本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及丹皮酚原苷在制備治療毒蛇咬傷藥物中的應(yīng)用及其提取方法。

背景技術(shù)：

毒蛇咬傷(蛇傷)是被WHO列為一個(gè)易忽視的重要的熱帶疾病之一，全球每年約有500萬(wàn)蛇傷事件發(fā)生，造成約2.5萬(wàn)—12.5萬(wàn)人死亡。在我國(guó)，每年因毒蛇咬傷患者達(dá)10萬(wàn)人次，其中73％為中青年，死亡率為5-10％，致殘或喪失勞動(dòng)能力者占25-30％，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了極大負(fù)擔(dān)。

自1894年世界上第一個(gè)商品化的抗蛇毒血清問(wèn)世以來(lái)，經(jīng)過(guò)一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，已有超過(guò)80種商品化的抗蛇毒血清研制成功。然而，應(yīng)用抗蛇毒血清治療蛇傷也存在一些不足，如價(jià)格昂貴、保存和使用不便，很難在蛇傷發(fā)生后及時(shí)進(jìn)行治療；抗蛇毒血清具有種間特異性，在致傷的蛇種不明時(shí)很難用于傷者的救治；抗蛇毒血清通過(guò)免疫動(dòng)物制備而來(lái)，血清中的雜蛋白可引起副作用，如過(guò)敏性休克、致熱反應(yīng)及血清病等；尤其是，抗蛇毒血清很難中和蛇毒引起的局部損傷。研究顯示，即使在毒蛇咬傷后及時(shí)注射抗蛇毒血清，也僅能中和蛇毒引起的全身系統(tǒng)性毒性。蛇傷患者康復(fù)后，常因蛇毒造成的局部損傷而伴有短暫性或永久性殘疾。據(jù)估計(jì)，約40萬(wàn)人因蛇傷造成了永久性殘疾。因此，尋求新的治療策略以彌補(bǔ)抗蛇毒血清存在的缺陷就顯得尤為重要。

蛇毒主要分為三類：1、血液循環(huán)毒素。包括蝰蛇、腹蛇、竹葉青、五步蛇等蛇分泌的毒素，它造成被咬傷處迅速腫脹、發(fā)硬、流血不止，劇痛，皮膚呈紫黑色，常發(fā)生皮膚壞死，淋巴結(jié)腫大。經(jīng)6-8小時(shí)可擴(kuò)散到頭部、頸部、四肢和腰背部。病犬戰(zhàn)栗，體溫升高，心動(dòng)加快，呼吸困難，不能站立。鼻出血，尿血，抽搐。如果咬傷后4小時(shí)內(nèi)未得到有效治療則最后因心力衰竭或休克而死亡。2、神經(jīng)毒素。包括金環(huán)蛇、銀環(huán)蛇等蛇分泌的毒素。被咬傷后，局部癥狀不明顯，流血少，紅腫熱病輕微。但是傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)急劇的全身癥狀，病人興奮不安，痛苦呻吟，全身肌肉顫抖，吐白沫，吞咽困難，呼吸困難，最后臥地不起，全身抽搐，呼吸肌麻痹而死亡。3、混合毒素。眼鏡蛇和眼鏡王蛇的蛇毒屬于混合毒素。被咬傷后，局部傷口紅腫，發(fā)熱，有痛感，可能出現(xiàn)壞死。毒素被吸收后，全身癥狀嚴(yán)重而復(fù)雜，既有神經(jīng)癥狀，又有血循毒素造成的損害，最后，死于窒息或心動(dòng)力衰竭。

在毒蛇中，尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)又稱五步蛇、百步蛇、七步蛇、蘄蛇等，隸屬于蝰蛇科(Viperidae)蝮亞科(Crotalinae)尖吻蝮屬(Deinagkistrodon)，僅分布于中國(guó)南方和越南部分地區(qū)，是引起我國(guó)蛇傷事故高發(fā)的主要毒蛇之一。尖吻蝮蛇毒主要作用于血液系統(tǒng)，能在短時(shí)間內(nèi)引起嚴(yán)重的局部損傷，造成出血、水腫及肌肉組織壞死癥狀，如不及時(shí)治療，將會(huì)導(dǎo)致永久性殘疾或死亡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了丹皮酚原苷在制備治療蛇傷藥物中的應(yīng)用及其提取方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：丹皮酚原苷在制備治療蛇傷藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，丹皮酚原苷在制備治療血液循環(huán)毒素類蛇蛇傷藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的試驗(yàn)例，丹皮酚原苷在制備治療尖吻蝮蛇蛇傷藥物中的應(yīng)用。

