本發(fā)明涉及藥物制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種腦蛋白水解物制劑及其設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
：腦蛋白水解物是由動(dòng)物腦組織中提取分離而來(lái)，它易于跨越生物膜并通過(guò)血腦屏障，通過(guò)多種方式促進(jìn)細(xì)胞代謝，增加腦活性，同時(shí)作用于神經(jīng)中樞，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)元修復(fù)提供氨基酸，促進(jìn)突觸形成，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，改善神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。近幾年，國(guó)內(nèi)該藥物主要采取注射給藥，口服給藥少，并且生物利用度低。所以應(yīng)該如何傳送保存這類藥物是藥劑學(xué)一直應(yīng)該堅(jiān)持探索的奮斗目標(biāo)。胃漂浮制劑是基于流體動(dòng)力學(xué)平衡原理制備的可長(zhǎng)時(shí)間浮在胃液之上的一類制劑。它可降低胃排空對(duì)制劑吸收的影響，能夠提高制劑的體內(nèi)吸收時(shí)間，從而提高在人體的利用度。但是，目前對(duì)胃漂浮制劑的處方篩選中還存在比較多的不足，例如需依賴于研究者的經(jīng)驗(yàn)，或即使可采用正交試驗(yàn)進(jìn)行篩選處方，也存在試驗(yàn)精度不夠，選擇的試驗(yàn)值僅僅是接近最佳取值，無(wú)法精確找到最佳點(diǎn)，以及條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn)，不能靈敏地考察各因素間的交互作用等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種腦蛋白水解物制劑及其設(shè)計(jì)方法，采用該方法設(shè)計(jì)得到的腦蛋白水解物制劑，具有最佳的釋放效果。一種設(shè)計(jì)腦蛋白水解物制劑的方法，包括以下步驟：劑型選擇：將腦蛋白水解物在人工胃液和人工腸液中處理進(jìn)行mtt實(shí)驗(yàn)，根據(jù)腦蛋白水解物在胃、腸中對(duì)氧化損傷模型的修復(fù)率選擇劑型；處方設(shè)計(jì)：按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，以預(yù)設(shè)制劑輔料為影響因素，以累積釋放度為效應(yīng)變量設(shè)計(jì)不同處方；實(shí)驗(yàn)：按照上述處方制備腦蛋白水解物制劑，并分別進(jìn)行釋放度實(shí)驗(yàn)，得到各處方腦蛋白水解物制劑的釋放度；建模：按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型擬合，得到以所述影響因素為自變量，以所述累計(jì)釋放度為效應(yīng)變量擬合方程；處方優(yōu)化：根據(jù)所述擬合方程，對(duì)自變量進(jìn)行優(yōu)化篩選，得到累計(jì)釋放度最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的自變量，即為最優(yōu)處方。通過(guò)上述方法設(shè)計(jì)腦蛋白水解物制劑，首先從細(xì)胞水平考慮了腦蛋白水解物的吸收和活性效果，進(jìn)行針對(duì)性的劑型選擇，又通過(guò)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，對(duì)選定劑型進(jìn)行處方篩選，最終得到活性和釋放效果最佳的腦蛋白水解物制劑。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述劑型選擇步驟中，所述mtt實(shí)驗(yàn)具體如下：(1)腦蛋白水解物給藥劑量的確定：將pc12細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行研究，按照下表1設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組別，并在酶標(biāo)儀550nm處檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組吸光度值a；表1.實(shí)驗(yàn)組別按照下式計(jì)算修復(fù)率，根據(jù)修復(fù)率得到腦蛋白水解物的最佳給藥劑量；式中：ag為不同濃度供試品組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度as為損傷細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度az為正常細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度(2)腦蛋白水解物在人工胃液和腸液中的修復(fù)率：將pc12細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行研究，按照下表2設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組別，并在酶標(biāo)儀550nm處檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組吸光度值a；表2.