專利名稱：無環(huán)核苷膦酸的前體藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的(R)-9-[2-(膦酰甲氧基)丙基]-腺嘌呤及(R)-9-[2-(膦酰甲氧基)丙基]-2，6-二氨基嘌呤的前體藥物及其非毒性藥學(xué)上可接受的鹽。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎和艾滋病等由病毒感染所致的疾病是威脅人類健康的重大疾病。雖然抗病毒藥物的研究已經(jīng)取得重要進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些臨床有效的抗病毒藥物。如干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯和恩替卡韋等用于治療乙肝，齊多夫定、司他夫定、奈韋拉平、茚地那韋等用于治療艾滋病。但是，這些化合物還具有不少副作用；而且長(zhǎng)期應(yīng)用時(shí)，病毒會(huì)變異產(chǎn)生抗藥性。因此，還需要新的藥理學(xué)性質(zhì)更好的抗病毒藥物。
(R)-9-[2-(膦酰甲氧基)丙基]-腺嘌呤{(R)-9-[2-(Phosphonomethoxy)propyl]-adenine，(R)-PMPA}及(R)-9-[2-(膦酰甲氧基)丙基]-2，6-二氨基嘌呤{(R)-9-[2-(Phosphonomethoxy)propyl]-2，6-diamino-purine，(R)-PMPDAP}是無環(huán)核苷膦酸類化合物，具有較強(qiáng)的抗HIV和抗HBV活性，而且細(xì)胞毒性較低。但是由于極性太大，(R)-PMPA及(R)-PMPDAP口服生物利用度低，口服給藥難以達(dá)到有效治療濃度。
中國(guó)發(fā)明專利CN1244200公開了一系列碳酸酯結(jié)構(gòu)的(R)-PMPA的前體藥物，其中的一個(gè)化合物(R)-雙-[(異丙氧基羰基-氧基)-甲氧基]-PMPA((R)-(POC)2-PMPA)在臨床已用于治療艾滋病。與(R)-PMPA相比，前體藥物(R)-(POC)2-PMPA的生物利用度顯著提高，狗口服給藥PMPA的生物利用度可以達(dá)到30％；但是人口服(R)-(POC)2-PMPA的生物利用度(25％)遠(yuǎn)低于類似藥物阿德福韋酯(59％)，而且(R)-(POC)2-PMPA的生物利用度受食物影響。
美國(guó)專利US5663159公開了一系列雙(烷酰氧甲氧基)無環(huán)核苷膦酸酯類的前體藥物，但是該專利未涉及包括(R)-PMPA和(R)-PMPDAP在內(nèi)的手性異構(gòu)體。
文獻(xiàn)(Shaw JP，et al.Pharmaceutical Research 1997；141824-1829.)報(bào)道，(R)-雙-[(特戊酰氧基)-甲氧基]-PMPA((R)-(POM)2-PMPA)具有比(R)-(POC)2-PMPA更高的口服生物利用度；但是，由于(R)-(POM)2-PMPA在體內(nèi)的水解產(chǎn)物特戊酸與輔酶A的結(jié)合物不能通過氧化途徑代謝，易蓄積在細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生毒性(Brass EP.Pharmacological Review，2002；54589-598.)，因此，(R)-(POM)2-PMPA的細(xì)胞毒性顯著高于(R)-(POC)2-PMPA(Robbins BL，et al.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998；42612-617.)，長(zhǎng)期服用含特戊酸的前藥將造成血漿中肉堿水平低下(Abrahamson K，et al.Biochem.Med.Metab.Biol.1994；5218-21.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供式I所代表的新的(R)-PMPA或(R)-PMPDAP的前體藥物
其中，R1為H或NH2，R2代表異丙基，異丁基，1-甲基丙基，1-乙基丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基、環(huán)己基或苯基。
本發(fā)明還提供式I所示的無環(huán)核苷膦酸酯及其非毒性藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物組合物。
本發(fā)明還提供式I所示的無環(huán)核苷膦酸酯及其非毒性藥學(xué)上可接受的鹽，以及包含式I所示的無環(huán)核苷膦酸酯及其非毒性藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物組合物作為抗病毒藥物特別是抗乙肝和抗艾滋病毒藥物的用途。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，這些實(shí)施例不應(yīng)作為對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。
本發(fā)明的化合物可以按照如下合成路線制備
以(R)-乳酸甲酯為原料，與溴化芐反應(yīng)成芐醚保護(hù)羥基；然后將酯鍵用四氫鋰鋁還原成醇，氯代，催化氫化脫去芐醚，得到(R)-1-氯-2-丙醇；R-1-氯-2-丙醇與多聚甲醛/HCl反應(yīng)得到(R)-1-氯-2-氯甲氧基丙烷，后者與亞磷酸三異丙基酯反應(yīng)，得到(R)-2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基氯，再與腺嘌呤或2，6-二氨基嘌呤反應(yīng)，制備(R)-9-{2-[雙-(異丙基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-腺嘌呤或(R)-9-{2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6二氨基嘌呤；然后與三甲基溴硅烷反應(yīng)，得到(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)-丙基]-腺嘌呤((R)-PMPA)或(R)-9-[2-(膦?；籽趸?-丙基]-2，6二氨基嘌呤((R)-PMPDAP)；最后，(R)-PMPA或(R)-PMPDAP再與烷酰氧基甲基氯反應(yīng)，制備相應(yīng)的目標(biāo)化合物。
實(shí)施例1(R)-9-{2-[雙-(異丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I1)的制備1.1(R)-1-氯-2-丙醇的合成在1200毫升二甲基甲酰胺中加入208克(R)-乳酸甲酯，冰浴冷卻，攪拌下分批加入96克60％的氫化鈉，攪拌反應(yīng)1小時(shí)。然后滴加408克溴化芐，滴完后在冰浴下攪拌4小時(shí)，在室溫下繼續(xù)攪拌48小時(shí)。減壓蒸去DMF，將殘留物用硅膠柱層析分離，用乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脫，收集所需組分，減壓蒸干，得191克油狀液體。