丹皮酚原苷，CAS號(hào)為：72520-92-4，結(jié)構(gòu)式如下：

經(jīng)本申請(qǐng)的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，能夠抑制蛇毒的致傷活性，特別是血液循環(huán)毒素類的致傷活性。

本申請(qǐng)以尖吻蝮蛇蛇毒為例，進(jìn)行說(shuō)明闡述。

根據(jù)毒液成分及藥理學(xué)作用方式的不同，蛇毒可分為血液循環(huán)毒素、神經(jīng)毒素和混合毒素三大類。尖吻蝮蛇毒屬典型的血循環(huán)毒素，主要成分為金屬蛋白酶、磷脂酶A₂(PhospholipaseA₂，PLA₂)、C-型凝集素、絲氨酸蛋白酶、核苷酸酶及核酸酶以及其他蛋白質(zhì)或多肽。其中，蛇毒金屬蛋白酶是引起出血的主要成分，也是尖吻蝮蛇毒中表達(dá)豐度最高的酶類，該酶能降解胞外基質(zhì)或基質(zhì)膜，破壞血管壁完整性，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚血液溢出，引起局部出血。根據(jù)本發(fā)明中的試驗(yàn)例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹皮酚原苷能顯著抑制尖吻蝮蛇毒引起的小鼠皮下出血癥狀，當(dāng)終濃度為20mM時(shí)，能使出血活性降低60％；當(dāng)終濃度為80mM時(shí)，可完全抑制小鼠皮下出血。

另外，蛇毒可以通過(guò)兩條途徑引發(fā)肌肉組織壞死，肌肉毒素PLA₂(堿性磷脂酶Lys49-PLA₂)直接作用于肌細(xì)胞質(zhì)膜，引起大量的肌肉組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致疼痛、肌肉無(wú)法運(yùn)動(dòng)；或者蛇毒金屬蛋白酶作用于微血管系統(tǒng)或肌肉動(dòng)脈，導(dǎo)致血管明顯受損，造成貧血，間接引起肌肉毒性。肌肉壞死是尖吻蝮蛇傷引起的至關(guān)重要損傷，可以導(dǎo)致永久性組織損傷、肢體殘疾甚至截肢。不同濃度丹皮酚原苷與蛇毒孵育后進(jìn)行肌肉損傷抑制實(shí)驗(yàn)，根據(jù)本發(fā)明中的試驗(yàn)例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹皮酚原苷可顯著的抑制尖吻蝮蛇毒造成的肌肉毒性，當(dāng)濃度達(dá)500mM時(shí)，可使肌肉毒性降低約70％。

毒蛇咬傷后水腫的發(fā)生涉及到多種毒素組分，如PLA₂、金屬蛋白酶，這些組分誘導(dǎo)機(jī)體快速釋放內(nèi)源性炎癥因子：激肽、組胺、5-羥色胺等物質(zhì)，引起毛細(xì)血管通透性增加，組織間液的膠體滲透壓上升，組織液生成增多，引起水腫抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹皮酚原苷處理組能使尖吻蝮蛇毒引起的水腫癥狀明顯減弱且趨于穩(wěn)定，而蛇毒處理組水腫癥狀不斷惡化；終濃度為80mM的丹皮酚原苷在處理后180min，可使水腫程度降低約53％。基于丹皮酚原苷具有的抗出血、抗肌肉毒性作用，本申請(qǐng)的發(fā)明人認(rèn)為其可能通過(guò)作用于蛇毒中的PLA₂和金屬蛋白酶而起到抑制水腫作用。