實(shí)驗(yàn)組別按照下式計(jì)算修復(fù)率，根據(jù)修復(fù)率選擇劑型；式中：ag為不同供試品組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度as為損傷細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度az為正常細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度。其中，正常細(xì)胞組或損傷細(xì)胞組皆為與同組對(duì)應(yīng)的組別作參比，直觀體現(xiàn)差異性。通過(guò)上述mtt實(shí)驗(yàn)，能夠準(zhǔn)確的得到活性成分腦蛋白水解物發(fā)揮功效的特性，從而針對(duì)性的選擇特定劑型。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述劑型為胃漂浮片劑，所述胃漂浮片劑中的腦蛋白水解物含量為18-22mg/片。該含量是在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)綜合考慮得到。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述設(shè)計(jì)步驟中，所述處方中的輔料包括：hpmc-k4m，十八醇，丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)，乳糖，微晶纖維素。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述處方中，所述腦蛋白水解物的含量為20mg/片，所述十八醇的含量為54.5-70.5mg/片，所述hpmc-k4m的含量為17.5-35.5mg/片，所述丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)的含量為8.5-18.5mg/片，所述乳糖的含量為10mg/片，所述微晶纖維素的含量為20mg/片。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述設(shè)計(jì)步驟中，以輔料十八醇、hpmc-k4m和丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)分別為影響因素x1，x2和x3，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，具體如下表：表3.三因素三水平實(shí)驗(yàn)表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在腦蛋白水解物胃漂浮制劑的處方中，十八醇、hpmc-k4m和丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)對(duì)釋藥性能和胃內(nèi)漂浮性能的影響最大，因此，以該三因素作為影響因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，能夠更好的對(duì)處方進(jìn)行篩選。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述實(shí)驗(yàn)步驟中，以0.1mol/l的鹽酸水溶液為溶出介質(zhì)，進(jìn)行釋放度測(cè)定。優(yōu)選的，根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》二部釋放度測(cè)定法第二法進(jìn)行測(cè)定即可反應(yīng)制劑在胃內(nèi)的釋放情況。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述建模步驟中，根據(jù)顯著性以及r2最大原則，優(yōu)選出二次模型方程，并在t檢驗(yàn)為p<0.005的水平上簡(jiǎn)化得如下擬合方程：y＝-1170.29515+31.17345x1+6.52281x2+28.42872x3+0.047361x1x2+0.048359x1x3-0.11451x2x3-0.26182x12-0.14885x22-0.10181x32上式中：y為累積釋放度，x1為hpmc-k4m處方量，x2為十八醇處方量，x2為丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)處方量。上述擬合方程，不僅模型較為簡(jiǎn)化，易于計(jì)算，而且模型的f＝20.60，p<0.0001，表明模型高度顯著。同時(shí)可知，該模型具有極其顯著的失擬度(p<0.005)，并能解釋96.36％的響應(yīng)值變化(調(diào)整確定系數(shù)r2＝0.9636)。通過(guò)上述所得數(shù)據(jù)，表明該模型具有良好的擬合度及較小的實(shí)驗(yàn)誤差，故簡(jiǎn)化方程仍具有較高的可信度。