本發(fā)明涉及一種豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑、其制備方法及應(yīng)用，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

疫苗免疫一般認(rèn)為是防治畜禽傳染病最有效和最經(jīng)濟(jì)的手段之一。然而，傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗也遇到了一些難以解決的問題：疫苗對(duì)某些群體的免疫效力低下；需要反復(fù)免疫才能產(chǎn)生較好的免疫力；疫苗保護(hù)力易隨時(shí)間推移而嚴(yán)重降低；甚至某些傳染病尚無有效疫苗防治等。因此，很多疫苗，尤其是亞單位疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗等新型疫苗必須產(chǎn)生更強(qiáng)大和更持久的免疫反應(yīng)才能滿足需要。免疫增強(qiáng)劑可以調(diào)動(dòng)、調(diào)節(jié)、提高動(dòng)物機(jī)體整個(gè)免疫系統(tǒng)的功能，從而輔佐性的使疫苗起到更有效的保護(hù)作用。

細(xì)胞因子(cytokines，CK)是一類存在于人和高等動(dòng)物體中的、由白細(xì)胞和其他細(xì)胞合成的異源性蛋白或糖蛋白，一般以小分子分泌物形式釋放，可結(jié)合在靶細(xì)胞的特異受體上，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長、APSC多能細(xì)胞以及損傷組織修復(fù)等多種功能。細(xì)胞因子可使細(xì)胞間的各種信使分子連成一動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，借以發(fā)揮其激活和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的多種功能，以便對(duì)外來的病原體感染或抗原性異物迅速作出免疫應(yīng)答和其他生理反應(yīng)。

細(xì)胞因子可被分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答中扮演重要角色，可影響抗原的激活、呈遞、識(shí)別等過程,具有明顯的免疫佐劑或免疫增強(qiáng)劑效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)的具有免疫佐劑效應(yīng)的細(xì)胞因子有干擾素(Interferon，IFN)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、腫瘤壞子因子(Tumor necrosis factor，TNF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)等，其中作為免疫增強(qiáng)劑效果最明顯的為IFN和IL-2。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供了一種豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑、其制備方法及應(yīng)用，通過將豬干擾素α、重組豬干擾素γ、重組豬IL-2與凍干保護(hù)劑制成凍干產(chǎn)品，將其與豬疫苗聯(lián)合應(yīng)用可提高豬疫苗的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下:

一種豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑，所述豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑包括豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物和凍干保護(hù)劑；所述豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物按照重量份數(shù)包括如下成分：重組豬干擾素α50～70份、重組豬干擾素γ15～25份、重組豬IL-2 15～25份。

所述豬干擾素α、重組豬干擾素γ、重組豬IL-2的編碼基因的核苷酸序列分別如SEQUENCE LISTING<400>1、SEQUENCE LISTING<400>2和SEQUENCE LISTING<400>3所示。

所述凍干保護(hù)劑包括脫脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，三者在豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑中的濃度依次為：脫脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。脫脂奶粉可促進(jìn)升華、加熱滅菌，易取得均質(zhì)產(chǎn)品；血清白蛋白可以增加總蛋白濃度，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的凍融起到很好的保護(hù)作用，減少其活性喪失。葡萄糖與蛋白質(zhì)活性組分的分子形成氫鍵而代替了原有水的位置，對(duì)蛋白質(zhì)活性起保護(hù)作用；

所述豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑的添加量為豬疫苗質(zhì)量的1～25％。

所述豬疫苗包括豬滅活疫苗、基因工程疫苗或減毒活疫苗。

一種豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

A.分別將所述重組豬干擾素α、重組豬干擾素γ、重組豬IL-2溶于PBS緩沖溶液中，分別配置成重組豬干擾素α的溶液、重組豬干擾素γ溶液、重組豬IL-2溶液；

B.將所述的重組豬干擾素α的溶液、重組豬干擾素γ溶液、重組豬IL-2溶液混合，混合液中按照重量份數(shù)包括如下成分：重組豬干擾素α50～70份、重組豬干擾素γ15～25份、重組豬IL-2 15～25份；

C.向步驟B得到的混合液中加入所述脫脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，混勻，每支2ml分裝，置于凍干機(jī)凍干，即可得到豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑。