將上步產(chǎn)品186克溶于1200ml無水四氫呋喃，冰浴，攪拌下分批加入60克四氫鋰鋁，加完后在室溫下繼續(xù)攪拌4小時(shí)。在冰浴下緩慢滴加20ml水。滴加完畢，再滴加60ml 15％的氫氧化鉀溶液。過濾，濾渣用乙醚洗三次。合并洗濾液，減壓蒸去有機(jī)溶劑。將殘留物用乙醚萃取3次，合并乙醚萃取液，用無水硫酸鎂干燥。減壓蒸干，將殘留物用硅膠柱層析分離，用乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇(2∶8∶0.5)洗脫，收集所需組分，減壓蒸干，得134克油狀液體。
在240克新蒸的二氯亞砜中，攪拌下滴加上步產(chǎn)品120克。加完后，回流反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸去未反應(yīng)的二氯亞砜，將殘留物溶于乙醚，相繼用水、10％的碳酸鈉溶液和水洗，用無水氯化鈣干燥。減壓蒸干，將殘留物用硅膠柱層析分離，用乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脫，收集所需組分，減壓蒸干，得93克油狀液體。
將上步產(chǎn)品90克加到1200毫升甲醇中，加入10克10％的鈀-炭，催化氫化。反應(yīng)過夜，過濾。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸去溶劑，將殘留物分餾，收集70-72℃/70mmHg的餾分，得(R)-1-氯-2-丙醇37克，[α]20D＝-22.3°(1％三氯甲烷溶液)。
1.2亞磷酸三異丙基酯在3L反應(yīng)瓶中，加入180克異丙醇、237克吡啶及1000ml石油醚，冰浴冷卻。劇烈攪拌下滴加137.5克三氯化磷于400ml石油醚的溶液。加完后，于50℃油浴中攪拌反應(yīng)1小時(shí)，濾去固體，將濾液減壓蒸去溶劑，殘留物減壓蒸餾，收集106-108℃/60mmHg的餾分，得亞磷酸三異丙基酯158克。
1.3 2-[雙-(異丙基)-膦酰基甲氧基]-丙基氯將36克(R)-1-氯-2-丙醇和18克多聚甲醛懸浮于100毫升二氯甲烷中，冰浴冷卻。攪拌下通入干燥的氯化氫氣體，持續(xù)24小時(shí)。將反應(yīng)液水洗后，以氯化鈣干燥。過濾，減壓蒸干，得(R)-1-氯-2-氯甲氧基丙烷33克。
將32克1-氯-2-氯甲氧基丙烷與亞50克亞磷酸三異丙基酯混合，在130℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)。減壓蒸去溶劑，分餾，收集120-124℃/2mmHg的餾分，得(R)-2-[雙-(異丙基)-膦酰基甲氧基]-丙基氯38克。1.4(R)-9-{2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤在300ml二甲基甲酰胺中加入10克腺嘌呤和11克無水碳酸鉀。于100℃油浴中加熱，攪拌下滴加19克(R)-2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基氯。加完后繼續(xù)攪拌8小時(shí)，將反應(yīng)液減壓蒸干。將殘留物用硅膠柱層析分離，用氯仿/甲醇(1∶0.05)洗脫，得到(R)-9-{2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤8.7克。
1.5(R)-9-[2-(膦?；籽趸?-丙基]-腺嘌呤在氮?dú)庀?，?.7克(R)-9-{2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤克懸浮于100ml無水乙氰中，加入32g三甲基溴硅烷，室溫?cái)嚢?6小時(shí)，硅膠薄層檢測(cè)原料消失(展開劑∶氯仿∶甲醇＝8.5∶1.5，原料的Rf＝0.7，產(chǎn)物的Rf＝0)。再真空蒸去溶劑，得殘留物，相繼加入50ml水和60ml丙酮，室溫?cái)嚢?0小時(shí)。過濾，將濾餅以15ml丙酮洗2次，用15ml無水乙醚洗1次，得(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)-丙基]-腺嘌呤的類白色固體6.4g，熔點(diǎn)270℃(分解)；[α]20D＝+21.3°(0.5％0.1M鹽酸溶液)。
1.6異丁酸氯甲酯的制備在10毫升氯仿中，分別加入8克異丁酰氯、2克氯化亞砜和0.2無水氯化鋅，在60℃加熱攪拌；然后分批加入3克多聚甲醛，加完后繼續(xù)攪拌5小時(shí).冰浴冷卻，滴加10毫升冰水，再攪拌0.5小時(shí).分去水層，有機(jī)層用5毫升X2水洗，飽和碳酸氫鈉洗至中性，最后再用5毫升X2水洗，無水氯化鈣干燥，減壓分餾，得到異丁酸氯甲酯5.2克。
1.7(R)-9-{2-[雙-(異丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I1)的制備在氮?dú)庀拢蚍磻?yīng)器中依次加入10ml干燥的乙腈，1.4g(R)-PMPA，2.8g N，N-二環(huán)己基-4-嗎啉脒及3.6g異丁酸氯甲酯，于室溫?cái)嚢?4小時(shí)。硅膠薄層檢測(cè)反應(yīng)基本完全(展開劑二氯甲烷∶甲醇＝95∶5，Rf＝0.4)。將反應(yīng)混合物用10ml乙酸乙酯稀釋，冷卻至25℃，攪拌30分鐘。濾去固體，用少量乙酸乙酯洗。合并洗濾液，用水洗(10ml/次，2次)，將有機(jī)層減壓蒸去溶劑，以硅膠柱層析分離，用含5％乙醇的二氯甲烷洗脫，得目標(biāo)化合物1.2g。元素分析C19H30N5O8P計(jì)算值(％)C46.82，H6.20，N14.37；測(cè)定值(％)C46.91，H6.24，N14.04。
實(shí)施例2(R)-9-{2-[雙-(異戊酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I2)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由異戊酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備異戊酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與異戊酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I2。元素分析C21H34N5O8P計(jì)算值(％)C48.93，H6.65，N13.59；測(cè)定值(％)C49.03，H6.42，N13.41。
