本發(fā)明涉及一種重組蛋白rlj-rgd4的新用途，尤其是重組蛋白rlj-rgd4在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

lj-rgd3為來(lái)源于日本七鰓鰻口腔腺分泌物的rgd毒素蛋白，由117個(gè)氨基酸殘基組成，lj-rgd3的一級(jí)結(jié)構(gòu)除具有三個(gè)rgd模體和一對(duì)半胱氨酸這一典型的rgd毒素蛋白特征外，還含有17個(gè)組氨酸，17個(gè)精氨酸，是一類(lèi)hrg的堿性蛋白，已公開(kāi)于專(zhuān)利號(hào)為200510083437.7、名稱(chēng)為“具抗腫瘤作用的日本七鰓鰻口腔腺rgd模體蛋白的基因克隆與表達(dá)”的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利文獻(xiàn)中，即命名為lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗腫瘤增殖等功效。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01410413382.0的發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種“源于人工合成基因的重組蛋白rlj-rgd4在血管新生抑制劑類(lèi)抗腫瘤藥物中的應(yīng)用”并公開(kāi)了rlj-rgd4的cdna序列（174bp）。從該專(zhuān)利申請(qǐng)文獻(xiàn)中得知，rlj-rgd4是以lj-rgd3基因?yàn)樵腿斯ず铣傻男碌幕蛐蛄兄亟M蛋白，具有4個(gè)rgd模體，由58個(gè)氨基酸殘基組成，被命名為rlj-rgd4。rlj-rgd4與lj-rgd3相比，其分子量更小，更具有成藥性。但是，卻沒(méi)有關(guān)于重組蛋白rlj-rgd4具有抗血栓作用的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是發(fā)現(xiàn)的重組蛋白rlj-rgd4能夠與血小板細(xì)胞膜上糖蛋白gpiib/iiia特異性結(jié)合而競(jìng)爭(zhēng)性拮抗纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，防止了血小板的活化和gpiib/iiia受體構(gòu)象的改變，阻斷受體與多種配體的結(jié)合，從而抑制血小板聚集的最終共同通路，阻斷血栓的形成，從而發(fā)明了一種重組蛋白rlj-rgd4在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種重組蛋白rlj-rgd4在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的重組蛋白rlj-rgd4在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用，抗血栓效果好，分子量小，便于人體吸收，更具有成藥性。

附圖說(shuō)明

圖1是rlj-rgd4對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓形成的影響（±s，n=10）示意圖。

圖2是rlj-rgd4對(duì)大鼠靜脈血栓形成的影響（±s，n=10）示意圖。

圖3是rlj-rgd4對(duì)大鼠血小板血栓形成的影響（±s，n=10）示意圖。

具體實(shí)施方式

一種重組蛋白rlj-rgd4在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。

（1）rlj-rgd4對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓形成的影響

取雄性sd大鼠50只，隨機(jī)均分5組（每組10只）：ns組，rlj-rgd425μg·kg^-1、50μg·kg^-1、100μg·kg^-1組以及陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽eptifibatide（100.0μg·kg^-1）組。大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯1.0g·kg^-1麻醉，分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，將體內(nèi)血栓形成儀的刺激電極置于頸總動(dòng)脈近心端，遠(yuǎn)心端置一溫度電極，大鼠舌下靜脈注射不同受試藥物（ns組給予等容量ns）后10min，以強(qiáng)度為1.6ma直流電連續(xù)刺激頸總動(dòng)脈7min，當(dāng)血栓形成阻塞血流時(shí)儀器報(bào)警，記錄從電刺激開(kāi)始至溫度驟降所需時(shí)間，稱(chēng)血流阻塞時(shí)間（occlusiontime，ot），即為血栓形成時(shí)間。以ns組為基準(zhǔn)，計(jì)算不同給藥組ot延長(zhǎng)百分率。

結(jié)果如圖1所示：圖1中縱坐標(biāo)為動(dòng)脈血流阻塞時(shí)間（occlusiontime，ot），ot值越大表明藥物抗動(dòng)脈血栓能力越強(qiáng)。從圖1可以看出rlj-rgd425μg·kg^-1、50μg·kg^-1、100μg·kg^-1組ot延長(zhǎng)率分別為18.5%、24.1%和41.0%（p<0.01），陽(yáng)性對(duì)照藥eptifibatide（埃替菲巴肽）100.0μg·kg^-1靜脈注射后ot延長(zhǎng)百分率為43.1%（p<0.01），表明rlj-rgd4具有明顯的抗動(dòng)脈血栓作用，且呈劑量依賴(lài)性。rlj-rgd4高劑量組（100μg·kg^-1）和陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽（100.0μg·kg^-1）的血栓抑制率相當(dāng)。注：與model組比較，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001

