本發(fā)明涉及一種載體，具體的說，涉及一種用于肺吸入殼聚糖基納米靶向聚合粒子及其制備方法，屬于生物材料的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

納米制劑是近年來發(fā)展起來的新型的給藥系統(tǒng)，由天然或合成的高分子載體材料制備而成的，其粒度在1到1000 nm的固態(tài)顆粒。由于它的粒徑小，表面能大，有利于附著在粘膜等部位更容易被細胞吞噬，并且能夠?qū)ζ溥M行靶向修飾，使其主動靶向到靶器官，增加了在細胞內(nèi)的高積累。還可以提高藥物的溶解性和生物利用度，改變給藥效率。

西妥昔單抗是EGF受體的單克隆抗體，許多研究表明，多種腫瘤細胞相比于正常細胞表現(xiàn)出EGFR過度表達，所以使用能夠與EGFR特異性靶向結(jié)合的西妥昔單抗修飾在納米粒表面，使其具有主動靶向癌細胞的能力。

殼聚糖是一種天然存在的陽離子多糖。具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且殼聚糖的滲透性和粘膜粘附性使其成為肺部給藥的良好載體。殼聚糖作為藥物載體可以控制藥物釋放，延長藥物療效，增加藥物與粘膜的接觸時間，提高藥物的穩(wěn)定性。殼聚糖由于其陽離子的性質(zhì)能夠與帶負電荷的物質(zhì)聚合自組裝而形成殼聚糖納米粒，而且?guī)д姾傻臍ぞ厶羌{米粒氣管內(nèi)給藥后更容易粘附到到支氣管上皮細胞，提高了被細胞攝取的能力。

肺部的特殊生理結(jié)構(gòu)決定了其給藥途徑的優(yōu)勢。肺部有著巨大的吸收表面積、豐富的毛細血管和極小的轉(zhuǎn)運距離，并且還無肝臟的首過效應(yīng)，這些條件都決定了肺部是藥物吸收的良好場所。肺吸入給藥既能起到局部作用又能起到全身作用，還能夠提高生物利用度。并且能夠?qū)⒅委熕幬镏苯虞斔偷讲≡顓^(qū)，減少了藥物在其他組織的分布。

在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下不足：由于肺吸入給藥要求良好的粉霧劑特性、有效的肺部沉積率、載體要有良好的安全性及適宜的空氣動力學(xué)粒徑（1-5 μm之間）。肺吸入給藥這種特殊性，以及殼聚糖納米粒較小的空氣動力學(xué)直徑，會導(dǎo)致納米顆粒隨呼氣呼出而在肺部沉積量較少，其他載體生物利用度低、無靶向性，同時又由于納米粒難以粉末化使其在肺部粉霧劑給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用受到限制；生物相容性差，被細胞吞噬率低；容易引起毒性反應(yīng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于肺吸入殼聚糖基納米靶向聚合粒子，以實現(xiàn)以下發(fā)明目的：

（1）本發(fā)明制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為2～10 μm，粒徑分布均勻，所負載的殼聚糖納米粒的粒徑為50～201 nm；且生物相容性良好。

（2）本發(fā)明制備的聚合粒子，提高了穩(wěn)定性并且增加了被細胞吞噬的能力，A549細胞吞噬率2 h達到50-60%，增加生物利用度。

（3）本發(fā)明制備的聚合粒子，在肺部環(huán)境中容易崩解，崩解時限為15 min，使納米粒釋放，納米粒在肺部的滯留率達50～75%。

（4）本發(fā)明制備的聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)。

本發(fā)明另一種目的是提供一種用于肺吸入殼聚糖基納米靶向聚合粒子的制備方法，具有操作簡便、工藝穩(wěn)定、易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。

本文所述的納米聚合粒子實質(zhì)上是一種以聚合粒子為基體（稱為一級載體）其負載著許多殼聚糖納米粒（稱為二級載體）的一種復(fù)合聚合粒子。該聚合粒子吸入人體后，經(jīng)過酶等體內(nèi)環(huán)境的作用，聚合粒子形態(tài)的一級載體崩解，能像集束炸彈一樣釋放出負載的殼聚糖納米粒使之到肺底部沉積，從而提高了藥物的利用率。

為解決以上問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種用于肺吸入殼聚糖基納米靶向聚合粒子，所述聚合粒子，