實(shí)施例3(R)-9-{2-[雙-(2-甲基丁酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-腺嘌呤(I3)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由2-甲基丁酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備2-甲基丁酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與2-甲基丁酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I3。元素分析C21H34N5O8P計(jì)算值(％)C48.93，H6.65，N13.59；測(cè)定值(％)C48.79，H6.20，N13.85。
實(shí)施例4(R)-9-{2-[雙-(2-乙基丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I4)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由2-乙基丁酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備2-乙基丁酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與2-乙基丁酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I4。元素分析C23H38N5O8P計(jì)算值(％)C50.82，H7.05，N12.88；測(cè)定值(％)C50.98，H7.26，N12.51。
實(shí)施例5(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丙甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I5)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由環(huán)丙甲酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備環(huán)丙甲酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與環(huán)丙甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I5。元素分析C19H26N5O8P計(jì)算值(％)C47.21，H5.42，N14.49；測(cè)定值(％)C47.18，H5.17，N14.82。
實(shí)施例6(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丁甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I6)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由環(huán)丁甲酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備環(huán)丁甲酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與環(huán)丁甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I6。元素分析C21H30N5O8P計(jì)算值(％)C49.31，H5.91，N13.69；測(cè)定值(％)C49.45，H5.73，N13.86。
實(shí)施例7(R)-9-{2-[雙-(環(huán)戊甲酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-腺嘌呤(I7)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由環(huán)戊甲酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備環(huán)丁甲酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與環(huán)戊甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I7。元素分析C23H34N5O8P計(jì)算值(％)C51.20，H6.35，N12.98；測(cè)定值(％)C51.41，H7.70，N12.69。
實(shí)施例8(R)-9-{2-[雙-(環(huán)己酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I8)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由環(huán)己甲酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備環(huán)丁甲酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與環(huán)己甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I8。元素分析C25H38N5O8P計(jì)算值(％)C52.90，H6.75，N12.34；測(cè)定值(％)C52.68，H6.94，N12.17。
實(shí)施例9(R)-9-{2-[雙-(苯甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I8)的制備參照實(shí)施例1.6的方法，由苯甲甲酰氯代替異丁酰氯與氯化亞砜及多聚甲醛反應(yīng)，制備苯甲酸氯甲酯。
參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與苯甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I9。元素分析C25H26N5O8P計(jì)算值(％)C54.06，H4.72，N12.61；測(cè)定值(％)C54.21，H4.46，N12.72。
實(shí)施例10{R)-9-{2-[雙-(異丁酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I10)的制備
10.1(R)-9-[2-(膦?；籽趸?-丙基]-2，6二氨基嘌呤((R)-PMPDAP)的制備按照實(shí)施例1.4的方法，用2，6-二氨基嘌呤代替腺嘌呤，與(R)-2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基氯，制得(R)-9-{2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6二氨基嘌呤。
按照實(shí)施例1.5的方法，(R)-9-{2-[雙-(異丙基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6二氨基嘌呤與三甲基溴硅烷反應(yīng)，制得(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)-丙基]-2，6二氨基嘌呤((R)-PMPDAP)。熔點(diǎn)282℃(分解)；[α]20D＝-26.2°(0.5％0.1M鹽酸溶液)。
