金蟬花多糖及其在制備神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及金蟬花多糖及其在制備神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物中的應(yīng)用。所述金蟬花多糖按照下述方法獲得：干燥金蟬花藥材，粉碎過(guò)藥典2號(hào)篩，粉末在90℃下用水回流提取兩次，每次2小時(shí)，提取液減壓濃縮后，加無(wú)水乙醇，4℃一25℃下過(guò)夜沉淀；3000r/min離心10一30min；干燥沉淀部分得金蟬花多糖(JCHCPS)。所得金蟬花多糖可明顯抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的衰老損傷，阻止細(xì)胞LDH釋放，提高細(xì)胞的存活率，能降低細(xì)胞內(nèi)的氧自由基水平，提高谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并且在清除DPPH·和超氧陰離子(O2·-)自由基實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。
【專利說(shuō)明】金蟬花多糖及其在制備神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及從中藥材金蟬花中制備具有神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性的部位及在制備神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)人口老齡化加劇，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率日益增高，衰老與神經(jīng)退行性疾病的研究已成為神經(jīng)科學(xué)的熱點(diǎn)。人體的衰老，往往會(huì)導(dǎo)致加快神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目的減少，從而產(chǎn)生一些以阿爾茨海默病(Alzheimer’ s Disease, AD)為代表的神經(jīng)退行性疾病。目前，神經(jīng)退行性疾病，病因不明，而且尚無(wú)有效的治療措施，僅有少數(shù)幾個(gè)藥物可用于治療神經(jīng)退行性疾病。
[0003]金蝶花為麥角菌科真菌大蝶草(Cordyceps cicadae Shing)及其寄主山蝶(Cicada flammata Dist)若蟲(chóng)形成的干燥復(fù)合體,其性味甘寒，與冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型同屬，功效相近。甄權(quán)所著《藥性論》云:“其蛻殼，頭上有一角，如冠狀，謂之蟬花，最佳。味甘寒，無(wú)毒。主小兒天吊,驚癇瘈,夜啼心悸。《證類本草》蟬花能解痙、散風(fēng)熱”?！侗静輬D經(jīng)》曾有記載:“今蜀中有一種蟬，其蛻殼上有一角，如花冠狀，謂之蟬花。西人有赍至都下者，醫(yī)工云，入藥最奇”?！侗静菥V目》中亦記載:“蟬花可治療驚癇 ，夜啼心悸，功同蟬蛻”?，F(xiàn)代藥理研究表明，金蟬花為傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有明顯的抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、改善腎功能、抗腫瘤等藥理活性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，金蟬花中主要含有多糖、腺苷、蟲(chóng)草酸、氨基酸、多球殼菌素、麥角甾醇等多種化學(xué)成分。
[0004]蟬花水煎劑能明顯延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠的游泳時(shí)間，明顯提高常壓缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間及在高溫下的存活時(shí)間，表明蟬花水煎劑有抗應(yīng)激、抗疲勞的作用；機(jī)體處在不良環(huán)境下，蟬花水煎劑能促進(jìn)內(nèi)環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定，從而增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)有害刺激的抵抗力。蟬花水煎劑高劑量組對(duì)雄性果蠅能顯著地延長(zhǎng)壽命，表明其有一定的抗衰老作用(王硯，等.蟬花藥理作用的初步探討[J].浙江中醫(yī)雜志，2001,36(5):219-220)。金蟬花總多糖能促進(jìn)造血和免疫功能，減輕老齡大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，與抗衰老有關(guān)(楊介鉆，等.蟬擬青霉多糖抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2004，24(4) =343-344.)
