達(dá)蛋白，例如Sambrook等，(1989)所描述的，本文已納入作為參考。所使用的啟動(dòng)子可以是組成性的、組織特異性的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和/或可在適當(dāng)?shù)臈l件下使被導(dǎo)入的DNA節(jié)段高水平表達(dá)的啟動(dòng)子，例如在大規(guī)模制備重組蛋白和/或肽時(shí)。啟動(dòng)子可以是異源的，也可以是內(nèi)源性的。

組織特異性啟動(dòng)子或元件的種類及鑒定其活性的測(cè)定是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這種區(qū)域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、生長抑素受體2基因(Kraus等，1998)、鼠附睪視黃酸結(jié)合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998),鼠α2(XI)膠原(Tsumaki,等，1998)、D1A多巴胺受體基因(Lee,等，1997)、胰島素樣生長因子II(Wu等，1997)、人血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(Almendro等，1996)、以及SM22α啟動(dòng)子。

2.起始信號(hào)和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)

編碼序列的有效翻譯還需要特異性的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子或其臨近序列。包含ATG起始密碼子的外源翻譯控制信號(hào)也需要提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地確定這一點(diǎn)并提供必須的信號(hào)。大家都知道起始密碼子必須位于目的編碼序列閱讀框架內(nèi)才能確保整個(gè)插入序列被翻譯。外源性的翻譯控制信號(hào)可以是天然的，也可以是合成的。插入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件可以提高表達(dá)的效率。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)可以使多個(gè)基因或多個(gè)順反子信使RNA表達(dá)。IRES元件可以使核糖體繞過5’甲基化帽子依賴性翻譯的掃描模式在內(nèi)部位點(diǎn)開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。小核糖核酸病毒家族的兩個(gè)成員(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒)來源的IRES元件以及哺乳動(dòng)物信使RNA來源的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。

IRES元件可以被連接到異源開放閱讀框上。多個(gè)開放閱讀框架可以一起轉(zhuǎn)錄，其中每個(gè)閱讀框架都被IRES隔開，轉(zhuǎn)錄出一條多順反子信使RNA。

利用IRES元件每個(gè)開放閱讀框架都可以有核糖體結(jié)合從而可以高效翻譯。利用單個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄出一條信使RNA可以使多個(gè)基因都得到有效表達(dá)(見美國專利5,925,565和5,935,819，本文已納入作為參考)。

3.多克隆位點(diǎn)

載體可包含多克隆位點(diǎn)(MCS)，MCS是指包含多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核酸序列，通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)每個(gè)酶切位點(diǎn)都可以用于消化載體(見Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Cocea，1997，本文已納入作為參考)?！跋拗菩詢?nèi)切酶消化”是指利用內(nèi)切酶催化切割核酸分子的過程，其中內(nèi)切酶只在核酸分子的特定位置上切割。很多這樣的限制性內(nèi)切酶都可以買到。這種內(nèi)切酶的使用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。載體通常被在MCS內(nèi)切割的限制性內(nèi)切酶線性化或片段化從而可以使外源序列連接到載體上?！斑B接“是指兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，其中兩個(gè)核酸片段可以是彼此不相臨近的。涉及限制性內(nèi)切酶和連接反應(yīng)的技術(shù)是重組技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。

4.剪接位點(diǎn)

大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄出來的真核RNA分子都會(huì)發(fā)生RNA剪接以去除初級(jí)轉(zhuǎn)錄子內(nèi)的內(nèi)含子。含基因組真核序列的載體需要供體和/或受體剪接位點(diǎn)以保證轉(zhuǎn)錄子被正確處理，然后表達(dá)蛋白(見Chandler等，1997，本文已納入作為參考)。

5.終止信號(hào)

本發(fā)明的載體或構(gòu)建體一般都包含至少一個(gè)終止信號(hào)。“終止信號(hào)”或“終止子”由參與RNA聚合酶所轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子特異性終止的DNA序列組成。因此，在某些實(shí)施方案中，需要結(jié)束RNA轉(zhuǎn)錄子合成的終止信號(hào)。終止子是在體內(nèi)獲得理想的信使RNA表達(dá)水平所必須的。在真核系統(tǒng)中，終止子區(qū)域還可以包含允許新轉(zhuǎn)錄子發(fā)生定點(diǎn)切割以暴露多聚腺苷酸信號(hào)的特異性DNA序列。

這種序列可向特異的內(nèi)源性聚合酶發(fā)出信號(hào)，使之將一段約200A的殘基(聚A)添加到轉(zhuǎn)錄子的3’末端。經(jīng)這種聚A尾巴修飾的RNA分子更穩(wěn)定，其翻譯的效率也更高。因此，在其他涉及真核生物的實(shí)施方案中，優(yōu)選包含RNA切割信號(hào)的終止子，更優(yōu)選的是該終止子信號(hào)可促進(jìn)信使RNA的多聚腺苷酸化。終止子和/或多聚腺苷酸位點(diǎn)元件可提高信使RNA的表達(dá)水平和/或使核糖體閱讀過表達(dá)盒進(jìn)入其他序列的可能降到最低。

本發(fā)明所用的終止子包括本文所描述的或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的轉(zhuǎn)錄子的任何已知的終止子，其中包括而不限于基因的終止序列，如牛生長激素終止子，或者病毒的終止序列，如SV40終止子。在某些實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)錄或可翻譯的序列可能缺少終止信號(hào)，如由于序列截短。

6.多聚腺苷酸信號(hào)

基因表達(dá)，特別是真核基因表達(dá)一般都包含多聚腺苷酸信號(hào)以使轉(zhuǎn)錄子正確多聚腺苷酸化。據(jù)信多聚腺苷酸信號(hào)的性質(zhì)不是成功實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的關(guān)鍵，任何這樣的序列都可以使用。優(yōu)選的實(shí)施方案包括SV40多聚腺苷酸信號(hào)和/或牛生長激素多聚腺苷酸信號(hào)，已知這些多聚腺苷酸信號(hào)在各種靶細(xì)胞內(nèi)都有功能，并且使用方便。多聚腺苷酸化可提高轉(zhuǎn)錄子的穩(wěn)定性，或者可以促進(jìn)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)。

7.復(fù)制起點(diǎn)

為了在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增載體，載體內(nèi)需包含一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)(通常被稱為“ori”)，這是一種復(fù)制在此處開始的特異性核酸序列。另外，如果宿主細(xì)胞是酵母，可以使用自主復(fù)制序列(ARS)。

8.選擇和篩選標(biāo)記

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以通過在表達(dá)載體內(nèi)添加一個(gè)標(biāo)記而便于含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的細(xì)胞在體外或體內(nèi)被鑒定。這種標(biāo)記可以使細(xì)胞具有可鑒定的表型從而便于鑒定含表達(dá)載體的細(xì)胞。一般來說，篩選標(biāo)記是一種可提供篩選特性的序列。陽性篩選標(biāo)記是指在標(biāo)記物存在的情況下可被篩選的標(biāo)記，而負(fù)性標(biāo)記是指在標(biāo)記物存在的情況下不被篩選的標(biāo)記。陽性篩選標(biāo)記的例子有耐藥標(biāo)記。

一般來說，包含藥物篩選標(biāo)記有助于轉(zhuǎn)化子的克隆和鑒定，例如提供新霉素嘌羅霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組胺醇耐藥性的基因都是有用的篩選標(biāo)記。除了能提供一種表型以便于區(qū)分轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記外，其他類型的標(biāo)記，包括篩選標(biāo)記，也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如GFP，其篩選的基礎(chǔ)是比色分析。另外，可篩選的酶如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)也可以使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何使用免疫標(biāo)記，可能結(jié)合FACS分析。用何種標(biāo)記被認(rèn)為是不重要的，只要該標(biāo)記可與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)表達(dá)就可以。選擇和篩選標(biāo)記的其他例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

D.宿主細(xì)胞

本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以互用。所有這些術(shù)語都包括其子代，可以是任何代和所有代的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的是并不是所有的子代細(xì)胞都是一致的，因?yàn)榭赡軙?huì)發(fā)生定向的或隨機(jī)的突變。在用于表達(dá)異源核酸序列時(shí)，“宿主細(xì)胞”是指原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括任何可被轉(zhuǎn)化的生物，只要它能夠復(fù)制載體和/或表達(dá)載體所編碼的異源基因。宿主細(xì)胞可以而且已經(jīng)被用作載體或病毒(如果不能表達(dá)外源多肽則不能作為載體)的受體。宿主細(xì)胞可以是“被轉(zhuǎn)染的”或“被轉(zhuǎn)化的”是指外源核酸，如修飾蛋白編碼序列，被轉(zhuǎn)移或?qū)氲剿拗骷?xì)胞內(nèi)的過程。轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括原代受體細(xì)胞及其子代細(xì)胞。

根據(jù)所要得到的結(jié)果是復(fù)制載體或是表達(dá)部分或全部載體編碼核酸序列，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，其中包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。許多細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物都可用作宿主細(xì)胞，可從美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得，這是收集和保存活體培養(yǎng)物和遺傳材料的組織(www.atcc.org)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)載體的結(jié)構(gòu)及所要得到的結(jié)果能夠確定選擇何種合適的宿主。例如，質(zhì)粒和粘?？杀粚?dǎo)入到原核宿主細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制大量的載體。作為宿主細(xì)胞用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)菌包括DH5α、JM109和KC8，以及許多商業(yè)化的細(xì)菌宿主，如感受態(tài)細(xì)胞和SOLOPACK^TM Gold細(xì)胞(公司，加州拉霍亞)(La Jolla，Calif.)。另外，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌LE392也可以作為宿主細(xì)胞復(fù)制噬菌體。合適的酵母細(xì)胞包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。

用于復(fù)制和/或表達(dá)載體的真核宿主細(xì)胞的例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。各種類型的細(xì)胞和生物來源的宿主細(xì)胞都可以得到，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。同樣，病毒載體可用于真核宿主細(xì)胞，也可用于原核宿主細(xì)胞，特別是能復(fù)制或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

某些載體可包含調(diào)控序列以使其既可以在原核細(xì)胞，又可以在真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還了解培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞并使其中的載體復(fù)制的條件。還清楚和了解大規(guī)模制備載體以及載體編碼的核酸及其同源多肽、蛋白或肽的技術(shù)和條件。

E.基因轉(zhuǎn)移方法

適于核酸轉(zhuǎn)移以表達(dá)本發(fā)明的組合物的方法被認(rèn)為可以包括能將核酸(如DNA，包括病毒載體和非病毒載體)導(dǎo)入到細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的任何方法，如本文所描述的和本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法。這些方法包括而不限于通過注射(美國專利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，本文已納入作為參考)、包括顯微注射(Harland和Weintraub，1985；美國專利5,789,215，本文已納入作為參考)；電穿孔(美國專利5,384,253，本文已納入作為參考)；鈣磷酸鹽沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；DEAE-葡聚糖、然后用聚乙二醇(Gopal，1985)；直接的聲波負(fù)載(Fechheimer等，1987)；脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)；微發(fā)射炮擊(PCT專利申請(qǐng)WO 94/09699和95/06128；美國專利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，本文已納入作為參考)；碳化硅纖維攪拌(Kaeppler等，1990；美國專利5,302,523和5,464,765，本文已納入作為參考)；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利5,591,616和5,563,055，本文已納入作為參考)；或PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993；美國專利4,684,611和4,952,500，本文已納入作為參考)；脫水/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等，1985)直接轉(zhuǎn)移基因。通過使用這些技術(shù)，細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或生物體可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

F.脂質(zhì)組分和部分

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含與核酸、氨基酸分子如肽或其他小分子化合物相連接的一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)的組合物。在本文所討論的所有實(shí)施方案中，分子既可以是痘病毒多肽或痘病毒多肽調(diào)節(jié)因子，如編碼全長或部分痘病毒多肽的核酸，也可以是編碼全長或部分痘病毒多肽調(diào)節(jié)因子的氨基酸分子。脂質(zhì)是不溶于水、能用有機(jī)溶劑提取的物質(zhì)。本文所特別指出的化合物以外的化合物可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解為脂質(zhì)，也包括在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi)。脂質(zhì)成分和非脂質(zhì)成分可通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵彼此結(jié)合。

脂質(zhì)可以是天然的，也可以是人工合成的(即人工設(shè)計(jì)并制備的)。但是，脂質(zhì)通常是一種生物物質(zhì)。生物脂質(zhì)是本領(lǐng)域所熟知的，包括中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜烯、溶血脂質(zhì)(lysolipids)、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、含有醚和酯連接脂肪酸的脂質(zhì)、可聚合的脂質(zhì)、以及上述脂質(zhì)的組合物。

與脂質(zhì)相關(guān)的核酸分子或氨基酸分子、如肽可被分散在含脂質(zhì)溶液中、用脂質(zhì)溶解、乳化、混合、與脂質(zhì)連接、共價(jià)結(jié)合、以懸液的形式懸浮于脂質(zhì)中、以及以其他方式與脂質(zhì)相聯(lián)系。脂質(zhì)或脂質(zhì)/本發(fā)明的痘病毒相關(guān)組合物并不局限于任何特定結(jié)構(gòu)的分子。例如，可以簡單地分散在溶液中，可能形成不同大小和形狀的凝集物。在其他的例子中，可以雙層的結(jié)構(gòu)存在，如微膠?；蛭莸慕Y(jié)構(gòu)。在其他的非限定性例子中，也可以考慮lipofectamine(吉布科公司(Gibco BRL))-痘病毒或Superfect(凱杰公司(Qiagen))-痘病毒復(fù)合物。

在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)組合物可以包含約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約31％、約32％、約33％、約34％、約35％、約36％、約37％、約38％、約39％、約40％、約41％、約42％、約43％、約44％、約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％、約51％、約52％、約53％、約54％、約55％、約56％、約57％、約58％、約59％、約60％、約61％、約62％、約63％、約64％、約65％、約66％、約67％、約68％、約69％、約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％或上述數(shù)值之間任何范圍的特定脂質(zhì)、脂類或非脂質(zhì)組分，如藥物、蛋白、糖、核酸或本文所描述的以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他物質(zhì)。在一個(gè)非限定性例子中，脂質(zhì)組合物包含約10％到20％中性脂質(zhì)、約33％到34％的腦苷脂和約1％的膽固醇。在另一個(gè)非限定性例子中，脂質(zhì)體包含約4％到12％的萜烯，其中約1％的微膠粒是番茄紅素，另外約有3％到11％的脂質(zhì)體包含其他萜烯；約10％到35％的磷脂酰膽堿以及約1％的藥物。因此，需要說明的是本發(fā)明的組合物包含任何組合或任何百分比的脂質(zhì)、脂類或其他組分。

IV.藥物制劑、遞送和治療方案

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種通過給予經(jīng)修飾的痘病毒，如痘苗病毒治療過度增殖性疾病、如癌癥的方法。可用該方法治療的腫瘤包括肝癌、肺癌、頭頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺內(nèi)的癌前病變、結(jié)腸癌、黑色素瘤、膀胱癌以及可被治療的其他癌或腫瘤。

本文中藥物組合物的有效量是指足以誘導(dǎo)溶瘤、破壞或裂解癌細(xì)胞，減緩、抑制或減少腫瘤生長或大小，包括在某些情況下根治腫瘤的用量。有效量也包括導(dǎo)致治療性病毒全身性間接播散到腫瘤如感染非注射腫瘤的用量。

患者最好具有適當(dāng)?shù)墓撬韫δ?定義為外周粒細(xì)胞絕對(duì)值>2,000/mm³，血小板絕對(duì)值為100,000/mm³)、適當(dāng)?shù)母喂δ?膽紅素<1.5mg/dl)和適當(dāng)?shù)哪I功能(肌氨酸酐<1.5mg/dl)。

A.給藥

利用本發(fā)明的方法和組合物誘導(dǎo)溶瘤時(shí)，使腫瘤與表達(dá)GM-CSF的痘病毒接觸。給藥途徑可視損傷的部位及損傷的性質(zhì)而不同，包括例如皮內(nèi)、透皮、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、局部(如在腫瘤附近給藥，尤其是利用腫瘤血管或臨近腫瘤的血管)、經(jīng)皮、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、膀胱內(nèi)、瘤內(nèi)、吸入、灌注、灌洗或口服等給藥途徑和制劑。

對(duì)于不連續(xù)的易接近的實(shí)體瘤來說，采用瘤內(nèi)注射或直接注射到腫瘤血管內(nèi)的方式給藥是特別合適的。局部、區(qū)域或系統(tǒng)給藥也可以采用。對(duì)于>4cm的腫瘤來說，注射的量約為4-10ml(優(yōu)選10ml)，而對(duì)于<4cm的腫瘤來說，注射的量約為1-3ml(優(yōu)選3ml)。多點(diǎn)注射給藥時(shí)單次劑量包含約0.1-0.5ml的體積。對(duì)于病毒顆粒來說最好通過多點(diǎn)注射來給藥，點(diǎn)與點(diǎn)之間的間隔約1cm。

在進(jìn)行手術(shù)干預(yù)的情況下，本發(fā)明可作為術(shù)前措施使無法進(jìn)行手術(shù)的腫瘤變成可被切除的腫瘤。

在合適的情況下可進(jìn)行連續(xù)給藥，例如在腫瘤中或腫瘤血管中植入導(dǎo)管。這種連續(xù)給藥可持續(xù)約1-2小時(shí)到2-6小時(shí)、約6-12小時(shí)、約12-24小時(shí)、約1-2天、約1-2周或更長時(shí)間。一般來說，通過持續(xù)灌注方式所給予的治療性組合物的劑量與單點(diǎn)注射或多點(diǎn)注射所給予的劑量等價(jià)，并且在灌注期間可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。還需要說明的是四肢灌注方式也可用于給予本發(fā)明的治療性組合物，尤其是用于治療黑色素瘤和肉瘤時(shí)。