（2）rlj-rgd4對(duì)靜脈血栓形成的影響

取雄性sd大鼠50只，隨機(jī)均分為5組（每組10只）：ns對(duì)照組，rlj-rgd46.25μg·kg^-1、12.5μg·kg^-1、25μg·kg^-1組，埃替菲巴肽eptifibatide（100.0μg·kg^-1）組。大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯1.0g·kg^-1麻醉，按rayers法，剖腹分離下腔靜脈，于左腎靜脈下方置一絲線(xiàn)備用，自舌下靜脈注射不同受試藥物，10min后結(jié)扎下腔靜脈造成瘀血，然后關(guān)閉腹腔，于結(jié)扎后4h打開(kāi)腹腔并于結(jié)扎下方2cm處夾閉血管，縱行剖開(kāi)血管，取出血栓，60℃干燥30min后稱(chēng)血栓干重。以ns組為基準(zhǔn)，計(jì)算各給藥組血栓干重抑制百分率。

結(jié)果如圖2所示：圖2中縱坐標(biāo)為靜脈血栓干重，血栓干重值越小表明藥物抗靜脈血栓能力越強(qiáng)。從圖2可以看出rlj-rgd46.25μg·kg^-1、12.5μg·kg^-1、25μg·kg^-1組iv后血栓干重抑制率分別為73.9%、84.9%、和85.3%（p<0.01），說(shuō)明rrgd4康肽具有明顯的抗靜脈血栓作用，且呈劑量依賴(lài)性。陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽100.0μg·kg^-1靜脈注射后血栓干重抑制率為78.1%，rlj-rgd4低劑量組（6.25μg·kg^-1）就和陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽（100.0μg·kg^-1）的抑制率相當(dāng)，中劑量（12.5μg·kg^-1）及高劑量（25μg·kg^-1）組遠(yuǎn)較陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽（100.0μg·kg^-1）強(qiáng)效。注：與model組比較，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001

（3）rlj-rgd4對(duì)血小板血栓形成的影響

采用大鼠動(dòng)靜脈環(huán)路法復(fù)制血小板血栓模型。取雄性sd大鼠50只，隨機(jī)均分5組（每組10只）：ns組，rlj-rgd40.75μg·kg^-1、1.5μg·kg^-1和3.0μg·kg^-1組，陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽eptifibatide（100.0μg·kg^-1）組。大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯1.0g·kg^-1麻醉，分離右頸總動(dòng)脈及左頸外靜脈并分別插管，二者以充滿(mǎn)肝素（50u/ml）生理鹽水溶液的中段放入一根長(zhǎng)6cm的7號(hào)手術(shù)線(xiàn)的聚乙烯管相連接，并以動(dòng)脈夾夾閉暫時(shí)阻斷血流。大鼠舌下靜脈各受試藥物，于藥后10min打開(kāi)動(dòng)脈夾，血液從右頸總動(dòng)脈流入聚乙烯管，返回左頸外靜脈，形成動(dòng)-靜脈環(huán)路。血流開(kāi)放15min后，中斷血流，迅速取出手術(shù)線(xiàn)，濾紙吸干表面水份，稱(chēng)血栓濕重，再于60℃烘干60min得其干重。以模型組為基準(zhǔn)，計(jì)算血栓形成抑制率。

結(jié)果如圖3所示：圖3中縱坐標(biāo)為靜脈血栓干重，血栓干重值越小表明藥物抗靜脈血栓能力越強(qiáng)。從圖3可以看出，rlj-rgd40.75μg·kg^-1、1.5μg·kg^-1和3.0μg·kg^-1組iv后血栓干重均明顯減輕，血栓干重抑制率分別為30.7%、45.5%、50.2%（p<0.01），說(shuō)明rlj-rgd4具有明顯的抗血小板血栓作用，且呈劑量依賴(lài)性。陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽100.0μg·kg^-1靜脈注射后血栓干重抑制率為28.9%。rlj-rgd4低劑量（0.75μg·kg^-1）與陽(yáng)性對(duì)照藥埃替菲巴肽（100.0μg·kg^-1）的抑制率相近，其抗血栓作用較陽(yáng)性對(duì)照埃替菲巴肽強(qiáng)效。注：與model組比較，**p<0.01、***p<0.001。