專利名稱：雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培法檢測(cè)分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙膦酸鹽類藥物(包括阿侖膦酸、帕米膦酸、伊班膦酸和利塞膦酸)的離子色譜分離分析方法，特別涉及等度分離積分脈沖安培檢測(cè)分析的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法。
背景技術(shù)：
雙膦酸鹽是一類廣泛用于治療骨骼病癥的化合物，包括惡性高鈣血癥，骨質(zhì)疏松和佩吉特氏病。該類化合物是具有P-C-P結(jié)構(gòu)，兩個(gè)磷酸基團(tuán)之間連接一個(gè)碳原子。雙膦酸如阿侖膦酸鈉、帕米膦酸、伊班膦和利塞膦酸鈉均為極性化合物。這使得其在非極性固定相如C18或C8柱上很難保留，由于缺乏生色基團(tuán)，沒有紫外吸收和熒光不容易檢出。因?yàn)槠鋼]發(fā)性低，且有離子的性質(zhì)，易導(dǎo)致峰展寬和峰不對(duì)稱，不適合用氣相色譜(GC)分析。液相色譜(LC)檢測(cè)大部分采用柱前或柱后衍生反應(yīng)。衍生化反應(yīng)的缺點(diǎn)包括其步驟復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間，其衍生物是可能不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)、方法存在的不足，提供一種雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，此方法既能保證分析效果，又能簡(jiǎn)化工藝流程，不需衍生即可進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明一種雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，包括以下步驟(1)實(shí)際樣品處理血漿用出離子水稀釋后加入乙腈沉淀蛋白，混合旋渦lmin，在離心機(jī)上以1000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，吸取上清液在氮?dú)饬飨?0°C左右蒸發(fā)近干，殘留物用水稀釋裝載到固相萃取柱上，洗脫后樣品通過0. 45 μ m濾膜過濾；(2)基線測(cè)繪將配制的洗脫液用泵輸入色譜分離柱使其達(dá)到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液流入電導(dǎo)流通池，由電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成基線被測(cè)繪；(3)進(jìn)樣和離子交換被測(cè)試樣在堿性洗脫液的推動(dòng)下進(jìn)入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換；(4)洗脫將洗脫液連續(xù)輸入色譜分離柱中，不斷將雙膦酸鹽在色譜分離柱上展開，各離子產(chǎn)生差速遷移而相互分離，在不同的保留時(shí)間被洗脫；(5)電化學(xué)檢測(cè)分析從色譜分離柱輸出的雙膦酸溶液通過電化學(xué)檢測(cè)池經(jīng)過電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成譜圖被記錄。本發(fā)明所述的雙膦酸鹽為阿侖膦酸，洗脫液為24mM NaOH溶液，采用等度洗脫。本發(fā)明所述的雙膦酸鹽為帕米膦酸，洗脫液為24mM NaOH溶液，采用等度洗脫。本發(fā)明所述的雙膦酸鹽為伊班膦酸，洗脫液為24mM NaOH溶液，采用等度洗脫。
本發(fā)明所述的雙膦酸鹽為利塞膦酸，洗脫液為24mM NaOH溶液，采用等度洗脫。本發(fā)明所述的分離柱為Dionex AG18 (50mmX 2mm)禾Π AS18 Q50mmX 2mm)陰離子交換柱，進(jìn)樣量為10 μ L。本發(fā)明積分脈沖安培檢測(cè)波形為:T1 :0. 00-0. 04s, El的范圍為-0. 4到-0. 15V ； Tl 0. 05-0. 21s, E2 的范圍為-0. 25 到-0. 05V ；T3 :0. 22-0. 46s, E3 的范圍為 0. 15 到 0. 30V ； T4 0. 47-0. 56s, E4 = -0. 15V ；T5 0. 57-0. 58s, E5 = -2. OOV ；T6 0. 59s, E6 = 0. 6V，積分區(qū)間0. 21-0. 56s。本發(fā)明具有以下有益效果1.對(duì)雙膦酸鹽藥物能進(jìn)行良好的分離分析，保留時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2. 0%，最低檢測(cè)限可達(dá)到10_6g/L，在0. 02-0. 80 μ g/mL濃度范圍內(nèi)，峰高對(duì)濃度、 峰面積對(duì)濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0. 997以上；2.分析時(shí)，將試樣直接注入離子色譜分離柱分離，從色譜分離柱輸出的雙膦酸鹽溶液通過電化學(xué)檢測(cè)池經(jīng)過電化學(xué)檢測(cè)器就能獲得高靈敏度的譜圖，使工藝流程大為簡(jiǎn)化；3.本方法可用于血液樣品中的雙膦酸鹽藥物含量的檢測(cè)。


