本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及包含稀有人參皂苷C-K的具有抗腫瘤活性的、高效低毒的稀有人參皂苷組合物。
背景技術(shù)：
癌癥是僅次于腦血管疾病的第二大威脅人類的病種。我國癌癥的發(fā)病人數(shù)每年超過300萬人，且肺癌、乳腺癌、食管癌的發(fā)病率逐年增長，其中肺癌的發(fā)病率年增長率26.8％，乳腺癌發(fā)病率年增長率6.8％。30年以來，乳腺癌的死亡率上升了96％，肺癌的死亡率猛增465％，我國的癌癥防治工作刻不容緩且形勢嚴峻。
另一方面，稀有人參皂苷C-K可由二醇組人參皂苷經(jīng)微生物酶法轉(zhuǎn)化而來，文獻報道該稀有人參皂苷C-K單組分具有抗腫瘤作用。
但是，關(guān)于如何以人參皂苷單組分為基礎(chǔ)進行組合，增強其抗腫瘤效果，制備高效低毒的抗腫瘤藥物，尚未見任何報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種以稀有人參皂苷C-K為基礎(chǔ)的、高效低毒的、具有抗腫瘤作用的稀有人參皂苷組合物。
此外，本發(fā)明的另一目的在于提供上述稀有人參皂苷組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
本發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，通過將稀有人參皂苷C-K與可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸按特定比例進行組合，不僅能夠顯著提高稀有人參皂苷組合物的抗腫瘤活性，而且能夠顯著降低其毒性，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下。
1.一種具有抗腫瘤活性的稀有人參皂苷組合物，其包含：
人參皂苷C-K和可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸；
其中，相對于100重量份的所述人參皂苷C-K，包含0.05～5重量份的所述可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸。
2.根據(jù)項1所述的稀有人參皂苷組合物，其中，可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸是選自草酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、己二酸和a-酮戊二酸中的一種或多種。
3.根據(jù)項1或2所述的稀有人參皂苷組合物，其中，相對于所述稀有人參皂苷組合物100重量份，所述人參皂苷C-K的含量為5重量份以上。
4.項1～3中任一項所述的稀有人參皂苷組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
5.根據(jù)項6所述的用途，其中，所述抗腫瘤藥物為口服劑型或注射劑型。
6.根據(jù)項4或5中任一項所述的用途，其中，所述腫瘤為肺癌、肝癌或黑色素瘤。
發(fā)明效果
本發(fā)明的以稀有人參皂苷C-K為基礎(chǔ)的稀有人參皂苷組合物具有高效低毒的抗腫瘤作用。
發(fā)明的具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細的說明。在無沖突的情況下，本說明書中的科學術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義，如有沖突應(yīng)以本說明書中的定義為準。
首先，在一個方面中，本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤活性的稀有人參皂苷組合物(本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物)，其包含：
人參皂苷C-K和可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸；
其中，相對于100重量份的所述人參皂苷C-K，包含0.05～5重量份的所述可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸。
在本說明書中，人參皂苷C-K是指下述化學式1所述的化合物。
【化學式1】
上述人參皂苷C-K是已知化合物，可以采用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法來制備，例如可以通過果膠酶催化人參皂苷Rb1水解來制備人參皂苷C-K。
在本說明書中，可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸具體可以列舉出例如草酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、己二酸和a-酮戊二酸。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將上述人參皂苷C-K與可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸以特定比例進行組合，不僅能夠顯著提高稀有人參皂苷組合物的抗腫瘤活性，而且能夠顯著降低其毒性。
