本發(fā)明屬于中藥提取物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種薺菜總生物堿提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，乙肝是一種具有傳染性的疾病，其對人類的健康危害巨大。乙肝是由乙肝病毒(HBV)引起的，以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒆罱K可導(dǎo)致多器官損害的一種傳染病，甚至某些患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌。當(dāng)前，我國是乙型肝炎病毒攜帶者的高發(fā)國，據(jù)統(tǒng)計，目前我國無癥狀乙肝病毒攜帶者有1.3億，乙肝患者3000萬。大約每年有23.7萬人死于與乙型肝炎相關(guān)的疾病，其中有15.6萬人死于肝癌。因此，盡快研制出療效顯著、毒副作用小的新型乙肝治療藥物，是當(dāng)前我國醫(yī)藥學(xué)家亟待解決的重要任務(wù)。
同時，隨著人們生活水平的提高，許多人的飲食質(zhì)量和習(xí)慣也在發(fā)生著改變，患高血脂的人數(shù)也在逐年增加，高血脂已成為一種全球性的疾病，并且這種疾病發(fā)病趨勢越來越年輕化，前景令人擔(dān)憂。此外，高血脂還能引起像冠心病及動脈粥樣硬化的并發(fā)癥，它已嚴(yán)重威脅到患者的身心健康。因此，研究和開發(fā)新型降血脂藥物具有重大的社會效益和經(jīng)濟效益。
目前，市場上有關(guān)治療乙肝和高血脂的藥物主要為化學(xué)合成藥。我們知道，若長期服用這些化學(xué)藥物，勢必會對人體造成巨大的傷害。令人欣慰的是，天然中藥在這方面有著得天獨厚的優(yōu)勢。薺菜，在民間作為一種野菜，其營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，深受人們的喜愛。根據(jù)“藥食同源”的原理，薺菜在藥物開發(fā)方面，具有綠色天然、毒副作用小、安全可靠等優(yōu)點?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明薺菜具有抗衰老、抗炎、抗癌、降血壓等作用。研究還發(fā)現(xiàn)薺菜中主要含有黃酮類、有機酸類和生物堿類等化學(xué)成分。目前，人們對薺菜的化學(xué)成分研究還不夠深入，尤其它在肝保護和降血脂方面未見有研究報道。因此，薺菜在藥物開發(fā)方面具有很大的研究空間，需要進一步挖掘其有效成分，明確其藥理活性與有效成分之間的關(guān)系，為人類從天然植物中發(fā)現(xiàn)具有肝保護活性和降血脂的新藥奠定重要理論基礎(chǔ)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種薺菜總生物堿提取物，具有良好的肝保護和降血脂作用。
本發(fā)明提供一種薺菜總生物堿提取物的制備方法，步驟如下：
（1）將干燥的薺菜地上部分粉碎，用乙醇回流提取，收集提取液并低溫減壓濃縮得浸膏；
（2） 將步驟（1）得到的浸膏加入HCl，攪拌得到均勻分散液，靜置，過濾，得濾液；
（3）將步驟（2）得到的濾液調(diào)至pH=8-10，用氯仿進行萃取至無生物堿反應(yīng)，合并萃取液濃縮得氯仿萃取物浸膏；
（4）將步驟（3）得到的氯仿萃取物浸膏上硅膠柱色譜，依次用體積比為10:1→6:1→4:1的石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，得到各洗脫部位；
（5）將步驟（4）得到的用體積比為6:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分濃縮后上Sephadex LH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)85-95 %甲醇進行洗脫，收集洗脫餾分，得到薺菜總生物堿提取物。
作為優(yōu)選，步驟（1）中所述用乙醇回流提取是用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為80-95%的乙醇進行加熱回流提取2-3次，每次1.5-2.5小時。
作為優(yōu)選，步驟（2）中所述浸膏與HCl的體積比為1:1；所述HCl的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1.0-2.0%。
作為優(yōu)選，步驟（2）中所述靜置時間為24-30小時。
作為優(yōu)選，步驟（5）中，收集洗脫餾分后，還包括減壓濃縮干燥的步驟。
本發(fā)明還提供應(yīng)用上述方法制備得到的薺菜總生物堿提取物。
本發(fā)明還提供上述薺菜總生物堿提取物在制備護肝藥物或食品中的應(yīng)用。
制備藥物時，按照藥物的常規(guī)制法制備即可。
制備食品中，將本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物添加入食品原料中，按照常規(guī)方法制備即可。
本發(fā)明還提供上述薺菜總生物堿提取物在制備降血脂藥物或食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種藥物，其有效成分為權(quán)利要求6所述的薺菜總生物堿提取物。
