本發(fā)明涉及微生物及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用表達(dá)GM-CSF的腺病毒提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起雞、火雞、鴿等禽類的一種急性、高度接觸傳染性疫病，主要通過引起禽類敗血癥而導(dǎo)致其死亡，是危害養(yǎng)禽養(yǎng)雞業(yè)的三大傳染病之一，多年來此疫病已在亞洲很多國家與地區(qū)造成了巨大的危害。目前應(yīng)對(duì)新城疫最有效的方式就是注射新城疫滅活疫苗，可有效預(yù)防禽類新城疫疫病的發(fā)生和傳播。

免疫佐劑又稱非特異性免疫增生劑，是一種本身不具抗原性，但同抗原一起或預(yù)先注射到機(jī)體內(nèi)能有效增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型的非特異性免疫增強(qiáng)劑。免疫佐劑種類很多，常用的佐劑可分為4類：無機(jī)佐劑，如氫氧化鋁、磷酸鈣、明礬等；有機(jī)佐劑，微生物及其產(chǎn)物如分枝桿菌(結(jié)核桿菌、卡介苗)、短小桿菌、大腸桿菌、百日咳桿菌、內(nèi)毒素、細(xì)菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷、脂質(zhì)體、表面活性劑等；油劑，如弗氏佐劑(Freund adjuvant)、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。弗氏佐劑目前在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中最常用，又可分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種，不完全佐劑可用于免疫注射，完全佐劑的免疫強(qiáng)度大于不完全佐劑，主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不適宜于人類使用，而且動(dòng)物多次注射后也常會(huì)發(fā)生佐劑病。

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)是一種多功能生長因子，研究表明，GM-CSF可以刺激造血祖細(xì)胞增殖、分化和成熟并從骨髓向外周轉(zhuǎn)移，可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞分化、增殖。集落細(xì)胞刺激因子也常被用作免疫佐劑，其免疫增強(qiáng)效果已被很多研究證實(shí)，其作為新城疫滅活疫苗的免疫佐劑使用時(shí)，接種到家禽體內(nèi)能夠增加抗原的體積，易被抗原提呈細(xì)胞(APC)攝取，延長抗原在體內(nèi)的存留期，增加與免疫細(xì)胞接觸的機(jī)遇，有利于刺激免疫細(xì)胞的增殖。

然而，通常將GM-CSF作為免疫佐劑使用時(shí)，會(huì)采用真核或原核表達(dá)系統(tǒng)作為遞呈載體，其缺陷是往往會(huì)因?yàn)镚M-CSF的半衰期短而無法很好的發(fā)揮免疫佐劑的作用，極大地影響了其免疫增強(qiáng)效果。本發(fā)明經(jīng)過多次嘗試，最終選擇了腺病毒作為GM-CSF的遞呈載體，充分利用腺病毒穩(wěn)定性好、可長時(shí)間保存感染力的優(yōu)勢，克服了GM-CSF半衰期短的弊端，提升 GM-CSF的免疫增強(qiáng)效果，進(jìn)一步提高了GM-CSF作為免疫佐劑增強(qiáng)新城疫滅活疫苗免疫活性的使用有效率。本發(fā)明所提供的這種通過改善免疫佐劑遞呈載體進(jìn)而提高該佐劑對(duì)新城疫滅活疫苗免疫增強(qiáng)效果的方法目前還未有人報(bào)道。本發(fā)明的方法及其試劑盒可廣泛適用于禽類免疫產(chǎn)業(yè)，本發(fā)明技術(shù)的推廣應(yīng)用將會(huì)具有良好的市場前景并產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題

本發(fā)明需要解決的問題是：本發(fā)明的目的是克服將GM-CSF作為免疫佐劑使用時(shí)，采用真核或原核表達(dá)系統(tǒng)作為遞呈載體所導(dǎo)致的因?yàn)镚M-CSF的半衰期短而無法很好發(fā)揮免疫佐劑的作用，并極大影響其免疫增強(qiáng)效果的技術(shù)問題。

技術(shù)方案

本發(fā)明旨在提供一種利用表達(dá)GM-CSF的腺病毒提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法，以解決目前存在的將GM-CSF作為免疫佐劑使用時(shí)，采用真核或原核表達(dá)系統(tǒng)作為遞呈載體所導(dǎo)致的因?yàn)镚M-CSF的半衰期短而無法很好發(fā)揮免疫佐劑的作用，并極大影響其免疫增強(qiáng)效果的技術(shù)難題。

本發(fā)明提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法，包括以下步驟：

(1)將表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重組腺病毒和新城疫滅活疫苗混勻得到疫苗免疫佐劑混合物；

(2)利用上述疫苗免疫佐劑混合物對(duì)禽類進(jìn)行免疫接種。

作為一種優(yōu)選方案，該方法中所述的表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重組腺病毒為表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的人五型重組腺病毒。

進(jìn)一步地，利用上述方法對(duì)禽類進(jìn)行免疫接種時(shí)采用胸部肌肉注射方式。

此外，本發(fā)明還提供了一種用于提高新城疫滅活疫苗免疫效果的免疫佐劑，該免疫佐劑是表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重組腺病毒。