綜上，丹皮酚原苷在制備治療蛇傷藥物中發(fā)揮重要作用。

本發(fā)明還提供了一種丹皮酚原苷的提取方法，包括以下步驟：

A、將中藥徐長(zhǎng)卿干燥、粉碎處理后，使用甲醇進(jìn)行醇提，得到甲醇提取液；

B、將所述甲醇提取液減壓濃縮至浸膏，然后加水混懸得到混懸液；

C、將所述混懸液依次使用石油醚、氯仿和乙酸乙酯除雜，除雜后使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取液；

丹皮酚原苷在石油醚、氯仿和乙酸乙酯中的溶解度很小，不會(huì)造成丹皮酚原苷的大量損失，同時(shí)，所述石油醚、氯仿和乙酸乙酯能夠溶解大量有機(jī)物，起到除雜的作用。

需要說(shuō)明的是，石油醚、氯仿和乙酸乙酯的極性依次增大，除雜效果依次增強(qiáng)，也可以直接使用乙酸乙酯進(jìn)行除雜。

D、將正丁醇萃取液依次使用羥丙基葡聚糖凝膠層析和反相高效液相色譜進(jìn)一步分離純化，得到單一組分化合物，即為丹皮酚原苷。

所述提取方法，先使用甲醇對(duì)徐長(zhǎng)卿進(jìn)行醇提，再依次進(jìn)行濃縮和多級(jí)萃取，并進(jìn)行凝膠層析和反相高效液相色譜分離純化，即可得到收率高、純度高的丹皮酚原苷，所述提取方法具有操作要求低、試驗(yàn)收率高的優(yōu)點(diǎn)。

為檢驗(yàn)所得到物質(zhì)的純度和結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述提取方法還包括還包括E、鑒定步驟：使用HPLC對(duì)步驟D得到的單一組分化合物進(jìn)行純度鑒定；純度鑒定之后，使用質(zhì)譜和/或核磁共振對(duì)步驟D得到的單一組分化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

步驟A中，所述醇提操作分三次進(jìn)行，每次醇提的具體步驟為：使用干燥后的徐長(zhǎng)卿4-6倍重量的甲醇，將徐長(zhǎng)卿進(jìn)行醇提，每次醇提的時(shí)間為2-4小時(shí)；三次醇提完成后，將取得的溶液合并即可。

多次醇提，能夠提取到更多的活性成分，增加所述提取方法的收率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟A中，使用70-80wt％的甲醇，使用索氏提取器對(duì)徐長(zhǎng)卿進(jìn)行醇提。

步驟B中，所述浸膏和干燥后的徐長(zhǎng)卿的重量比為1:8-10。

步驟D中，將所述正丁醇萃取液上樣于羥丙基葡聚糖凝膠層析柱，以70-80wt％的甲醇，0.5-1.5ml/min的流速洗脫，并將層析產(chǎn)物干燥后，溶于5-15wt％的甲醇中上樣于反相高效液相色譜，使用甲醇溶液洗脫，分離純化得到單一組分的丹皮酚原苷。

進(jìn)一步地，步驟D中，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇對(duì)反相高效液相色譜柱進(jìn)行洗脫，每個(gè)濃度階段洗脫10-20min。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明公開(kāi)了丹皮酚原苷在制備治療蛇傷藥物中的應(yīng)用。本申請(qǐng)的發(fā)明人，通過(guò)對(duì)蛇毒的成分分析、丹皮酚原苷的結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析并結(jié)合臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)丹皮酚原苷能夠顯著抑制蛇毒引起的皮下出血癥狀，能夠可顯著的抑制蛇毒造成的肌肉毒性，并能夠使蛇毒引起的水腫癥狀明顯減弱且趨于穩(wěn)定，具有的抗出血、抗肌肉毒性作用。

2、本發(fā)明還提供了一種丹皮酚原苷的提取方法，先使用甲醇對(duì)徐長(zhǎng)卿進(jìn)行醇提，再依次進(jìn)行濃縮和多級(jí)萃取，并進(jìn)行凝膠層析和反相高效液相色譜分離純化，即可得到收率高、純度高的丹皮酚原苷，所述提取方法具有操作要求低、試驗(yàn)收率高的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是丹皮酚原苷經(jīng)HPLC純度檢測(cè)圖譜；