作為優(yōu)選，還包括醫(yī)學(xué)上可接受的輔料。
本發(fā)明的優(yōu)點在于選取“藥食兩用”的薺菜為原料來源，其制備方法簡捷方便，節(jié)省原料，制備過程易于控制，產(chǎn)率較高，生產(chǎn)過程綠色環(huán)保，可循環(huán)進行，適宜于批量化生產(chǎn)，并對護肝和降血脂有很好的效果。
附圖說明
附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
圖1為本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物制備方法流程圖。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。
本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物的制備方法為：
（1）取干燥的薺菜地上部分為原料，粉碎至0.5-1.0 厘米，加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為80-95%的乙醇進行加熱回流提取2-3次，每次1.5-2.5小時。過濾、收集濾液，低溫（40-55 ℃）減壓濃縮得浸膏，備用；
（2）將步驟（1）得到的浸膏加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1.0-2.0% HCl（浸膏：HCl=1:1，V/V），攪拌得到均勻分散液，靜置24-30小時，過濾，得濾液，備用；即采用酸溶堿沉法進行提??；上述鹽酸用量能將薺菜總堿溶解完全；
（3）將步驟（2）得到的濾液用氨水調(diào)至pH=8-10，用氯仿進行萃取至無生物堿反應(yīng)，合并萃取液濃縮得氯仿萃取物浸膏；
（4）將步驟（3）得到氯仿萃取物浸膏上硅膠（100-200目）柱色譜，依次用體積比為10:1→6:1→4:1的石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，得到各洗脫部位，分別濃縮成稠膏備用；
（5）將步驟（4）中得到的用體積比為6:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分上Sephadex LH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)85-95 %甲醇進行洗脫，對得到的洗脫餾分進行合并，減壓濃縮干燥，即得薺菜總生物堿提取物，提取率為0.5%-1%。
經(jīng)試驗，以本發(fā)明方法制備得到的薺菜總生物堿提取物均具有對肝的保護作用以及降脂活性。
實施例1
取干燥的薺菜地上部分，用粉碎機粉碎至長度為0.6 厘米，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)85%乙醇進行回流提取2次，每次1.5小時，過濾、收集濾液，50℃減壓濃縮得稠膏。然后加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1.2 % HCl（浸膏：HCl=1:1，V/V），攪拌得到均勻分散液，靜置26小時，過濾得濾液；再用氨水將濾液調(diào)至pH = 8，用氯仿進行萃取至無生物堿反應(yīng)，得萃取液，合并萃取液濃縮干燥得萃取物浸膏。將該萃取物浸膏上硅膠（100-200目）柱色譜，依次用體積比為10:1→6:1→4:1的石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，得到各洗脫部位，分別濃縮成稠膏；將體積比為6:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分上Sephadex LH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)85 %甲醇進行洗脫，對得到的洗脫餾分進行合并，最后減壓濃縮干燥，即得到薺菜總生物堿提取物，提取率為0.9%。
實施例2
取干燥的薺菜地上部分，用粉碎機粉碎至長度為0.8 厘米，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為90%乙醇進行回流提取2次，每次2.0小時，過濾、收集濾液，40℃減壓濃縮得稠膏。然后加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1.6 % HCl（浸膏：HCl=1:1，V/V），攪拌得到均勻分散液，靜置28小時，過濾得濾液；再用氨水將濾液調(diào)至pH = 9，用氯仿進行萃取至無生物堿反應(yīng)，得萃取液，合并萃取液濃縮干燥得萃取物浸膏。將該萃取物浸膏上硅膠（100-200目）柱色譜，依次用體積比為10:1→6:1→4:1的石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，得到各洗脫部位，分別濃縮成稠膏，將體積比為6:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分上Sephadex LH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)90 %甲醇進行洗脫，對得到的洗脫餾分進行合并，最后減壓濃縮干燥，即得到薺菜總生物堿提取物，提取率為1%。