作為一種優(yōu)選方案，該免疫佐劑是表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的人五型重組腺病毒。

此外，本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法制成的試劑盒，該試劑盒中包括表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重組腺病毒和新城疫滅活疫苗。

作為一種優(yōu)選方案，該試劑盒中包括表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的人五型重組腺 病毒和新城疫滅活疫苗。

進(jìn)一步地，本發(fā)明試劑盒可廣泛應(yīng)用于禽類養(yǎng)殖業(yè)中。

有益效果

本發(fā)明所提供的這種通過改善免疫佐劑遞呈載體進(jìn)而提高該佐劑對(duì)新城疫滅活疫苗免疫增強(qiáng)效果的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的嚴(yán)重缺陷，并為改善免疫佐劑的免疫增強(qiáng)作用提供了簡便易行的技術(shù)方案。本發(fā)明經(jīng)過多次嘗試，最終選擇了腺病毒作為GM-CSF的遞呈載體，充分利用腺病毒穩(wěn)定性好、可長時(shí)間保存感染力的優(yōu)勢，克服了GM-CSF半衰期短的弊端，提升GM-CSF的免疫增強(qiáng)效果，進(jìn)一步提高了GM-CSF作為免疫佐劑增強(qiáng)新城疫滅活疫苗免疫活性的使用有效率。本發(fā)明的方法及其試劑盒可廣泛適用于禽類免疫產(chǎn)業(yè)，本發(fā)明技術(shù)的推廣應(yīng)用將會(huì)具有良好的市場前景并產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。

附圖說明

圖1為免疫后新城疫抗體變化。在7、14、21和28天采血分離血清，用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測抗體滴度，用HI的log2值來比較抗體差異，當(dāng)p≤0.05，差異顯著(*)。

圖2為加強(qiáng)免疫后免疫相關(guān)分子表達(dá)變化。以28s做內(nèi)參，所有組和無攻毒對(duì)照組比較，當(dāng)p≤0.05，差異顯著(*)。

圖3為攻毒后臨床癥狀評(píng)價(jià)和存活率統(tǒng)計(jì)。Daily clinical index：臨床得分指數(shù)；percent survival：存活率；Days post infection(DPI)：感染后天數(shù)。

圖4為組織和眼觀病理變化觀察。A：前胃顯微鏡病變(H.E染色，10×40)；B：肺顯微鏡病變(他染色，10×40)；C：十二指腸病變觀察。

圖5為組織病毒載量檢測。在感染后5d采集感染雞的心臟(heart)、肺臟(lung)、胃(stomach)、十二指腸(Duodenum)和法氏囊(Bursa fabricii)，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測病毒滴度，當(dāng)p≤0.05，差異顯著(*)。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明利用表達(dá)雞GM-CSF的腺病毒和雞新城疫病毒滅活疫苗共同免疫，能夠顯著提升新城疫滅活疫苗的體液、細(xì)胞免疫水平，增強(qiáng)對(duì)新城疫強(qiáng)毒(F48E9)感染的免疫保護(hù)效果。

1.實(shí)驗(yàn)材料

病毒：野生型人五型腺病毒(wAd)，表達(dá)GM-CSF的重組腺病毒(rAd-GM-CSF)，新城疫滅活疫苗(InV)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雛雞126只。

2.試驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物免疫與攻毒試驗(yàn)

將試驗(yàn)雞平均分成6組，每組21只，分別按照表1所示設(shè)計(jì)方案進(jìn)行處理，在7日齡進(jìn)行初免，21日齡進(jìn)行二免。免疫采用胸部肌肉注射，和腺病毒同時(shí)免疫的組，預(yù)先將腺病毒和滅活疫苗混勻。

表1動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

二免后2周用0.1ml含有108TCID50的新城疫強(qiáng)毒F48E9毒株進(jìn)行攻毒，評(píng)價(jià)免疫保護(hù)效果。

2.2抗體檢測

在0、14、21、28和35d收集血清抗體，用OIE推薦的方法進(jìn)行血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)，檢測血清新城疫抗體滴度。

采集健康公雞紅細(xì)胞，配制1％的紅細(xì)胞，生理鹽水作為稀釋液，稀釋4單位抗原(以新城疫病毒la Sota毒株作為標(biāo)準(zhǔn)抗原)，用HI的log2值來評(píng)價(jià)血清抗體滴度。

2.3細(xì)胞免疫相關(guān)分子檢測

用脾細(xì)胞IFN-а、IFN-β、IFN-γ，和IL-4的表達(dá)量來評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫效果。在第22d(免疫后24h)，處死5只雞，采集脾臟，提取RNA檢測IFN-а、IFN-β、IFN-γ，和IL-4的表達(dá)。用相對(duì)定量的方法評(píng)價(jià)幾種免疫相關(guān)因子的表達(dá)量的變化，每份樣品做3個(gè)重復(fù)，選用28s作為內(nèi)參(ΔCt＝Ct目標(biāo)–Ct內(nèi)參)，然后和非免組比較(2-ΔΔCT，ΔΔCT＝ΔCt處理組-ΔCt對(duì)照組)，通過升高或降低的倍數(shù)來衡量滿意效果。