包括以下成分：殼聚糖或其衍生物、三聚磷酸鈉、單克隆抗體西妥昔單抗、磷脂或其衍生物、羥丙基β-環(huán)糊精、賦形劑。

以下是對上述技術(shù)方案的進一步改進：

所述聚合粒子，包括以下重量份的成分：

殼聚糖或其衍生物1～5份

三聚磷酸鈉1～5份

單克隆抗體西妥昔單抗0.01～0.03份

磷脂或其衍生物1～3份

羥丙基β-環(huán)糊精1～5份

賦形劑1～6份。

所述聚合粒子的粒徑為2～10 μm，負載的殼聚糖納米粒為50～201 nm。

所述殼聚糖納米粒的粒徑為251 nm～426 nm，其中最優(yōu)為308 nm；

所述殼聚糖納米粒的粒徑為112 nm～157 nm，其中最優(yōu)為127 nm；

所述殼聚糖納米粒的粒徑為80 nm～108 nm，其中最優(yōu)為90 nm。

所述殼聚糖或其衍生物為高、中、低分子量的殼聚糖或其衍生物中的一種；

所述殼聚糖或其衍生物，為殼聚糖、殼寡糖、殼聚糖季銨鹽、羧甲基殼聚糖中的一種或幾種。

所述高分子量的殼聚糖或其衍生物，分子量范圍為1000～1250kDa；

所述中分子量的殼聚糖或其衍生物，分子量范圍為390～700kDa；

所述低分子量的殼聚糖或其衍生物，分子量范圍為100～160kDa；

所述殼聚糖或其衍生物的脫乙酰度為85%～98%；

所述殼聚糖衍生物的取代度為50%～90%。

所述高分子量的殼聚糖或其衍生物，分子量最優(yōu)為1120kDa；

所述中分子量的殼聚糖或其衍生物，分子量最優(yōu)為660kDa；

所述低分子量的殼聚糖或其衍生物，分子量最優(yōu)為120kDa；

所述殼聚糖或其衍生物，脫乙酰度最優(yōu)為96%；

所述殼聚糖衍生物，取代度最優(yōu)為63%。

所述磷脂或其衍生物為大豆磷脂、卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC、1,2-棕櫚酰磷脂酰甘油鈉鹽DPPG、二硬質(zhì)酰磷脂酸膽堿DSPC、二硬脂?；字Ｒ掖及稤SPE、二棕櫚?；字Ｒ掖及稤PPE中的一種或幾種；

所述賦形劑為甘露醇、海藻糖、乳糖、白芨多糖、枸杞多糖、亮氨酸及其衍生物中的一種或幾種。

一種用于肺吸入殼聚糖基納米靶向聚合粒子的制備方法，包括以下步驟：制備殼聚糖納米粒懸浮液、修飾單抗、制備賦形劑溶液、混合、噴霧干燥。

所述制備殼聚糖納米粒懸浮液，在持續(xù)勻速100-1000 r/min的攪拌速度下，將三聚磷酸鈉、殼聚糖分別用溶劑溶解，配制成1-4 mg/mL的溶液，然后以10-60滴/min的速度，將三聚磷酸鈉溶液逐滴滴入殼聚糖溶液中，得到殼聚糖納米粒懸浮液。

所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺與殼聚糖或其衍生物的質(zhì)量比例為：4:6:15-25。

所述溶劑為色譜級乙醇、甲醇、乙酸、乙腈、純凈水中的一種或幾種。

所述修飾單抗，將西妥昔單抗與殼聚糖納米粒懸浮液混合后，再與EDC和NHS反應(yīng)24小時，蒸餾水透析后，過濾，濃縮，調(diào)節(jié)濾液濃度為0.1%～2％，作為A液。

所述透析，用3500Da透析袋透析3天；

所述過濾，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

所述制備賦形劑溶液，將磷脂或其衍生物、羥丙基β-環(huán)糊精、賦形劑溶于蒸餾水中，配置成賦形劑含量為0.25-0.75%的溶液作為B液；

所述混合，將A液在100-600 r/min連續(xù)攪拌的情況下，倒入B液中持續(xù)攪拌，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，得濾液C。

所述方法，還包括噴霧干燥，所述噴霧干燥，將C液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入噴霧干燥器，以氮氣做動力控制噴霧干燥條件制成粉末聚合粒子；

