本發(fā)明涉及納米復(fù)合載體，尤其是涉及一種具有光熱/光動(dòng)力治療性能的金納米棒復(fù)合載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤(癌癥)是嚴(yán)重威脅人類健康的第二大疾病，其治愈率低、死亡率高。我國癌癥發(fā)生率目前正處于快速上升期，據(jù)世界衛(wèi)生組織全球癌癥報(bào)告顯示：2015年我國有280多萬人死于癌癥。目前臨床上多采用常規(guī)治療方法如放療、化療和手術(shù)治療等，但這些方法均存在很大的局限性，如耐藥性、晚期轉(zhuǎn)移率高、愈后多不佳等(Omoti,A.E.&Omoti,C.E.Ocular toxicity of systemic anticancer chemotherapy.Pharm Pract(Granada)4,55-59(2006))。因此，新型的腫瘤治療方法如光熱療發(fā)、光動(dòng)力療法、基因療法成為研究的熱點(diǎn)。但是單一的治療方式也很難達(dá)到良好的臨床治療效果。因此，發(fā)展兩種或多種腫瘤治療手段聯(lián)合起來共同抗擊腫瘤，成為腫瘤醫(yī)學(xué)發(fā)展的重點(diǎn)研究內(nèi)容之一。

光熱療法是利用高溫來治療腫瘤的一種方法,是局部治療腫瘤的新手段。通過熱療試劑能夠有效地將光能轉(zhuǎn)換為熱能，高溫殺傷惡性腫瘤細(xì)胞，并且對(duì)人體無毒副作用，因而被國際醫(yī)學(xué)界稱之為“綠色療法”(Choi,W.I.,Sahu,A.,Kim,Y.H.&Tae,G.Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods.Ann Biomed Eng 40,534-546(2012))。近年來有大量研究顯示：金納米棒(Gold nanorods，AuNR)具有良好的光學(xué)特性，在很窄的光譜帶寬下具有更高的等離子體共振強(qiáng)度，同時(shí)金納米棒的紫外吸收光譜其長徑比有關(guān)，其可調(diào)范圍可以到達(dá)近紅外區(qū)域。與其他金屬材料相比，金納米棒在腫瘤光熱治療方面有著更強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)化優(yōu)勢(shì)，因此，常被用作為腫瘤光熱治療的首選材料。

光動(dòng)力療法是治療人體局部病變特別是惡性腫瘤的一種激光醫(yī)學(xué)技術(shù)，以光、光敏劑和氧的相互作用為基礎(chǔ)。當(dāng)光敏劑受到特定波長的光照射時(shí)，它能夠吸收光子而被激發(fā),又通過系間跨越轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)而將吸收的光能迅速傳遞給周圍的氧分子，氧分子發(fā)生一系列光化學(xué)反應(yīng)形成單線態(tài)氧，從而殺傷腫瘤或其他病理組織，達(dá)到治療的目的(Agostinis,P.et al.Photodynamic therapy of cancer:an update.CA Cancer J Clin 61,250-281(2011).)。近紅外熒光染料在長波長段(700～900nm)有強(qiáng)吸收峰，對(duì)應(yīng)于生物體自身吸收較弱的“治療窗口”，可實(shí)現(xiàn)較好深層組織的光動(dòng)力治療。但熒光染料在水中容易發(fā)生團(tuán)聚而產(chǎn)生熒光淬滅現(xiàn)象，且量子產(chǎn)率較低，這些問題影響了近紅外熒光染料在光動(dòng)力治療方面的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在提供一種具有光熱/光動(dòng)力治療性能的金納米棒復(fù)合載體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種具有光熱/光動(dòng)力治療性能的金納米棒復(fù)合載體的制備方法。

所述具有光熱/光動(dòng)力治療性能的金納米棒復(fù)合載體，以金納米棒(AuNR)為核，二氧化硅(SiO₂)為殼層，并在二氧化硅殼層外表面修飾光動(dòng)力治療的近紅外熒光染料。