具體而言，本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物中，相對于100重量份的所述人參皂苷C-K，可以例如包含0.05～5重量份、優(yōu)選0.1～4重量份、更優(yōu)選0.2～3重量份、更優(yōu)選0.5～2重量份的所述可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸。
本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物中除了包含上述人參皂苷C-K和可食用的C2-C6有機二元或三元羧酸以外，還可以包含其他成分，只要在不顯著損害本發(fā)明的效果即可。作為其他成分，可以列舉出其他人參皂苷、其他抗腫瘤活性成分、輔料等。優(yōu)選地，本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物中，相對于所述稀有人參皂苷組合物100重量份，所述人參皂苷C-K的含量為5重量份以上，優(yōu)選10重量份以上，更優(yōu)選20重量份以上，更優(yōu)選30重量份以上。所述人參皂苷C-K的含量可以例如采用HPLC法測定。
對于本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物中的輔料，沒有特殊限制，例如可以使用本技術(shù)領(lǐng)域通常用于藥品或保健品的輔料。
其次，在另一個方面中，本發(fā)明提供上述本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
正如前述，本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物具有高效低毒抗腫瘤作用。在“高效”方面，本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物的抗腫瘤效果明顯優(yōu)于單獨使用人參皂苷C-K；在“低毒”方面，本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物的生物安全性可媲美甚至高于氯化鈉。
這里，“抗腫瘤”包括殺滅腫瘤細胞、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、改善腫瘤預(yù)后或防止腫瘤復(fù)發(fā)等。這些腫瘤包括例如：腦腫瘤、頭頸部癌、頸癌、腭癌、上腭癌、腭下腺癌、口腔癌、唾液腺癌、舌下腺癌、腮腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌(包括胰管癌)、胃癌、膽道癌、小腸癌或十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌(包括腎細胞癌)、肝癌、前列腺癌、子宮癌(包括子宮頸癌、子宮體癌)、卵巢癌、甲狀腺癌、咽頭癌、肉瘤、惡性淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、皮膚癌以及黑色素瘤等。
抗腫瘤效果可通過例如X光照片、CT等的觀察結(jié)果、及活檢的病理組織診斷、或腫瘤標志物的值等確認。
對所述抗腫瘤藥物的劑型沒有特殊限制，例如可以是口服劑型或注射劑型。所述口服劑型可以是液體劑型，也可以是固體劑型。
制備口服用固體制劑時，可以在向主藥中加入賦形劑以及視需要而定的粘合劑、崩解劑、滑潤劑、著色劑、矯味劑等后，按照常規(guī)方法制成片劑、包衣片劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、膠囊劑等。
作為賦形劑，可使用例如乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、山梨糖醇、結(jié)晶纖維素、二氧化硅等；作為粘合劑，可使用例如聚乙烯醇、乙基纖維素、甲基纖維素、阿拉伯膠、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素等；作為滑潤劑，可使用例如硬脂酸鎂、滑石、二氧化硅等；作為著色劑，可使用允許在藥品中添加的著色劑；作為矯味劑，可使用可可粉、薄荷腦、芳香酸、薄荷油、龍腦、桂皮粉。當然，也可以在上述片劑、顆粒劑上包覆糖衣、明膠衣、以及其它的必要外衣。
制備注射劑時，可以根據(jù)需要向主藥中添加pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、懸助劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑等，再按照常規(guī)方法制成靜脈、皮下、肌肉內(nèi)注射劑。此時，也可以根據(jù)需要，利用常規(guī)方法制成冷凍干燥物。
作為懸助劑，可列舉例如甲基纖維素、吐溫80、羥基乙基纖維素、阿拉伯膠、透明質(zhì)酸鈉、羧甲基纖維素鈉、聚氧乙烯山梨糖醇單月桂酸鹽等。
作為增溶劑，可列舉例如聚氧化乙烯氫化蓖麻油、吐溫80、煙酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇單月桂酸鹽、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。