所述PBS緩沖溶液的pH為7.2～7.4。

所述重組豬干擾素α的溶液、重組豬干擾素γ溶液、重組豬IL-2溶液的濃度均為1mg/mL。

本發(fā)明還提供了所述豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑與豬疫苗聯(lián)合使用的應(yīng)用。

本發(fā)明的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑中：

重組豬干擾素α(IFN-α)能夠激活活性蛋白C，增加抗體的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞毒性T細(xì)胞的效應(yīng)，促進(jìn)Th1型細(xì)胞分化、單核細(xì)胞分泌IL-1、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

重組豬干擾素γ(IFN-γ)具有誘導(dǎo)機(jī)體合成多種阻斷病毒復(fù)制功能的抗病毒酶和蛋白，是抗病毒感染的重要分子。IFN-γ還能增強(qiáng)機(jī)體Tn細(xì)胞和DTH的免疫應(yīng)答。其機(jī)理是通過提高抗原遞呈細(xì)胞膜表面MHCⅡ類抗原的表達(dá)。所以IFN-γ也是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在臨床上常用作免疫佐劑。IFN-γ能顯著增加抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類抗原的數(shù)量，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等MHC II類抗原的識(shí)別過程，增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用并誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖和分化，與IL-2協(xié)同增加輕鏈合成。IFN-γ還可使靜止的CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，從而增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。

重組豬IL-2可以促進(jìn)T細(xì)胞生長、誘導(dǎo)或增強(qiáng)細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺傷活性、協(xié)同刺激B細(xì)胞增值及分泌免疫球蛋白、增強(qiáng)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN和CSF、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2R、促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和增殖及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬殺傷能力等免疫生物學(xué)效應(yīng)。

研究表明，體內(nèi)的各種細(xì)胞因子之間并不是孤立存在的，而是有著復(fù)雜的相互作用，它們之間通過合成和分泌的相互調(diào)節(jié)，受體表達(dá)的相互調(diào)節(jié)、生物學(xué)效應(yīng)的相互影響等組成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子互作網(wǎng)絡(luò)。這些相互調(diào)節(jié)作用建立在各細(xì)胞因子之間合適的比例用量的條件下，若某一組份含量過高會(huì)導(dǎo)致其他調(diào)節(jié)通路被抑制，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，過少則達(dá)不到預(yù)期效果。

該免疫增強(qiáng)劑能非特異性激活、增強(qiáng)豬的細(xì)胞免疫和體液免疫，增強(qiáng)動(dòng)物的抗感染能力。在豬疫苗使用中添加該免疫增強(qiáng)劑，添加量為豬疫苗質(zhì)量的1～25％，能有效地提高豬疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答與體液免疫應(yīng)答水平；使用范圍包括豬滅活疫苗、基因工程疫苗和減毒活疫苗。

本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：

1)可提高豬疫苗的體液免疫應(yīng)答水平：本免疫增強(qiáng)劑與疫苗合用后，疫苗保護(hù)期特異性抗體水平提高，抗體產(chǎn)生窗口期縮短30～50％，特異性體液免疫應(yīng)答標(biāo)志物IL-4分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗可提高1～5倍。

2)可提高豬疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，細(xì)胞免疫應(yīng)答標(biāo)志物干擾素γ分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗可提高1～5倍。

3)安全性好，可制備成水溶性，解決了目前市場上疫苗免疫佐劑存在注射局部膿腫、結(jié)節(jié)、潰瘍的形成而導(dǎo)致急性或慢性炎癥反應(yīng)等問題。

4)體內(nèi)無殘留。本免疫增強(qiáng)劑均為重組細(xì)胞因子蛋白質(zhì)，正常豬體內(nèi)亦含有，安全、體內(nèi)無殘留，并易于存貯。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2-4的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑提高腹瀉二聯(lián)疫苗免疫后干擾素γ分泌水平的對(duì)比圖；

圖2為實(shí)施例2-4的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑提高腹瀉二聯(lián)疫苗免疫后干擾素IL-4分泌水平的對(duì)比圖；

圖3為實(shí)施例2的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑提高豬傳染性胃腸炎病毒疫苗免疫后抗體水平；

圖4為實(shí)施例3的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑提高豬傳染性胃腸炎病毒疫苗免疫后抗體水平；