治療方案可以不同，要根據(jù)腫瘤的類型、腫瘤的部位、疾病的進(jìn)展情況以及患者的健康狀況和年齡而定。顯然，某些類型的腫瘤需要更積極的治療措施，而同時(shí)某些患者可能無法耐受較繁重的治療過程。臨床醫(yī)生最適宜根據(jù)治療性制劑的效力和毒性(如果有)來作決定。

在某些實(shí)施方案中，被處理的腫瘤可能是無法被切除的，或者至少最初是無法被切除的。通過治療性病毒構(gòu)建體的處理可能能夠提高腫瘤的可切除性，可能由于腫瘤的邊界發(fā)生皺縮，或者由于去除了腫瘤某些侵入的部分。經(jīng)過處理后就可能能夠切除了。切除后可進(jìn)一步采用其他處理措施來消除腫瘤部位殘存的微小腫瘤組織。

治療方案包括不同的“單位劑量”。單位劑量定義為預(yù)先確定的治療性組合物的量。藥物使用劑量、給藥途徑和劑型的選擇是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。單位劑量并不一定只通過一次注射來完成，也可以在一定的期間內(nèi)持續(xù)輸注。本發(fā)明的單位劑量為了方便用病毒構(gòu)建體的噬菌斑形成單位(pfu)來表示。單位劑量范圍為10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹，10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³pfu以及更高。另外，根據(jù)病毒種類及其可得到的滴度不同，可給予腫瘤或腫瘤位點(diǎn)1-100、10-50、100-1000、或者高達(dá)或至少約1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、或1×10¹⁵或更多的有感染性的病毒顆粒(vp)，包括其間所有值和范圍。

B.可注射的組合物和制劑

本發(fā)明中將編碼全長或部分痘病毒基因組的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到腫瘤或腫瘤細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)選方法是通過瘤內(nèi)注射。但是，本文所描述的藥物組合物也可以通過其他方式給藥，如通過胃腸外、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、透皮、甚至腹腔內(nèi)途徑給藥，如美國專利5,543,158、5,641,515和5,399,363所描述(本文都已完整納入作為參考)。

核酸構(gòu)建體可用注射器或其他任何可注射溶液的方法注射，只要表達(dá)構(gòu)建體能夠通過特定孔徑的注射針頭就可以。最近所描述的一種無針注射系統(tǒng)(美國專利5,846,233)含有一個(gè)安裝在安瓿腔內(nèi)的噴嘴用于吸取溶液，一個(gè)動(dòng)力裝置用于將液體推出噴嘴轉(zhuǎn)移到遞送部位。在基因治療中也可以用注射器系統(tǒng)將預(yù)先確定的精確量的溶液以任意深度注射到多個(gè)部位(美國專利5,846,225)。

活性化合物的游離堿溶液或藥用鹽溶液可通過在水中與適宜的表面活性劑，如羥丙基纖維素混合而制備。分散劑可用甘油、液體聚乙烯甘油或其混合物、或油來制備。在普通儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑都要加入防腐劑以阻止微生物的生長。適于注射的藥用制劑包括無菌水溶液或分散劑，以及在使用前可臨時(shí)制備成無菌注射溶液或分散劑的粉末(美國專利5,466,468，本文已完整納入作為參考)。無論何種情況，制劑都必須是無菌的，并且其流動(dòng)性要足以能夠通過注射器。在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，并且要防止微生物，如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙烯甘油等)、上述物質(zhì)的適當(dāng)混合物和/或植物油的溶劑或分散介質(zhì)。可以通過包被，如卵磷脂，使顆粒在分散劑中保持所需的直徑以及通過使用表面活性劑使制劑維持合適的流動(dòng)性?？赏ㄟ^加入各種抗細(xì)菌和抗真菌物質(zhì)，如對(duì)羥基苯甲酸酯類(parabens)、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等來防止微生物的生長。在許多情況下，加入一些等滲物質(zhì)，如糖或氯化鈉是優(yōu)選的?？赏ㄟ^在組合物中加入吸收延遲物質(zhì)，如單硬脂酸鋁和明膠使可注射組合物的吸收緩慢。

對(duì)于通過胃腸外途徑給藥的水溶液來說，如果需要溶液應(yīng)是緩沖的，液體稀釋劑應(yīng)首先用足量的鹽或糖調(diào)節(jié)成等滲的。這些水溶液特別適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)和腹腔內(nèi)給藥。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本說明書的描述可以選擇應(yīng)用這種水溶液所需要的無菌水溶劑。例如，一個(gè)劑量的藥物可溶解到1ml等滲的氯化鈉溶液中，然后添加到1000ml皮下補(bǔ)液溶液中或注射到輸注的適當(dāng)部位(見《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第15版，1035-1038頁和1570-1580頁)。要根據(jù)被治療的個(gè)體的情況來調(diào)整劑量。不論在任何情況下都負(fù)責(zé)給藥的人來確定不同個(gè)體所需要的合適劑量。而且對(duì)于給人給藥來說，制劑必須符合FDA生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室所制定的無菌、熱源、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。

無菌注射液可通過使溶于合適溶劑中的所需量的活性化合物與上述各種其他組分混合、然后通過過濾除菌來制備。一般來說，分散劑可通過將各種無菌活性成分加入到含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需要的上述各種其他組分的無菌載體內(nèi)而制備。如果是用于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，該技術(shù)可從上述過濾除菌的溶液中制備出活性成分和其他所需成分的粉末。

本文所描述的組合物可制備成中性制劑和鹽制劑。藥用鹽包括酸加鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成的鹽)，可用無機(jī)酸制備，如鹽酸和磷酸，也可以用有機(jī)酸制備，如乙酸、醋漿草酸、酒石酸、扁桃酸等。與游離羧基形成的鹽也可以來源于無機(jī)堿，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣和氫氧化鐵，或者有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組胺、普如卡因等。制成制劑以后，溶液就可以以劑型相配的方式、以治療有效量給予。各種劑型都可以很容易地給藥，如可注射溶液、緩釋膠囊等。

本文所用的術(shù)語“載體”包含各種溶劑、分散介質(zhì)、載體、包被物、稀釋劑、抗細(xì)菌和抗真菌藥物、等滲和吸收延遲物質(zhì)、緩沖液、載體溶液、懸液、膠體等。利用這種介質(zhì)和試劑制備藥用活性物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域所熟知的。除了那些與活性組分不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑以外，其在治療性組合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明所涉及的。補(bǔ)充的活性組分也可以添加到組合物中。

術(shù)語“藥用的”是指給予人體后不會(huì)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)或類似不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。含有蛋白性活性組分的水性組合物的制備方法是本領(lǐng)域所熟知的。一般來說，這種組合物應(yīng)制備成可注射的溶液或懸液，或者在注射前可制備成溶液或懸液的固體形式。

C.聯(lián)合治療

本發(fā)明的化合物和方法可用于治療過度增殖性疾病，其中包括癌癥。為了提高本發(fā)明的組合物，如表達(dá)GM-CSF的痘苗病毒的治療效率，這些組合物可與其他能有效治療這些疾病的藥物聯(lián)合使用。例如，腫瘤可用本發(fā)明的治療性化合物聯(lián)合其他的腫瘤治療措施來治療，如抗癌藥或手術(shù)。

各種聯(lián)合治療措施都可以使用；例如，痘病毒如痘苗病毒是“A”，第二種抗癌措施是“B”：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

將本發(fā)明的痘病毒/痘苗病毒載體給予患者可按照第二種治療措施的通用方法進(jìn)行，并且需要考慮痘病毒治療措施的毒性。如果需要，可重復(fù)進(jìn)行幾個(gè)治療周期。還需要說明的是，各種標(biāo)準(zhǔn)的治療措施以及手術(shù)干預(yù)都可以和本文所描述的癌癥或腫瘤治療措施聯(lián)合使用。

“抗癌”藥是對(duì)生物體內(nèi)的腫瘤能產(chǎn)生消極影響的藥物，如殺傷癌細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的調(diào)亡、降低癌細(xì)胞的生長速度、抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)生或轉(zhuǎn)移的數(shù)目、縮小腫瘤、抑制腫瘤的生長、減少腫瘤或癌細(xì)胞的血供、激發(fā)抗癌細(xì)胞或腫瘤的免疫反應(yīng)、阻止或抑制腫瘤的發(fā)展、或者延長癌癥患者的生存期。抗癌藥包括生物藥(生物治療)、化療藥和放療藥。最常見的情況是這些組合物各以有效量聯(lián)合使用以殺傷或抑制細(xì)胞的增殖。這個(gè)過程包括細(xì)胞與表達(dá)構(gòu)建體和藥物或多個(gè)因子同時(shí)接觸。這可以通過使細(xì)胞與一種包含兩種藥物的組合物或藥用制劑接觸，或者使細(xì)胞與兩種不同的組合物或制劑同時(shí)接觸，其中一種組合物含表達(dá)構(gòu)建體，另一種組合物含第二藥物。

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥和放療藥耐受是臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域遇到的一個(gè)主要問題。目前癌癥研究的一個(gè)目標(biāo)就是通過結(jié)合基因治療找到提高化療和放療療效的方法。例如，單純皰疹病毒-胸苷激酶(HS-tK)基因用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到腦腫瘤內(nèi)后可成功地誘導(dǎo)出腫瘤對(duì)抗病毒藥物更昔洛韋的敏感性(Culver等，1992)。在本發(fā)明中，除了其他一些前調(diào)亡調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之外，痘病毒治療同樣可聯(lián)合化療、放療、免疫治療以及其他生物干預(yù)措施。

另外，痘病毒治療可在其他藥物治療前或治療后數(shù)分鐘到數(shù)周內(nèi)進(jìn)行。在其他藥物和痘病毒分別給予細(xì)胞的實(shí)施方案中，兩種治療措施實(shí)施的時(shí)間間隔一般不能太長，這樣才能保證藥物和痘病毒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在這種情況下，兩種治療措施最好在約12-24小時(shí)內(nèi)分別給予細(xì)胞，更優(yōu)選的是在6到12小時(shí)內(nèi)。但是在某些情況下，人們希望將治療的間隔時(shí)間延長，比如不同的治療措施之間間隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7)到數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

1.化療

癌癥的治療措施還包括與化療和放療聯(lián)合的各種治療措施。例如，聯(lián)合化療包括順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝脲、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、普里克霉素(plicomycin)、絲裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合藥、紫杉醇、吉西他濱、新霉酰胺、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉑、5-氟尿嘧啶、長春新堿、長春花堿、氨甲蝶呤、太麻米德(Temazolomide)(DTIC的液態(tài)形似)、或上述藥物的類似物或衍生物?；熕幣c生物治療聯(lián)合被稱為生物化療。

2.放療

可引起DNA損傷并被廣泛應(yīng)用的其他因素包括大家所熟知的γ射線、X射線和/或直接給予腫瘤細(xì)胞放射性同位素。本發(fā)明涉及的其他形式的DNA損傷因子還包括微波和紫外線輻射。最可能的情況是所有這些因子都可以對(duì)DNA、DNA的前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)、染色體的裝配和維持造成廣泛的損傷。X射線的使用劑量范圍為每日50-200倫琴持續(xù)一段時(shí)間(3到4周)到單次劑量2000-6000倫琴。放射性同位素的劑量使用范圍很寬，要根據(jù)放射性同位素的半衰期、所激發(fā)的輻射的強(qiáng)度和類型以及腫瘤細(xì)胞的攝取量而定。

術(shù)語“接觸”和“暴露于”在本文中用于細(xì)胞時(shí)是指治療性構(gòu)建體和化療或放療藥轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞或者與靶細(xì)胞直接并排放置的過程。為了達(dá)到殺死細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長的目的，兩種治療措施都要以有效量給予細(xì)胞以便于殺死細(xì)胞或阻止其分裂。

3.免疫治療

一般來說，免疫治療依賴于利用免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子靶向并摧毀癌細(xì)胞。例如，免疫效應(yīng)因子可以是腫瘤細(xì)胞表面某些標(biāo)記物特異性的抗體?？贵w本身可以單獨(dú)作為治療效應(yīng)因子或者可以激活其他細(xì)胞來影響細(xì)胞的殺傷?？贵w也可以被連接到藥物或毒素(化療藥物、放射性核苷酸、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)上，只作為一種靶向性藥物。另外，效應(yīng)因子可以是攜帶能與腫瘤細(xì)胞靶位直接或間接相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞。聯(lián)合治療，即直接的細(xì)胞毒活性和某種痘病毒多肽的抑制或降低活性可以為癌癥的治療提供有益的幫助。

免疫治療還可以作為聯(lián)合治療的一部分。聯(lián)合治療的常用方法將在下面討論。在免疫治療的一個(gè)方面，腫瘤細(xì)胞必須攜帶可作為靶位的某種標(biāo)記，即在其他大多數(shù)細(xì)胞上不存在的標(biāo)記。腫瘤細(xì)胞上存在多種標(biāo)記物，這些標(biāo)記物都可以作為本發(fā)明的適宜靶位。常見的腫瘤標(biāo)記物包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿系統(tǒng)腫瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erb B和p155。免疫治療的另一個(gè)方面涉及利用免疫刺激效應(yīng)產(chǎn)生抗癌效應(yīng)。免疫刺激分子包括：細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、IFNγ，趨化因子如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生長因子如FLT3配基。聯(lián)合使用免疫刺激分子，無論是以蛋白的形式，還是腫瘤抑制因子如mda-7的基因轉(zhuǎn)移，都可以增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)(Ju等，2000)。

正如以前所討論的，目前正在研究或正在應(yīng)用的免疫治療措施有免疫佐劑(如牛型結(jié)核菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美國專利5,801,005；美國專利5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)、細(xì)胞因子治療(如干擾素α、β和γ；IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)、基因治療(如TNF，IL-1，IL-2，p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美國專利5,830,880和5,846,945)以及單克隆抗體(如抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM2，抗HER-2，抗-p185)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美國專利5,824,311)。赫賽汀(Herceptin)(曲妥單抗)是一種嵌合的(鼠-人)單克隆抗體，能夠阻斷HER2-neu受體。它具有抗腫瘤活性，已被批準(zhǔn)用于治療惡性腫瘤(Dillman，1999)。赫賽汀和化療藥物聯(lián)合治療癌癥已被證明比單獨(dú)的治療措施更有效。

因此，本發(fā)明涉及利用一種或多種抗癌治療措施與本文所描述的痘病毒相關(guān)治療方法聯(lián)合使用以治療腫瘤的方法。

被動(dòng)免疫治療

現(xiàn)在已經(jīng)有許多治療癌癥的被動(dòng)免疫療法。大致可以分為以下幾類：單獨(dú)注射抗體；注射連接有毒素或化療藥的抗體；注射連接有放射性同位素的抗體；注射抗獨(dú)特型抗體；以及凈化骨髓中的腫瘤細(xì)胞。

被動(dòng)免疫治療優(yōu)選人源單克隆抗體，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨颊唧w內(nèi)的毒副作用很低或沒有。人源化和嵌合單克隆抗體也成功用于癌癥治療。用作癌癥治療劑的單克隆抗體包括依決洛單抗(edrecolomab)、利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、吉姆單抗(gemtuzumab)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、托西莫單抗(tositumomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)和帕尼單抗(panitumamab)。

較好的是給予一種以上的抗兩種不同抗原的單克隆抗體，甚至多種抗原的抗體。治療方法還包括給予淋巴因子(lympholine)或其他免疫增強(qiáng)劑，如Bajorin等，(1988)的描述。有關(guān)人源單克隆抗體的研究進(jìn)展會(huì)在本說明書的其他部分作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

主動(dòng)免疫治療

主動(dòng)免疫治療給予的是抗原性肽、多肽或蛋白質(zhì)，或者自身的或同種異體的腫瘤細(xì)胞組合物或“疫苗”，一般需要和不同的細(xì)菌佐劑聯(lián)合使用(Ravindranath和Morton，1991；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。對(duì)于黑色素瘤的免疫治療來說，那些激發(fā)出高滴度IgM反應(yīng)的患者通常比未激發(fā)出或激發(fā)的IgM抗體滴度比較低的患者生存率更高(Morton等，1992)。IgM抗體一般都是瞬時(shí)抗體，但是抗神經(jīng)節(jié)苷脂和抗糖類的抗體好像是例外。

獲得性免疫治療

獲得性免疫治療是指在體外分離出患者血液中的淋巴細(xì)胞或腫瘤侵潤淋巴細(xì)胞，在體外用淋巴因子如IL-2活化或者轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤壞死基因，然后再輸注到患者體內(nèi)(Rosenberg等，1988；1989)。為達(dá)到這個(gè)目的，需要給動(dòng)物或患者給予免疫有效量的活化的淋巴細(xì)胞和本文所描述的含佐劑的抗原肽組合物?；罨牧馨图?xì)胞最好是患者自身的易于從血液或腫瘤標(biāo)本中分離并在體外被活化(或“擴(kuò)增”)的細(xì)胞。這種形式的免疫治療已對(duì)幾例黑色素瘤和腎癌產(chǎn)生了抑制作用，但是發(fā)生反應(yīng)的患者比未發(fā)生反應(yīng)的患者明顯要少。

4.基因

在另外一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療措施是基因治療，其中治療性多核苷酸在給予減毒痘病毒之前、之后或同時(shí)給予。痘病毒與編碼下列基因產(chǎn)物之一的載體一起遞送可對(duì)靶組織產(chǎn)生聯(lián)合的抗癌效應(yīng)。另外，痘病毒可改造成含治療性多核苷酸的病毒載體。本發(fā)明包含多種蛋白質(zhì)，其中一些將在下文描述。表7列舉了本發(fā)明所涉及的可作為基因治療靶位的各種基因。