所述噴霧干燥條件為：進口溫度90～150℃，出口溫度80～110℃，噴嘴流速200～900 L/h，進樣速度5～50 mL/min，噴霧干燥后制成納米聚合粒子。

進一步優(yōu)選，所述噴霧干燥，進口溫度140℃，出口溫度100℃，噴嘴流速520 L/h，進樣速度55 mL/min，噴霧干燥后得納米聚合粒子。

進一步優(yōu)選，所述噴霧干燥條件為：進口溫度125℃，出口溫度90℃，噴嘴流速300 L/h，進樣速度30 mL/min，噴霧干燥后得納米聚合粒子。

再進一步的優(yōu)化方案，噴霧干燥條件為：進口溫度125℃，出口溫度100℃，噴嘴流速300 L/h，進樣速度55 mL/min，噴霧干燥后得納米聚合粒子。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為2～10 μm，粒徑分布均勻，所負載的殼聚糖納米粒的粒徑為50～201 nm；且生物相容性良好。

（2）本發(fā)明制備的聚合粒子，提高了穩(wěn)定性并且增加了被細胞吞噬的能力，A549細胞吞噬率2 h達到50-60%，增加了生物利用度。

（3）本發(fā)明制備的聚合粒子，在模擬肺部濕度和溫度的條件下該聚合粒子24h時吸濕率基本達到平衡，平衡時的吸濕率為13～16%，崩解時限為14 min,由于吸濕率較高，會使吸入肺中的聚合粒子沉降后從而崩解，從而能夠釋放負載的殼聚糖納米粒，釋放的納米粒在肺部的滯留率為50～75%。

（4）本發(fā)明制備的聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)，小鼠急性毒性試驗結(jié)果，血液白細胞計數(shù)為3.0-3.2′10⁹/L，中性粒細胞為0.4-0.6′10⁹/L，淋巴細胞1.7-1.9′10⁹/L，與正常組無顯著性差異，與Triton X-100（陽性對照）組具有極顯著差異。

（5）本發(fā)明肺吸入殼聚糖基納米靶向聚合粒子有制備方法簡便、工藝穩(wěn)定，易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。

下面結(jié)合附圖和實施案例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的說明。下面結(jié)合附圖和實施案例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的說明。

附圖說明

附圖1為實施例1負載的殼聚糖納米粒透射電鏡的結(jié)果圖；

附圖2為實施例1負載著殼聚糖納米粒的聚合粒子的整體掃描電鏡結(jié)果圖；

附圖3為實施例1制備的聚合粒子負載著的殼聚糖納米粒的掃描電鏡圖；

附圖4為實施例1負載著殼聚糖納米粒聚合粒子的紅外結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1一種用于肺吸入的殼聚糖基靶向納米聚合粒子

所述納米聚合粒子，包括殼聚糖、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、卵磷脂、羥丙基β-環(huán)糊精和賦形劑；

所述殼聚糖，分子量為1120Kda；脫乙酰度96%，粉末狀；

所述磷脂為卵磷脂；

所述賦形劑為乳糖；

所述殼聚糖、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、卵磷脂、羥丙基β-環(huán)糊精、乳糖質(zhì)量比為5:1:0.01:2:1:5；

所述肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的制備方法，包括以下步驟：

（1）制備殼聚糖溶液

稱取500 mg殼聚糖，溶解在250 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，制備成2 mg/mL的殼聚糖溶液。

（2）制備三聚磷酸鈉溶液

稱取三聚磷酸鈉100 mg，將三聚磷酸鈉溶于100 mL蒸餾水，配制成的1 mg/mL三聚磷酸鈉溶液。

（3）制備殼聚糖納米粒懸浮液

在持續(xù)勻速500 r/min的攪拌速度下，取1 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液100 mL，以20滴/min的速度逐滴滴入2 mg/mL的250 mL殼聚糖溶液中，控制殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為5:1，得到殼聚糖納米粒懸浮液。

（4）修飾單抗

稱取1 mg的西妥昔單抗，將西妥昔單抗與殼聚糖納米粒懸浮液混合后，再與80 mg的EDC和120 mg的NHS反應(yīng)24小時，蒸餾水透析3天后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濃縮至450 mL作為A液。