另外，作為穩(wěn)定劑，可列舉例如亞硫酸鈉、偏亞硫酸鈉等；作為防腐劑，可列舉例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
對于所述抗腫瘤藥物的作用機理沒有特殊限制，可以是抑制腫瘤細胞增殖、抗腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤新生血管生成和/或提高機體的免疫力。
此外，在另一方面中，本發(fā)明還提供一種治療對象中的腫瘤的方法，其包括給所述對象使用本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物的步驟。
這里，所述對象可以是哺乳動物，例如可以是人、大鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗、猴等，優(yōu)選為人。
本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物，可以口服或非口服施用。施用量因癥狀程度、患者年齡、性別、體重、敏感性差異、施用方法、施用時期、施用間隔、藥物制劑的性質(zhì)、有效成分的種類等而異，無特殊限制，但通常成人(體重60Kg)每日1～3000mg、優(yōu)選10～1000mg、更優(yōu)選100～500mg，上述施用量通?？擅咳辗?～3次施用。較好的劑量是每日300mg左右。
實施例
下面給出的實施例，是為了便于理解本發(fā)明，并不以任何方式限定本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍。
實施例1人參皂苷膠C-K膠囊劑制備
稱取10kg人參皂苷C-K，0.2kg檸檬酸，加入淀粉68.5kg，混勻，過篩，用乙醇水溶液作為粘合劑，制成適宜軟材，18目篩制粒，60℃烘箱干燥5小時，16目篩整粒，加入500g硬脂酸鎂，混勻，制得膠囊劑。
實施例2人參皂苷膠C-K片劑制備
取50kg人參皂苷C-K，己二酸0.5kg，草酸0.5kg，粉碎成細粉，加入微晶纖維素10kg、羧甲基淀粉鈉2kg，混合均勻，濕法制粒，干燥，加滑石粉2kg、硬脂酸鎂0.3kg，按常規(guī)制片劑制備工藝制成片劑。
實施例3人參皂苷膠C-K粉劑制備
取40kg人參皂苷C-K和己二酸0.8kg，粉碎成細粉，加入硬脂酸鎂0.3kg，混合均勻，分裝成散劑。
實施例4本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物對腫瘤細胞的抑制作用
參考中國專利公開CN104814972A實施例4設(shè)計，稍有改動。
實驗動物：昆明小鼠購買西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。
細胞：B16黑色素瘤細胞(B16melanoma cell)和人肝癌細胞(HepG2)從美國典型細胞庫(ATCC,Hanassas,VA,USA)購買獲取。
培養(yǎng)基：細胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)液(FBS；HyClone,Logan,UT,USA)，培養(yǎng)液添加10％胎牛血清(FBS；HyClone,Logan,UT,USA)，0.03％L-谷氨酰胺，100U/L青霉素，100mg/L鏈霉素，5％Na2CO3調(diào)pH至6.8-7.0。實驗組1：人參皂苷C-K；
實驗組2：人參皂苷C-K：檸檬酸＝1:0.005，重量比；
實驗組3：人參皂苷C-K：檸檬酸＝1:0.02，重量比；
實驗組4：檸檬酸。
上述成分用20μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，用于配置不同濃度的DMEM細胞培養(yǎng)基；
紫杉醇組：紫杉醇(Paclitaxel)購自Sigma Chemical公司(St.Louis，MO)；順鉑組：順鉑(Cisplatin)購自Sigma Chemical公司(St.Louis，MO)。
原代培養(yǎng)的正常昆明鼠腎細胞，B16細胞以及HepG2細胞以細胞密度為1×104/ml接種于96孔板中培養(yǎng)24小時后，把普通DMEM培養(yǎng)基換為含有終濃度為0μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，75μg/ml，100μg/ml不同組成分的DMEM培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，并在24小時之后用MTT法檢測細胞的活性。培養(yǎng)基的量是150μL/孔。
MTT法的具體操作是：向吸去上清的細胞孔中加入0.4mg/mL MTT，0.1mL/孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)4h，去上清，每孔加入0.1mL二甲基亞砜(DMSO)，孵育10min，在酶標儀上測定溶液在570nm下的吸光度值。
細胞抑制活性用抑制濃度IC50表示。抑制濃度(IC50)為細胞活性抑制率為50％時的藥物濃度，計算方法為
IC50＝(A細胞對照組-A供試樣品組)/A細胞對照組-A空白組)×100％。
表1對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50(μg/mL)