細(xì)胞增殖誘導(dǎo)因子

誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)根據(jù)功能的不同可分為不同的類型。這些蛋白質(zhì)的一個(gè)共同點(diǎn)就是其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的能力。例如，一種形式的PDGF，sis癌基因，就是一種分泌型的生長因子。癌基因很少來源于編碼生長因子的基因，到目前為止，sis是唯一已知的天然癌基因生長因子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種特殊的細(xì)胞增殖誘導(dǎo)因子的反義mRNA被用于阻止該細(xì)胞增殖誘導(dǎo)因子的表達(dá)。

蛋白質(zhì)FMS、ErbA、ErbB和neu是生長因子受體。這些受體的突變可導(dǎo)致其調(diào)節(jié)功能的喪失。例如，Neu受體蛋白跨膜區(qū)的一個(gè)點(diǎn)突變可導(dǎo)致neu癌基因的產(chǎn)生。ErbA癌基因來源于甲狀腺激素的胞內(nèi)受體。被修飾的癌基因ErbA受體被認(rèn)為可與內(nèi)源性的甲狀腺激素受體競(jìng)爭，引起增殖失控。

最大的一類癌基因包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(如Src、Abl和Ras)。Src蛋白是胞漿蛋白酪氨酸激酶，在某些情況下它可以從原癌基因轉(zhuǎn)化成癌基因，這是其酪氨酸殘基527突變的結(jié)果。相反，在一個(gè)例子中，GTP酶蛋白ras從原癌基因轉(zhuǎn)化成癌基因是其序列上的12位氨基酸從纈氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸的結(jié)果，這種突變可導(dǎo)致ras的GTP酶活性下降。

蛋白Jun、Fos和Myc可作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)核功能直接產(chǎn)生影響。

細(xì)胞增殖的抑制因子

腫瘤抑制癌基因的功能是抑制過度的細(xì)胞增殖。這些基因的滅活可使其抑制活性喪失，結(jié)果導(dǎo)致增殖失控。下面將要描述腫瘤抑制因子p53、p16和C-CAM。

除了上面所描述的p53之外，另外一個(gè)細(xì)胞增殖抑制因子是p16。真核細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換主要被細(xì)胞周期素依賴的激酶或CDK激發(fā)。一種CDK，細(xì)胞周期素依賴的激酶4(CDK4)可調(diào)節(jié)細(xì)胞通過G₁期。這個(gè)酶的活性可在G₁晚期使Rb磷酸化。CDK4的活性受活化亞單位－D型周期素和抑制亞單位－p16^INK4的調(diào)節(jié)，這兩個(gè)亞單位是能夠特異性結(jié)合并抑制CDK的蛋白質(zhì)，因此可以調(diào)節(jié)Rb的磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。由于p16^INK4蛋白是CDK4的抑制因子(Serrano，1993)，因此這個(gè)基因的缺失可使CDK的活性升高，導(dǎo)致Rb蛋白的過度磷酸化。已知p16還可以調(diào)節(jié)CDK6的功能。

p16^INK4屬于新發(fā)現(xiàn)的一類CDK-蛋白，該類CDK蛋白還包括p16^B、p19、p21、WAF1和p27^KIP1。p16^INK4基因位于染色體上的9p21區(qū)，這是一個(gè)多種類型的腫瘤經(jīng)常發(fā)生缺失的染色體區(qū)。p16^INK4基因在人源腫瘤細(xì)胞系中常常發(fā)生純合的缺失和突變。這些現(xiàn)象說明p16^INK4基因是一種腫瘤抑制基因。但是這種解釋受到了挑戰(zhàn)，因?yàn)橐呀?jīng)觀察到p16^INK4基因在原發(fā)的未經(jīng)培養(yǎng)的腫瘤中發(fā)生突變的幾率比培養(yǎng)的細(xì)胞要低的多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1994；Orlow等，1994；Arap等，1995)。通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)載體恢復(fù)野生型p16^INK4的功能可降低某些人源癌細(xì)胞系的克隆形成能力(Okamoto，1994；Arap，1995)。

可用于本發(fā)明的其他基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合蛋白、p21/p27融合蛋白、抗血栓基因(如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、參與血管形成的基因(如VEGF、FGF、血小板凝血酶敏感蛋白、BAI-1、GDAIF或其受體)和MCC。

細(xì)胞調(diào)亡調(diào)節(jié)因子

調(diào)亡或程序性細(xì)胞死亡是正常胚胎發(fā)育、維持成年組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、以及抑制腫瘤形成的一個(gè)基本過程(Kerr等，1972)。Bcl-2家族的蛋白和ICE樣蛋白酶已被證明在其他系統(tǒng)中是重要的調(diào)節(jié)因子和調(diào)亡效應(yīng)因子。Bcl-2蛋白是一種與濾泡淋巴瘤有關(guān)的蛋白，在受到不同調(diào)亡刺激信號(hào)后在控制調(diào)亡和增加細(xì)胞的存活中扮演主要角色(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到進(jìn)化保守的Bcl-2蛋白是相關(guān)蛋白家族的一個(gè)成員，這個(gè)家族可被分類為死亡激動(dòng)劑或死亡拮抗劑。

Bcl-2被發(fā)現(xiàn)以后被證明可抑制各種刺激信號(hào)所激發(fā)的細(xì)胞死亡?，F(xiàn)在已經(jīng)清楚Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白家族具有相似的結(jié)構(gòu)和序列同源性。這個(gè)家族的不同成員或者具有與Bcl-2相同的功能(如Bcl_XL、Bcl_W、Bcl_S、Mcl-1、A1、Bfl-1)，或者與Bcl-2的功能相反，可促進(jìn)細(xì)胞的死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Haraliri)。

手術(shù)

大約60％的癌癥患者都做過不同類型的手術(shù)，其中包括為了預(yù)防、診斷或分期、治愈和緩解的目的而進(jìn)行的手術(shù)。以治愈為目的的手術(shù)可結(jié)合其他治療措施，如本發(fā)明的治療措施、化療、放療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其他治療方法。

以治愈為目的的手術(shù)包括切除腫瘤，其中癌組織的全部或部分被物理去除、切掉和/或毀壞。腫瘤切除是指通過物理方法至少去除腫瘤的一部分。除了切除腫瘤以外，手術(shù)治療措施還包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電手術(shù)和顯微手術(shù)(Mohs手術(shù))。本發(fā)明還可用于配合淺表癌、癌前病變或少量正常組織的去除。

全部或部分癌細(xì)胞、癌組織或腫瘤被切除以后，在體內(nèi)可能會(huì)形成空腔。本發(fā)明的治療措施可通過灌注、直接注射或局部使用來實(shí)施，并配合以其他的抗癌治療措施。這種治療措施可重復(fù)進(jìn)行，如每1、2、3、4、5、6或7天、每1、2、3、4和5周、每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12月進(jìn)行一次。這種治療措施還可以選擇不同劑量。

其他藥劑

其他藥劑也可與本發(fā)明聯(lián)合使用以改善治療的效果。這些其他藥劑包括免疫調(diào)節(jié)劑、影響細(xì)胞表面受體和GAP連接表達(dá)上調(diào)的藥劑、細(xì)胞增殖抑制和分化劑、細(xì)胞粘附抑制劑、增加過度增殖細(xì)胞對(duì)調(diào)亡誘導(dǎo)因子敏感性的藥劑以及其他生物劑。

免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β和γ；IL-2及其他細(xì)胞因子；F42K及其他細(xì)胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES及其他趨化因子。細(xì)胞表面受體或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配基)的表達(dá)上調(diào)可通過其對(duì)過度增殖細(xì)胞的自分泌或旁分泌效應(yīng)提高本發(fā)明的調(diào)亡誘導(dǎo)能力。提高增加GAP連接的數(shù)目增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)水平可提高對(duì)臨近過度增殖細(xì)胞群的抗過度增殖效應(yīng)。在其他的實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖抑制和分化因子可與本發(fā)明聯(lián)合使用以改善本發(fā)明的抗過度增殖效應(yīng)。細(xì)胞粘附抑制因子也可以提高本發(fā)明的療效。細(xì)胞粘附抑制因子的例子有病灶粘附激酶(FAK)抑制因子和洛伐他汀。本發(fā)明還包括能提高過度增殖細(xì)胞對(duì)調(diào)亡的敏感性的其他因子，如抗體c225，這些因子也可與本發(fā)明聯(lián)合以改善治療的效果。

Apo2配基(Apo2L，也叫TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)細(xì)胞因子家族的一個(gè)成員。TRAIL可激活多種類型的癌細(xì)胞發(fā)生快速調(diào)亡，但是對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性。各種組織中都有TRAIL mRNA。大多數(shù)正常細(xì)胞對(duì)TRAIL的細(xì)胞毒活性耐受，說明存在保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生TRAIL誘導(dǎo)的調(diào)亡的機(jī)制。TRAIL的第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的受體被稱為死亡受體4(DR4)，含有胞漿“死亡域”；DR4可轉(zhuǎn)導(dǎo)TRAIL攜帶的調(diào)亡信號(hào)。其他可結(jié)合TRAIL的受體也被鑒定出來。其中一個(gè)受體被稱為DR5，含有一個(gè)與DR4非常相似的死亡域和調(diào)亡信號(hào)。

DR4和DR5mRNA在多種正常組織和腫瘤細(xì)胞系內(nèi)都有表達(dá)。最近，誘騙受體如DcR1和DcR2被證明可通過DR4和DR5阻止TRAIL誘導(dǎo)的調(diào)亡。因此，這些誘騙受體代表了一種新型的對(duì)前調(diào)亡細(xì)胞因子在細(xì)胞表面的直接調(diào)節(jié)敏感性的機(jī)制。這些抑制性受體在正常組織內(nèi)優(yōu)先表達(dá)說明TRAIL可作為抑制抗癌因子誘導(dǎo)癌細(xì)胞的調(diào)亡，而對(duì)正常細(xì)胞起保護(hù)作用(Marsters等，1999)。

利用細(xì)胞毒性化療藥物進(jìn)行腫瘤的治療取得了很多成功，但是，化療的后果之一就是藥物耐藥表型的出現(xiàn)/獲得以及多藥耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)依然是治療這類腫瘤所遇到的主要問題，因此需要采用其他的方法，如基因治療。

可與化療、放療或生物治療聯(lián)合應(yīng)用的其他治療措施包括溫?zé)岑煼ǎ摲椒ㄊ菍⒒颊叩慕M織置于高溫下(可達(dá)106°F)。外部或內(nèi)部發(fā)熱裝置可用于局部、區(qū)域或全身溫?zé)嶂委?。局部溫?zé)嶂委熓侵钢粚?duì)一個(gè)小的區(qū)域加熱，如腫瘤部位。外部加熱通常是通過體外的裝置發(fā)射高頻微波靶向到腫瘤。內(nèi)部加熱是利用一個(gè)無菌的探針，如一個(gè)細(xì)的熱金屬絲或充滿熱水的中空細(xì)管、植入的微波天線或射頻電極。

患者的器官或四肢可被加熱以進(jìn)行區(qū)域治療，該療法利用能產(chǎn)生高能量的裝置進(jìn)行，如磁體。另外，可以抽出患者的一部分血液，加熱后再輸注到能內(nèi)部加熱的區(qū)域。全身溫?zé)岑煼ㄔ诎U(kuò)散到全身的情況下也可以使用。熱水套、熱蠟、感應(yīng)線圈和熱房可用于此目的。

激素療法也可與本發(fā)明或上述其他癌癥治療措施聯(lián)合使用。激素可被用于降低某些激素的表達(dá)水平或阻斷某些激素的效應(yīng)以治療某些類型的腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或?qū)m頸癌。這種療法通常與至少一種其他治療措施聯(lián)合使用，作為輔助治療措施或降低轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。表-US-00007表6癌基因來源人類疾病功能生長因子HST/KS轉(zhuǎn)染FGF家族成員INT-2MMTV啟動(dòng)子FGF家族插入成員INTI/WNTI MMTV啟動(dòng)子因子樣插入SIS猿肉瘤PDGF B病毒受體酪氨酸激酶ERBB/HER禽類擴(kuò)增的，EGF/TGF-α/紅-刪除的鱗癌雙調(diào)蛋白/囊胚(blastosis)細(xì)胞癌；β細(xì)胞素病毒(Hetacellulin virus)；ALV膠質(zhì)瘤受體啟動(dòng)子插入；擴(kuò)增的人腫瘤ERBB-2/NEU/轉(zhuǎn)染擴(kuò)增乳腺，受到來自大鼠卵巢HER-2的調(diào)控，胃NDF/成膠質(zhì)細(xì)胞瘤癌癥調(diào)蛋白和EGF-相關(guān)因子FMS SM貓科CSF-1受體肉瘤病毒KIT HZ貓科MGF/Steel肉瘤病毒受體造血TRK轉(zhuǎn)染NGF(來自人生長因子的神經(jīng))結(jié)腸癌受體MET轉(zhuǎn)染分散因子/來自人HGF受體骨肉瘤RET轉(zhuǎn)位零星甲狀腺孤兒受體和點(diǎn)癌癥；家族性Tyr突變骨髓甲狀腺激酶癌癥；多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤2A和2B ROS URII禽類孤兒受體肉瘤病毒Tyr激酶PDGF受體轉(zhuǎn)位慢性TEL(ETS樣骨髓單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄白血病因子)/PDGF受體基因融合。

V.實(shí)施例

以下實(shí)施例用于展示本發(fā)明的多種實(shí)施方式，并無意以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)該知道，可改造本發(fā)明以實(shí)現(xiàn)目的并獲得提及的結(jié)果和優(yōu)勢(shì)，以及本文所述的目的、結(jié)果和優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例以及本文所述方法代表當(dāng)前的優(yōu)選實(shí)施方式，是示例性的，無意于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可對(duì)它們及其用途在權(quán)利要求書范圍所限定的本發(fā)明構(gòu)思范圍內(nèi)進(jìn)行更改。

實(shí)施例1

肝癌的治療

A.目的

(1)測(cè)定JX-594瘤內(nèi)(IT)注射給藥的最大耐受劑量(MTD)和/或最大可行劑量(MFD)，(2)評(píng)價(jià)JX-594I.T.注射給藥的安全性，(3)評(píng)價(jià)JX-594I.T.注射給藥的復(fù)制/藥代動(dòng)力學(xué)，(4)評(píng)價(jià)I.T.注射給藥后，對(duì)JX-594和腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)(注射和非注射部位炎癥浸潤增加；中和抗體的形成；細(xì)胞因子反應(yīng)；以及腫瘤和病毒特異性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo))，(5)評(píng)價(jià)JX-594I.T.給藥在注射和非注射部位的抗腫瘤效果。

B.研究設(shè)計(jì)

這是一個(gè)I期開放式劑量遞增試驗(yàn)，對(duì)象是具有影像引導(dǎo)下可注射的淺表腫瘤結(jié)節(jié)的肝癌患者。難治性腫瘤患者接受下列劑量遞增設(shè)計(jì)中的一種進(jìn)行治療：組1：1x 10⁸pfu，組2：3x 10⁸pfu，組3：1x 10⁹pfu，組4：3x 10⁹pfu。

該試驗(yàn)的目標(biāo)治療期是15個(gè)月。編入的患者每周期接受1次治療。如果患者接受治療時(shí)沒有劑量限制性毒性(DLT)，并且目標(biāo)腫瘤沒有進(jìn)展，該患者將進(jìn)入另一周期直至總數(shù)為4個(gè)周期。如果患者的目標(biāo)腫瘤進(jìn)展，或者因?yàn)镈LT或其它原因退出，該患者將進(jìn)行研究結(jié)束訪問(End of Study Visit)，并進(jìn)入隨訪期。三周為一個(gè)周期。僅在第一個(gè)周期中觀察DLT。

一次給藥劑量可分布在三處病灶。注射病灶最大直徑的總和必須小于10cm。每一劑量水平將對(duì)三個(gè)患者進(jìn)行治療直至觀察到DLT。3名編入患者(enrollment)中若沒有發(fā)生DLT，將進(jìn)入到下一劑量水平；若3名患者中有1人發(fā)生DLT，則需編入另1名患者，直至觀察到第二例DLT發(fā)生(在此定義為毒性劑量)或直至總共6名患者均接受治療。如果組中未出現(xiàn)第二例DLT，患者進(jìn)入下一劑量水平。

若2名患者在某一劑量JX-594治療后發(fā)生DLT，則此劑量緊接著的前一劑量確定為MTD。當(dāng)未確定MTD時(shí)，最高劑量水平確定為MFD。當(dāng)MTD/MFD確定時(shí)，對(duì)另外6名患者進(jìn)行治療以獲得更多在此劑量水平下關(guān)于安全性和毒性的數(shù)據(jù)。如果組4中未發(fā)生MTD，而此前組的劑量中發(fā)生多于2/3的PR效果，則用此劑量進(jìn)行另外6名病人的臨床試驗(yàn)。

DLT定義為JX-594造成的以下任一情況：1.任一時(shí)期的4級(jí)毒性，2.3級(jí)毒性(不包括流感類似癥狀：疲勞、惡心、肌肉酸痛、發(fā)燒)持續(xù)>5天。使用美國國立癌癥研究所常見毒性標(biāo)準(zhǔn)指定本研究中發(fā)生毒性的嚴(yán)重程度。

1.對(duì)照腫瘤(非注射腫瘤)(周期1)和JX-594注射(周期2+)的決定

研究者在周期1中決定對(duì)照腫瘤位點(diǎn)。對(duì)照腫瘤應(yīng)該是清晰的腫瘤結(jié)節(jié)，位于目標(biāo)腫瘤所在肝葉之外的肝葉并且應(yīng)該在目標(biāo)腫瘤的淋巴回流之外。因此，對(duì)照腫瘤應(yīng)該獨(dú)立位于肝臟左葉或右葉。然而，如果腫瘤結(jié)節(jié)位于肝臟一側(cè)的限制內(nèi)，對(duì)照腫瘤可為JX-594的非注射腫瘤結(jié)節(jié)；然而當(dāng)腫瘤具有大范圍的單一結(jié)節(jié)時(shí)，不可確立對(duì)照腫瘤。以與JX-594治療腫瘤相同的方式評(píng)價(jià)對(duì)照腫瘤。這樣可對(duì)腫瘤生長和局部毒性/活性的對(duì)照效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