因此可用其對(duì)腦蛋白水解物胃漂浮片的工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟優(yōu)化中，固定一個(gè)自變量后對(duì)其余兩個(gè)自變量以累計(jì)釋放度對(duì)其余兩個(gè)自變量影響作曲面圖和等高線圖，通過(guò)對(duì)回歸模型求解方程計(jì)算，得到累計(jì)釋放度最高所對(duì)應(yīng)的自變量，具體為：十八醇為63mg，hpmc-k4m為27mg，丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)為13mg，乳糖為10mg/片，微晶纖維素為20mg/片，腦蛋白水解物20mg/片，即為最優(yōu)處方。本法明還公開(kāi)了上述的設(shè)計(jì)腦蛋白水解物制劑的方法設(shè)計(jì)得到的腦蛋白水解物制劑。通過(guò)該方法設(shè)計(jì)得到的腦蛋白水解物制劑，具有最佳的胃內(nèi)漂浮性能和釋放效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的一種設(shè)計(jì)腦蛋白水解物制劑的方法，首先從細(xì)胞水平考慮了腦蛋白水解物的吸收和活性效果，進(jìn)行針對(duì)性的劑型選擇，又通過(guò)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，對(duì)選定劑型進(jìn)行處方篩選，最終得到活性和釋放效果最佳的腦蛋白水解物制劑。并且，還對(duì)各設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)的具體手段進(jìn)行了細(xì)化篩選，最終得到和真實(shí)情況高度相符的擬合方程，能夠?qū)δX蛋白水解物胃漂浮片的工藝進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和預(yù)測(cè)。試驗(yàn)表明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化該制劑的處方科學(xué)、穩(wěn)定、可行。本發(fā)明對(duì)今后的漂浮片制劑的處方優(yōu)化，輔料的研究有一定的現(xiàn)實(shí)可行性意義。附圖說(shuō)明圖1為在不同生理環(huán)境中腦蛋白水解物對(duì)細(xì)胞的修復(fù)作用；圖2為y＝f(x2，x3)等高線圖；圖3為y＝f(x2，x3)響應(yīng)曲面圖；圖4為y＝f(x1，x3)等高線圖；圖5為y＝f(x1，x3)響應(yīng)曲面圖；圖6為y＝f(x1，x2)等高線圖；圖7為y＝f(x1，x2)響應(yīng)曲面圖。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。以下實(shí)施例中的部分儀器和材料如下，其余均為市售。儀器：tdp-5型單沖壓片機(jī)(長(zhǎng)沙市云麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；modelld310-2電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；sy-6d型片劑四用測(cè)定儀(常州銳品精密儀器有限公司)；實(shí)驗(yàn)室微型噴霧干燥機(jī)l-117(北京來(lái)亨科貿(mào)有限公司技術(shù)開(kāi)發(fā)中心)。材料：腦蛋白水解物(吉林長(zhǎng)慶藥業(yè))；十八醇(湖南爾康制藥股份有限公司批號(hào)：105220140801)；羥丙甲纖維素hpmc-qbj-k4m(安徽山河藥用輔料股份有限公司批號(hào)：f20072003)；聚丙烯酸樹(shù)脂ⅱ(中國(guó)藥典2010年版，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)：f20090001)；乳糖(曲阜市天利藥用輔料有限公司，批號(hào)：20110106)；微晶纖維素(曲阜市天利藥用輔料有限公司批號(hào)：20140305)；蒸餾水：自制。dmem(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司，批號(hào)：55d00151)；噻唑藍(lán)(mtt)：(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào)：51l10156)；過(guò)氧化氫：(沈陽(yáng)市華東試劑廠，批號(hào)：20121009)；二甲基亞砜(dmso)：(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：nzm1301)；胎牛血清：(浙江天杭生物科技股份有限公司,批號(hào)：20150918)；胰蛋白酶：(genview公司，批號(hào)：4028010564)；鹽酸：(天津市凱信化學(xué)有限公司，批號(hào)：20140611)；磷酸二氫鉀：(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)：200,1112)；氫氧化鈉：(曲阜市天利藥用輔料有限公司，批號(hào)：20140305)；胃蛋白酶：(genview公司，批號(hào)：4028010375)；pc12細(xì)胞：(通派(上海)生物科技有限公司)。