（5）制備賦形劑溶液

稱取200 mg的卵磷脂、100 mg的羥丙基β-環(huán)糊精和500 mg的乳糖溶于200 mL蒸餾水中，配置成賦形劑含量為0.25%的溶液作為B液。

（6）混合

將A液在500 r/min連續(xù)攪拌的情況下，倒入B液中持續(xù)攪拌，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

（7）噴霧干燥

將步驟（6）中所得的續(xù)濾液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴。噴霧干燥“一步”制得聚合粒子粉末，噴霧干燥條件為：噴霧干燥進口溫度125℃，出口溫度90℃，噴嘴流速300 L/h，進樣速度30 mL/min，在干燥器中收集聚合粒子粉末。即可得到肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子。

結(jié)果顯示，

本發(fā)明實施例1制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為1～8 μm，粒徑分布均勻，聚合粒子負載著大量殼聚糖納米粒，所負載的殼聚糖納米粒的粒徑為88～108 nm；且生物相容性良好。

本發(fā)明實施例1制備的聚合粒子在擬肺部濕度和溫度（濕度為60%RH，溫度25℃時）的環(huán)境下，隨著時間的延長，吸濕率明顯增加，2h的吸濕率為6.74%，12 h的吸濕率為12.56%，平衡時（24 h）的吸濕率達到了15.31%，崩解時限為16 min，作為一級載體的聚合粒子易崩解，釋放出負載的殼聚糖納米粒，釋放的納米粒在肺部的滯留率為48.47%。

本發(fā)明實施例1制備的聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)，小鼠急性毒性試驗結(jié)果，血液白細胞計數(shù)為(3.2±0.2)′10⁹/L，中性粒細胞為(0.6±0.1)′10⁹/L，淋巴細胞(1.9±0.1)′10⁹/L，與正常組無顯著性差異，與Triton X-100（陽性對照）組具有極顯著差異。

本發(fā)明實施例1制備的聚合粒子，A549細胞吞噬率2 h達到50.48%，比未修飾單抗的納米粒吞噬率增加了14%，極大提高了生物利用度。

表1 本發(fā)明聚合粒子的小鼠急性毒性試驗結(jié)果 (10⁹/L,`x±s)

實施例2一種用于肺吸入的殼聚糖基靶向納米聚合粒子

所述納米聚合粒子，包括殼聚糖衍生物、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、磷脂衍生物、羥丙基β-環(huán)糊精和賦形劑；

所述殼聚糖衍生物，分子量為1250Kda， 取代度為86%的羧甲基殼聚糖，粉末狀；

所述磷脂衍生物為，二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC

所述賦形劑為甘露醇；

所述羧甲基殼聚糖、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、DPPC、羥丙基β-環(huán)糊精、甘露醇質(zhì)量比為4:2:0.02:3:3:1；

所述肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子，其制備方法包括以下步驟：

（1）制備殼聚糖溶液

稱取400 mg羧甲基殼聚糖，將脫乙酰度96%的羧甲基殼聚糖粉末溶解在200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，制備成2 mg/mL的羧甲基殼聚糖溶液。

（2）制備三聚磷酸鈉溶液

稱取200 mg三聚磷酸鈉，將三聚磷酸鈉溶于200 mL蒸餾水，配制成的1mg/mL三聚磷酸鈉溶液。

（3）制備殼聚糖納米粒懸浮液

在持續(xù)勻速200 r/min的攪拌速度下，將2 mg/mL的羧甲基殼聚糖溶液200 mL, 1 mg/mL的三聚磷酸鈉100 mL溶液按照殼聚糖、三聚磷酸鈉質(zhì)量比為4:2的比例以10滴/min的速度逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，得到殼聚糖納米粒懸浮液。

（4）修飾單抗

稱取2 mg的西妥昔單抗，將西妥昔單抗與殼聚糖納米粒懸浮液混合后，再與80 mg的EDC和120 mg的NHS反應(yīng)24小時，蒸餾水透析3天后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濃縮至300 mL作為A液。

（5）制備賦形劑溶液

稱取300 mg的DPPC、300 mg的羥丙基β-環(huán)糊精和100 mg的乳糖溶于200 mL蒸餾水中，配置成賦形劑含量為0.05%的溶液作為B液。

（6）混合

將A液在300 r/min連續(xù)攪拌的情況下，倒入B液中持續(xù)攪拌，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