圖2是試驗(yàn)例1中蛇毒引起小鼠皮下出血活性圖；

圖3是試驗(yàn)例1中各處理組小鼠皮下出血代表圖譜；

圖4是試驗(yàn)例2中丹皮酚原苷對(duì)尖吻蝮蛇毒所致小鼠肌肉毒素活性的影響圖；

圖5是試驗(yàn)例3中丹皮酚原苷對(duì)尖吻蝮蛇毒所致小鼠水腫活性的影響圖。

圖中：

**表示與蛇毒處理組比較，P<0.01；

***表示與蛇毒處理組比較，P<0.001。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例1

一種丹皮酚原苷的提取方法，包括以下步驟：

A、將干燥后的中藥徐長(zhǎng)卿500g，粉碎處理后，使用甲醇進(jìn)行醇提，所述醇提操作分三次進(jìn)行，每次醇提的具體步驟為：使用2000g的80wt％的甲醇，將徐長(zhǎng)卿進(jìn)行醇提，每次醇提的時(shí)間為2小時(shí)；三次醇提完成后，將取得的溶液合并，得到甲醇提取液；

B、將所述甲醇提取液減壓濃縮至浸膏，所述浸膏的重量為85g，然后加水混懸得到混懸液；

C、將所述混懸液依次使用石油醚、氯仿和乙酸乙酯除雜，除雜后使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取液；

D、將所述正丁醇萃取液上樣于羥丙基葡聚糖凝膠層析柱，以70wt％的甲醇，1.5ml/min的流速洗脫，并將層析產(chǎn)物干燥后，溶于5wt％的甲醇中上樣于反相高效液相色譜，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇對(duì)反相高效液相色譜柱進(jìn)行洗脫，每個(gè)濃度階段洗脫20min，分離純化得到單一組分的丹皮酚原苷；

實(shí)施例2

A、將干燥后的中藥徐長(zhǎng)卿500g，粉碎處理后，使用甲醇進(jìn)行醇提，所述醇提操作分三次進(jìn)行，每次醇提的具體步驟為：使用3000g的70wt％的甲醇，將徐長(zhǎng)卿進(jìn)行醇提，每次醇提的時(shí)間為4小時(shí)；三次醇提完成后，將取得的溶液合并，得到甲醇提取液；

B、將所述甲醇提取液減壓濃縮至浸膏，所述浸膏的重量為50g，然后加水混懸得到混懸液；

C、將所述混懸液使用氯仿和乙酸乙酯除雜，除雜后使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取液；

D、將所述正丁醇萃取液上樣于羥丙基葡聚糖凝膠層析柱，以80wt％的甲醇，0.5ml/min的流速洗脫，并將層析產(chǎn)物干燥后，溶于15wt％的甲醇中上樣于反相高效液相色譜，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇對(duì)反相高效液相色譜柱進(jìn)行洗脫，每個(gè)濃度階段洗脫10min，分離純化得到單一組分的丹皮酚原苷；

實(shí)施例3

一種丹皮酚原苷的提取方法，包括以下步驟：

A、將干燥后的中藥徐長(zhǎng)卿500g，粉碎處理后，使用甲醇進(jìn)行醇提，所述醇提操作分三次進(jìn)行，每次醇提的具體步驟為：使用2500g的75wt％的甲醇，將徐長(zhǎng)卿進(jìn)行醇提，每次醇提的時(shí)間為3小時(shí)；三次醇提完成后，將取得的溶液合并，得到甲醇提取液；

B、將所述甲醇提取液減壓濃縮至浸膏，所述浸膏的重量為65g，然后加水混懸得到混懸液；

C、將所述混懸液依次使用乙酸乙酯除雜，除雜后使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到正丁醇萃取液；