實(shí)施例一種腦蛋白水解物制劑，通過(guò)以下方法設(shè)計(jì)得到：一、劑型選擇。將腦蛋白水解物在人工胃液和人工腸液中處理進(jìn)行mtt實(shí)驗(yàn)，根據(jù)腦蛋白水解物在胃、腸中對(duì)氧化損傷模型的修復(fù)率選擇劑型，具體如下。(1)腦蛋白水解物給藥劑量的確定：將pc12細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行研究，按照下表設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組別，具體加樣及實(shí)驗(yàn)方法為：將細(xì)胞濃度為1ml含1.0×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于正常細(xì)胞對(duì)照組、損傷細(xì)胞對(duì)照組、不同濃度供試品1-3組的96孔板中，每孔加入100μl，空白對(duì)照組每孔加100μl10％胎牛血清培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，放到37℃，5％newbrunswich二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。等到細(xì)胞完全貼著培養(yǎng)瓶壁后，空白對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組、損傷細(xì)胞對(duì)照組每孔加入100μl10％胎牛血清培養(yǎng)基，供試品組1還加入100μl6μg/ml腦蛋白水解物，供試品組2還加入100μl60μg/ml腦蛋白水解物，供試品組3還加入100μl600μg/ml腦蛋白水解物。24h后向損傷細(xì)胞對(duì)照組，不同濃度供試品1-3組每孔加入0.5mmol/lh2o2溶液50μl，其他組每孔加入10％胎牛血清全培養(yǎng)液50μl，鋪好后放于37℃，5％newbrunswich二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。結(jié)束培養(yǎng)前的4h，吸出培養(yǎng)液，pbs洗一次，加pbs100μl，噻唑藍(lán)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出舊的培養(yǎng)液，加入100μl二甲基亞砜，搖勻。隨后在酶標(biāo)儀550nm處檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組吸光度值a；表4.實(shí)驗(yàn)組別及修復(fù)率(n＝3)按照下式計(jì)算修復(fù)率，根據(jù)修復(fù)率得到腦蛋白水解物的最佳給藥劑量；式中：ag為不同濃度供試品組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度as為損傷細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度az為正常細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度從上述修復(fù)率結(jié)果可以看出，腦蛋白水解物的最佳濃度為60μg/l，據(jù)此，經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)最佳給藥劑量為20mg/片。(2)腦蛋白水解物在人工胃液和腸液中的修復(fù)率：將pc12細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行研究，按照下表設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組別，具體加樣及實(shí)驗(yàn)方法為：將細(xì)胞濃度為1ml含1.0×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于正常細(xì)胞對(duì)照組、損傷細(xì)胞對(duì)照組、正常細(xì)胞+腦蛋白水解物胃液組、正常細(xì)胞+腦蛋白水解物腸液組、正常細(xì)胞+腦蛋白水解物組、損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物胃液組、損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物腸液組、損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物組的96孔板中，每孔加入100μl，空白對(duì)照組每孔加100μl10％胎牛血清培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，放到37℃，5％newbrunswich二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。