（7）噴霧干燥

將步驟（6）中所得的續(xù)濾液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴。噴霧干燥“一步”制得聚合粒子粉末，噴霧干燥條件為：噴霧干燥進口溫度140℃，出口溫度100℃，噴嘴流速520 L/h，進樣速度55 mL/min，在干燥器中收集聚合粒子粉末。即可得到肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子。

結(jié)果顯示：

本發(fā)明實施例2制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為3～11 μm，負載的殼聚糖納米粒的粒徑為126～149 nm，粒徑分布均勻，聚合粒子負載著大量殼聚糖納米粒，且生物相容性良好。

本發(fā)明實施例2制備的聚合粒子，在擬肺部濕度和溫度（濕度為60%RH，溫度25℃時）的環(huán)境下，隨著時間的延長的吸濕率明顯增加，2h的吸濕率為5.14%，12 h的吸濕率為10.18%，平衡時（24 h）的吸濕率達到了12.78%，崩解時限為18 min，作為一級載體的聚合粒子容易崩解，并能釋放出負載的殼聚糖納米粒，釋放的納米粒在肺部的滯留率為52.61%。

本發(fā)明實施例2制備的聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)，小鼠急性毒性試驗血液白細胞計數(shù)為(3.0±0.3)′10⁹/L，中性粒細胞為(0.4±0.1)′10⁹/L，淋巴細胞(1.7±0.2)′10⁹/L與正常組無顯著性差異，與Triton X-100（陽性對照）組具有極顯著差異。

本發(fā)明實施例2制備的聚合粒子，A549細胞吞噬率2h達到51.14%，比未修飾單抗的納米粒吞噬率增加了13%，極大提高了生物利用度。

實施例3一種用于肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子

所述納米聚合粒子，包括殼聚糖衍生物、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、磷脂衍生物、羥丙基β-環(huán)糊精和賦形劑；

所述殼聚糖衍生物，分子量為1000Kda取代度為90%的殼聚糖季銨鹽，粉末狀；

所述磷脂衍生物為，1,2-棕櫚酰磷脂酰甘油鈉鹽DPPG

所述賦形劑為海藻糖；

所述殼聚糖季銨鹽、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、DPPG、羥丙基β-環(huán)糊精、海藻糖質(zhì)量比為3:2:0.01:1:3:5；

所述肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子，其制備方法包括以下步驟：

（1）制備殼聚糖溶液

稱取300 mg殼聚糖季銨鹽，將脫乙酰度大于95%的殼聚糖粉末溶解在150 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，制備成2 mg/mL的殼聚糖溶液。

（2）制備三聚磷酸鈉溶液

稱取200 mg三聚磷酸鈉，將三聚磷酸鈉溶于200 mL蒸餾水，配制成的1mg/mL三聚磷酸鈉溶液。

（3）制備殼聚糖納米粒懸浮液

在持續(xù)勻速600 r/min的攪拌速度下，將2 mg/mL的殼聚糖溶液150 mL, 1 mg/mL的三聚磷酸鈉200 mL溶液按照殼聚糖、三聚磷酸鈉質(zhì)量比為3:2的比例以30滴/min的速度逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，得到殼聚糖納米粒懸浮液。

（4）修飾單抗

稱取西妥昔單抗1 mg，將西妥昔單抗與殼聚糖納米粒懸浮液混合后，再與80 mg的EDC和120 mg的NHS反應(yīng)24小時，蒸餾水透析3天后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濃縮至350 mL作為A液。

（5）制備賦形劑溶液

稱取100 mg 的DPPG，300 mg的羥丙基β-環(huán)糊精和500 mg的海藻糖溶于200 mL蒸餾水中，配置成賦形劑含量為0.25%的溶液作為B液。

（6）混合

將A液在600 r/min連續(xù)攪拌的情況下，倒入B液中持續(xù)攪拌，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

（7）噴霧干燥

將步驟（6）中所得的續(xù)濾液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴。噴霧干燥“一步”制得聚合粒子粉末，噴霧干燥條件為：噴霧干燥進口溫度125℃，出口溫度100℃，噴嘴流速300 L/h，進樣速度55 mL/min，在干燥器中收集聚合粒子粉末。即可得到肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子。

結(jié)果顯示：

本發(fā)明實施例3制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為2～14 μm，所負載的殼聚糖納米粒的粒徑為50～163 nm，粒徑分布均勻，聚合粒子負載著大量殼聚糖納米粒，且生物相容性良好。