圖1是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的阿侖膦酸、帕米膦酸、伊班膦酸和利塞膦酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；圖中標(biāo)記為，(1)是帕米膦酸，(2)是阿侖膦酸，(3)是伊班膦酸，(4) 利塞膦酸；圖2是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的人體血漿加標(biāo)實(shí)際樣品中雙膦酸鹽類藥物含量檢測(cè)的色譜圖；圖中標(biāo)記為，(1)是帕米膦酸，(2)是阿侖膦酸，(3)是伊班膦酸，(4)是
利塞膦酸。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說明工藝步驟依次包括實(shí)際樣品處理、測(cè)繪、進(jìn)樣和離子交換、洗脫、積分脈沖安培檢測(cè)分析(1)實(shí)際樣品處理血漿用出離子水稀釋后加入乙腈沉淀蛋白，混合旋渦lmin，在離心機(jī)上以1000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，吸取上清液在氮?dú)饬飨?0°C左右蒸發(fā)近干，殘留物用水稀釋裝載到固相萃取柱上，洗脫后樣品通過0. 45 μ m濾膜過濾；(2)基線測(cè)繪將配制的洗脫液用泵輸入色譜分離柱使其達(dá)到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液流入電導(dǎo)流通池，由電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成基線被測(cè)繪；(3)進(jìn)樣和離子交換被測(cè)試樣在堿性洗脫液的推動(dòng)下進(jìn)入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換；(4)洗脫將洗脫液連續(xù)輸入色譜分離柱中，不斷將雙膦酸鹽在色譜分離柱上展開，各離子產(chǎn)生差速遷移而相互分離，在不同的保留時(shí)間被洗脫；(5)電化學(xué)檢測(cè)分析從色譜分離柱輸出的雙膦酸溶液通過電化學(xué)檢測(cè)池經(jīng)過電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成譜圖被記錄。
分析上述雙膦酸鹽類藥物溶液時(shí)，分離柱為Dionex AG18 (50mmX 2mm)和 AS18(250mmX2mm)陰離子交換柱，進(jìn)樣量為10 μ L，洗脫液為24mMNa0H溶液，采用等度洗脫，優(yōu)化后的積分脈沖安培檢測(cè)波形為:T1 :0. 00-0. 04s, El = -0. 3V ；Tl :0. 05-0. 21s, E2 =-0. 15V ；T3 :0. 22-0. 46s, Ε3 = 0. 22V ；T4 :0. 47-0. 56s, Ε4 = -0. 15V ；T5 :0. 57-0. 58s, Ε5 = -2. OOV ；Τ6 :0. 59，E6 = 0. 6V，積分區(qū)間:0. 21-0. 56s。下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明實(shí)施例本實(shí)施例是對(duì)人體血漿加標(biāo)雙膦酸鹽類藥物含量進(jìn)行分析檢測(cè)使用儀器DX_600離子色譜儀(戴安，美國)，GP50梯度泵，LC25色譜柱溫箱和 ED50A 電化學(xué)檢測(cè)器；DionexAG18 (50mmX 2mm)和 AS18 (250mmX 2mm)陰離子交換柱，10 μ L 定量環(huán)；流速:0. 25mL/min ；柱溫:30°C ；進(jìn)樣量=IOyL ；檢測(cè)方式積分脈沖安培檢測(cè)，波形設(shè)置:T1 :0. 00-0. 04s, El = _0· 3V ；Tl 0. 05-0. 21s,E2 = -0. 15V ；T3 :0. 22-0. 46s,Ε3 = 0. 22V ；T4 :0. 47-0. 56s,Ε4 = -0. 15V ；T5 0. 57-0. 58s, E5 = -2. OOV ；T6 :0. 59，E6 = 0. 6V，積分區(qū)間:0. 21-0. 56s。數(shù)據(jù)處理=Chrome 6. 8的變色龍軟件；洗脫液24mMNaOH 溶液；分析步驟(1)實(shí)際樣品處理血漿用出離子水稀釋后加入乙腈沉淀蛋白，混合旋渦lmin，在離心機(jī)上以1000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，吸取上清液在氮?dú)饬飨?0°C左右蒸發(fā)近干，殘留物用水稀釋裝載到固相萃取柱上，洗脫后樣品通過0. 45 μ m濾膜過濾；(2)基線測(cè)繪將混合配制的洗脫液用泵輸入色譜分離柱使其達(dá)到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液流入電導(dǎo)流通池，由電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成基線被測(cè)繪；(3)進(jìn)樣和離子交換被測(cè)試樣在堿性洗脫液的推動(dòng)下進(jìn)入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換；(4)洗脫將洗脫液連續(xù)輸入色譜分離柱中，不斷將雙膦酸鹽在色譜分離柱上展開，各離子產(chǎn)生差速遷移而相互分離，在不同的保留時(shí)間被洗脫；(5)電化學(xué)檢測(cè)分析從色譜分離柱輸出的雙膦酸溶液通過電化學(xué)檢測(cè)池經(jīng)過電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成譜圖被記錄，所測(cè)繪的譜圖1是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的阿侖膦酸、帕米膦酸、伊班膦酸和利塞膦酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；圖中標(biāo)記為，(1) 是帕米膦酸，( 是阿侖膦酸，( 是伊班膦酸，(4)利塞膦酸；圖2是根據(jù)本發(fā)明提供的方法獲得的人體血漿加標(biāo)實(shí)際樣品中雙膦酸鹽類藥物含量檢測(cè)的色譜圖；圖中標(biāo)記為，(1) 是帕米膦酸，(2)是阿侖膦酸，(3)是伊班膦酸，(4)是利塞膦酸。