等到細(xì)胞完全貼到培養(yǎng)瓶壁后，空白對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組、損傷細(xì)胞對(duì)照組每孔加入100μl10％胎牛血清培養(yǎng)基，正常細(xì)胞+腦蛋白水解物胃液組和損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物胃液組每孔加入100μl腦蛋白水解物經(jīng)人工胃液處理的樣品，正常細(xì)胞+腦蛋白水解物腸液組和損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物腸液組每孔加入100μl腦蛋白水解物經(jīng)人工腸液處理的樣品，正常細(xì)胞+腦蛋白水解物組和損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物組每孔加入100μl腦蛋白水解物。24h后向損傷細(xì)胞對(duì)照組，損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物胃液組，損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物腸液組，損傷細(xì)胞+腦蛋白水解物組每孔加入0.5mmol/lh2o2溶液50μl，其他組每孔加入10％胎牛血清培養(yǎng)液50μl，鋪好細(xì)胞后放于37攝氏度，5％newbrunswich二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。結(jié)束培養(yǎng)前4h，吸出舊的培養(yǎng)液，pbs洗一次，加pbs100微升,噻唑藍(lán)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出舊的培養(yǎng)液，加入100μl二甲基亞砜，搖勻。；隨后在酶標(biāo)儀550nm處檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組吸光度值a；表5.實(shí)驗(yàn)組別及修復(fù)率(n＝3)所述經(jīng)人工胃液處理具體為：取9.5％～10.5％稀鹽酸16.4ml，加水約800ml與胃蛋白酶10g，搖勻后，加水稱釋成1000ml，即得人工胃液，用于溶解腦蛋白水解物；所述經(jīng)人工腸液處理具體為：取磷酸二氫鉀6.8g，加水500ml使溶解，用0.1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至6.8，取胰酶10g，加水量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000ml，即得人工腸液，用于溶解腦蛋白水解物。按照下式計(jì)算修復(fù)率，根據(jù)修復(fù)率選擇劑型；式中：ag為不同供試品組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度as為損傷細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度az為正常細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度-空白對(duì)照組平均吸光度。其中，正常細(xì)胞組或損傷細(xì)胞組皆為與同組對(duì)應(yīng)的組別作參比，直觀體現(xiàn)差異性。結(jié)果如圖1及下表所示。表6.在不同生理環(huán)境中腦蛋白水解物對(duì)細(xì)胞的修復(fù)作用(n＝3)組別人工胃液組人工腸液組正常組修復(fù)率(平均值)124％*107％*112％*表示與正常組對(duì)比，p<0.05。從上述結(jié)果中可以看出，與正常組相比，人工胃液組的修復(fù)率明顯高于正常組(p<0.05)，且人工腸液組的修復(fù)率明顯低于正常組(p<0.05)，提示腦蛋白水解物的最佳作用部位為胃部，因此將該腦蛋白水解物的劑型確定為胃漂浮片。二、處方設(shè)計(jì)。按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，以預(yù)設(shè)制劑輔料為影響因素，以累積釋放度為效應(yīng)變量設(shè)計(jì)不同處方。根據(jù)腦蛋白水解物的特性和胃漂浮片的特點(diǎn)，選擇hpmc-k4m，十八醇，丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)，乳糖和微晶纖維素為輔料制備胃漂浮片。并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，選定的處方如下：并以十八醇、hpmc-k4m和丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)作為考察因素對(duì)腦蛋白水解物胃漂浮片8h的體外總釋放的影響，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化的原理設(shè)計(jì)了三因素三水平試驗(yàn)并以此優(yōu)化處方。具體如下表7-8表7試驗(yàn)因素水平編碼表表8響應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案三、實(shí)驗(yàn)。按照上述處方制備腦蛋白水解物制劑，并分別進(jìn)行釋放度實(shí)驗(yàn)，得到各處方腦蛋白水解物制劑的釋放度。(1)腦蛋白水解物胃漂浮片的制備。將液體的腦蛋白水解物用噴霧干燥機(jī)噴成固體粉末。