[0005]鑒于蟬花和名貴中藥冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型同屬真菌(蟲(chóng)草屬)，且蟬擬青霉有免疫等多種藥理作用，并具有毒性小、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，有希望作為冬蟲(chóng)夏草的代用品，但對(duì)其相應(yīng)的活性功能成分尚未十分明確，大多的藥理實(shí)驗(yàn)僅停留在原藥材或粗提物的基礎(chǔ)上，尚無(wú)金蟬花提取物進(jìn)一步精制至活性部位并用于制備神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物的報(bào)道。
[0006]為了測(cè)試和評(píng)估本發(fā)明金蟬花活性部位的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老方面的應(yīng)用潛力，已使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法測(cè)試藥材各部位的生物活性。這些已知的測(cè)試方法包括谷氨酸損傷神經(jīng)細(xì)胞PC12衰老模型，抗氧化模型等。結(jié)果表明選定的金蟬花多糖活性部位具有較好的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是提供金蟬花具有神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性應(yīng)用潛力的有效部位。
[0008]金蟬花提取物的各部位經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性篩選，確認(rèn)金蟬花水提物的多糖部位具有可明顯抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的衰老損傷，阻止細(xì)胞LDH釋放，提高細(xì)胞的存活率，能降低細(xì)胞內(nèi)的氧自由基水平，提高谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，顯示出良好的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性，并且在清除DPPH.和超氧陰離子(02‘_)自由基實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性，表明金蟬花的多糖部位具有良好的抗氧化作用，具有抗衰老的潛力。
[0009]因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及提供金蟬花多糖活性部位及其制備方法:金蟬花多糖制備方法，按照下述步驟進(jìn)行:干燥金蟬花藥材，粉碎過(guò)藥典2號(hào)篩，粉末在90°C下用水回流提取兩次，每次2小時(shí)，提取液減壓濃縮后，加無(wú)水乙醇，4°C一 25°C下過(guò)夜沉淀；3000r/min離心10 — 30min ;干燥沉淀部分得金蝶花多糖(JCHcps)。
[0010]本發(fā)明第二個(gè)方面涉及對(duì)所述金蟬花多糖活性部位用于制備神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物的用途。
[0011]為了檢測(cè)本發(fā)明所得的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性組分的性能，將本發(fā)明所得的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性組分按照配制成50~200 μ g/ml藥液，用于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞的PC12細(xì)胞處理，分別觀察樣品在不同劑量下對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老的保護(hù)作用。結(jié)果表明金蟬花多糖活性部位具有顯著的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性，可用于制備治療神經(jīng)退行性疾病等疾病的輔助藥物；同時(shí)在體外模型中具有顯著的抗氧化活性，表明金蟬花多糖活性部位在制備抗衰老藥物方面具有良好的潛力。
[0012]本發(fā)明第三個(gè)方面涉及提供金蟬花活性部位與藥學(xué)上可接受的輔料組成的藥物組合物。
[0013]金蟬花活性部位可單獨(dú)或幾種部位組合，再進(jìn)一步與輔料組合，劑型包括:片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑等。
[0014]本發(fā)明所述的載體或賦形劑包括藥劑學(xué)常規(guī)應(yīng)用的載體和賦形劑，例如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑、粘合劑等。
[0015]下面的實(shí)施例和藥理活性實(shí)驗(yàn)是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，以下所列舉的實(shí)施例不以任何方式構(gòu)成限制。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1金蟬花多糖(JCHcps)的制備:
[0017]取粉碎過(guò)藥典2號(hào)篩干燥金蟬花粉末80g，在90°C下，用800mL水回流提取兩次，每次2小時(shí)，提取液減壓濃縮后，加4倍體積的無(wú)水乙醇，置4°C冰箱過(guò)夜沉淀；3000r/min離心15min ;干燥沉淀部分得JCHepJ.02g。
[0018]實(shí)施例2JCHePS對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老的保護(hù)作用
[0019](I)MTT法、LDH法測(cè)定細(xì)胞活力:
[0020]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞(由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)，以2 X IO4/孔接種于96孔培養(yǎng)板，200μ 1/L。在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、藥物處理組。即對(duì)照組(不含Glu的完全培養(yǎng)基)；模型組(完全培養(yǎng)基+Glu);藥物處理組(完全培養(yǎng)基 +JCHePS+Glu，濃度分別為 200 μ g/mL, 100 μ g/mL,、50 μ g/mL，用培養(yǎng)液稀釋)。JCHcps預(yù)處理Ih后加Glu孵育24h每組設(shè)4個(gè)平行孔。培養(yǎng)24h后，每孔加5g/L MTT20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)上清液，做LDH實(shí)驗(yàn)。每孔加入DMS0150 μ L，使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)570nm處讀取吸光度(OD)。取4孔OD值的均數(shù)按公式計(jì)算細(xì)胞存活率結(jié)果見(jiàn)表1。細(xì)胞存活率％ =實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組ODX 100%。數(shù)據(jù)表明，JCHcps能保護(hù)Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷作用。
[0021]收集培養(yǎng)液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)(購(gòu)買于南京建成生物工程研究所)的活性結(jié)果見(jiàn)表2。LDH的釋放抑制率按下式計(jì)算:LDH抑制率(％ ) = (LDHtsa組-LDH給難)/ (LDH模型組-LDH正常組)X 100%。數(shù)據(jù)表明，JCHgps能抑制Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞LDH釋放。
[0022]表1MTT測(cè)定JCHcps對(duì)Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞生存率的影響(7±.s’, n = 4)
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種金蟬花多糖，具有神經(jīng)保護(hù)和抗衰老活性，其特征在于所述金蟬花多糖按照下述方法獲得:干燥金蟬花藥材，粉碎過(guò)藥典2號(hào)篩，粉末在90°C下用水回流提取兩次，每次2小時(shí)，提取液減壓濃縮后，加無(wú)水乙醇，4°C一 25°C下過(guò)夜沉淀；3000r/min離心10 —30min ;干燥沉淀部分得金蝶花多糖。
2.權(quán)利要求1所述金蟬花多糖在制備神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物中的用途。
3.—種以金蟬花制備的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老藥物，其特征在于該藥物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的金蟬花多糖。
4.一種藥物制劑，其特征在于含有有效劑量的權(quán)利要求1所述金蟬花多糖和一種或多種藥學(xué)上可接受的藥 物賦形劑，或可與金蟬花多糖組方的其他藥物。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK103992416SQ201410232441
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】歐陽(yáng)臻, 張魏琬麒, 趙明, 王吉標(biāo), 尚磊, 王璠, 汪愿 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)