實驗結(jié)果如表1所示，實驗組1～3均對B16和HepG2細胞有抑制作用，對兩種腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50均在40μg/mL以下。單獨的檸檬酸組對腫瘤細胞基本上沒有抑制作用，但通過與檸檬酸組合，人參皂苷C-K的腫瘤細胞抑制活性顯著增強。而且，所有實驗組對正常小鼠腎細胞均沒有毒性。
此外，我們將實驗組中的檸檬酸替換為其它有機羧酸重復(fù)上述實驗，發(fā)現(xiàn)當將實驗組中的檸檬酸替換為草酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸、己二酸和a-酮戊二酸時，均能夠取得相似的效果。具體而言，實驗組1～3均對B16和HepG2細胞有抑制作用，且對兩種腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50均在40μg/mL以下。
實施例5本發(fā)明的稀有人參皂苷組合物對小鼠B16-BL6z細胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的抑制作用
參考中國專利公告CN101695513B實施例9設(shè)計，稍有改動。
實驗材料：己二酸(純度99％)，購自百靈威科技有限公司；人參皂苷C-K(純度≥95％),購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。取上述己二酸與人參皂苷C-K，按實施例3方法配制而成，即為與人參皂苷C-K組合物；紫杉醇，購自Sigma Chemical公司。
實驗動物和細胞系：C57BL/6小鼠，由中國科學院上海實驗動物中心提供。B16-BL6小鼠黑色素瘤細胞高轉(zhuǎn)移株，購自中國科學院上海藥物研究所。
方法
荷瘤模型制作方法：將生長狀態(tài)良好的B16-BL6細胞用0.25％胰蛋白酶消化，離心收集細胞，無菌PBS洗滌，用無菌生理鹽水配制成1×107個/mL細胞懸液。
實驗觀察：105只小鼠，分成正常組；荷瘤對照組；己二酸治療組；紫杉醇治療組；己二酸人參皂苷C-K組合物低、中、高劑量組；人參皂苷C-K組，共7組，每組15只。除正常組外，其余每只小鼠后肢爪墊皮下接種50μL(含5×105個瘤細胞)。各組都在荷瘤次日起腹腔注射給藥，每周5次，連續(xù)5周，每次給藥0.1mL/10g。紫杉醇劑量為10mg/kg；己二酸人參皂苷C-K組合物低、中、高劑量分別為250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg；人參皂苷C-K和己二酸組的劑量分別為1000mg/kg，10mg/kg。接種瘤液后3周，當瘤體>10mm3時，將小鼠用乙醚麻醉，無菌條件下切除患肢。2周后處死動物，解剖取肺，稱重，計算肺系數(shù)。將肺Bouins液固定，于解剖顯微鏡下計數(shù)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。采用Mann Withey U-檢驗進行統(tǒng)計學處理。
實驗結(jié)果
結(jié)果見表2，可知己二酸人參皂苷C-K組合物高、中、低劑量組對小鼠B16-BL6細胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用。
表2己二酸人參皂苷C-K組合物對小鼠B16-BL6細胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的抑制作用
實施例6人參皂苷C-K與有機酸組合物的急性毒性實驗
動物：昆明小鼠42只，小鼠體重要保證組內(nèi)差異<20％(20g～24g)，雌雄各半，保證雌性未產(chǎn)、無孕。飼養(yǎng)前需要對小鼠的飼養(yǎng)房、籠具、飲水瓶等進行消毒。小鼠飼養(yǎng)在方形透明的鼠籠中，保證充足的飲水和食物。實驗前飼養(yǎng)2d～3d，以適應(yīng)實驗環(huán)境，并觀察其正常生長活動和健康狀況。給藥前禁食處理--空腹過夜(不禁水)。
樣品：
1：C-K與蘋果酸1:0.02重量比配成組合物
2：氯化鈉
實驗過程：將小鼠平均分為7組，1組作為空白對照組，3組為氯化鈉給藥組，3組為C-K與蘋果酸組合物給藥組，按照下表一給藥劑量進行灌胃給藥，統(tǒng)計一周內(nèi)的動物死亡數(shù)，結(jié)果如表3所示。
表3人參皂苷C-K與有機酸組合物的急性毒性實驗結(jié)果
還需要說明的是，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進行組合，來構(gòu)成其它技術(shù)方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當于記載在本說明書中。
以上通過具體實施方式和實施例對本發(fā)明進行了說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，這些并非意圖對本發(fā)明的范圍進行限定，本發(fā)明的范圍應(yīng)由權(quán)利要求書確定。
工業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種高效低毒的稀有人參皂苷組合物。