如果病人繼續(xù)進(jìn)行周期2，以周期1中目標(biāo)腫瘤相同的JX-594劑量水平注射對(duì)照腫瘤。如上所述，應(yīng)當(dāng)基于腫瘤大小使劑量成比例分布于腫瘤中。

2.非目標(biāo)(非注射)腫瘤響應(yīng)者

研究中非注射腫瘤可發(fā)生響應(yīng)；在之前此類患者的JX-594臨床I期試驗(yàn)中已報(bào)道該現(xiàn)象。了解該效應(yīng)的機(jī)理是必需的；可能性包括病毒從注射腫瘤中擴(kuò)散和/或腫瘤特異性細(xì)胞毒的誘導(dǎo)(T淋巴細(xì)胞(CTL)的腫瘤浸潤，以及后續(xù)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤破壞)。為了更好的理解這種效應(yīng)的機(jī)理，進(jìn)行下列研究。如果非注射腫瘤發(fā)生臨床響應(yīng)，與注射腫瘤在同一采集時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行核心活檢或細(xì)針穿刺(參見附錄A；非目標(biāo)腫瘤活檢總共不超過兩個(gè)位點(diǎn))。利用與獲自注射腫瘤材料所用相同的方法對(duì)非注射腫瘤樣品進(jìn)行分析。

C.病人選擇

1.入選標(biāo)準(zhǔn)

通常，患者應(yīng)當(dāng)符合下列所有標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡大于18歲，(2)臨床或組織學(xué)確認(rèn)(原發(fā)或轉(zhuǎn)移)的肝癌患者，具有影像引導(dǎo)下可注射的淺表腫瘤(最長直徑≤10cm)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)療法仍發(fā)生進(jìn)展(即對(duì)標(biāo)準(zhǔn)療法是難治性)，(3)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)治療如手術(shù)切除、動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、化療和放療，腫瘤仍然進(jìn)展，(4)卡氏行為狀態(tài)(Karnofsky Performance Status)(KPS)≥70的患者，(5)預(yù)期生存期至少16周的患者，(6)如果是性活躍患者，患者愿意在JX-594治療后3個(gè)月內(nèi)使用避孕方法，(7)患者具有了解并愿意簽署知情同意書的能力，(8)患者具有配合研究步驟以及隨訪檢驗(yàn)的能力，(9)患者具有合適的骨髓功能：WBC>3,000細(xì)胞/mm³，ANC>1,500細(xì)胞/mm³，血色素>10g/dL，血小板計(jì)數(shù)>75,000細(xì)胞/mm³，(10)患者具有合適的腎功能：血清肌酸酐<1.5mg/dL，(11)病人具有合適的肝功能：血清AST(≤2.5ULN)，ALT(≤2.5ULN)，總膽紅素(≤2.0mg/dL)；對(duì)于原發(fā)性肺癌患者，其Child-Pugh分級(jí)應(yīng)當(dāng)為A或B。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)

患者禁止出現(xiàn)任一下列排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)懷孕或哺乳嬰兒，(2)HIV患者，(3)Child-Pugh分級(jí)為C的患者；分級(jí)為A或B中患者總膽紅素>2mg/dL(當(dāng)為原發(fā)性肝癌時(shí))，(4)患者具有臨床顯著活動(dòng)的感染或被認(rèn)為對(duì)新實(shí)驗(yàn)性藥物治療具有高風(fēng)險(xiǎn)的未控制的醫(yī)學(xué)狀況(如呼吸、神經(jīng)、心血管、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng))，(5)患者顯著免疫缺陷，或家族成員具有潛在疾病和/或服藥引起的癥狀，(6)患者具有需要全身治療的濕疹的病史，(7)患者具有不穩(wěn)定的心臟疾病，包括在編入本研究中之前6個(gè)月診斷患有需要藥物治療的不穩(wěn)定心臟疾病，包括MI、不穩(wěn)定心絞痛、充血性心力衰竭、心肌炎、心率失常，以及其它任何具有臨床顯著狀況的心臟狀態(tài)，(8)患者在本研究藥物治療前4周內(nèi)接受全身性皮質(zhì)類固醇或其它任何免疫抑制藥物治療，(9)患者在編入本研究中之前4周內(nèi)接受任何其它研究性藥物研究、放療、化療或手術(shù)，(10)患者能夠但不愿出具書面知情同意書，(11)患者對(duì)本研究藥物組分過敏。

D.研究訪問步驟

觀察和測(cè)試計(jì)劃中展示了本研究步驟的匯總表。通常允許自計(jì)劃日+1/-1天的窗口，周末和假期不計(jì)入。

1.篩選訪問(第–14至0天)

這是一項(xiàng)使用病毒的臨床研究，該研究在與患者討論后進(jìn)行。任何意于參加的患者必須提供書面知情同意書。在簽署知情同意書后，每位患者在研究開始前14天內(nèi)將進(jìn)行下列評(píng)估：

臨床評(píng)估包括(1)完整的用藥和手術(shù)史，包括抗癌治療，(2)體重和生命指征(體溫、脈搏速率和血壓)，(3)體檢(全身系統(tǒng))，(4)卡氏行為評(píng)分(Karnofsky Performance Score)，(5)胸部x-射線(前后及雙側(cè))，(6)12-導(dǎo)聯(lián)ECG(加入本研究前3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行的均可接受)，(7)伴隨藥物評(píng)估(加入本研究前14天內(nèi)所有使用的藥物)。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估包括(1)常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù))，(2)血清化學(xué)；鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，(3)凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)；纖維蛋白原，(4)HIV、HBV和甲胎蛋白測(cè)試，(5)中和抗體滴度，(6)病毒基因組(Q-PCR)，(7)常規(guī)尿分析(包括顯微鏡檢)，(8)懷孕測(cè)試(對(duì)于有生育可能的婦女)，(9)在篩選測(cè)試時(shí)根據(jù)腫瘤類型進(jìn)行合適腫瘤標(biāo)記物測(cè)試(CA125、CEA、AFP、PSA、CA19-9等)，當(dāng)增加時(shí)，在每一周期的第22天進(jìn)行測(cè)試。

基于影像的腫瘤評(píng)估和測(cè)量包括腹部CT掃描測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)(最長直徑測(cè)量)；可換為第1天時(shí)CT掃描(治療前)。(病人加入本研究前2周內(nèi)完成均可接受)。

第1天(周期1-4)-應(yīng)當(dāng)注意的是在JX-594給藥前或給藥后進(jìn)行哪些評(píng)估。

第1天；治療前—臨床評(píng)估：體檢(全身系統(tǒng))，體重和生命指征(體溫，脈搏速率和血壓)，卡氏行為評(píng)分，同時(shí)治療的鑒定，目標(biāo)腫瘤的測(cè)試和評(píng)估，目標(biāo)腫瘤的測(cè)量(n＝1-3)；其它非注射腫瘤的測(cè)量，(n＝1-3)，目標(biāo)腫瘤的活檢。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：血液--1.常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，2.血清化學(xué)；鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，3凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原，4.細(xì)胞因子(包括GM-CSF)，5.中和抗體滴度，6.病毒基因組(Q-PCR)

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：其它--1.pfu尿測(cè)試，2.pfu咽拭子

研究藥物給藥-1.如第8章所述進(jìn)行JX-594給藥

第1天:治療后--1.體檢。6小時(shí)內(nèi)每小時(shí)檢測(cè)兩次生命指征(30分鐘和60分鐘時(shí))，隨后常規(guī)測(cè)量，2.在如下時(shí)間點(diǎn)抽血進(jìn)行細(xì)胞因子分析：治療后1小時(shí)和3小時(shí)，3.在如下時(shí)間點(diǎn)抽血測(cè)量循環(huán)JX-594基因組：開始給藥后10-15分鐘，25-35分鐘和4-6小時(shí)，4.治療后3-4小時(shí)測(cè)定尿液和咽拭子樣本中的病毒脫落，5.記錄副反應(yīng)和并發(fā)癥。

第3天(周期1-4)--實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：血液--1.常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，2.血清化學(xué)、鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，3凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原，4.細(xì)胞因子(包括GM-CSF)，5.中和抗體滴度，6.病毒基因組(Q-PCR)

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：其它--1.pfu尿測(cè)試，2.pfu咽拭子

臨床評(píng)估-記錄副反應(yīng)和并發(fā)癥。

基于影像的評(píng)估：臨床評(píng)估懷疑副反應(yīng)時(shí)進(jìn)行腹部CT掃描。

第5天(周期1-4)--臨床評(píng)估記錄副反應(yīng)和并發(fā)癥。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：血液--1.常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，2.血清化學(xué)、鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，3凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原，4.細(xì)胞因子(包括GM-CSF)，5.中和抗體滴度，6.病毒基因組(Q-PCR)

第8天(周期1-4)--臨床評(píng)估-體檢，CT掃描；目標(biāo)腫瘤活檢(也對(duì)至多1-2個(gè)表現(xiàn)出顯著變化，包括炎癥、壞死或縮小等的非注射腫瘤進(jìn)行活檢)。僅在周期1和2由PI主觀衡量病人狀況進(jìn)行活檢。記錄副反應(yīng)和并發(fā)癥。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：血液--1.常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，2.血清化學(xué)、鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，3凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原，4.細(xì)胞因子(包括GM-CSF)，5.中和抗體滴度，6.病毒基因組(Q-PCR)

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：其它--1.pfu尿測(cè)試，2.pfu咽拭子，3.當(dāng)發(fā)生壞死時(shí)細(xì)針穿刺壞死(僅在周期1和2時(shí)進(jìn)行)。

第15天(周期1–4)--臨床評(píng)估-體檢。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：血液--1.常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，2.血清化學(xué)、鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，3凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原，4.細(xì)胞因子(包括GM-CSF)，5.中和抗體滴度，6.病毒基因組(Q-PCR)

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：其它--1.pfu尿測(cè)試，2.pfu咽拭子

第22天(周期1-4)--臨床評(píng)估1.體檢，2.基于影像的評(píng)估：腹部CT掃描(僅在周期2和4時(shí)進(jìn)行)，3.目標(biāo)腫瘤的測(cè)量(n＝1-3)；測(cè)量其它非注射腫瘤，4.目標(biāo)腫瘤活檢(也對(duì)至多1-2個(gè)表現(xiàn)出顯著變化，包括炎癥、壞死或縮小等的非注射腫瘤進(jìn)行活檢)，5.記錄副反應(yīng)和并發(fā)癥，6.第22天當(dāng)作在后續(xù)周期前的第1天。在第22天和后續(xù)周期的第1天間可有至多1周的間隔。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：血液-1.常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，2.血清化學(xué)、鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，3凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原，4.中和抗體滴度，5.病毒基因組(Q-PCR)，6.在篩選測(cè)試時(shí)根據(jù)腫瘤類型進(jìn)行合適腫瘤標(biāo)記物測(cè)試(CA125、CEA、AFP、PSA、CA19-9等)，當(dāng)增加時(shí)，在每一周期的第22天進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：其它--1.pfu尿測(cè)試，2.pfu咽拭子

第28天或研究結(jié)束訪問-臨床評(píng)估-體檢，記錄副作用和并發(fā)癥。

實(shí)驗(yàn)室評(píng)估：血液--1.常規(guī)血液測(cè)試(包括血小板計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，2.血清化學(xué)測(cè)試：鈉、鉀、BUN、肌酸酐、ALT、AST、堿性磷酸酶、總膽紅素、LDH、鈣、磷、鎂、隨機(jī)血糖、總蛋白、清蛋白和尿酸，3.凝血測(cè)試：凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原，4.病毒基因組(Q-PCR)

周期3-4--1.在周期2第22天注射位點(diǎn)腫瘤最長直徑未顯示>25％增加的病人將進(jìn)入周期3-4，2.在周期2第22天注射位點(diǎn)腫瘤最長直徑顯示25-50％增加的病人可進(jìn)入周期3-4，3.在周期2第22天注射位點(diǎn)腫瘤最長直徑顯示>50％增加的病人將退出試驗(yàn)。

病人的隨訪和回顧—在研究結(jié)束訪問后，以常規(guī)跟蹤肝癌病人的方式對(duì)完成該臨床研究的病人進(jìn)行為期1年的隨訪跟蹤。不論哪種臨床研究，每三個(gè)月病人返回醫(yī)院并進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)存活的病人進(jìn)行常規(guī)測(cè)試如肝癌血清測(cè)試和基于影像的評(píng)估。臨床研究結(jié)束后，若確定有明顯的臨床受益，在簽訂另外的書面知情同意書后，再進(jìn)行總數(shù)多至4次的給藥。這時(shí)所有研究步驟與本研究最初4次給藥方式相同。到周期4研究結(jié)束后，直到PI判斷有顯著的臨床受益(不止是病情穩(wěn)定)，另外給予本研究藥物共計(jì)4次。這種情況下，PI應(yīng)事先與試驗(yàn)發(fā)起人討論并取得發(fā)起人的同意。所有的研究計(jì)劃與臨床研究進(jìn)行方式相同。

E.病毒復(fù)制、傳播和特殊測(cè)試

1.血漿和尿液的Q-PCR和噬斑形成單位實(shí)驗(yàn)(藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試)

用定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)測(cè)試評(píng)估傳播到血流中的病毒。為了檢測(cè)病毒是否在尿液和咽拭子中出現(xiàn)，在治療后收集樣品。

2.腫瘤活檢和細(xì)針穿刺(免疫應(yīng)答測(cè)試)

為了檢查腫瘤位點(diǎn)病毒的復(fù)制，在治療前后進(jìn)行核心活檢和細(xì)針穿刺(如果認(rèn)為是安全且簡便的)。分析這些活檢樣本，找到病毒復(fù)制、炎癥和免疫細(xì)胞浸潤、壞死和凋亡的證據(jù)。

為了獲得組織，在影像引導(dǎo)下，使用核心活檢或者使用細(xì)針穿刺活檢。但是，這些活檢有時(shí)會(huì)使病人處于緊急或危險(xiǎn)的狀況。因此當(dāng)進(jìn)行活檢獲取組織時(shí)，首先應(yīng)關(guān)注病人的安全。當(dāng)病人情況很有可能處于危險(xiǎn)時(shí)(肝囊腫瘤等)，應(yīng)該通過安全的途徑獲取組織。

如果PI判斷組織活檢(細(xì)針穿刺)有可能引起病人的危險(xiǎn)，則不進(jìn)行活檢(細(xì)針穿刺。此外，若病人安全需要，根據(jù)PI的判斷，在進(jìn)行組織活檢(細(xì)針穿刺)和/或JX-594瘤內(nèi)注射前后多至5天，病人可入院觀察。

3.細(xì)胞因子分析(免疫應(yīng)答測(cè)試)

用ELISA方法測(cè)定血清中GM-CSF、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-δ和TNF-α的濃度。

4.中和抗體實(shí)驗(yàn)(藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試)

用噬斑試驗(yàn)測(cè)定病人連續(xù)稀釋血清中JX-594中和抗體滴度的出現(xiàn)。

5.藥代動(dòng)力學(xué)采血

藥代動(dòng)力學(xué)使用小黃頭真空取血管采集3ml血液。

F.研究用藥的給藥

1.劑量、給藥和治療計(jì)劃

劑量。劑量通常如下：組1:1x 10⁸pfu、組2:3x 10⁸pfu、組3:1x 10⁹pfu、組4:3x 10⁹pfu。

給藥。JX-594可通過瘤內(nèi)注射進(jìn)行給藥。由專家醫(yī)生通過所述方式進(jìn)行瘤內(nèi)注射給藥。使用21號(hào)或更小的針頭，將相當(dāng)于約25％腫瘤總體積(1-3個(gè)腫瘤)的含病毒的溶液直接注入瘤內(nèi)。通常，注射在影像(如CT)的引導(dǎo)下進(jìn)行?？勺⑸?-3個(gè)腫瘤。每一腫瘤注射相等量的溶液。如果注射2-3個(gè)腫瘤，注入瘤內(nèi)病毒溶液的體積與該腫瘤相對(duì)其它腫瘤的體積成正比(即如果一個(gè)腫瘤是另一腫瘤的2倍，則大腫瘤將注射2/3體積的病毒溶液)。

盡管周期1中所選目標(biāo)腫瘤可能停止生長，但應(yīng)當(dāng)在所有周期中繼續(xù)注射。然而，如果必要，在周期3中，研究者還可選擇在周期1、2到3中未注射的非目標(biāo)腫瘤，包括周期1中的目標(biāo)腫瘤。注射腫瘤最大直徑的總和必須≤10cm。瘤內(nèi)注射病毒溶液的劑量與腫瘤體積成正比。

JX-594制備。JX-594以冷凍(-60℃或更低)的、含150μl病毒制劑(遞送0.1mL)的一次性玻璃瓶的形式供應(yīng)。100μl體積含有1.9x 10⁸pfu病毒。在室溫下豎直解凍小瓶。不要將JX-594放置于熱水浴中。用移液管重懸。當(dāng)稀釋并運(yùn)送至病人時(shí)，將病毒存儲(chǔ)于4℃。解凍JX-5944小時(shí)后不可注射。

高級(jí)藥師和其它指定藥師應(yīng)小心將JX-594豎直儲(chǔ)存于生物安全柜中(2級(jí))(使用手套、安全眼鏡和防護(hù)衣)。所有稀釋的起始步驟：使用注射器，取出需要量的無菌生理鹽水溶液并轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)福爾肯(falcon)管中。病毒加上稀釋液的終體積應(yīng)當(dāng)約等于目標(biāo)腫瘤體積的25％。