圖5為實(shí)施例4的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑提高豬傳染性胃腸炎病毒疫苗免疫后抗體水平。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

制備重組豬干擾素α、重組豬干擾素γ、重組豬IL-2

重組豬干擾素α、重組豬干擾素γ、重組豬IL-2的制備，包括如下步驟：

1)重組豬干擾素α制備

構(gòu)建含重組豬干擾素α目的基因的工程大腸桿菌→工程菌發(fā)酵→菌液破碎→離心取含目的蛋白上清→蛋白純化→中間品檢驗(yàn)；其制備方法具體參見2008年10月22日公開的中國專利CN101289666。

2)重組豬干擾素γ制備

構(gòu)建含重組豬干擾素γ目的基因的工程大腸桿菌→工程菌發(fā)酵→菌液破碎→離心取含目的蛋白上清→蛋白純化→中間品檢驗(yàn)；

具體包括以下步驟：

(1)構(gòu)建克隆載體

重組豬γ干擾素的目的基因?yàn)椋?/p>

atgagttata caacttattt cttagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc tcttactgcc aggcgccctt ttttaaagaa ataacgatcc taaaggacta ttttaatgca agtacctcag atgtacctaa tggtggacct cttttcttag aaattttgaa gaattggaaa gaggagagtg acaaaaaaat aattcagagc caaattgtct ccttctactt caaattcttt gaaatcttca aagataacca ggccattcaa aggagcatgg atgtgatcaa gcaagacatg tttcagaggt tcctaaatgg tagctctggg aaactgaatg acttcgaaaa gctgattaaa attccggtag ataatctgca gatccagcgc aaagccatca gtgaactcat caaagtgatg aatgatctgt caccaagatc taacctaaga aagcggaaga gaagtcagac tatgttccaa ggccagagag catcaaaa aa；

特異性PCR引物如下：上游：5'-GCA GGATCC ATGAGTTATACAAC-3’

下游：5'-AAC CTCG AG TTTTGATGCTCTCT-3’

利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR獲得豬干擾素γ的目的基因，并將目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector并轉(zhuǎn)化至JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測序；

(2)構(gòu)建豬γ干擾素表達(dá)工程菌

鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進(jìn)行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定出表達(dá)載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)。并加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)劑低溫誘導(dǎo)表達(dá)，收集工程菌后，菌液在-20℃與室溫反復(fù)凍融沉淀3次，4℃超聲裂解細(xì)菌沉淀，功率：400W，工作3S，間隔3S，超聲6min，重復(fù)3-4次，離心12000r/min離心15min獲得上清。

(3)純化

上清液經(jīng)親和層析純化、離子交換層析純化和分子篩層析純化后鑒定，即可得到重組豬干擾素γ的目的基因。

3)重組豬IL-2制備方法：構(gòu)建含重組豬IL-2目的基因的工程大腸桿菌→工程菌發(fā)酵→菌液破碎→離心取含目的蛋白上清→蛋白純化→中間品檢驗(yàn)；

具體包括以下步驟：

(1)構(gòu)建克隆載體

重組豬IL-2的目的基因?yàn)椋?/p>

atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct gaaacaagtt tcgaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga ct；

特異性引物序列：上游：5'-CG GGATCC ATGGGTAAGATG-3’

下游：5'-CCG CTCGAG AGTCAGTGTTGA-3’

用特異性引物PCR擴(kuò)增豬IL-2的目的基因后，并將目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測序；

(2)構(gòu)建表達(dá)豬IL-2工程菌

鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進(jìn)行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定出表達(dá)載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌進(jìn)行放大培養(yǎng)。并加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)劑低溫誘導(dǎo)表達(dá)，

收集工程菌后，菌液在-20℃與室溫反復(fù)凍融沉淀3次，4℃超聲裂解細(xì)菌沉淀，功率：400W，工作3S，間隔3S，超聲6min，重復(fù)3-4次，離心12000r/min離心15min獲得上清。

(3)純化

上清液經(jīng)親和層析純化、離子交換層析純化和分子篩層析純化后鑒定，即可得到重組豬IL-2的目的基因。

實(shí)施例2

制備豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑

本實(shí)施例的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑，包括豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物和凍干保護(hù)劑。

豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物，按照重量份數(shù)包括如下成分：重組豬干擾素α50重量份、重組豬干擾素γ25重量份、重組豬IL-2 25重量份，所述的重組豬干擾素α的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的重組豬干擾素γ的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述的重組豬IL-2的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

凍干保護(hù)劑包括脫脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，所述的各個(gè)成分在免疫增強(qiáng)劑的濃度如下：脫脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。

本實(shí)施例的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑，配制方法如下：

1)配制1mg/ml的重組豬干擾素α溶液、1mg/ml重組豬干擾素γ溶液和1mg/ml重組豬IL-2溶液；

溶液配制方法：在pH＝7.2～7.4的PBS緩沖液中加入實(shí)施例1制備的蛋白配制而成；

2)取1mg/ml的重組豬干擾素α溶液50ml，取1mg/ml重組豬干擾素γ溶液25ml，取1mg/ml重組豬IL-2溶液25ml，混合后得到的100ml混合液(混合液中含有50mg重組豬干擾素α，25mg重組豬干擾素γ和25mg重組豬IL-2)；

3)向100ml混合液中加入5g脫脂奶粉、5g葡萄糖和10g血清白蛋白作為凍干保護(hù)劑，混勻，每支2ml分裝，置于凍干機(jī)凍干。

使用時(shí)，將每支凍干產(chǎn)品用2ml pH＝7.2～7.4PBS緩沖溶液溶解后按比例加入疫苗中，免疫增強(qiáng)劑的添加量為豬疫苗質(zhì)量的1％。

實(shí)施例3

制備豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑

本實(shí)施例的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑，包括豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物和凍干保護(hù)劑。

豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物，按照重量份數(shù)包括如下成分：重組豬干擾素α60重量份、重組豬干擾素γ20重量份、重組豬IL-2 20重量份，所述的重組豬干擾素α的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的重組豬干擾素γ的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述的重組豬IL-2的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

凍干保護(hù)劑包括脫脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，所述的各個(gè)成分在免疫增強(qiáng)劑的濃度如下：脫脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。

本實(shí)施例的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑，配制方法如下：

1)配制1mg/ml的重組豬干擾素α溶液、1mg/ml重組豬干擾素γ溶液和1mg/ml重組豬IL-2溶液；

溶液配制方法：在pH＝7.2～7.4的PBS緩沖液中加入實(shí)施例1制備的蛋白配制而成；

2)取1mg/ml的重組豬干擾素α溶液60ml，取1mg/ml重組豬干擾素γ溶液20ml，取1mg/ml重組豬IL-2溶液20ml，混合后得到的100ml混合液(混合液中含有60mg重組豬干擾素α，20mg重組豬干擾素γ和20mg重組豬IL-2)；

3)向100ml混合液中加入5g脫脂奶粉、5g葡萄糖和10g血清白蛋白作為凍干保護(hù)劑，混勻，每支2ml分裝，置于凍干機(jī)凍干。

使用時(shí)，將每支凍干產(chǎn)品用2ml pH＝7.2～7.4的PBS緩沖溶液溶解后按比例加入疫苗中，免疫增強(qiáng)劑的添加量為豬疫苗質(zhì)量的15％。

實(shí)施例4

制備豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑

本實(shí)施例的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑，包括豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物和凍干保護(hù)劑。

豬基因工程細(xì)胞因子復(fù)合物，按照重量份數(shù)包括如下成分：重組豬干擾素α70重量份、重組豬干擾素γ15重量份、重組豬IL-2 15重量份，所述的重組豬干擾素α的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的重組豬干擾素γ的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述的重組豬IL-2的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

凍干保護(hù)劑包括脫脂奶粉、葡萄糖和血清白蛋白，所述的各個(gè)成分在免疫增強(qiáng)劑的濃度如下：脫脂奶粉5g/100ml、葡萄糖5g/100ml和血清白蛋白10g/100ml。