所述金納米棒的長徑比可為2～7，金納米棒的表面等離子共振吸收區(qū)域可介于600-1200nm波長范圍之內(nèi)。所述殼層的厚度可為2～30nm。

所述近紅外熒光染料可采用羅丹明染料、異硫氰酸熒光素?zé)晒馊玖?、酞菁類熒光染料、吲哚菁綠熒光染料、花青素類熒光染料、花菁類熒光染料等中的一種。

所述金納米棒的局部等離子共振吸收峰與近紅外熒光染料的吸收峰重疊。

所述具有光熱/光動(dòng)力治療性能的金納米棒復(fù)合載體的制備方法，包括以下步驟：

1)將氯金酸溶液與十六烷基三甲基溴化銨溶液混合，再加入硼氫化鈉冰水混合溶液，得到納米金種子溶液A；

2)在二元表面活性劑溶液中加入硝酸銀溶液和氯金酸溶液，反應(yīng)后加入鹽酸，繼續(xù)反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液B；

3)向反應(yīng)溶液B中加入抗壞血酸和納米金種子溶液A，反應(yīng)，靜置，離心，清洗后，得金納米棒；

4)將正硅酸乙酯甲醇溶液和氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液加入到金納米棒溶液中，攪拌，離心，清洗后，得到以金納米棒(AuNR)為核，以二氧化硅(SiO₂)為殼的AuNR@SiO₂復(fù)合納米粒子；

5)向近紅外熒光染料中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，反應(yīng)后再加入N-羥基琥珀酰亞胺，繼續(xù)反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液C。

6)將AuNR@SiO₂復(fù)合納米粒子溶液與反應(yīng)溶液C混合，避光攪拌后，離心，洗滌，即得具有光熱/光動(dòng)力治療性能的金納米棒復(fù)合載體。

在步驟1)中，所述氯金酸溶液、十六烷基三甲基溴化銨溶液、硼氫化鈉冰水混合溶液的體積比可為(4～8)︰(5～10)︰(0.5～2)，所述氯金酸溶液的摩爾濃度可為0.1～1mM，所述十六烷基三甲基溴化銨溶液的摩爾濃度可為0.05～0.2M，硼氫化鈉冰水混合溶液的摩爾濃度可為5～20mM。

在步驟2)中，所述二元表面活性劑可選自十六烷基三甲基溴化銨/水楊酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨/甲基水楊酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨/油酸鈉、甲基水楊酸鈉/油酸鈉、水楊酸鈉/油酸鈉等中的至少一種；所述二元表面活性劑溶液、硝酸銀溶液、氯金酸溶液、鹽酸的體積比可為(50～100)︰(3～6)︰(40～80)︰(0.1～1)，所述硝酸銀溶液的摩爾濃度可為1～5mM，所述氯金酸溶液的摩爾濃度可為0.1～1mM；所述反應(yīng)的時(shí)間可為1～3h，繼續(xù)反應(yīng)的時(shí)間可為10～30min。

在步驟3)中，所述抗壞血酸和納米金種子溶液A的體積比可為(0.1～0.5)︰(0.1～0.5)；所述抗壞血酸的摩爾濃度可為0.05～0.1M；所述反應(yīng)的時(shí)間可為10～60s；靜置的時(shí)間可為10～24h。

在步驟4)中，所述正硅酸乙酯甲醇溶液、氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液、金納米棒溶液的體積比可為(5～20)μL︰(5～20)μL︰(5～20)mL，所述正硅酸乙酯甲醇溶液的質(zhì)量百分濃度可為5％～20％，所述氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液的質(zhì)量百分濃度可為1％～10％；所述攪拌的時(shí)間可為12～24h。

在步驟5)中，所述近紅外染料與步驟4)得到的AuNR@SiO₂復(fù)合納米粒子的摩爾比可為(200～500)︰1；所述反應(yīng)的時(shí)間可為30～40min，所述繼續(xù)反應(yīng)的時(shí)間可為30～40min。

在步驟6)中，所述避光攪拌的時(shí)間可為4～6h。

為了克服近紅外熒光染料的局限性，實(shí)現(xiàn)光熱和光動(dòng)力治療的聯(lián)合應(yīng)用，本發(fā)明將近紅外熒光染料連接在金納米棒表面，通過調(diào)節(jié)金納米棒的等離子共振吸收峰和中間殼層的厚度，實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng)，從而提高近紅外熒光染料的光動(dòng)力治療效果。在激光輻射后，實(shí)現(xiàn)了金納米棒光熱治療和近紅外熒光染料光動(dòng)力治療的協(xié)同作用，顯著增強(qiáng)了腫瘤治療效果，因此所述具有光熱/光動(dòng)力治療性能的金納米棒復(fù)合載體可在制備治療腫瘤藥物中應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明所述金納米棒復(fù)合載體為核殼結(jié)構(gòu)，充分利用金納米棒表面等離子共振產(chǎn)生的強(qiáng)烈局部電磁場(chǎng)，通過調(diào)節(jié)中間殼層二氧化硅的厚度，實(shí)現(xiàn)了金納米棒對(duì)近紅外熒光染料顯著的熒光和光動(dòng)力增強(qiáng)效果。