組1：將一(1)小瓶JX-594用于組1中的病人。用微量移液器/注射器移取處方規(guī)定體積的轉(zhuǎn)移至無菌生理鹽水溶液的JX-594。

組2：將二(2)小瓶JX-594用于組2中的病人。混合后將第一個(gè)小瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)至第二個(gè)小瓶中。用微量移液器/注射器移取處方規(guī)定體積的轉(zhuǎn)移至無菌生理鹽水溶液的JX-594。

組3和4：將四(4)或十一(11)小瓶JX-594分別用于組3或4中病人的給藥。將所有的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到混和的小聚丙烯管中。用微量移液器/注射器移取處方規(guī)定體積的轉(zhuǎn)移至無菌生理鹽水溶液的JX-594。

所有稀釋的最終步驟：于室溫下將小管用鋁箔包裹或?qū)⑵渲糜诒芄獯?。給藥前劇烈振蕩10秒。在室溫下暴露30分鐘或解凍后4小時(shí)后不可進(jìn)行注射。

治療計(jì)劃。通常編入病人每個(gè)周期接受1次治療或1個(gè)劑量的JX-594。在周期結(jié)束時(shí)，JX-594注射目標(biāo)腫瘤體積未進(jìn)展的病人將接受后續(xù)周期的治療(直到總共4個(gè)周期)。目標(biāo)腫瘤進(jìn)展的病人終止隨訪。一個(gè)周期定義為3周。可在1-3個(gè)病灶中平分劑量。注射病灶最大直徑的總和必須≤10cm。

劑量遞增。在臨床研究的劑量遞增期，每一組有2-6名病人。如果最初3名病人未經(jīng)歷DLT，研究進(jìn)入下一組。如果一個(gè)組中3名病人有一名發(fā)生DLT，繼續(xù)進(jìn)行研究直到總共編入6名病人，或者包含第一名病人的兩名病人經(jīng)歷DLT。

如果組1中6名病人中少于2名在首次注射后直至兩周經(jīng)歷DLT，研究進(jìn)入下一組。如果2名患者經(jīng)歷DLT，則此劑量緊接著的前一劑量確定為MTD。

在周期1中第1名病人首次注射后1周，編入第2名病人；編入下一名病人時(shí)應(yīng)用該原則。如果一個(gè)組中發(fā)生DLT，在對(duì)所有原來編入病人完成周期1中第1次注射后2周，開始后續(xù)編入病人的治療。在原來組的最后一名病人完成周期1中第1次注射后至少2周，病人進(jìn)入下一劑量水平的組。

如果組1中超過2名病人經(jīng)歷DLT，終止臨床研究。

G.安全性

治療后可發(fā)生全身性副作用。發(fā)熱、寒冷、肌肉痛、疲勞/無力、惡心和嘔吐。注射腫瘤位點(diǎn)發(fā)生副作用如疼痛、壞死、潰瘍和炎癥。根據(jù)臨床前研究和GM-CSF臨床研究，可發(fā)生淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和白細(xì)胞的短時(shí)間增加并伴隨噬中性粒細(xì)胞的增加。在注射腫瘤位點(diǎn)可發(fā)生如下情況：疼痛、壞死、潰瘍和炎癥。

盡管在之前JX-594的I期試驗(yàn)中未描述散發(fā)性疫苗相關(guān)皮疹或腦炎，并且是可能性極小的，但仍理論上可能發(fā)生；這些并發(fā)癥分別在約10,000名疫苗接種者中有1名和1,000,000名疫苗接種者中有1名。

劑量限制性毒性(DLT)

DLT定義為JX-594引起的任一3級(jí)或更嚴(yán)重的毒性，不包括流感類似癥狀(如疲勞、惡心或肌肉痛)，持續(xù)時(shí)間超過5天或4級(jí)毒性持續(xù)任意時(shí)間。

確保病人安全遠(yuǎn)離操作風(fēng)險(xiǎn)(Security of Safety for Patients from Risk of Procedure)?；顧z可引起并發(fā)癥，如腹膜內(nèi)出血和/或腫瘤破裂引起的休克。盡管報(bào)道并發(fā)癥的發(fā)生率<0.1％并可通過經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞治療術(shù)治愈，但首先應(yīng)當(dāng)考慮病人的安全。因此，如果治療醫(yī)師判斷活檢有可能引起病人的危險(xiǎn)，可不進(jìn)行活檢。此外，若病人安全需要，根據(jù)PI的判斷，在進(jìn)行組織活檢(細(xì)針穿刺)和/或JX-594瘤內(nèi)注射前后至多5天，病人可入院觀察。

H.效果

本研究的主要目的是臨床I期安全性研究，并非為了臨床受益。不過仍希望由于直接的病毒效應(yīng)(即溶瘤效應(yīng))引起注射和/或非注射腫瘤縮小和/或發(fā)生治療誘導(dǎo)的免疫介導(dǎo)的腫瘤破壞。

效果評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)是目標(biāo)病灶的變化。如果非目標(biāo)病灶發(fā)生任何變化，根據(jù)下表基于目標(biāo)病灶的反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。

目標(biāo)病灶的評(píng)價(jià)。完全反應(yīng)(CR):所有目標(biāo)病灶消失。部分反應(yīng)(PR):目標(biāo)病灶的總LD比作為對(duì)照的基線總LD減少至少30％。疾病進(jìn)展(PD)：目標(biāo)病灶的總LD比作為對(duì)照的自開始治療以來記錄的最小總LD增加至少20％。疾病穩(wěn)定(SD)：與作為對(duì)照的自開始治療以來記錄的最小總LD相比，既沒有足夠的縮小符合PR，也沒有足夠增加符合PD。

下表列出了對(duì)于總體反應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。最好總體反應(yīng)指從治療開始點(diǎn)到疾病進(jìn)展/復(fù)發(fā)所記錄的最好的反應(yīng)。

表2最好總體反應(yīng)的評(píng)價(jià)

注意：對(duì)于健康狀況整體惡化需要停止治療但當(dāng)時(shí)沒有疾病進(jìn)展的客觀證據(jù)的病人應(yīng)當(dāng)歸為“癥狀惡化”。應(yīng)當(dāng)盡全力檢測(cè)客觀疾病進(jìn)展，即便是在治療停止后。

在一些情況下，很難區(qū)分殘余病灶和正常組織。當(dāng)基于這些判斷進(jìn)行完全反應(yīng)的評(píng)價(jià)時(shí)，推薦在確認(rèn)完全反應(yīng)狀態(tài)前對(duì)殘留病灶進(jìn)行研究(細(xì)針穿刺/活檢)。

可測(cè)量病灶的評(píng)價(jià)原則。所有的測(cè)量在周期2的最后一天(第22天)或周期4的最后一天(第22天)通過CT或MRI進(jìn)行，使用尺或卡尺以度量符號(hào)記錄。所有的基線測(cè)量應(yīng)在盡可能接近治療開始時(shí)進(jìn)行，不可超過治療開始前4周。

注意：之前照射過的病灶不可作為測(cè)量病灶。如果根據(jù)研究者的判斷認(rèn)為這些病灶可作為測(cè)量病灶，試驗(yàn)方案應(yīng)描述考慮這些病灶的條件。還應(yīng)當(dāng)注意位于之前照射過區(qū)域的腫瘤病灶也被認(rèn)為是不適合作為測(cè)量病灶的。如果研究者認(rèn)為該病灶適合測(cè)量，則試驗(yàn)方案中必須明確考慮這類病灶的條件。

在基線(測(cè)定)和跟蹤過程中，對(duì)于每一鑒定的和報(bào)道的病灶應(yīng)使用相同的評(píng)估方法和技術(shù)進(jìn)行表征。當(dāng)使用兩種方法評(píng)估治療的抗腫瘤效果時(shí)，臨床檢查的評(píng)價(jià)優(yōu)選基于影像的評(píng)價(jià)。

使用相鄰切片進(jìn)行常規(guī)CT，切片厚度應(yīng)當(dāng)為10mm或更低。操作螺旋CT時(shí)使用5mm相鄰重建算法。如果可用的話，在篩選隨訪中使用PET-CT，在本文中，在周期2的第22天使用PET-CT。需要的話在周期4的第22天重復(fù)PET-CT。

測(cè)量確認(rèn)/反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。確認(rèn)：為了指定PR或CR狀態(tài)，必須通過重復(fù)評(píng)價(jià)確認(rèn)腫瘤測(cè)量值的變化，重復(fù)評(píng)價(jià)在首次復(fù)合反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的8周后進(jìn)行。當(dāng)為SD時(shí)，在進(jìn)入研究后，最小16周間隔的隨訪測(cè)量必須至少有一次滿足SD標(biāo)準(zhǔn)。

反應(yīng)持續(xù)時(shí)間：總體反應(yīng)持續(xù)時(shí)間定義為從首次記錄CR或PR的日期(以先記錄者為準(zhǔn))到最早客觀確認(rèn)疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展日期(作為疾病進(jìn)展參考的是自治療開始后最小的測(cè)量記錄)的時(shí)間。整體完全反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間定義為從首次記錄CR的日期到最早客觀確認(rèn)復(fù)發(fā)的日期的時(shí)間。

疾病穩(wěn)定的持續(xù)時(shí)間：SD定義為從治療后首次記錄SD的日期到最早客觀確認(rèn)PD的日期的時(shí)間(作為疾病進(jìn)展參考的是自治療開始后最小的測(cè)量記錄)。

腫瘤反應(yīng)的重新評(píng)估。需要的話本研究可由獨(dú)立放射科醫(yī)生進(jìn)行腫瘤反應(yīng)的評(píng)估。然而，這些評(píng)估結(jié)果僅用作研究目的而不影響臨床結(jié)論。

I.統(tǒng)計(jì)方法和數(shù)據(jù)分析

1.樣本量

估計(jì)樣本量為18個(gè)病人，可能的范圍是2-30個(gè)病人。本研究的主要目的是瘤內(nèi)注射JX-594的安全性、MTD或MFD。本研究代表JX-594的第二次人體臨床試驗(yàn)。因?yàn)橹皼]有基于有意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算的臨床試驗(yàn)，本研究樣本量的選擇基于臨床安全性的考慮。本研究的結(jié)果可用于為將來的臨床研究提供決定樣本量變化的估計(jì)。

每一組中的病人有一次在到達(dá)真實(shí)MTD前停止研究的機(jī)會(huì)以及一次超過真實(shí)MTD繼續(xù)進(jìn)行的機(jī)會(huì)。下表顯示了基于真實(shí)DLT發(fā)生率的每種后果的統(tǒng)計(jì)學(xué)可能性。下表代表了組中首先3個(gè)病人的每種后果的概率(每一病人群體給定不同真實(shí)發(fā)生率)。

表3

下表顯示了6名病人的組中每種后果的概率。在最初3名病人中觀察到1例DLT并在組中加入另外3名病人之后，代表在給定病人群體中各種真實(shí)發(fā)生率。

表4

*一名病人來自最初3名病人，一名來自第二次的3名病人。

2.統(tǒng)計(jì)方法/數(shù)據(jù)分析

概述群體為意向治療(ITT)群體，定義為所有病人接受至少一次JX-594治療。此外，可評(píng)估病人也評(píng)價(jià)為ITT群體的子集?？稍u(píng)估病人指那些接受了至少1個(gè)周期的治療，在治療前后合適時(shí)間階段進(jìn)行合適腫瘤測(cè)量的病人。

本研究分4個(gè)治療組進(jìn)行，根據(jù)組不同，每一組有2-6名病人。用合適的描述統(tǒng)計(jì)學(xué)、頻率表格、圖和數(shù)據(jù)表概述每一組的數(shù)據(jù)。將來自治療組的數(shù)據(jù)合并用于挑選的數(shù)據(jù)顯示。如下文所述產(chǎn)生特定數(shù)據(jù)顯示。

對(duì)象年齡、體重和身高以描述統(tǒng)計(jì)學(xué)概述(平均值、中位數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、最小值和最大值)，性別和種族以頻率表格概述。治療組的數(shù)據(jù)以每一病人單獨(dú)方式以及組合方式進(jìn)行概述。為此產(chǎn)生單個(gè)病人列表。體檢(Physical medical)歷史數(shù)據(jù)以每一治療組獨(dú)立分開，并組合以頻率表格進(jìn)行概述。以描述統(tǒng)計(jì)學(xué)方式概述治療給藥(平均值、中位數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、最小值和最大值)。任一接受研究藥物的病人均納入安全性分析。在每一治療組終止時(shí)分別概述包括不良事件、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果、毒性、生命指征和退出時(shí)間的安全性數(shù)據(jù)。用COSTART身體系統(tǒng)分類方案對(duì)AE進(jìn)行編碼并列表。產(chǎn)生AE對(duì)象的數(shù)量和比例以治療組和治療目的進(jìn)行列表；此外，根據(jù)AE嚴(yán)重性和研究者指明的與JX-594的關(guān)系對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分級(jí)(stratify)。

在終止時(shí)用顯示治療前后發(fā)生變化病人數(shù)目的移動(dòng)表格對(duì)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行概述。所選變量的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果以圖像顯示。

除了整體腫瘤反應(yīng)率，還報(bào)告目標(biāo)和非目標(biāo)位點(diǎn)的腫瘤反應(yīng)率。報(bào)告目標(biāo)和非目標(biāo)位點(diǎn)的時(shí)間-腫瘤進(jìn)展，還報(bào)告總體存活情況。因?yàn)楸狙芯繛樽杂煞请S機(jī)研究，每一組中病人數(shù)目很少，因此不單獨(dú)對(duì)于來自本研究的測(cè)試數(shù)據(jù)做出假設(shè)。為了評(píng)價(jià)治療組間的差異，可使用合適的參數(shù)或非參數(shù)方法對(duì)每一組進(jìn)行比較。

實(shí)施例2

不可切除的惡性黑色素瘤的治療

A.劑量和計(jì)劃

1.劑量和計(jì)劃的原理

每一治療給予總劑量1x 10⁸pfu。該劑量低于最高每周劑量1.6x 10⁸pfu，這一劑量在首次JX-594治療手術(shù)無法治愈的皮下黑色素瘤的I期臨床試驗(yàn)中給藥是安全的(Mastrangelo等，1998)。此外，1x 10⁸pfu比正在進(jìn)行的JX-594I期瘤內(nèi)(IT)試驗(yàn)至今所知的安全給藥的最高劑量(n＝2)低10倍，比至今所知的最高劑量低3倍。在那次試驗(yàn)中，每3周進(jìn)行一次給藥，對(duì)1-3個(gè)肝臟腫瘤進(jìn)行IT注射。該研究的的初步結(jié)果表明在JX-594治療4天后(即第5天)流感類似癥狀和血液學(xué)參數(shù)恢復(fù)到基線水平。

因?yàn)樵谇笆稣谶M(jìn)行的肝臟IT研究中所有組的病人在第5天均從輕度到中度治療相關(guān)毒性中恢復(fù)，所以選用每周1次的給藥方案。此外，來自Mastrangelo等，1998的數(shù)據(jù)表明每周兩次每次治療高至8x 10⁷pfu是安全有效的。

最初I/II期黑色素瘤研究(Mastrangelo等，1998)的證據(jù)表明，發(fā)現(xiàn)病人在再次接種后14-21天內(nèi)，對(duì)痘苗病毒產(chǎn)生顯著的體液免疫應(yīng)答。發(fā)現(xiàn)盡管持續(xù)治療但抗體滴度在暴露4-6周達(dá)到平臺(tái)期。因此，在產(chǎn)生高滴度抗體和T細(xì)胞之前，本方案研究每周一次IT給藥6周以產(chǎn)生最大的可能遞送和JX-594的抗腫瘤效果。

2.研究原理

因?yàn)樽⑸淇傻竭_(dá)疾病的比率相對(duì)高，且可見黑色素瘤中對(duì)于IL-2免疫療法的陽性反應(yīng)，而對(duì)于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者尚缺少有效可耐受的治療方法，因此黑色素瘤是JX-594免疫療法的理想靶點(diǎn)。此外，預(yù)計(jì)JX-594復(fù)制靶向黑色素細(xì)胞中高表達(dá)的EGFR通路。

最初I/II研究結(jié)果表明，瘤內(nèi)注射JX-594能夠安全有效治療手術(shù)無法治愈轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人的注射的和遠(yuǎn)端的疾病。顯示了注射腫瘤(7名病人中的5名)和至少1個(gè)非注射腫瘤(7名病人中的4名)的反應(yīng)，包括兩名病人對(duì)JX-594治療達(dá)到部分反應(yīng)(6+個(gè)月)和一名病人完全反應(yīng)(4+個(gè)月)。尤其值得注意的是，盡管所有病人都在治療前接種過疫苗(因此預(yù)先存在抗牛痘免疫性)，但仍產(chǎn)生療效和基因的表達(dá)。

選擇本研究設(shè)計(jì)為了擴(kuò)展上述最初的I/II期研究，并在多至15名可評(píng)價(jià)的3期或4期不可切除的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人上評(píng)價(jià)注射腫瘤反應(yīng)。此外，評(píng)價(jià)JX-594的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和對(duì)JX-594的免疫應(yīng)答以及血液和腫瘤組織中GM-CSF轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。研究者也評(píng)價(jià)JX-594是否能夠靜脈內(nèi)擴(kuò)散并感染非注射局部和遠(yuǎn)端疾病，表明它能夠產(chǎn)生與那些經(jīng)歷直接瘤內(nèi)注射位點(diǎn)類似的抗腫瘤效果。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)除了對(duì)IT JX-594給藥的整體臨床經(jīng)驗(yàn)做出補(bǔ)充外，也強(qiáng)烈支持IV JX-594用于治療晚期/轉(zhuǎn)移性疾病，尤其是用于晚期惡性黑色素瘤的治療。