實施例3
取干燥的薺菜地上部分，用粉碎機粉碎至長度為1.0 厘米，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)95%乙醇進行回流提取3次，每次2.5小時，過濾、收集濾液，55℃減壓濃縮得稠膏。然后加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1.8 % HCl（浸膏：HCl=1:1，V/V），攪拌得到均勻分散液，靜置30小時，過濾得濾液；再用氨水將濾液調(diào)至pH = 10，用氯仿進行至無生物堿反應(yīng)，得萃取液，合并萃取液濃縮干燥得萃取物浸膏。將該萃取物浸膏上硅膠（100-200目）柱色譜，依次用體積比為10:1→6:1→4:1的石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，得到各洗脫部位，分別濃縮成稠膏；將體積比為6:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分上Sephadex LH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)95 %甲醇進行洗脫，對得到的洗脫餾分進行合并，最后減壓濃縮干燥，即得到薺菜總生物堿提取物，，提取率為0.6%。
實施例4
取干燥的薺菜地上部分，用粉碎機粉碎至長度為0.5厘米，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)80%乙醇進行回流提取3次，每次2.5小時，過濾、收集濾液，45℃減壓濃縮得稠膏。然后加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)1.0% HCl（浸膏：HCl=1:1，V/V），攪拌得到均勻分散液，靜置24小時，過濾得濾液；再用氨水將濾液調(diào)至pH = 10，用氯仿進行至無生物堿反應(yīng)，得萃取液，合并萃取液濃縮干燥得萃取物浸膏。將該萃取物浸膏上硅膠（100-200目）柱色譜，依次用體積比為10:1→6:1→4:1的石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，得到各洗脫部位，分別濃縮成稠膏；將體積比為6:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分上Sephadex LH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)90 %甲醇進行洗脫，對得到的洗脫餾分進行合并，最后減壓濃縮干燥，即得到薺菜總生物堿提取物，提取率為0.5%。
實施例5
取干燥的薺菜地上部分，用粉碎機粉碎至長度為0.8 厘米，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)85%乙醇進行回流提取3次，每次2.0小時，過濾、收集濾液，55℃減壓濃縮得稠膏。然后加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)2.0% HCl（浸膏：HCl=1:1，V/V），攪拌得到均勻分散液，靜置28小時，過濾得濾液；再用氨水將濾液調(diào)至pH = 9，用氯仿進行至無生物堿反應(yīng)，得萃取液，合并萃取液濃縮干燥得萃取物浸膏。將該萃取物浸膏上硅膠（100-200目）柱色譜，依次用體積比為10:1→6:1→4:1的石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，得到各洗脫部位，分別濃縮成稠膏；將體積比為6:1的石油醚-乙酸乙酯洗脫餾分上Sephadex LH-20凝膠吸附樹脂柱色譜，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)85%甲醇進行洗脫，對得到的洗脫餾分進行合并，最后減壓濃縮干燥，即得到薺菜總生物堿提取物，提取率為0.85%-1%。
實施例6 本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物的用途實驗
（一）肝保護活性
（1）用MTT法觀察本發(fā)明得到的薺菜總生物堿提取物對HL-7702細(xì)胞成活率的影響。MTT法，全稱 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，化學(xué)名為溴化 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，簡稱四唑鹽，又名噻唑藍(lán)。MTT 比色實驗是一種常見的檢測細(xì)胞生長和成活率方法。它是指在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成正比。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚結(jié)晶，吸光度值 A（OD 值）可以通過酶聯(lián)免疫檢測儀在 570nm 處測得。根據(jù)測得的吸光度值，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD 值越大，細(xì)胞活性越強。由此，測定加入抗腫瘤藥物后腫瘤細(xì)胞吸光值的變化，并計算出藥物對細(xì)胞的抑制率，從而推測腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感程度，以了解藥物的作用程度。