10.2(R)-9-{2-[雙-(異丁酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I10)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與異丁酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I10。C19H31N6O8P計(jì)算值(％)C45.42，H6.22，N16.73；測(cè)定值(％)C45.28，H6.14，N16.55。
實(shí)施例11(R)-9-{2-[雙-(異戊酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I11)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與異戊酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I11元素分析C21H35N6O8P計(jì)算值(％)C47.54，H6.65，N15.84；測(cè)定值(％)C47.32，H6.47，N15.58。
實(shí)施例12(R)-9-{2-[雙-(2-甲基丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I12)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與2-甲基丁酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I12。元素分析C21H35N6O8P計(jì)算值(％)C47.54，H6.65，N15.84；測(cè)定值(％)C47.49，H6.53，N15.74。
實(shí)施例13(R)-9-{2-[雙-(2-乙基丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I13)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與2-乙基丁酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I13。元素分析C23H39N6O8P計(jì)算值(％)C49.46，H7.04，N15.05；測(cè)定值(％)C49.40，H7.81，N15.37。
實(shí)施例14(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丙甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I14)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與環(huán)丙甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I14。元素分析C19H27N6O8P計(jì)算值(％)C45.79，H5.46，N16.86；測(cè)定值(％)C45.83，H5.72，N16.80。
實(shí)施例15(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丁甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I15)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與環(huán)丁甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I15。元素分析C21H31N6O8P計(jì)算值(％)C47.91，H5.93，N15.96；測(cè)定值(％)C47.66，H5.84，N15.75。
實(shí)施例16(R)-9-{2-[雙-(環(huán)戊甲酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I16)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與環(huán)戊甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I16。元素分析C23H35N6O8P計(jì)算值(％)C49.82，H6.36，N15.15；測(cè)定值(％)C49.76，H6.48，N15.34。
實(shí)施例17(R)-9-{2-[雙-(環(huán)己酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I17)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與環(huán)己甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I17。元素分析C25H39N6O8P計(jì)算值(％)C51.54，H6.75，N14.43；測(cè)定值(％)C51.62，H6.37，N14.35。
實(shí)施例18(R)-9-{2-[雙-(苯甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I18)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPDAP與苯甲酸氯甲酯反應(yīng)，制得目標(biāo)化合物I18。元素分析C25H27N6O8P計(jì)算值(％)C52.63，H4.77，N14.73；測(cè)定值(％)C52.38，H4.54，N14.83。
參考例1(R)-9-{2-[雙-(特戊酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤((R)-(POM)2-PMPA)的制備參照實(shí)施例1.7的方法，(R)-PMPA與特戊酸氯甲酯反應(yīng)，制得(R)-(POM)2-PMPA。
生物活性的測(cè)定1體外抗乙肝病毒活性及細(xì)胞毒性的測(cè)定將Hep G 2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，接種于96孔板中，細(xì)胞數(shù)3×104/孔，在5％CO2培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％時(shí)，棄舊培養(yǎng)液，加入含不同濃度待測(cè)藥物的新培養(yǎng)液，200μl/孔，設(shè)置3個(gè)平行孔；每隔2天更換培養(yǎng)液。在給藥后第10天，取100μl上清，用定量PCR的方法測(cè)定HBV DNA的含量，計(jì)算50％抑制濃度，即為IC50值。