本發(fā)明實施例3聚合粒子，在擬肺部濕度和溫度（濕度為60%RH，溫度25℃時）的環(huán)境下，隨著時間的延長的吸濕率明顯增加，2 h吸濕率為3.26%，12 h吸濕率為8.97%，平衡時（24 h）的吸濕率達到了13.55%，崩解時限為13 min，作為一級載體的聚合粒子容易崩解，并能釋放出負載的殼聚糖納米粒，釋放的納米粒在肺部的滯留率為63.27%。

本發(fā)明實施例3聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)，小鼠急性毒性試驗血液白細胞計數(shù)為(3.1±0.1)′10⁹/L，中性粒細胞為(0.5±0.2)′10⁹/L，淋巴細胞(1.8±0.1)′10⁹/L與正常組無顯著性差異，與Triton X-100（陽性對照）組具有極顯著差異。

本發(fā)明實施例3聚合粒子，A549細胞吞噬率2h達到59.26%比未修飾單抗的納米粒吞噬率增加了18%，極大提高了生物利用度。

實施例4一種用于肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子

所述納米聚合粒子，包括殼聚糖衍生物、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、磷脂衍生物、羥丙基β-環(huán)糊精和賦形劑；

所述殼聚糖衍生物，分子量為700Kda取代度為63%的羧甲基殼聚糖，粉末狀；

所述磷脂衍生物為，二硬質(zhì)酰磷脂酸膽堿DSPC

所述賦形劑為海藻糖與殼寡糖比例為4:1；

所述殼聚糖季銨鹽、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、DSPC、羥丙基β-環(huán)糊精、海藻糖與殼寡糖質(zhì)量比為3:2:0.03:1:5:(4:1)；

肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子，所述制備方法包括以下步驟：

（1）制備殼聚糖溶液

稱取300 mg取代度為63%的羧甲基殼聚糖，溶解在150 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，制備成2 mg/mL的殼聚糖溶液。

（2）制備三聚磷酸鈉溶液

稱取200 mg三聚磷酸鈉，將三聚磷酸鈉溶于200 mL蒸餾水，配制成的1 mg/mL三聚磷酸鈉溶液。

（3）制備殼聚糖納米粒懸浮液

在持續(xù)勻速400 r/min的攪拌速度下，將2 mg/mL的殼聚糖溶液150 mL, 1 mg/mL的三聚磷酸鈉200 mL溶液按照殼聚糖、三聚磷酸鈉質(zhì)量比為3:2的比例以40滴/min的速度逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，得到殼聚糖納米粒懸浮液。

（4）修飾單抗

稱取3 mg西妥昔單抗，將西妥昔單抗與殼聚糖納米粒懸浮液混合后，再與80 mg的EDC和120 mg的NHS反應(yīng)24小時，蒸餾水透析3天后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濃縮至350 mL作為A液。

（5）制備賦形劑溶液

稱取100 mg的DSPC、500 mg的羥丙基β-環(huán)糊精和400 mg與100 mg的海藻糖與殼寡糖溶于200 mL蒸餾水中，配置成賦形劑含量為0.25%的溶液作為B液。

（6）混合

將A液在400 r/min連續(xù)攪拌的情況下，倒入B液中持續(xù)攪拌，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

（7）噴霧干燥

將步驟（6）中所得的續(xù)濾液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴。噴霧干燥“一步”制得聚合粒子粉末，噴霧干燥條件為：噴霧干燥進口溫度140℃，出口溫度100℃，噴嘴流速520 L/h，進樣速度55 mL/min，在干燥器中收集聚合粒子粉末。即可得到肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子。

結(jié)果顯示：

本發(fā)明實施例4制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為2～6 μm，所得負載的殼聚糖納米粒的粒徑為75～201 nm，粒徑分布均勻，聚合粒子負載著大量殼聚糖納米粒，且生物相容性良好。

本發(fā)明實施例4制備的聚合粒子在擬肺部濕度和溫度（濕度為60%RH，溫度25℃時）的環(huán)境下，隨著時間的延長的吸濕率明顯增加，2 h吸濕率為1.87%，12 h吸濕率為6.78%，平衡時（24 h）的吸濕率達到了10.14%，崩解時限為15 min，作為一級載體的聚合粒子容易崩解，并能釋放出負載的殼聚糖納米粒，釋放的納米粒在肺部的滯留率為49.47%。