再將處方量的十八醇在60℃熔融，加入處方量的丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)和2/3的量hpmc-k4m趁熱用16目篩制粒，將剩余的hkmc-k4m與乳糖，微晶纖維素，腦蛋白水解物，蒸餾水濕法制粒。將兩次制得的?；旌虾蟾稍铮?，加入1％硬脂酸鎂，壓片，即得。(2)體外漂浮性能的考察取6片上述胃漂浮片放入(37±0.5)℃的人工胃液(0.1mol·l-1的鹽酸溶液)中，模擬胃蠕動(dòng)。記錄漂浮片從投入人工胃液同一深度中到上漂至液面的時(shí)間及其持續(xù)漂浮時(shí)間，觀察它的漂浮性，記錄起漂時(shí)間與持續(xù)漂浮時(shí)間。結(jié)果每片的漂浮滯后時(shí)間均＜5s，持續(xù)漂浮時(shí)間＞8h，說(shuō)明漂浮性能良好。(3)體外釋放度的測(cè)定a.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品腦蛋白水解物片精密稱適量，以0.1mol·ml-1鹽酸溶液為溶劑，配成濃度分別為1.02，2.03，4.06，8.13，16.25，32.50μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定254nm波長(zhǎng)處吸光度，以吸光度值(a)對(duì)濃度(c)進(jìn)行線性回歸，其方程為a＝0.0158c+0.1943；r2＝0.9991(n＝6)。實(shí)驗(yàn)得出，腦蛋白水解物片在1.02～32.50μg·ml-1范圍，其吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系。b.釋放度測(cè)定方法根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》二部釋放度測(cè)定法第二法進(jìn)行測(cè)定。將胃漂浮片置于溶出杯中，轉(zhuǎn)速50r·min-1，溫度(37±0.5)℃，以0.1mol·l-1鹽酸溶液1000ml為溶出介質(zhì)，分別在第2，5，8h將藥片取出，取樣20ml，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，于254nm處測(cè)定吸光度值，代入當(dāng)天所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出濃度并計(jì)算釋放度。c.結(jié)果結(jié)果如下表所示。表9響應(yīng)面法累積釋放度試驗(yàn)結(jié)果四、建模。按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型擬合，得到以所述影響因素為自變量，以所述累計(jì)釋放度為效應(yīng)變量擬合方程。用design-expert8.0.6trial軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型擬合根據(jù)顯著性(p<0.005)以及r2最大原則，優(yōu)選出二次模型方程為最佳擬合方程。t檢驗(yàn)在p<0.005水平上簡(jiǎn)化得擬合方程如下：y＝-1170.29515+31.17345x1+6.52281x2+28.42872x3+0.047361x1x2+0.048359x1x3-0.11451x2x3-0.26182x12-0.14885x22-0.10181x32(r2＝0.9636)并對(duì)擬合方程各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)下表，對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。表10響應(yīng)面二次回歸方程方差分析由上表可以看出：模型的f＝20.60，p<0.0001，表明模型高度顯著。同時(shí)可知，該模型具有極其顯著的失擬度(p<0.005)，并能解釋96.36％的響應(yīng)值變化(調(diào)整確定系數(shù)r2＝0.9636)[8～10]。通過(guò)上述所得數(shù)據(jù)，表明該模型具有良好的擬合度及較小的實(shí)驗(yàn)誤差，故簡(jiǎn)化方程仍具有較高的可信度[11]。因此可用其對(duì)小腦蛋白水解物胃漂浮片的工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。五、處方優(yōu)化。根據(jù)所述擬合方程，對(duì)自變量進(jìn)行優(yōu)化篩選，得到累計(jì)釋放度最高所對(duì)應(yīng)的自變量，即為最優(yōu)處方。根據(jù)累計(jì)釋放度做二項(xiàng)式分析：根據(jù)擬合方程，固定一個(gè)變量后對(duì)其余兩個(gè)變量以8h總釋放度對(duì)其影響作曲面圖和等高線圖，如圖2-7。選擇星點(diǎn)設(shè)計(jì)中不同變量的優(yōu)化范圍(該點(diǎn)越接近橢圓中心，表示y值越大，y值越大結(jié)果越好)；當(dāng)x1＝62.50時(shí)y＝-1170.29515+1948.34063+6.52281x2+28.42872x3+0.047361x1x2+0.048359x1x3-0.11451x2x3-0.26182x12-0.14885x22-0.10181x32，b-hpmc(x2因素)及c-樹(shù)脂ⅱ號(hào)(x3因素)交互影響的高線及響應(yīng)曲面見(jiàn)圖2-3。