D、將所述正丁醇萃取液上樣于羥丙基葡聚糖凝膠層析柱，以75wt％的甲醇，1ml/min的流速洗脫，并將層析產(chǎn)物干燥后，溶于10wt％的甲醇中上樣于反相高效液相色譜，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇對(duì)反相高效液相色譜柱進(jìn)行洗脫，每個(gè)濃度階段洗脫15min，分離純化得到單一組分的丹皮酚原苷；

E、鑒定步驟：使用HPLC對(duì)步驟D得到的單一組分化合物進(jìn)行純度鑒定；純度鑒定之后，使用質(zhì)譜和/或核磁共振對(duì)步驟D得到的單一組分化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

HPLC的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，說(shuō)明純度較高。質(zhì)譜顯示m/z:483.00([M+Na]⁺)，329.00([M-Ara+H]⁺)，167.05([M-Ara-Glc+H]⁺)，458.95([M-H]^—)，505.40([M-H+HCOOH]^—)，計(jì)算值460.43，推測(cè)其分子式為C₂₀H₂₈O₁₂，核磁數(shù)據(jù)顯示：¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ:7.82(1H，d，J＝9.0Hz，H-6)，6.89(1H，d，J＝2.3Hz，H-3)，6.86(1H，dd，J＝2.3，8.7Hz，H-5)，5.33(H，d，J＝7.7Hz，H-1')，4.46(1H，d，J＝7.7Hz，H-1″)，3.96(3H，s，-OCH₃)，2.72(3H，s，-CH₃)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ:121.43(C-1)，157.78(C-2)，99.76(C-3)，164.6(C-4)，108.25(C-5)，132.56(C-6)，102(C-1')，75.5(C-2')，75.8(C-3')，69.38(C-4')，75.67(C-5')，68.6(C-6')，103.34(C-1″)，72.79(C-2″)，73.07(C-3″)，69.22(C-4″)，65.07(C-5″)，55.84(-OCH₃)，30.4(-CH₃)，203.14(-COOCH₃)。則證明所示單一組分化合物為丹皮酚原苷。

試驗(yàn)例1

本實(shí)驗(yàn)為丹皮酚原苷抑制尖吻蝮蛇毒的出血活性實(shí)驗(yàn)。

出血活性檢測(cè)參照Kondon等的方法進(jìn)行。選取健康昆明小鼠25只(20±2g)，隨機(jī)分為5組，于小鼠背部皮下注射0.1ml不同劑量尖吻蝮蛇毒溶液(0μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、30μg)。2h后，小鼠經(jīng)乙醚麻醉處死，取背部皮膚，用游標(biāo)卡尺測(cè)量注射點(diǎn)皮下出血斑的平均直徑。以出血斑直徑對(duì)蛇毒劑量做圖，最小出血?jiǎng)┝?Minimum hemorrhagic dose,MHD)定義為引起出血直徑達(dá)10mm的蛇毒劑量。

抑制出血活性實(shí)驗(yàn)：將100μL由不同劑量功效組分(20μM、40μM、80μM)與尖吻蝮蛇毒(MHD劑量)組成的混合液，置于37℃水浴45min后，進(jìn)行小鼠背部皮下注射。蛇毒溶液和生理鹽水分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以MHD劑量引起的出血直徑作為100％出血活性。

尖吻蝮蛇毒屬典型的血循環(huán)毒素，主要成分為金屬蛋白酶、磷脂酶A2(Phospholipase A₂，PLA₂)、C-型凝集素、絲氨酸蛋白酶、核苷酸酶及核酸酶以及其他蛋白質(zhì)或多肽。其中，蛇毒金屬蛋白酶是引起出血的主要成分，也是尖吻蝮蛇毒中表達(dá)豐度最高的酶類，該酶能降解胞外基質(zhì)或基質(zhì)膜，破壞血管壁完整性，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚血液溢出，引起局部出血。如圖2和圖3所示，丹皮酚原苷能顯著抑制尖吻蝮蛇毒引起的小鼠皮下出血癥狀，當(dāng)終濃度為20mM時(shí)，能使出血活性降低60％；當(dāng)終濃度為80mM時(shí)，可完全抑制小鼠皮下出血。