在取完100μl上清的96孔板中，加入7.5mg/ml的MTT，30μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，棄上清后，加入含10％吐溫X-100的酸性異丙醇溶液，120μl/孔，用酶聯(lián)儀測(cè)定540nm處的吸收，計(jì)算50％抑制濃度，即為CC50值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1
表1體外抗乙肝病毒活性及細(xì)胞毒性

2口服生物利用度的比較參考文獻(xiàn)(Starrett JE，et al.Jmed Chem 1994；371857-1864.)的方法，通過測(cè)定大鼠口服給藥后尿液中活性藥物(R)-PMPA或(R)-PMPDAP的含量，與(R)-PMPA或(R)-PMPDAP靜脈給藥后尿液中的含量進(jìn)行比較，考察藥物的生物利用度。
所有動(dòng)物給藥前禁食12小時(shí)，每組3只大鼠。靜脈注射藥物配成15毫克/毫升的生理鹽水溶液，通過尾靜脈注射給藥；口服藥物配成濃度為3毫克/毫升含5％二甲亞砜的水溶液。給藥劑量相當(dāng)于30毫克/公斤的(R)-PMPA或(R)-PMPDAP。收集給藥后48小時(shí)的尿液，參考文獻(xiàn)(Naesens L，et al.Clin Chem 1992；38480-485。)的方法，測(cè)定尿液中(R)-PMPA或(R)-PMPDAP的含量。根據(jù)下式計(jì)算口服給藥的生物利用度
生物利用度＝[M1]0→48h/[M2]0→48×100％[M1]0→48h為口服給藥后48小時(shí)內(nèi)尿排泄藥物的總量，[M2]0→48h為靜注給藥后48小時(shí)內(nèi)尿排泄藥物的總量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2表2大鼠口服生物利用度比較

權(quán)利要求
1.式I所代表的(R)-PMPA或(R)-PMPDAP的前體藥物 其中，R1為H或NH2，R2代表異丙基，異丁基，1-甲基丙基，1-乙基丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基或環(huán)己基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，其特征在于所述前體藥物為(R)-9-{2-[雙-(異丁酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-腺嘌呤(I1)；(R)-9-{2-[雙-(異戊酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I2)；(R)-9-{2-[雙-(2-甲基丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I3)；(R)-9-{2-[雙-(2-乙基丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I4)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丙甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I5)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丁甲酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-腺嘌呤(I6)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)戊甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-腺嘌呤(I7)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)己酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-腺嘌呤(I8)；(R)-9-{2-[雙-(苯甲酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-腺嘌呤(I9)(R)-9-{2-[雙-(異丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I10)；(R)-9-{2-[雙-(異戊酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I11)；(R)-9-{2-[雙-(2-甲基丁酰氧基甲氧基)-膦酰基甲氧基]-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I12)；(R)-9-{2-[雙-(2-乙基丁酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I13)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丙甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I14)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)丁甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I15)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)戊甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I16)；(R)-9-{2-[雙-(環(huán)己酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I17)。(R)-9-{2-[雙-(苯甲酰氧基甲氧基)-膦?；籽趸鵠-丙基}-2，6-二氨基嘌呤(I18)。
3.權(quán)利要求2所述的前體藥物的非毒性藥學(xué)上可接受的鹽。
4.權(quán)利要求2和3所述的前體藥物及其非毒性藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物組合物。
5.權(quán)利要求2、3和4所述的前體藥物及其非毒性藥學(xué)上可接受的鹽以及包含所述前體藥物及其非毒性藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物組合物作為抗病毒藥物特別是抗乙肝和抗艾滋病毒藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供式I所代表的新的(R)－PMPA或(R)－PMPDAP的前體藥物，其中，R
文檔編號(hào)A61P31/12GK1986553SQ20051013473
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者楊兆新, 房建山 申請(qǐng)人:北京美倍他藥物研究有限公司