B.研究用產(chǎn)品描述

JX-594是靶向癌癥，選擇性復(fù)制的痘苗病毒，來源于常用的惠氏疫苗株(惠氏實(shí)驗(yàn)室)(Wyeth laboratories)。該病毒來源于一種胸腺嘧啶激酶(TK)失活的疫苗株。JX-594包含一種參與免疫應(yīng)答的有效細(xì)胞因子hGM-CSF的基因和啟動(dòng)子。進(jìn)一步改造JX-594插入lacZ基因以追蹤組織中的病毒。

C.目的

目的包括評(píng)價(jià)(a)注射腫瘤的目標(biāo)反應(yīng)率，(b)JX-594IT注射給藥的安全性和毒性，(c)JX-594IT注射給藥后整體疾病負(fù)荷的目標(biāo)反應(yīng)率(RECIST標(biāo)準(zhǔn))，(d)無進(jìn)展生存(PFS)時(shí)間，以及(e)非注射腫瘤反應(yīng)率。

D.研究設(shè)計(jì)

1.研究概述

這是一項(xiàng)在不可切除的3或4期惡性黑色素瘤病人中開展的臨床I/II期開放試驗(yàn)。病人在6周內(nèi)接受總共六(6)次JX-594瘤內(nèi)給予。每次治療給予總劑量為1x 10⁸噬斑形成單位，并均分在至多5個(gè)腫瘤中。如果病人在完成6次治療后經(jīng)歷對(duì)于JX-594IT治療的部分給予腫瘤反應(yīng)，則可另外給予3次每周1次的治療。

2.研究終點(diǎn)

臨床研究的主要終點(diǎn)是注射腫瘤的反應(yīng)率，包括完全反應(yīng)率、部分反應(yīng)率和反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。此類研究的第二個(gè)終點(diǎn)包括安全性，由治療相關(guān)不良事件、嚴(yán)重不良事件(SAE)和與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室參數(shù)中基線相比臨床顯著變化決定，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室參數(shù)包括完全反應(yīng)率、部分反應(yīng)率、反應(yīng)持續(xù)時(shí)間、無進(jìn)展生存(PFS)、非注射腫瘤反應(yīng)率，包括完全反應(yīng)率、部分反應(yīng)率和反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。其它終點(diǎn)可包括總體生存、臨床受益(包括體重增加和行為狀態(tài)的改善)、JX-594評(píng)價(jià)(如血漿和/或全血中病毒基因組(Q-PCR)；血漿和/或全血中病毒感染性病毒，任選(噬斑實(shí)驗(yàn)))，免疫學(xué)評(píng)價(jià)(血清中JX-594中和抗體；血清中GM-CSF測(cè)量(ELISA實(shí)驗(yàn)))，組織學(xué)評(píng)價(jià)(組織中病毒基因表達(dá)；GM-CSF表達(dá)；lac-Z表達(dá)；炎癥細(xì)胞浸潤；壞死；凋亡；胞質(zhì)中病毒復(fù)制工廠；EGFR通路狀態(tài)；以及腫瘤胸腺嘧啶激酶狀態(tài))。

3.劑量

通常，如本文所述在無菌生理鹽水中稀釋病毒。每次治療給予總劑量為1x10⁸噬斑形成單位，并均分在至多5個(gè)腫瘤中。

4.總體研究持續(xù)時(shí)間和隨訪

研究期通常包括用于篩選的病人訪問、研究治療和治療后隨訪評(píng)價(jià)。

篩選。在JX-594首次治療前14天內(nèi)確定符合研究條件的病人。

治療。在6周內(nèi)給予符合條件病人總共6次治療，每周進(jìn)行一次瘤內(nèi)注射(第1、8、15、22、29和36天)，給藥劑量1x 10⁸pfu。再次治療前病人必須繼續(xù)符合所有的合格標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)槿魏卧蜻z漏一次治療，只要符合合格條件就在下一周給予遺漏的治療，相應(yīng)的調(diào)整訪問計(jì)劃，借此跟蹤病人使病人總共接受6次治療。注射延遲累計(jì)最大為4周。延遲治療的病人仍需完成6次治療并在第6次治療后1周對(duì)反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在最后一次給藥后一周(即第43天)啟動(dòng)反應(yīng)評(píng)價(jià).如果病人在完成6次治療后出現(xiàn)對(duì)JX-594IT治療的部分注射腫瘤反應(yīng)，則可另外給予3次每周1次的治療。

治療后隨訪。所有病人在JX-594最后一次治療后28天(即第64天)返回進(jìn)行跟蹤隨訪。治療結(jié)束后6個(gè)月或直到病人在注射位點(diǎn)發(fā)生疾病進(jìn)展，開始新的癌癥治療或者死亡。最后一次注射后每3周病人返回門診進(jìn)行體檢測(cè)量腫瘤(可能的話)并評(píng)價(jià)反應(yīng)。每6周，通過PE和/或CT/MRI評(píng)價(jià)反應(yīng)。在6個(gè)月隨訪后，病人每3個(gè)月返回門診進(jìn)行腫瘤測(cè)量和反應(yīng)評(píng)價(jià)(包括CT/MRI)直到注射位點(diǎn)疾病進(jìn)展、死亡或直到開始新的癌癥治療。

基因治療產(chǎn)物的長期隨訪。在注射位點(diǎn)疾病進(jìn)展或開始新癌癥治療后，根據(jù)當(dāng)前FDA指導(dǎo)原則，繼續(xù)監(jiān)測(cè)病人存活和基因治療的潛在長期效應(yīng)。如果病人不再返回門診治療或治療后隨訪，可通過郵件或電話收集數(shù)據(jù)。

E.研究群體

1.入選標(biāo)準(zhǔn)

通常病人滿足下列所有條件：組織學(xué)確認(rèn)的3期或4期惡性黑色素瘤；至少有一個(gè)瘤塊能被CT/MRI和/或體檢測(cè)量，在超聲引導(dǎo)下能夠直接目測(cè)進(jìn)行注射；預(yù)計(jì)生存期至少16周；癌癥無法手術(shù)切除治愈；KPS評(píng)分≥70；年齡≥18歲；有生育能力的男性和女性在用JX-594治療期間和最后一次治療后三月內(nèi)愿意進(jìn)行公認(rèn)的生育控制方法；理解并愿意簽署倫理審查委員會(huì)(IRB)/獨(dú)立倫理委員會(huì)(IEC)(Institutional Review Board(IRB)/Independent Ethics Committee(IEC))批準(zhǔn)的書面知情同意書表格；能夠配合研究步驟和隨訪檢查；肝功能尚可(總膽紅素≤2.0ULN；AST、ALT≤2.0ULN)；骨髓功能尚可(WBC>3,500細(xì)胞/mm³并<50,000細(xì)胞/mm³；ANC>1,500細(xì)胞/mm³，血紅蛋白>10g/dL；血小板計(jì)數(shù)>125,000血小板/mm³)；可接受的凝血狀態(tài)(INR<(ULN+10％))；以及可接受的腎功能(血清肌氨酸酐<2.0mg/dL).

2.排除標(biāo)準(zhǔn)

通常，病人不應(yīng)該符合下列任一排除標(biāo)準(zhǔn)：目標(biāo)腫瘤粘附于和/或侵襲主要血管結(jié)構(gòu)(如頸動(dòng)脈)；懷孕或哺乳期；已知HIV感染；JX-594首次給藥前4周內(nèi)全身使用過皮質(zhì)類固醇或其它免疫抑制藥物；被認(rèn)為對(duì)于研究用新藥治療具有高風(fēng)險(xiǎn)的臨床顯著活動(dòng)的感染或不可控的醫(yī)學(xué)狀況(如肺部、神經(jīng)、心血管、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng))；潛在疾病和/或藥物(如全身性使用皮質(zhì)類固醇)引起的顯著性免疫缺陷；一些階段需要全身治療的濕疹病史；臨床顯著的和/或快速蓄積的腹水、心包和/或胸膜滲出液(如需要引流進(jìn)行癥狀控制)；嚴(yán)重或不穩(wěn)定的心臟疾病，包括但不限于，篩選前6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)下列任一情況：心肌梗死、不穩(wěn)定心絞痛、充血性心力衰竭、心肌炎、確診并需要藥物的心率失常，或其它心臟狀態(tài)臨床顯著性變化；篩選前4周內(nèi)目標(biāo)腫瘤經(jīng)過放療、化療、手術(shù)或研究性藥物治療(若為絲裂霉素C和亞硝基脲則為6周內(nèi))；之前對(duì)天花疫苗有嚴(yán)重反應(yīng)或副作用；不能或不愿意給出知情同意書或配合本方案所需步驟；其家庭聯(lián)系人為懷孕或哺乳、兒童<5歲、一些階段需要全身治療的濕疹病史、或潛在疾病(如HIV)和/或藥物(如全身性使用皮質(zhì)類固醇)引起的顯著性免疫缺陷的病人也被排除，除非在病人活動(dòng)給藥期間和最后一次研究給藥3周后能夠另有生活安排。

3.其它符合標(biāo)準(zhǔn)的考慮

合格標(biāo)準(zhǔn)的偏差。如果預(yù)計(jì)偏差不會(huì)影響病人的安全、研究的進(jìn)行或?qū)ρ芯拷Y(jié)果的解釋，也可編入與上述入選/排除標(biāo)準(zhǔn)有微小偏差(如實(shí)驗(yàn)室結(jié)果在預(yù)先明確的值之外)的病人。需要研究發(fā)起者或發(fā)起者代表對(duì)編入有微小偏差的病人的書面同意。

4.病人編入步驟

一旦研究者進(jìn)行篩選評(píng)估并確認(rèn)病人合格，發(fā)起者檢查篩選和合格信息并向研究者提供所編入的每一位病人的確認(rèn)書。一旦確認(rèn)編入，使用預(yù)定病人編號(hào)方案對(duì)病人指定一個(gè)識(shí)別號(hào)。病人識(shí)別號(hào)由研究編號(hào)、位置編號(hào)、病人編號(hào)和病人姓名首字母組成。

F.研究產(chǎn)品

JX-594由杰尼瑞斯生物治療公司(Jennerex Biotherapeutics)提供。通常，JX-594制劑為液體且凍存于供一次使用的玻璃小瓶中。每一小瓶含有0.15mL。病毒溶液為無色到淡黃色的澄清到輕微乳白色溶液。JX-594濃度為1.9x 10⁹pfu/mL。

JX-594被認(rèn)為是生物安全2級(jí)(BSL-2)的感染性物質(zhì)。BSL-2名稱和相關(guān)指導(dǎo)原則應(yīng)用于對(duì)人體或環(huán)境有中度潛在危害的試劑。其它BSL-2試劑的例子包括麻疹病毒、沙門菌和乙肝病毒。參考機(jī)構(gòu)感染控制政策。

通常JX-594儲(chǔ)存于受監(jiān)控的、進(jìn)入受限的安全冰箱中。JX-594應(yīng)當(dāng)在-60℃或以下儲(chǔ)存于第二層包裝內(nèi)標(biāo)示清楚的小瓶中，放置于門上具有生物危害標(biāo)志(表明試劑的性質(zhì))的冰箱或房間內(nèi)。冰箱在-65℃設(shè)置報(bào)警限制使其在溫度升至-60℃之前反應(yīng)。長期處于>-60℃時(shí)需要將受影響的材料隔離直到其滴度得以再次確認(rèn)。

在研究地點(diǎn)提供工作表以及補(bǔ)充研究信息以保證正確處理和準(zhǔn)備JX-594。參考并執(zhí)行機(jī)構(gòu)感染控制政策[生物安全2級(jí)(BSL-2)]進(jìn)行準(zhǔn)備、運(yùn)輸和處理病毒載體。所有時(shí)間必須佩戴手套、長袍和護(hù)目鏡。在特派藥學(xué)家/科學(xué)家的指導(dǎo)下，根據(jù)BSL-2處理指導(dǎo)原則，于藥房/實(shí)驗(yàn)室的垂直生物安全柜(2級(jí))中進(jìn)行關(guān)于JX-594的所有工作。在使用前后用70％酒精擦拭安全柜。

解凍。將小瓶直立在室溫下進(jìn)行解凍。不應(yīng)將JX-594置于熱水浴中。一旦解凍，將小瓶置于15mL聚丙烯錐形離心管中(如康寧(Corning)或福爾肯(Falcon))，蓋上管子，100x g離心2分鐘。用鑷子或類似工具將JX-594小瓶從試管中取出。在稀釋和遞送給病人前，病毒制劑必須儲(chǔ)存于冰上或冷藏(2-8℃)。在解凍后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行注射。

制備。將小瓶離心后，用微量移液器溫和重懸(建議使用調(diào)到100μL的200μL微量移液器)。注意不要在制劑內(nèi)吹入氣泡。通常準(zhǔn)備約2.75mL病毒溶液(JX-594+鹽水)，分裝于5只注射器中，每只0.5mL。使用微量移液器將2.64mL無菌生理鹽水轉(zhuǎn)移到合適大小的聚丙烯試管中(如5mL福爾肯試管)。從一(1)小管JX-594中吸取116μL JX-594并將其轉(zhuǎn)移到含鹽水的福爾肯試管中。重新蓋上福爾肯試管的蓋子，使試管避光(用鋁箔或置于避光容器中)，并將蓋好的試管馬上放置于2-8℃(冷藏或防于濕冰上)。

在給藥前30分鐘內(nèi)，劇烈渦旋振蕩10秒。渦旋后，吸取0.5mL病毒溶液(JX-594+鹽水)到5只注射器的每一只中。蓋上注射器并送交研究者注射。在病毒制劑解凍后4小時(shí)內(nèi)開始注射。在稀釋和遞送給病人前，病毒制劑必須儲(chǔ)存于冰上或冷藏(2-8℃)。

1. JX-594給藥

在6周內(nèi)以每周一次共六(6)次用JX-594進(jìn)行瘤內(nèi)注射給藥。在第1、8、15、22和36天進(jìn)行給藥。每次治療病人接受劑量為1x 10⁸pfu，分別給予≤5個(gè)病灶。只有能通過經(jīng)皮注射(如皮膚可觸及的結(jié)節(jié)或淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移)或超聲波(US)引導(dǎo)注射可到達(dá)的病灶才符合治療要求。

研究者決定每一次治療注射的病灶(腫瘤)。根據(jù)大小注射腫瘤；最大的病灶應(yīng)在每次治療時(shí)都進(jìn)行注射。根據(jù)研究者的判斷，治療一個(gè)腫瘤可使用一只或多只注射器。

在進(jìn)針位點(diǎn)無菌備皮后進(jìn)行局部麻醉。注射使用18–22號(hào)針頭。如上所述使注射針頭進(jìn)入腫瘤。由主要研究者或副研究者進(jìn)行注射。

將完整注射器體積(0.5mL)注入每個(gè)腫瘤中由中央進(jìn)針位點(diǎn)輻射出的4個(gè)等距針道中。例如，如下進(jìn)行病毒注射操作：(1)將針頭(18-22號(hào))插入腫瘤中央部位，(2)將針頭向腫瘤邊緣擴(kuò)展(到腫瘤邊緣1-3mm)，(3)注射約25％注射器體積(約0.125mL)后向中央進(jìn)針位點(diǎn)抽回，(4)無需將針頭完全從腫瘤中撤回，以90°間隔重復(fù)上述步驟，總共產(chǎn)生4個(gè)針道。

預(yù)計(jì)毒性。治療后預(yù)計(jì)產(chǎn)生如下全身毒性：發(fā)熱、寒冷、厭食、肌肉痛、疲勞/衰弱和/或頭痛。預(yù)計(jì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板和血細(xì)胞比容會(huì)短時(shí)下降。通常血液學(xué)參數(shù)在第5天回到基線(通常經(jīng)歷2-3天)。僅在周期1中，首次注射后的前4天內(nèi)可能出現(xiàn)白細(xì)胞增多。在組3的兩名病人給藥后5-8天報(bào)道總白細(xì)胞計(jì)數(shù)為24,000/μL和118,000/μL。預(yù)計(jì)嗜酸性粒細(xì)胞在治療后也會(huì)升高，通常在8天內(nèi)保持升高。預(yù)計(jì)在注射位點(diǎn)可能出現(xiàn)下列毒性：疼痛、壞死、潰瘍和炎癥。其它病毒復(fù)制位點(diǎn)(如遠(yuǎn)端腫瘤)可能發(fā)生疼痛、壞死、潰瘍和炎癥。

盡管在任何治療或接觸JX-594后不大可能或未觀察到散發(fā)性疫苗相關(guān)皮疹或腦炎，但仍可能發(fā)生這些狀況；這些并發(fā)癥分別在約10,000名疫苗接種者中有1名和1,000,000名疫苗接種者中有1名。此外，在最近的使用NYCBOH痘苗病毒株接種的項(xiàng)目中，證實(shí)了心肌炎的風(fēng)險(xiǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著升高(每10,000接種者中有1-2人)(Arness等2004)。

G.統(tǒng)計(jì)學(xué)

1.后果定義

關(guān)于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果定義如下。本方案其它部分討論了毒性代碼，以及疾病進(jìn)展、完全反應(yīng)、部分反應(yīng)、總體反應(yīng)持續(xù)時(shí)間、可評(píng)價(jià)病人和治療相關(guān)的定義。

無進(jìn)展生存期。從首次JX-594治療到研究者診斷為進(jìn)展的診斷日期，或到無進(jìn)展死亡日期的時(shí)間。對(duì)于最后一次了解到存活且無進(jìn)展的病人在其最后一次評(píng)價(jià)進(jìn)展時(shí)進(jìn)行刪除。在統(tǒng)計(jì)分析中對(duì)在記載為疾病進(jìn)展前接受非本方案治療的病人進(jìn)行刪除。