試驗(yàn)例2

本實(shí)驗(yàn)為丹皮酚原苷抑制尖吻蝮蛇毒的肌肉組織壞死活性實(shí)驗(yàn)。

肌肉壞死活性檢測(cè)參照Mebs等的方法進(jìn)行。選取健康昆明小鼠25只(20±2g)，隨機(jī)分為5組。小鼠右腿肌肉注射50μL尖吻蝮蛇毒溶液(30μg)作為蛇毒組，陰性對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。1h后摘除小鼠眼球，取血，37℃孵育10min，8000g離心10min制備血清。血清中肌酸激酶(Creatine kinase,CK)活性檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作(南京建成生物工程研究所)。以蛇毒組測(cè)得CK活力作為陽(yáng)性對(duì)照，定義為100％組織壞死活性。抑制肌肉組織壞死活性實(shí)驗(yàn)：將50μL由不同劑量功效組分(125mM、250mM、500mM)與尖吻蝮蛇毒(30μg)組成的混合液，置于37℃水浴45min，再肌肉注射至小鼠右后腿，按上述方法進(jìn)行CK活力檢測(cè)。

蛇毒可以通過(guò)兩條途徑引發(fā)肌肉組織壞死，肌肉毒素PLA₂(堿性磷脂酶Lys49-PLA₂)直接作用于肌細(xì)胞質(zhì)膜，引起大量的肌肉組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致疼痛、肌肉無(wú)法運(yùn)動(dòng)；或者蛇毒金屬蛋白酶作用于微血管系統(tǒng)或肌肉動(dòng)脈，導(dǎo)致血管明顯受損，造成貧血，間接引起肌肉毒性。肌肉壞死是尖吻蝮蛇傷引起的至關(guān)重要損傷，可以導(dǎo)致永久性組織損傷、肢體殘疾甚至截肢。不同濃度丹皮酚原苷與蛇毒孵育后進(jìn)行肌肉損傷抑制實(shí)驗(yàn)，如圖4所示，丹皮酚原苷可顯著的抑制尖吻蝮蛇毒造成的肌肉毒性，當(dāng)濃度達(dá)500mM時(shí)，可使肌肉毒性降低約70％。

試驗(yàn)例3

本實(shí)驗(yàn)為丹皮酚原苷抑制尖吻蝮蛇毒的水腫活性實(shí)驗(yàn)。

蛇毒水腫活性檢測(cè)參照Rojas等的方法進(jìn)行。選取健康昆明小鼠25只(20±2g)，隨機(jī)分為5組。小鼠右后腳注射20μL尖吻蝮蛇毒溶液(2μg)作為陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水，于注射后不同時(shí)間點(diǎn)(0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠右后腳厚度，計(jì)算腫脹率【腫脹率＝(不同時(shí)間點(diǎn)腳掌厚度-注射前腳掌厚度)÷注射前腳掌厚度×100】。抑制水腫活性實(shí)驗(yàn)：將20μL由不同劑量功效組分(20μM、40μM、80μM)與尖吻蝮蛇毒(2μg)組成的混合液，于37℃水浴45min，再注射小鼠右后腳，按上述方法進(jìn)行腫脹率檢測(cè)。

毒蛇咬傷后水腫的發(fā)生涉及到多種毒素組分，如PLA₂、金屬蛋白酶，這些組分誘導(dǎo)機(jī)體快速釋放內(nèi)源性炎癥因子：激肽、組胺、5-羥色胺等物質(zhì)，引起毛細(xì)血管通透性增加，組織間液的膠體滲透壓上升，組織液生成增多，引起水腫抑制，如圖5所示，丹皮酚原苷處理組能使尖吻蝮蛇毒引起的水腫癥狀明顯減弱且趨于穩(wěn)定，而蛇毒處理組水腫癥狀不斷惡化；終濃度為80mM的丹皮酚原苷在處理后180min，可使水腫程度降低約53％?；诘てし釉站哂械目钩鲅?、抗肌肉毒性作用，推測(cè)其可能通過(guò)作用于蛇毒中的PLA₂和金屬蛋白酶而起到抑制水腫作用。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。