本實(shí)施例的豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑，配制方法如下：

1)配制1mg/ml的重組豬干擾素α溶液、1mg/ml重組豬干擾素γ溶液和1mg/ml重組豬IL-2溶液；

溶液配制方法：在pH＝7.2～7.4的PBS緩沖液中加入實(shí)施例1制備的蛋白配制而成；

2)取1mg/ml的重組豬干擾素α溶液70ml，取1mg/ml重組豬干擾素γ溶液15ml，取1mg/ml重組豬IL-2溶液15ml，混合后得到的100ml混合液(混合液中含有70mg重組豬干擾素α，15mg重組豬干擾素γ和15mg重組豬IL-2)；

3)向100ml混合液中加入5g脫脂奶粉、5g葡萄糖和10g血清白蛋白作為凍干保護(hù)劑，混勻，置于凍干機(jī)凍干，每支2ml。

使用時(shí)，將每支凍干產(chǎn)品用2mlpH＝7.2～7.4的PBS緩沖溶液溶解后按比例加入疫苗中，免疫增強(qiáng)劑的添加量為豬疫苗質(zhì)量的25％。

實(shí)施例5

檢測實(shí)施例2-4的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑提高豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗免疫效果。

5.1豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗購自江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司。

5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

5.2.1方案1

將15頭豬隨機(jī)分為3組，每組5頭。

1)試驗(yàn)組：實(shí)施例2的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑+豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗組；免疫增強(qiáng)劑的添加量為豬疫苗質(zhì)量的1％。

2)對(duì)照組：單獨(dú)豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗組對(duì)照組；

3)對(duì)照組：正常豬對(duì)照組。

5.2.2方案2

將15頭豬隨機(jī)分為3組，每組5頭。

1)試驗(yàn)組：實(shí)施例3的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑+豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗組；免疫增強(qiáng)劑的添加量為豬疫苗質(zhì)量的15％。

2)對(duì)照組：單獨(dú)豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗組對(duì)照組；

3)對(duì)照組：正常豬對(duì)照組。

5.2.3方案3

將15頭豬隨機(jī)分為3組，每組5頭。

1)試驗(yàn)組：實(shí)施例4的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑+豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗組；免疫增強(qiáng)劑的添加量為豬疫苗質(zhì)量的25％。

2)對(duì)照組：單獨(dú)豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗組對(duì)照組；

3)對(duì)照組：正常豬對(duì)照組。

5.3樣品采集

免疫后1—4周，每周每頭前腔靜脈采血1ml，3000r/min離心去上清分離血清，-20℃凍存，分別檢測每個(gè)方案中每組的血清細(xì)胞因子分泌水平和抗體水平。

5.4試驗(yàn)結(jié)果

5.4.1干擾素γ和IL-4分泌水平檢測結(jié)果

采用ELISA試劑盒(購自Biorbyt公司)檢測血清中干擾素γ和IL-4水平。

結(jié)果見圖1和圖2。

從圖1和圖2中，可以看出：

方案1試驗(yàn)組中細(xì)胞免疫應(yīng)答標(biāo)志物干擾素γ分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗的對(duì)照組提高3倍；試驗(yàn)組中體液免疫應(yīng)答標(biāo)志物IL-4分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗的對(duì)照組提高2.5倍；

方案2試驗(yàn)組中細(xì)胞免疫應(yīng)答標(biāo)志物干擾素γ分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗的對(duì)照組提高2倍；試驗(yàn)組中體液免疫應(yīng)答標(biāo)志物IL-4分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗的對(duì)照組提高1.5倍；

方案3試驗(yàn)組中細(xì)胞免疫應(yīng)答標(biāo)志物干擾素γ分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗的對(duì)照組提高2.5倍；試驗(yàn)組中體液免疫應(yīng)答標(biāo)志物IL-4分泌量較單獨(dú)應(yīng)用疫苗的對(duì)照組提高1.5倍。

5.4.2抗體水平檢測結(jié)果

采用ELISA法檢測血清中抗體水平。

結(jié)果見圖3-5。從圖3-5可以看出：使用方案1-3的新型豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑+豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗試驗(yàn)組明顯較單獨(dú)應(yīng)用疫苗對(duì)照組平臺(tái)期抗體水平提高，以ELISA檢測結(jié)果P/N＞2.1計(jì)算，方案1-3試驗(yàn)組中的抗體產(chǎn)生窗口期均從14天縮短為7天，均縮短50％。

上述參照實(shí)施例對(duì)豬疫苗用免疫增強(qiáng)劑、其制備方法及應(yīng)用進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。