總體生存期。從首次JX-594治療到死亡日期或最后一次知道其存活的日期的時(shí)間；在統(tǒng)計(jì)分析中對(duì)最后一次知道其存活的病人進(jìn)行截尾。

2.分析集合或群體

對(duì)所有接受JX-594的病人進(jìn)行分析，篩選時(shí)分析其人口學(xué)特征，而后則分析安全性、有效性、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。概述群體為意向治療(ITT)群體，定義為接受至少一次JX-594治療的所有病人。此外還評(píng)估可評(píng)價(jià)病人群體(ITT群體的子集)。如果一個(gè)病人接受了至少一次JX-594治療，并在基線和治療后的第一合適時(shí)間點(diǎn)具有合適的腫瘤測(cè)量值，則認(rèn)為該病人是可評(píng)價(jià)的。

3.分析方法

使用描述性統(tǒng)計(jì)概述連續(xù)變量(n、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、最小值和最大值)。對(duì)于分類變量則通過顯示每一分類內(nèi)病人的數(shù)目和百分率(n，％)進(jìn)行概述?；诳稍u(píng)價(jià)病人以及意向治療群體進(jìn)行分析。進(jìn)行總體分析；此外，安全性和有效性分析與疾病階段相關(guān)。

安全性：分析方法。將接受任何研究藥物治療的病人納入安全性分析。包括不良事件、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果、毒性、生命指征和撤銷信息(withdrawal information)的安全性數(shù)據(jù)將隨時(shí)間進(jìn)行概述。用描述性統(tǒng)計(jì)概述病人年齡、體重和身高，用頻率表概述年齡和種族。用頻率表概述診療史。

用MedDRA分類方案對(duì)不良事件進(jìn)行編碼和列表。對(duì)治療緊急AE的發(fā)生率進(jìn)行列表；此外，根據(jù)不良事件嚴(yán)重性(等級(jí))和研究者指明的與JX-594的關(guān)系對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分級(jí)(stratify)。安全性分析關(guān)注3或4級(jí)非血液學(xué)不良事件和4級(jí)血液學(xué)不良事件。產(chǎn)生SAE的列表。

用描述性統(tǒng)計(jì)概述血液學(xué)和血清化學(xué)中的連續(xù)變量。此外，進(jìn)行所選血液學(xué)參數(shù)的最低點(diǎn)分析并概述。在移動(dòng)表格中隨時(shí)間概述實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，移動(dòng)表格顯示了相對(duì)參考范圍、給藥后由基線發(fā)生變化的病人的數(shù)目。所選變量的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果以圖片顯示。

用描述性統(tǒng)計(jì)概述KPS行為評(píng)分中的分類變量。同時(shí)概述KPS行為評(píng)分中與篩選和/或基線相比的最大偏移。用描述性統(tǒng)計(jì)概述其余安全性變量。

藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)：分析方法。用下列血液中基因組的濃度評(píng)價(jià)隨時(shí)間病毒復(fù)制和脫落進(jìn)入血液。在所有的病人中測(cè)量JX-594的血液濃度和GM-CSF的水平，估測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

要分析的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括JX-594和GM-CSF對(duì)外周血計(jì)數(shù)、MIA和腫瘤活檢組織的影響。評(píng)估并概述IT注射后對(duì)JX-594的免疫應(yīng)答，包括白細(xì)胞亞組(絕對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、ANC、淋巴細(xì)胞)、細(xì)胞因子和JX-594中和抗體的形成與基線值相比的變化。

評(píng)價(jià)并概述組織學(xué)終點(diǎn)與基線值(腫瘤組織和正常組織對(duì)照)相比的變化，包括炎癥細(xì)胞浸潤、病毒基因表達(dá)、GM-CSF表達(dá)、lac-Z表達(dá)和腫瘤壞死。還評(píng)價(jià)凋亡、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)病毒復(fù)制工廠、EGFR通路狀態(tài)和腫瘤胸腺嘧啶激酶狀態(tài)。

效果：分析方法。評(píng)價(jià)如下基于RECIST標(biāo)準(zhǔn)的治療反應(yīng)率：總體反應(yīng)率、注射腫瘤反應(yīng)率和非注射腫瘤反應(yīng)率。概述完全反應(yīng)率、部分反應(yīng)率、疾病穩(wěn)定率和疾病進(jìn)展率。還報(bào)告無進(jìn)展生存時(shí)間、至進(jìn)展時(shí)間、反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和總體生存率。評(píng)價(jià)與疾病分期的相關(guān)性。

用卡普蘭-梅爾(Kaplan-Meier)法估測(cè)無進(jìn)展生存期和反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。展現(xiàn)中位數(shù)，中值、最小、最大持續(xù)時(shí)間的(雙側(cè))95％置信區(qū)間，以及刪除患者的數(shù)目。進(jìn)行無進(jìn)展生存期的描述性統(tǒng)計(jì)并描繪曲線。通過對(duì)JX-594治療后病人體重增加和行為狀態(tài)的改善的評(píng)估來評(píng)價(jià)病人的臨床受益。評(píng)價(jià)黑色素瘤抑制活性蛋白(MIA)隨時(shí)間的變化。還可將MIA與治療反應(yīng)進(jìn)行比較。

反應(yīng)評(píng)估的獨(dú)立審閱。可要求中心向獨(dú)立放射科審查員提供所選病人的所有放射學(xué)數(shù)據(jù)拷貝(優(yōu)選數(shù)字形式或CD-ROM)。對(duì)于有皮膚損傷的病人，也將照片發(fā)送給IRR做獨(dú)立審閱。來自中心和IRR的結(jié)果均進(jìn)行報(bào)告。不對(duì)閱讀者間的矛盾之處進(jìn)行評(píng)價(jià)。

實(shí)施例3

難治性肝臟腫瘤的治療

在JX-594的I期初步試驗(yàn)中，7名黑色素瘤病人接受注射入淺表皮膚轉(zhuǎn)移瘤的遞增劑量(Mastrangelo等，1999)。未報(bào)告最大耐受劑量(MTD)；報(bào)告了腫瘤反應(yīng)。當(dāng)前試驗(yàn)的目的是為了明確下列內(nèi)容：沒有預(yù)先免疫(如在初步研究中所做的)、特別是在實(shí)體器官內(nèi)治療后，顯著更高劑量(100倍)的安全性和MTD；藥代動(dòng)力學(xué)，包括3周的復(fù)制依賴性脫落進(jìn)入血液；對(duì)抗廣譜癌癥類型的有效性。因此在該I期試驗(yàn)中，發(fā)明者通過瘤內(nèi)注射治療肝臟腫瘤(原發(fā)的或轉(zhuǎn)移的)病人。發(fā)明者第一次報(bào)告了MTD，以及高水平JX-594復(fù)制和全身性GM-CSF表達(dá)，良好耐受劑量下的有效性和遠(yuǎn)端腫瘤靶向性。本文中該結(jié)果支持將來JX-594及來自該類型的產(chǎn)品的i.t.和i.v.試驗(yàn)。

A.材料和方法

1.研究設(shè)計(jì)

主要目的是為了確定JX-594的安全性和MTD。第二目的包括藥代動(dòng)力學(xué)、復(fù)制和脫落(尿液、咽拭子)、免疫應(yīng)答(中和抗體、細(xì)胞因子)和腫瘤反應(yīng)。在一個(gè)按組順序劑量遞增的設(shè)計(jì)中(每一劑量水平2-6名病人)，病人接受4個(gè)劑量水平(10⁸、3x 10⁸、10⁹、3x 10⁹噬斑形成單位，pfu)中的一種劑量。若2名或多名患者在某一劑量治療后觀察到DLT，則此劑量緊接著的前一劑量水平確定為MTD。DLT定義為任何4級(jí)毒性，或3級(jí)毒性持續(xù)>5天。獨(dú)立數(shù)據(jù)安全性監(jiān)控委員會(huì)(Data Safety Monitoring Board(DSMB))審閱所有劑量遞增的決定和主要的安全性評(píng)價(jià)。

2.病人選擇

根據(jù)藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范(GCP)指導(dǎo)原則，病人簽署知情同意書。入選條件包括盡管經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)療法治療但仍然進(jìn)展的肝臟內(nèi)不可切除的、可注射的實(shí)體瘤，正常的造血功能(白細(xì)胞計(jì)數(shù)>3,000mm³，血色素>10g/dL，血小板計(jì)數(shù)>75,000/mm³)以及臟器功能(包括肌氨酸酐<1.5mg/dL，AST/ALT≤2·5ULN，Child-Pugh A或B級(jí))，預(yù)計(jì)生存期>16周，且卡氏行為狀態(tài)(Karnofsky Performance Status)(KPS)≥70。排除條件包括增高的接種并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)(如免疫抑制、濕疹)，4周內(nèi)接受過免疫抑制劑或癌癥治療藥物的治療、懷孕或哺乳。

3. JX-594的生產(chǎn)和準(zhǔn)備

JX-594由惠氏牛痘毒株改造而來，在其TK基因區(qū)域插入人GM-CSF和lacZ基因使兩種基因分別在合成早期啟動(dòng)子和p7·5啟動(dòng)子的控制之下。按照GMP指導(dǎo)原則在Vero細(xì)胞中產(chǎn)生并通過蔗糖梯度離心純化得到臨床試驗(yàn)材料?；蚪M-pfu比例約為70:1。在含10％甘油、138mM氯化鈉的pH7.4的磷酸緩沖鹽水中配制JX-594。最終產(chǎn)物的QC釋放測(cè)試包括無菌、內(nèi)毒素和功效的測(cè)定。用0.9％生理鹽水稀釋JX-594，其體積相當(dāng)于目標(biāo)腫瘤估計(jì)總體積的25％。

4.治療步驟

使用21-號(hào)PEIT(經(jīng)皮乙醇注射，多孔；日本東京漢考醫(yī)療公司)(HAKKOMedicals)針頭通過影像引導(dǎo)的瘤內(nèi)注射給予JX-594。每3周進(jìn)行一次注射(n＝1-3)，從腫瘤中拔出針頭的過程中，沿兩個(gè)針頭軌跡進(jìn)行注射。最初的療程為2個(gè)周期；如果腫瘤發(fā)生反應(yīng)則可至多再進(jìn)行6個(gè)周期。

5.病人監(jiān)控

如表5所示進(jìn)行病人監(jiān)控。住院治療后至少對(duì)病人監(jiān)控48小時(shí)，門診病人監(jiān)控4周。

表5研究步驟

6.中和抗體(NAb)滴度

通過細(xì)胞病變效應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定NAb滴度。用培養(yǎng)基以半對(duì)數(shù)稀釋度連續(xù)稀釋熱滅活的血清。將50μL樣品與1,000pfu JX-594一起孵育2小時(shí)，然后接種到A2780細(xì)胞上。3天后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(日本熊本的島京實(shí)驗(yàn)室)(Donjindo Laboratories，Kumamoto，Japan)檢測(cè)細(xì)胞活力。NAb滴度定義為引起≥50％細(xì)胞存活的最高血清稀釋度的倒數(shù)。

7. JX-594的定量PCR

用定量PCR(Q-PCR)連續(xù)測(cè)定血液中JX-594基因組，因?yàn)樵摲椒軌驒z測(cè)產(chǎn)物并具有重現(xiàn)性而與抗體和/或補(bǔ)體中和無關(guān)。從QIAmp DNA血液微型試劑盒(德國希爾敦的凱杰公司)(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)制備的樣品中純化JX-594DNA。如前所述進(jìn)行Q-PCR(Kulesh等，2004)。JX-594檢測(cè)和定量的下限分別是666和3,333拷貝/毫升血漿。

8. JX-594脫落檢測(cè)

使用噬斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)任何感染性JX-594脫落進(jìn)入環(huán)境；感染性單位脫落有可能對(duì)公眾健康有影響。尿液和唾液樣本離心后重懸于10mM Tris(pH 9·0)中，用噬斑試驗(yàn)對(duì)A2780細(xì)胞進(jìn)行滴定。檢測(cè)限是20pfu/ml樣品。

9.細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)

根據(jù)供應(yīng)商指導(dǎo)用ELISA試劑盒(美國加州卡爾斯巴德市生物資源國際公司)(BioSource International；Carlsbad，CA，USA)檢測(cè)GM-CSF。根據(jù)廠家指導(dǎo)用LINCOplex試劑盒(密蘇里州查爾斯市林可公司)(LINCO；St.Charles，MO)檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和干擾素γ的水平。

10.血液和腫瘤樣品中痘苗病毒蛋白和lacZ的組織病理學(xué)染色

用蘇木精和伊紅對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋的活檢樣品進(jìn)行染色。對(duì)于免疫組織化學(xué)，使用B5R的小鼠單克隆抗體(Vac-14，α-B5R，46μg/mL；賓夕法尼亞大學(xué)Gary Cohen博士；1:50或1:100稀釋)，然后與達(dá)科(DAKO)EnVision+^TM抗小鼠HRP標(biāo)記的聚合物(加州卡平特里亞的達(dá)科公司(DAKO，Carpinteria，CA))孵育，最后用DAB顯色(馬里蘭州蓋瑟斯堡市基爾克和派瑞實(shí)驗(yàn)室)(Kirkegaard&Perry Laboratories；Gaithersburg，MD)。對(duì)于LacZ染色，將細(xì)胞900rpm離心1分鐘，在玻片上用0.5％戊二醛固定。然后沖洗細(xì)胞并用X-gal溶液染色4小時(shí)至過夜。

11.腫瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)

每2個(gè)周期后評(píng)價(jià)腫瘤反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)方法是對(duì)比度增強(qiáng)CT掃描(除非禁忌)。獲取最大腫瘤直徑和杭斯費(fèi)爾德單位(Hounsfield unit)(HU；密度估計(jì)值)。使用RECIST和Choi反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(Choi等，2007)。對(duì)基線處升高的腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行跟蹤。

12.統(tǒng)計(jì)學(xué)問題

安全性問題決定研究樣本大小。使用意向治療群體(≥1劑量)和標(biāo)準(zhǔn)劑量遞增設(shè)計(jì)?？紤]到治療群體中真實(shí)DLT率不同，根據(jù)I期劑量遞增試驗(yàn)的常規(guī)計(jì)算劑量遞增的可能性。

B.結(jié)果

1.病人特征

共編入14位病人(表6列出特征；圖20顯示試驗(yàn)概況)。3名病人在組1-2中進(jìn)行治療，6名在第三組中，2名在最高劑量組中。因?yàn)槟[瘤進(jìn)展引起非相關(guān)病人死亡，根據(jù)DSMB的要求6名病人在組3中進(jìn)行治療。2名病人(組1、3)由于無關(guān)不良事件在1個(gè)周期后暫停治療，最高劑量組的病人由于DLT接受了1個(gè)周期的治療(見下)。

表6.病人統(tǒng)計(jì)

2.治療相關(guān)毒性

a.不良事件(AE)

JX-594在MTD(10⁹pfu)之內(nèi)耐受良好。研究中未發(fā)生治療相關(guān)的死亡。所有病人均經(jīng)歷1-2級(jí)流感樣癥狀(治療后4-16小時(shí))。劑量相關(guān)低血壓(2級(jí)，無器官功能紊亂)在4-12小時(shí)內(nèi)發(fā)生。表7中列出了可能與JX-594相關(guān)的最常見AE。僅有1例嚴(yán)重AE病例(厭食和腹痛)被認(rèn)為是治療相關(guān)。報(bào)告了10例嚴(yán)重的無關(guān)(根據(jù)PI)AE歸因于腫瘤進(jìn)展相關(guān)并發(fā)癥。在AE報(bào)告期間，4名病人因?yàn)槟[瘤進(jìn)展死亡。

組4中2名病人經(jīng)歷了DLT。兩者均經(jīng)歷了腫瘤腫脹和阻塞肝內(nèi)膽管引起的3級(jí)直接膽紅素升高，以及III級(jí)厭食和腹痛。

b.實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)

在最初3天內(nèi)觀察到治療相關(guān)的淋巴細(xì)胞、血小板和血細(xì)胞比容的瞬時(shí)減少。在最初4天內(nèi)，9名病人的絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(ANC)有顯著增加(7例增加>100％；圖2A)。ANC的增加是劑量相關(guān)的并常與血液中檢測(cè)到GM-CSF相關(guān)。組3和4中70％的病人ANC顯著升高(≥5,000/μL)(相對(duì)組1和2中的17％；圖21A)；觀察到單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的升高。血小板減少是劑量依賴的(圖22A)，但是不依賴周期(圖22B)。在周期1中ANC升高最多(圖22C)。2名病人發(fā)生淋巴細(xì)胞減少和白細(xì)胞減少(表7)。MTD時(shí)未發(fā)生顯著的轉(zhuǎn)氨酶升高(圖21B)。

3.藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)終點(diǎn)

a.血清GM-CSF

13名病人在基線時(shí)血清GM-CSF呈陰性。MTD時(shí)注射JX-594后3名病人檢測(cè)到GM-CSF的時(shí)間>48小時(shí)(46-16,000pg/mL)(圖21A)，濃度高于那些皮下注射GM-CSF蛋白的病人(Cebon等，1992)。GM-CSF濃度與WBC誘導(dǎo)相關(guān)(圖21A)。

b.中和抗體(NAb)

79％病人在基線時(shí)抗JX-594抗體(NAb)水平很低(<10)或檢測(cè)不到。所有病人在22天內(nèi)產(chǎn)生NAb。45％病人在首次給藥后NAb滴度達(dá)到峰值，而55％則繼續(xù)增加。

未發(fā)現(xiàn)基線值或治療后NAb滴度與任一臨床或?qū)嶒?yàn)室終點(diǎn)，包括JX-594藥代動(dòng)力學(xué)、復(fù)制、GM-CSF表達(dá)或效果的相關(guān)性。3名有目標(biāo)RECIST腫瘤反應(yīng)的病人具有可檢測(cè)的基線NAb滴度以及治療后高滴度(32,000、32,000和10,000)。此外，在高水平NAb誘導(dǎo)后對(duì)兩名病人新產(chǎn)生的頸部轉(zhuǎn)移進(jìn)行治療，兩者的腫瘤都產(chǎn)生目標(biāo)反應(yīng)(如下；表8和圖24B)。