本發(fā)明實施例4制備的聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)，小鼠急性毒性試驗血液白細胞計數(shù)為(3.2±0.3)′10⁹/L，中性粒細胞為(0.4±0.2)′10⁹/L，淋巴細胞(1.8±0.1)′10⁹/L，與正常組無顯著性差異，與Triton X-100（陽性對照）組具有極顯著差異。

本發(fā)明實施例4制備的聚合粒子，A549細胞吞噬率2h達到52.73%比未修飾單抗的納米粒吞噬率增加了11%，極大提高了生物利用度。

實施例5一種用于肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子

所述納米聚合粒子，包括殼聚糖、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、磷脂衍生物、羥丙基β-環(huán)糊精和賦形劑；

所述殼聚糖，分子量660KDa殼聚糖，粉末狀；

所述磷脂衍生物為，二硬脂?；字Ｒ掖及稤SPE

所述賦形劑為海藻糖與殼寡糖質(zhì)量比為3:2；

所述殼聚糖、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、DSPE、羥丙基β-環(huán)糊精、海藻糖與殼寡糖質(zhì)量比為3:3:0.02:2:2:3:2；

肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子，所述制備方法包括以下步驟：

（1）制備殼聚糖溶液

稱取300 mg的分子量660KDa殼聚糖，將殼聚糖粉末溶解在150 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，制備成2 mg/mL的殼聚糖溶液。

（2）制備三聚磷酸鈉溶液

稱取300 mg的三聚磷酸鈉，將三聚磷酸鈉溶于300 mL蒸餾水，配制成的1mg/mL三聚磷酸鈉溶液。

（3）制備殼聚糖納米粒懸浮液

在持續(xù)勻速100 r/min的攪拌速度下，將2 mg/mL的殼聚糖溶液150 mL, 1 mg/mL的三聚磷酸鈉300 mL溶液按照殼聚糖、三聚磷酸鈉質(zhì)量比為3:2的比例以20滴/min的速度逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，得到殼聚糖納米粒懸浮液。

（4）修飾單抗

稱取2 mg的西妥昔單抗，將西妥昔單抗與殼聚糖納米粒懸浮液混合后，再與80 mg的EDC和120 mg的NHS反應(yīng)24小時，蒸餾水透析3天后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濃縮至450 mL作為A液。

（5）制備賦形劑溶液

稱取200 mg的DSPE、200 mg的羥丙基β-環(huán)糊精和300 mg與200 mg的海藻糖與殼寡糖溶于200 mL蒸餾水中，配置成賦形劑含量為0.25%的溶液作為B液。

（6）混合

將A液在400 r/min連續(xù)攪拌的情況下，倒入B液中持續(xù)攪拌，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

（7）噴霧干燥

將步驟（6）中所得的續(xù)濾液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴。噴霧干燥“一步”制得聚合粒子粉末，噴霧干燥條件為：噴霧干燥進口溫度140℃，出口溫度100℃，噴嘴流速520 L/h，進樣速度55 mL/min，在干燥器中收集聚合粒子粉末。即可得到肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子。

結(jié)果顯示：

本發(fā)明實施例5制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為3～10 μm，所負載的殼聚糖納米粒的粒徑為102～180 nm，粒徑分布均勻，聚合粒子負載著大量殼聚糖納米粒，且生物相容性良好。

本發(fā)明實施例5制備聚合粒子，在擬肺部濕度和溫度（濕度為60%RH，溫度25℃時）的環(huán)境下，隨著時間的延長的吸濕率明顯增加，2 h吸濕率為3.97%，12 h吸濕率為11.26%，平衡時（24 h）的吸濕率達到了14.19%，崩解時限為16 min，作為一級載體的聚合粒子容易崩解，并能釋放出負載的殼聚糖納米粒，釋放的納米粒在肺部的滯留率為74.03%。

本發(fā)明實施例5制備聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)，小鼠急性毒性試驗血液白細胞計數(shù)為(3.0±0.1)′10⁹/L，中性粒細胞為(0.6±0.1)′10⁹/L，淋巴細胞(1.7±0.3)′10⁹/L與正常組無顯著性差異，與Triton X-100（陽性對照）組具有極顯著差異。