2、本發(fā)明所述金納米棒復(fù)合載體在同一波長激光照射下，使得光熱和光動(dòng)力治療效果協(xié)同增強(qiáng)，從而獲得更顯著的腫瘤治療效果。

附圖說明

圖1是不同長徑比AuNR的透射電子顯微鏡對(duì)比圖。在圖1中，A為長：50.6±3.0nm、寬：16.3±0.9nm、AR：3.1；B為長：61.8±6.3nm、寬：14.1±0.9nm、AR；4.4；C為長：62.3±4.7nm、寬：9.9±0.7nm、AR；6.3。

圖2是AuNR及AuNR@SiO₂復(fù)合納米粒子的透射電子顯微鏡對(duì)比圖。在圖2中，A為長：56.9±4.3nm、寬：17.1±0.9nm、AR；3.3；B為SiO₂殼層厚度：12.2±0.5nm。

圖3是AuNR及AuNR@SiO₂復(fù)合納米粒子的紫外吸收?qǐng)D譜。

圖4是AuNR@SiO₂-IR795金納米棒復(fù)合載體的紅外圖譜。

圖5是AuNR@SiO₂-IR795金納米棒復(fù)合載體的熒光光圖譜。

圖6是AuNR@SiO₂-IR795金納米棒復(fù)合載體的光動(dòng)力效應(yīng)。

圖7是AuNR@SiO₂-IR795金納米棒復(fù)合載體的光熱效應(yīng)。

圖8是AuNR@SiO₂-IR795金納米棒復(fù)合載體在HepG2細(xì)胞中細(xì)胞殺傷率。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1

5mL 0.5mM氯金酸與5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化銨溶液混合，攪拌均勻，加入新鮮配制的0.6mL 0.01M NaBH₄，快速攪拌2min，溶液顏色有黃色變?yōu)樽攸S色，金種溶液室溫繼續(xù)生長30min。

稱取1.4g十六烷基三甲基溴化銨和0.2468g油酸鈉，加50ml水加熱攪拌溶解，冷卻至室溫，加入4.8ml 4nM硝酸銀和50ml 0.5mM氯金酸，靜置15min后，繼續(xù)攪拌1.5h，平行三份，分別加入濃鹽酸0.26、0.35和0.55ml，攪拌15min，再加入0.25ml 64mM抗壞血酸，快速攪拌30s，最后加入0.16ml上述所制金種溶液，攪拌30s，30℃靜置12h，離心洗滌后分散在水中，即得不同長徑比(aspect ratio,AR)的AuNR溶液。AuNR納米粒子的TEM圖如圖1所示，圖1中的A、B和C三種AuNR納米粒子的長徑比分別為3.1、4.5和6.2，大小均勻，分散性較好。

實(shí)施例2

按照實(shí)施例1的步驟，通過調(diào)節(jié)鹽酸的投料量至0.27mL，制得如圖2A所示長徑比為3.3的AuNR納米粒子。此AuNR納米粒子的紫外吸收?qǐng)D譜如圖3所示；AuNR納米粒子在783nm處有較強(qiáng)的等離子共振吸收。取10ml制備好的AuNR溶液，加入100l 0.1M氫氧化鈉，攪拌15min，加入12μL10％正硅酸乙酯(TEOS)的甲醇溶液和12μL 1％氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的甲醇溶液，共三次，每次間隔30min，30℃水域攪拌24h，離心、洗滌后分散在水中，即得AuNR@SiO₂溶液。AuNR@SiO₂復(fù)合納米粒子的TEM圖片如圖2B所示，從透射電鏡圖中可以看到明顯的二氧化硅層，其厚度約為12.2nm。AuNR@SiO₂納米粒子的紫外吸收?qǐng)D譜如圖3所示，其等離子共振吸收紅移至796nm，說明實(shí)驗(yàn)中包覆二氧化硅成功；且AuNR@SiO₂的等離子共振吸收峰與IR795的紫外吸收峰幾乎完全重疊，這為后續(xù)的熒光增強(qiáng)奠定了基礎(chǔ)。