表8.目標(biāo)腫瘤反應(yīng)和生存時(shí)間

¹第一個(gè)數(shù)字反映劑量水平(如103在劑量水平1中)

²RECIST標(biāo)準(zhǔn)：部分反應(yīng)(PR)是最大直徑減少≥30％；疾病進(jìn)展(PD)是增加≥20％；疾病穩(wěn)定則是直徑變化在PR和PD范圍之間。

³Choi標(biāo)準(zhǔn)：最大直徑減少≥10％或密度減少≥15％；+表明反應(yīng)

⁴腫瘤標(biāo)記物反應(yīng)的定義：減少≥50％：PR；增加≥25％：PD；減少<50％或增加25％：SD；在病人201、301、402中標(biāo)記物為甲胎蛋白(AFP)；在病人401中為PIVKA2；在病人302、305、306中為癌胚抗原(CEA)。

⁵生存期：+表明沒有癌癥相關(guān)死亡；m：月；d:日

⁶仍然生存

⁷HU：杭斯菲爾德單位(Hounsfield unit)

⁸第3周進(jìn)行CT掃描顯示腫瘤進(jìn)展

c.細(xì)胞因子

白介素6、IL-10和TNF-α在3小時(shí)達(dá)到峰值。也觀察到較晚的峰值(3–22天)。周期2-8中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)強(qiáng)于周期1。白介素-6誘導(dǎo)與血清中GM-CSF相關(guān)。未觀察到IL-1β和IL-4誘導(dǎo)。

d. JX-594藥代動(dòng)力學(xué)

所有病人在注射后(50個(gè)周期中的49個(gè))立即檢測(cè)到JX-594基因組。濃度與劑量相關(guān)(圖23A和23B)，在15分鐘內(nèi)減少～50％，在4-6小時(shí)內(nèi)減少～90％。最初的清除速率不依賴劑量，也不依賴抗體滴度。在血液中注射的JX-594最初釋放和清除之后，經(jīng)常檢測(cè)到循環(huán)JX-594的延遲再度出現(xiàn)，這與復(fù)制相一致。15名病人中有12名(80％)在第3-22天檢測(cè)到基因組(血液或血漿)。第二峰值濃度常與劑量相關(guān)，藥代動(dòng)力學(xué)相似(圖23B)。在周期2-7中重復(fù)給藥后檢測(cè)到較低的第二濃度峰值(11名病人中的4名)。圖23C顯示了代表性的藥代動(dòng)力學(xué)。

e.非注射遠(yuǎn)端腫瘤位點(diǎn)中JX-594的散播、復(fù)制

在非注射腫瘤組織中檢測(cè)到JX-594，表明遠(yuǎn)端腫瘤選擇性的感染和復(fù)制(圖23D-F)。例如，一名病人的惡性腹水和胸膜滲出液比同時(shí)間點(diǎn)的血液中具有更高的基因組濃度(分別高17-倍和12-倍)和GM-CSF濃度(分別高24-倍和13-倍)(圖3D)。胸膜滲出液中的LacZ(+)細(xì)胞確認(rèn)了JX-594的感染(圖23E)。對(duì)另一病人進(jìn)行遠(yuǎn)端頸部腫瘤活檢，組織學(xué)檢驗(yàn)證明存在復(fù)制的JX-594(圖23F)。

f. JX-594脫落

在任一咽喉和尿液樣中未檢測(cè)到感染性JX-594。

g. JX-594的抗腫瘤效果

評(píng)價(jià)10名病人的目標(biāo)腫瘤反應(yīng)；未評(píng)價(jià)的病人有禁忌癥用以對(duì)比(2)或者未進(jìn)行治療后掃描(2)。9名(90％)有符合CT RECIST標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)反應(yīng)(30％)或疾病穩(wěn)定(60％)。8名病人(80％)有符合Choi標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)反應(yīng)(表8)。同時(shí)具有符合RECIST和Choi標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)的病人患有非小細(xì)胞肺癌(圖24A)、HCC和黑色素瘤(表8)。目標(biāo)反應(yīng)是持續(xù)的；反應(yīng)腫瘤位點(diǎn)未發(fā)生再次生長(隨訪4–18個(gè)月)。在肝臟中進(jìn)行4個(gè)預(yù)先周期后，對(duì)兩名病人原來未注射的頸部腫瘤進(jìn)行直接注射，盡管產(chǎn)生高水平的JX-594中和抗體，但仍然得到了Choi和/或RECIST反應(yīng)(表8，圖24B)；因此再次治療的效果是可行的。

同樣評(píng)價(jià)了遠(yuǎn)端非注射腫瘤的反應(yīng)。在7名有遠(yuǎn)端非注射腫瘤的病人中，6名病人出現(xiàn)符合RECIST標(biāo)準(zhǔn)的遠(yuǎn)端疾病穩(wěn)定；這些遠(yuǎn)端腫瘤的至進(jìn)展時(shí)間從6+到30+周。這些病人中的3名出現(xiàn)符合Choi標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)(n＝2)或符合PET-CT標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)(n＝1；減少25-100％；表9)。

表9.具有目標(biāo)腫瘤對(duì)照的病人的遠(yuǎn)端腫瘤反應(yīng)(RECIST PR或SD)

¹第一個(gè)數(shù)字反映劑量水平(如103在劑量水平1中)

²通過CT RECIST；+表明沒有癌癥相關(guān)的死亡

HU：杭斯菲爾德單位；LN：淋巴結(jié)；SC:鎖骨上；PA:耳前；CR：完全反應(yīng)；PR：部分反應(yīng)；SD：疾病穩(wěn)定；PD：疾病進(jìn)展。

至今，8名病人(57％)已經(jīng)存活至少8個(gè)月，4名超過1年并且1名超過20+個(gè)月。中位生存期是9個(gè)月。

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根據(jù)本公開，本說明書和權(quán)利要求書所描述的所有組合物和/或方法無需特別的試驗(yàn)就可以制備和實(shí)施。雖然本發(fā)明的組合物和方法是利用優(yōu)選實(shí)施方案來描述的，但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的組合物和/或方法以及本文所描述的方法的步驟或步驟的順序作出改動(dòng)。更具體地說，本文所描述的因子可用某些化學(xué)和物理相關(guān)的因子代替，但是可以得到相同或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是，所有這種相似的替代和修改都被認(rèn)為包含在權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。

參考文獻(xiàn)

下列參考文獻(xiàn)，在本文列舉的范圍內(nèi)提供示例性步驟或其它補(bǔ)充本文所列舉的細(xì)節(jié)，將其納入本文作參考。

美國專利4,554,101

美國專利4,683,202

美國專利4,684,611

美國專利4,952,500

美國專利5,073,627

美國專利5,302,523

美國專利5,322,783

美國專利5,384,253

美國專利5,399,363

美國專利5,464,765

美國專利5,466,468

美國專利5,538,877

美國專利5,538,880

美國專利5,543,158

美國專利5,550,318

美國專利5,563,055

美國專利5,580,859

美國專利5,589,466

美國專利5,591,616

美國專利5,610,042

美國專利5,633,016

美國專利5,641,515

美國專利5,656,610

美國專利5,702,932

美國專利5,736,524

美國專利5,739,169

美國專利5,780,448

美國專利5,789,215

美國專利5,798,339

美國專利5,801,005

美國專利5,824,311

美國專利5,824,348

美國專利5,830,880

美國專利5,846,225

美國專利5,846,233

美國專利5,846,945

美國專利5,925,565

美國專利5,928,906

美國專利5,935,819

美國專利5,945,100

美國專利5,981,274

美國專利5,994,624

Alcami和Smith，Cell.，71(1):153-167，1992.

Alcami等，J.Gen.Virol.，80:949-959，1999.

Alcami等，Sem.Virol.，5:419-427，1998.

Alcami等，Virology，74(23):11230-11239，2000.

Almendro等，J.Immunol.，157(12):5411-5421，1996.

Arap等，Cancer Res.，55(6):1351-1354，1995.

Arness等，Am.J.Epidemiol.，160:642-51，2004.

Austin-Ward和Villaseca，Revista Medica de Chile，126(7):838-845，1998.

Ausubel等，刊于《分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)方案》(In:Current Protocols in Molecular Biology),約翰威利父子公司(John,Wiley&Sons,Inc)，紐約，16.15.1-16.18.10，1996.

Bajorin等，J.Clin.Oncol.，6(5):786-792，1988.

Bakhshi等，Cell，41(3):899-906，1985.

Blasco和Moss，J.Virology，66(7):4170-4179，1992.

Blasco等，J.Virology，67(6):3319-3325，1993.

Boyd等，Cell，79:341-351，1994.

Brizel，Semin.Radiat.Oncol.，8(4):237-246，1998.

Bukowski等，Clinical Cancer Res.，4(10):2337-2347，1998.

Caldas等，Cancer Res.，54:3568-3573，1994.

Carbonelli等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.，177(1):75-82，1999.

Cebon等，Br.J.Haematol.，80(2):144-150，1992.

Chandler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(8):3596-601，1997.

Chen和Okayama，Mol.Cell Biol.，7(8):2745-2752，1987.

Cheng等，Cancer Res.，54(21):5547-5551，1994.

Choi等，J.Clin.Oncol.，25(13):1753-1759，2007.

Christodoulides等，Microbiology，144(Pt 11):3027-3037，1998.

Cleary和Sklar，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(21):7439-7443，1985.

Cleary等，J.Exp.Med.，164(1):315-320，1986.

Cocea，Biotechniques，23(5):814-816，1997.

Colamonici等，J.Biol.Chem.，270:15974-15978，1995.

Culver等，Science，256(5063):1550-1552，1992.

Curran，Seminars Radiation Oncol.，8(4Supp1):2-4，1998.

Davidson等，J.Immunother.，21(5):389-398，1998.

Dillman，Cancer Biother.Radiopharm.，14(1):5-10，1999.

Dobbelstein和Shenk，J.Virology，70:6479-6485，1996.

Durrant和Spendlove，Curr.Opin.Investig.Drugs，2(7):959-66，2001.

Eliopoulos等，Oncogene，11(7):1217-28，1995.

Erlandsson，Cancer Genet.Cytogenet.，104(1):1 18，1998.

Fechheimer等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，84:8463-8467，1987.

Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76:3348-3352，1979.

GenBank登錄號(hào)NC001559

Gnant等，Ann Surg，230(3):352-360，1999.

Gnant等，Cancer Res.，59(14):3396-403，1999.

Gnant等，J.Natl.Cancer Inst.，91(20):1744-1750，1999.

Goebel等，Virology，179(1):247-266，517-563，1990.

Gopal，Mol.Cell Biol.，5:1188-1190，1985.

Graham和Van Der Eb，Virology，52:456-467，1973.

Graham等，Virology，229(1):12-24，1997.

Gross等，Genes Dev.，13(15):1899-911，1999.

Gross等，J.Biol.Chem.，274:1156–1163，1999.

Hanibuchi等，Int.J.Cancer，78(4):480-485，1998.

Harland和Weintraub，J.Cell Biol.，101(3):1094-1099，1985.

Heise等，Cancer Gene Ther.，6(6):499-504，1999.

Heise等，Cancer Res.，59(11):2623-2628，1999.

Hellstrand等，Acta Oncologica，37(4):347-353，1998.

Hermiston，J.Clin.Invest.，105:1169-1172，2000.

Ho等，J.Biol.Chem.，27:7765-7769，1998.

Homey等，Nature.Rev.Immunol.，2:175-184，2002.

Hui和Hashimoto，Infection Immun.，66(11):5329-5336，1998.

Hussussian等，Nat.Genet.，8(1):15-21，1994.

Ikeda等，Nat.Med.，5(8):881-7，1999.

Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.，13:3101-3109，1985.

Irie和Morton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(22):8694-8698，1986.

Irie等，Lancet.1(8641):786-787，1989.

Isaacs等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(2):628-32，1992.

Johnson和Hamdy，Oncol.Rep.，5(3):553-557，1998.

Ju等，Gene Ther.，7(19):1672-1679，2000.

Ju等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，59(3):241-250，2000.

Kaeppler等，Plant Cell Reports，9:415-418，1990.

Kamb等，Nat.Genet.，8(1):23-26，1994.

Kamb等，Science，2674:436-440，1994.

Kaneda等，Science，243:375-378，1989.

Kato等，J.Biol.Chem.，266:3361 3364，1991.

Kay等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(9):4686-4691，1997.

Kerr等，Br.J.Cancer，26(4):239-257，1972.

Kettle等，J.Gen.Virology，78:677-685，1997.

Kirn等，Nat.Med.，7:781-787，2001.

Kolmel，J.Neurooncol.，38(2-3):121-125，1998.

Kraus等，F(xiàn)EBS Lett.，428(3):165-170，1998.

Kulesh等，J.Clin.Microbiol.，42(2):601-609，2004.

Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157(1):105 132，1982.

Lareyre等，J.Biol.Chem.，274(12):8282-8290，1999.

Lee等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，238(2):462-467，1997.

Levenson等，Hum.Gene Ther.，9(8):1233-1236，1998.

Liebermann，Oncogene，17(10):1189-94，1998.

Macejak和Sarnow，Nature，353:90-94，1991.

Magi-Galluzzi等，Anal.Quant.Cytol.Histol.，20(5):343-350，1998.

Mangray和King，F(xiàn)ront Biosci.，3:D1148-1160，1998.

Marsters等，Recent Prog.Horm.Res.，54:225-234，1999.

Mastrangelo等，Cancer Gene Ther.，6(5):409-422，1999.

Mastrangelo等，Cancer Treat Res.，94:35-50，1998.

Mayer等，Radiat.Oncol.Investig.，6(6):281-288，1998.

McCart等，Gene Ther.，7(14):1217-23，2000.

Mitchell等，Ann.NY Acad.Sci.，690:153-166，1993.

Mitchell等，J.Clin.Oncol.，8(5):856-869，1990.

Mori等，Cancer Res.，54(13):3396-3397，1994.

Morton等，Arch.Surg.，127:392 399，1992.

Moss，刊于《費(fèi)爾茲病毒學(xué)》中(In:Fields Virology.)，費(fèi)爾茲(編)(Fields(Ed.))，立品科特-瑞文出版社(Lippincott-Raven Publishers):費(fèi)城，2637-2672，1996.

Mossman等，Virology，215(1):17-30，1996.

Mougin等，Ann.Biol.Clin.，(Paris)56(1):21-8，1998.

Mumby和Walter，Cell Regul.，2(8):589-98，1991.

Natoli等，Biochem.Pharmacol.，56(8):915-20，1998.

Nicolau和Sene Nobori等，1994

Nomoto等，Gene，236(2):259-271，1999.

Ochi等，Am.J.Gastroenterol.，93(8):1366-1368，1998.

Ohara，Gan To Kagaku Ryoho，25(6):823-828，1998.

Okamoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(23):11045-11049，1994.

Omirulleh等，Plant Mol.Biol.，21(3):415-428，1993.

Orlow等，Cancer Res，54(11):2848-2851，1994.

PCT申請(qǐng)WO 94/09699

PCT申請(qǐng)WO 95/06128

Pelletier和Sonenberg，Nature，334(6180):320-325，1988.

Pietras等，Oncogene，17(17):2235-2249，1998.

Puhlmann等，Cancer Gene Ther.，7:66-73，2000.

Qin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(24):14411-14416，1998.

Ravindranath和Morton，Intern.Rev.Immunol.，7:303 329，1991.

《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences”)第15版，1035-1038和1570-1580，1990.

Rippe,等，Mol.Cell Biol.，10:689-695，1990.

Rosel等，J.Virol.，60(2):436-449，1986.

Rosenberg等，Ann.Surg.210(4):474-548，1989.

Rosenberg等，N.Engl.J.Med.，319:1676，1988.

Sambrook等，刊于《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular cloning：a laboratory manual)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港，1989.

Saraiva和Alcami，J.Virology，75(1):226-33，2001.

Serrano等，Nature，366:704-707，1993.

Serrano等，Science，267(5195):249-252，1995.

Sinkovics和Horvath，J.Clin.Viro.，16:1-15，2000.

Smith等，Immunol.Rev.，159:137-154，1997.

Smith等，J.Clin.Oncol.，18:2046-2052，2000.

Smith等，Neuron.，20:1093-1102，1998.

Solyanik等，Cell.Prolif.，28(5):263-278，1995.

Spriggs等，Cell.，71(1):145-52，1992.

Stokke等，Cell.Prolif.，30(5):197-218，1997.

Symons等，Cell，81:551-560，1995.

Todo等，Cancer Res.，61:153-161，2001.

Tsujimoto和Croce，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(14):5214-5218，1986.

Tsujimoto等，Nature，315:340-343，1985.

Tsujimoto等，Science，228(4706):1440-1443，1985.

Tsumaki等，J.Biol.Chem.，273(36):22861-22864，1998.

Upton等，Science，258(5086):1369-1372，1992.

Upton等，Virology，184(1):370-82，1991.

Vanderplasschen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(13):7544-7549，1998.

Vicari和Caus，Cytokine Growth Factor Rev.，13:143-154，2002.

Vogelstein和Kinzler，Cell，70(4):523-6，1992.

Wallach等，Annu.Rev.Immunol.，17:331-367，1999.

Wold等，J.Virol..52:307-313，1984.

Wold等，Trends Microbiol.，2:437-443，1994.

Wong等，Gene，10:87 94，1980.

Wu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，233(1):221-226，1997.

Zhao-Emonet等，Biochim.Biophys.Acta，1442(2-3):109-119，1998.