本發(fā)明實施例5制備聚合粒子，A549細胞吞噬率2 h達到56.28%比未修飾單抗的納米粒吞噬率增加了13%，極大提高了生物利用度。

實施例6一種用于肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子

所述納米聚合粒子，包括殼聚糖衍生物、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、磷脂衍生物、羥丙基β-環(huán)糊精和賦形劑；

所述殼聚糖衍生物，分子量為160Kda取代度為50%的羧甲基殼聚糖，粉末狀；

所述磷脂衍生物為，二棕櫚?；字Ｒ掖及稤PPE；

所述賦形劑為海藻糖與乳糖質(zhì)量比為2:1；

所述羧甲基殼聚糖、三聚磷酸鈉、西妥昔單抗、DSPE、羥丙基β-環(huán)糊精、海藻糖與乳糖質(zhì)量比為4:1:0.02:3:3:4:2；

肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子，所述制備方法包括以下步驟：

（1）制備殼聚糖溶液

稱取400 mg取代度為50%的羧甲基殼聚糖，將其粉末溶解在200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，制備成2 mg/mL的殼聚糖溶液。

（2）制備三聚磷酸鈉溶液

稱取100 mg三聚磷酸鈉，將三聚磷酸鈉溶于100 mL蒸餾水，配制成的1mg/mL三聚磷酸鈉溶液。

（3）制備殼聚糖納米粒懸浮液

在持續(xù)勻速300 r/min的攪拌速度下，將2 mg/mL的殼聚糖溶液200 mL, 1 mg/mL的三聚磷酸鈉100 mL溶液按照殼聚糖、三聚磷酸鈉質(zhì)量比為3:2的比例以50滴/min的速度逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，得到殼聚糖納米粒懸浮液。

（4）修飾單抗

稱取2 mg西妥昔單抗，將西妥昔單抗與殼聚糖納米粒懸浮液混合后，再與80 mg的EDC和120 mg的NHS反應(yīng)24小時，蒸餾水透析3天后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濃縮至300 mL作為A液。

（5）制備賦形劑溶液

稱取300 mg的DPPE、300 mg的羥丙基β-環(huán)糊精和400 mg與200 mg的海藻糖與乳糖溶于200 mL蒸餾水中，配置成賦形劑含量為0.3%的溶液作為B液。

（6）混合

將A液在300 r/min連續(xù)攪拌的情況下，倒入B液中持續(xù)攪拌，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

（7）噴霧干燥

將步驟（6）中所得的續(xù)濾液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴。噴霧干燥“一步”制得聚合粒子粉末，噴霧干燥條件為：噴霧干燥進口溫度125℃，出口溫度100℃，噴嘴流速300 L/h，進樣速度55 mL/min，在干燥器中收集聚合粒子粉末。即可得到肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子。

結(jié)果顯示：

本發(fā)明實施例6制備的肺吸入殼聚糖基靶向納米聚合粒子的粒徑為3～7 μm，所負載的殼聚糖納米粒的粒徑為167～199 nm，粒徑分布均勻，聚合粒子負載著大量殼聚糖納米粒，且生物相容性良好。

本發(fā)明實施例6制備的聚合粒子在擬肺部濕度和溫度（濕度為60%RH，溫度25℃時）的環(huán)境下，隨著時間的延長的吸濕率明顯增加，2 h吸濕率為2.65%，12 h吸濕率為9.76%，平衡時（24 h）的吸濕率達到了15.27%，崩解時限為17 min，作為一級載體的聚合粒子容易崩解，并能釋放出負載的殼聚糖納米粒，釋放的納米粒在肺部的滯留率為63.89%。

本發(fā)明實施例6制備的聚合粒子，作為載體不引起毒性反應(yīng)，小鼠急性毒性試驗血液白細胞計數(shù)為(3.1±0.2)′10⁹/L，中性粒細胞為(0.5±0.1)′10⁹/L，淋巴細胞(1.9±0.2)′10⁹/L與正常組無顯著性差異，與Triton X-100組具有極顯著差異。

本發(fā)明實施例6制備的聚合粒子，A549細胞吞噬率2 h達到51.11%比未修飾單抗的納米粒吞噬率增加了11%，極大提高了生物利用度。

本發(fā)明中所述單克隆抗體西妥昔單抗，簡稱為：西妥昔單抗；

本發(fā)明所述EDC，為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；

所述NHS，為N-羥基琥珀酰亞胺。

除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)，本發(fā)明所述的比例，均為質(zhì)量比例。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。