分析結(jié)果三次重復(fù)進(jìn)樣后阿侖磷酸鈉、帕米膦酸鈉、伊班膦酸鈉和利塞膦酸鈉的加標(biāo)回收率為88. 37% -97. 32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1. 46% -2. 13%。上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)力要求保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明做出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，其特征在于，包括以下步驟(1)實(shí)際樣品處理血漿用出離子水稀釋后加入乙腈沉淀蛋白，混合旋渦lmin，在離心機(jī)上以1000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，吸取上清液在氮?dú)饬飨?0°C左右蒸發(fā)近干，殘留物用水稀釋裝載到固相萃取柱上，洗脫后樣品通過0. 45 μ m濾膜過濾；(2)基線測(cè)繪將配制的洗脫液用泵輸入色譜分離柱使其達(dá)到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液流入電導(dǎo)流通池，由電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成基線被測(cè)繪；(3)進(jìn)樣和離子交換被測(cè)試樣在堿性洗脫液的推動(dòng)下進(jìn)入色譜分離柱產(chǎn)生離子交換；(4)洗脫將洗脫液連續(xù)輸入色譜分離柱中，不斷將雙膦酸鹽在色譜分離柱上展開，各離子產(chǎn)生差速遷移而相互分離，在不同的保留時(shí)間被洗脫；(5)電化學(xué)檢測(cè)分析從色譜分離柱輸出的雙膦酸溶液通過電化學(xué)檢測(cè)池經(jīng)過電化學(xué)檢測(cè)器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而形成譜圖被記錄。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽為阿侖膦酸，洗脫液為24mM NaOH溶液，采用等度洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽為帕米膦酸，洗脫液為24mMNaOH溶液，采用等度洗脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽為伊班膦酸，洗脫液為24mM NaOH溶液，采用等度洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽為利塞膦酸，洗脫液為24mM NaOH溶液，采用等度洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，其特征在于，所述的分離柱為Dionex AG18(50mmX2mm)和 AS18(250mmX2mm)陰離子交換柱，進(jìn)樣量為10 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，其特征在于，積分脈沖安培檢測(cè)波形為T1 :0. 00-0. 04s, El的范圍為-0. 4到-0. 15V ； Tl 0. 05-0. 21s, E2 的范圍為-0. 25 到-0. 05V ；T3 :0. 22-0. 46s, E3 的范圍為 0. 15 到 0. 30V ； T4 0. 47-0. 56s, E4 = -0. 15V ；T5 0. 57-0. 58s, E5 = -2. OOV ；T6 0. 59s, E6 = 0. 6V，積分區(qū)間0. 21-0. 56s。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離分析方法，特別涉及等度分離積分脈沖安培檢測(cè)分析的雙膦酸鹽類藥物的離子色譜分離積分脈沖安培檢測(cè)分析方法，包括實(shí)際樣品處理、基線測(cè)繪、進(jìn)樣和離子交換、洗脫、電化學(xué)檢測(cè)分析步驟；本發(fā)明對(duì)雙膦酸鹽藥物能進(jìn)行良好的分離分析，保留時(shí)間、峰高、峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0％，工藝流程大為簡(jiǎn)化，本方法還可用于血液樣品中的雙膦酸鹽藥物含量的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/12GK102565264SQ20121000150
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者劉玉秀, 朱巖, 陳智棟, 陳梅蘭 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)