2.4攻毒保護(hù)效果檢測

2.4.1臨床癥狀觀察

用打分的方式評(píng)價(jià)雞的臨床表現(xiàn)(正常0，沉郁1，癱瘓2，死亡3)。感染后觀察14天，記錄打分結(jié)果，用得分平均值評(píng)價(jià)感染雞的發(fā)病情況，同時(shí)記錄死亡率。

2.4.2組織病理學(xué)觀察

在感染后第5d，處死3只雞，取肺臟和腺胃制作病理切片，觀察新城疫感染造成的組織病理變化差異。

2.4.3組織病毒含量檢測

在感染后第5d，處死5只雞，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測心、肺、胃、十二指腸和法氏囊中的病毒載量，引物針對(duì)NDV的M基因，序列如表2所示。

表2實(shí)時(shí)定量檢測所用的引物

檢測使用Vazyme(Cat.No Q111-02，Vazyme Biotech co.，ltd)的SYBR Green定量檢測試劑盒，儀器使用西安天隆四通道實(shí)時(shí)定量PCR儀。

2.4.4排毒檢測

在感染后3、5、7d采集氣管和泄殖腔棉拭子，放置在含抗生素的1毫升PBS中，經(jīng)處理后接種SPF雞胚蛋，通過血凝試驗(yàn)檢測雞胚尿液中病毒含量，分析排毒情況。

3.試驗(yàn)結(jié)果

3.1新城疫抗體滴度

如圖1所示，二免后同時(shí)免疫滅活疫苗和表達(dá)GM-CSF重組腺病毒的組(InV+GM)，獲得了最高的抗體滴度，平均效價(jià)約為12(log2)；只免疫滅活疫苗的組(InV)抗體效價(jià)約為10(log2)，差異顯著，其它組抗體效價(jià)約為6(log2)。上述結(jié)果表明同時(shí)免疫表達(dá)GM-CSF的腺病毒能夠顯著提高免疫雞的抗體水平。

3.2脾細(xì)胞免疫相關(guān)因子表達(dá)量

如圖2所示，二免后24h，InV+GM組的雞脾細(xì)胞IFN-а、IFN-β、IFN-γ，和IL-4的表達(dá)量顯著高于其它組，與InV組相比較差異顯著(p<0.05)。表明同時(shí)免疫表達(dá)GM-CSF的腺病毒能夠顯著提高免疫相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平。

3.3臨床癥狀評(píng)價(jià)和存活率

InV+GM組臨床得分約為0.5，而InV組臨床得分約為1.5。

接種了wAd的組，雞在感染后第7d全部死亡；非免疫攻毒對(duì)照的組(CC)，雞在感染后第8d全部死亡；接種了表達(dá)集落細(xì)胞刺激因子，但沒有接種新城疫滅活疫苗的組(rAd-GM)在感染后第10d全部死亡。

如圖3所示，InV組存活率為46％(7/15)，InV+GM組的存活率為86％(13/15)。表明同時(shí)免疫表達(dá)GM-CSF的腺病毒能夠降低強(qiáng)毒感染造成的發(fā)病嚴(yán)重程度和死亡率。

3.4眼觀及組織病理變化

如圖4所示，在感染后第5d，剖檢3只雞，評(píng)價(jià)病變情況，發(fā)現(xiàn)CC、wAd和rAd-GM組的雞在多個(gè)組織器官上都可以看到明顯的出血。InV組可以在腸道漿膜面見到輕微的出血，而InV+GM組則見不到出血現(xiàn)象。

組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組CC、wAd和rAd-GM肺臟和腺胃可見明顯的出血和炎性細(xì)胞的浸潤；InV組可見腺胃管輕度水腫和肺臟的出血，而免InV+GM組的雞在腺胃管上可見更加輕微的水腫，肺臟則可見病理變化。表明同時(shí)免疫表達(dá)GM-CSF的腺病毒能夠減低強(qiáng)毒感染造成的眼觀組織病理變化和顯微組織病理變化。

3.5組織病毒含量和排毒

如圖5所示，對(duì)照組組織病毒含量約為103.5～104.2拷貝/100ul，InV組的雞組織病毒含量約為102.6～102.9拷貝/100ul，InV+GM組的雞組織病毒含量約為102.1～102.4拷貝/100ul。表明同時(shí)免疫表達(dá)GM-CSF的腺病毒能夠顯著降低組織病毒載量。

從表3感染后排毒雞的數(shù)量中可以看出，排毒檢測發(fā)現(xiàn)對(duì)照組在感染后3、5和7d都存在嚴(yán)重的排毒現(xiàn)象，而InV組在感染后3、5和7d的排毒率分別為40％、20％和20％；InV+GM組排毒率分別為0％、20％和0％。表明同時(shí)免疫表達(dá)GM-CSF的腺病毒能夠顯著降低排毒率。

表3感染后排毒雞的數(shù)量

注*感染后天數(shù)

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