實(shí)施例3

取2.5ml 4μg/ml的花菁染料(IR795)溶液，加入15μL 1mM 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min，再加入15μL 1mM N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)30min。將10nM AuNR@SiO₂復(fù)合納米粒子加上述溶液，繼續(xù)室溫避光震蕩5h，反應(yīng)結(jié)束后，將懸浮液離心清洗2次，將收集到的沉淀重新分散于等體積的去離子水中，即可得到AuNR@SiO₂-IR795核殼納米粒子。連接IR795后，紫外吸收?qǐng)D譜及透射電鏡圖與AuNR@SiO₂的無明顯變化。AuNR@SiO₂-IR795復(fù)合納米載體的紅外圖譜如圖4所示，修飾IR795后，1657cm^-1處峰增強(qiáng)，為酰胺鍵的特征峰，說明IR795已成功連接在二氧化硅層的表面。

實(shí)施例4

取0.2mL 1nM AuNR@SiO₂-IR795復(fù)合納米載體用超純水稀釋至2mL后，對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)測(cè)定等量的IR795在水中和甲醇中的熒光強(qiáng)度。熒光圖譜如圖5所示，當(dāng)IR795連接在AuNR@SiO₂表面后，其熒光強(qiáng)度是水中的51.7倍，與在甲醇中相比也有2.5倍地增強(qiáng)。

取2mL 0.1nM AuNR@SiO₂-IR795溶液及等量的IR795溶液，分別加入10μL 0.01μg/mL 9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA)溶液作為¹O₂檢測(cè)劑，震蕩孵育2min。¹O₂的檢測(cè)需在暗室中進(jìn)行，用808nm激光器(1W/cm²)照射混合溶液，每光照5min檢測(cè)一次熒光光譜變化，總照射時(shí)間為30min。從圖6的ABDA熒光強(qiáng)度減弱結(jié)果可知：隨著激光照射時(shí)間的延長，IR795組ABDA的熒光強(qiáng)度減弱量無明顯變化，而AuNR@SiO₂-IR795組ABDA的熒光強(qiáng)度減弱量逐漸增加，說明單獨(dú)IR795無明顯的光動(dòng)力作用，而AuNR@SiO₂-IR795在熒光增強(qiáng)的同時(shí)也增強(qiáng)了IR795的光動(dòng)力作用。與單獨(dú)的IR795相比，AuNR@SiO₂-IR795的光動(dòng)力效果增強(qiáng)了6.3倍。

實(shí)施例5

取2mL 0.1nM AuNR@SiO₂-IR795溶液及等量量的AuNR@SiO₂和IR795溶液放入樣品池，用808nm激光器(1W/cm²)照射，激光光源與樣品池之間的距離為5cm，并進(jìn)行固定，在樣品池內(nèi)放入熱敏電耦溫度計(jì)并開始進(jìn)行讀數(shù)并計(jì)時(shí)，平均5s進(jìn)行讀數(shù)并記錄。以水作為空白對(duì)照，IR795有微弱的光熱作用，而AuNR@SiO₂和AuNR@SiO₂-IR795的光熱作用明顯增強(qiáng)。從溫度變化曲線圖7可以看到，激光照射10min后，AuNR@SiO₂-IR795納米粒子的溫度上升至56℃，表明AuNR@SiO₂-IR795金納米棒復(fù)合載體具有良好的光熱效果。

實(shí)施例6

將IR795、AuNR@SiO₂、AuNR@SiO₂-IR795用Minimum Essential Media(MEM)培養(yǎng)液分別配成濃度為0.4μM、1nM、1nM的樣品，加入到事先鋪好HepG2細(xì)胞的96孔板中，每空細(xì)胞數(shù)1×10⁴個(gè)，共孵育12h后，棄去培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液潤洗一次，加入新的培養(yǎng)液，用808nm激光器(1W/cm²)照射5min，激光光源與細(xì)胞培養(yǎng)板之間的距離為5cm。激光照射后繼續(xù)培養(yǎng)12h，未加激光照射的直接孵育24h后，分別加20μL 5mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)溶液，孵育4h，棄去上清液，每空加入200μL DMSO溶液，避光孵育10min，在490nm處測(cè)定光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，當(dāng)激光照射后，AuNR@SiO₂-IR795組細(xì)胞存活率明顯降低至28％，說明激光照射后觸發(fā)了AuNR@SiO₂-IR795金納米棒復(fù)合載體的光熱和光動(dòng)力效應(yīng)，對(duì)肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷效果。