（2）把HL-7702細(xì)胞放在37 °C、含5 % CO2的孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM（10 % 胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，pH 7.2-7.4）。
（3）實驗分組：
正常組：HL-7702細(xì)胞；
控制組：D-GalN (D-半乳糖胺)；
對照組：雙環(huán)醇；
樣品組：本發(fā)明實施例3制備的薺菜總生物堿提取物；
（3）用培養(yǎng)基將細(xì)胞分散，使其成為密度為1×105個/mL的單細(xì)胞懸液，并以每孔0.1 mL接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后換含有受試藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中受試藥物的濃度為50μg/ml，在給藥后1 h加入D-半乳糖胺（終濃度為50 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)。給藥后24 h換含MTT（0.5 mg/mL）無血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，加入DMSO (150 μL/空)振蕩使溶解，在490 nm測定各孔吸光值。抑制率 (%) = [(OD(樣品組) - OD(控制組))/(OD(正常組) - OD(控制組))] × 100。實驗結(jié)果參見表1。
表 1 薺菜總生物堿提取物對肝細(xì)胞損傷的保護作用
注：樣品組為薺菜總生物堿提取物；對照組為雙環(huán)醇。ap< 0.05。
上述實驗結(jié)果（表 1）表明，本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物具有明顯肝保護作用，從實驗數(shù)據(jù)來看，該提取物對損傷肝細(xì)胞的成活率明顯高于陽性對照藥雙環(huán)醇。因此，本發(fā)明的總生物堿提取物對于從“藥食兩用”的薺菜中研制出具有肝保護作用的藥物具有重要指導(dǎo)意義。
（二）降脂活性
（1） 取氯化鈣0.294g，加0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液40mL溶解，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.1，加水稀釋至100mL，配得三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.1)。
（2）使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液將本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物配置成不同濃度的樣品液；取10mg豬胰腺脂肪酶，使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制成1mg/mL的酶溶液；同時，使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液將4-甲基傘形酮油酸酯配置成 0.1mmol/L底物溶液；使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制 0.1mmol/L的檸檬酸鈉溶液，用 HCl 調(diào)至 pH=4.2備用。
（3）取30 μL步驟（2）的樣品液加入到30 μL酶溶液中，充分混勻；再加入60 μL底物溶液，在25℃孵育20分鐘，用110 μL檸檬酸鈉溶液終止反應(yīng)。待測樣品的終濃度分別為600、300、150、75、37.5、18.8 μg/mL。
（4）選用樣品液、酶溶液和底物溶液混合作為樣品組，樣品液與底物溶液混合作為背景組，酶溶液和底物溶液混合作為對照組，底物溶液作為空白對照組。分別在320nm激發(fā)光和450nm發(fā)射光測定吸光值。然后根據(jù)公式計算化合物的脂肪酶抑制率。實驗結(jié)果見表2。脂肪酶抑制率計算公式如下：脂肪酶抑制率 %=1-(樣品組-背景組 )/(對照組-空白對照組 ) ×100%。結(jié)果參見表2。
表 2 薺菜總生物堿提取物的降脂活性結(jié)果
上述實驗數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物對豬胰腺脂肪酶具有明顯的抑制作用，其脂肪酶抑制率高達(dá)90.24%。因此，本發(fā)明的薺菜總生物堿提取物對于從“藥食兩用”的薺菜中研制出具有降脂活性的藥物具有重要意義。
最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。