優(yōu)化區(qū)域：35.5>x2>17.5，16.5>x3>8.5當(dāng)x2＝26.5時(shí)y＝-1170.29515+31.17345x1+172.8542+28.42872x3+0.047361x1x2+0.048359x1x3-0.11451x2x3-0.26182x12-0.14885x22-0.10181x32，a-十八醇(x1因素)及c-樹(shù)脂ⅱ號(hào)(x3因素)交互影響的高線及響應(yīng)曲面見(jiàn)圖4-5。優(yōu)化區(qū)域70.50>x1>54.5，16.5>x3>8.5當(dāng)x3＝12.5時(shí)y＝-1170.29515+31.17345x1+6.52281x2+355.359+0.047361x1x2+0.048359x1x3-0.11451x2x3-0.26182x12-0.14885x22-0.10181x32，a-十八醇(x1因素)及b-hpmc(x2因素)交互影響的高線及響應(yīng)曲面見(jiàn)圖6-7。優(yōu)化區(qū)域：70.5>x1>54.5，35.5>x2>17.5研究通過(guò)使用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法并根據(jù)擬合方程及方差分析結(jié)果表明：hpmc是影響漂浮片的體外釋放的最顯著因素，十八醇、丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)分別次之。以hpmc-k4m(羥丙基甲基纖維素)和十八醇、丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)作為因素，考察對(duì)腦蛋白水解物胃漂浮片的體外釋放的影響，已確定最佳工藝處方。通過(guò)對(duì)回歸模型求解方程計(jì)算，得出最大釋放率為85.4377％，小腦蛋白水解物胃漂浮片制備最佳工藝處方為：hpmc-k4m為63mg，十八醇27mg，丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)為13mg，腦蛋白水解物20mg，乳糖10mg，微晶纖維素20mg。六、處方驗(yàn)證根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化出的最佳處方：hpmc為63mg，十八醇27mg，丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)為13mg，腦蛋白水解物20mg，乳糖10mg，微晶纖維素20mg。再次進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，以此來(lái)驗(yàn)證次最佳處方的可行性?？?h累計(jì)釋放度的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值見(jiàn)下表。表11驗(yàn)證處方的8h累積釋放度(n＝3)從上表可以看出，藥物累積釋放度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值偏差<5％，漂浮滯后時(shí)間均＜5s，持續(xù)漂浮時(shí)間＞8h模型預(yù)測(cè)性良好，且重復(fù)性良好，符合設(shè)計(jì)要求。從上述實(shí)驗(yàn)可以看出，大多數(shù)口服藥物主要在小腸中上部(十二脂腸至回腸遠(yuǎn)端)的無(wú)菌部位吸收。釋放的藥物以溶液狀態(tài)到達(dá)無(wú)菌部位的量越大,吸收就越多,滯留時(shí)間越長(zhǎng)吸收時(shí)間越長(zhǎng)。藥物通過(guò)無(wú)菌部位的時(shí)間一般為2-3小時(shí),對(duì)大多數(shù)制劑由于胃腸滯留時(shí)間太短,許多藥物未被釋放、吸收就已通過(guò)吸收部位,藥物的生物利用度不高。并且由于胃排空的個(gè)體差異較大，使某些藥物的藥效個(gè)體差異顯著。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)過(guò)氧化氫對(duì)pc12細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，建立損傷模型，確定腦蛋白水解物對(duì)損傷細(xì)胞的修復(fù)率修復(fù)濃度。腦蛋白水解物分別經(jīng)過(guò)胃液、腸液處理后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，可以得出在經(jīng)過(guò)胃液處理的腦蛋白水解物比經(jīng)過(guò)腸液處理的及沒(méi)有處理的腦蛋白水解物的修復(fù)率都高，并且有顯著性差異。腦蛋白水解物的水溶性極強(qiáng)，非常易于溶于水，大部分是在胃和小腸上半部中被吸收。因此有必要制備胃內(nèi)漂浮制劑，延長(zhǎng)制劑胃腸滯留時(shí)間，在控制釋放的同時(shí),增加藥物的吸收,提高藥物的生物利用度。hpmc是影響漂浮片的體外釋放的最顯著因素，十八醇、丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)分別次之。hpmc-k4m的密度較低,在漂浮片中含量越少,漂浮片的密度越低,隨著hpmc的逐漸增加，漂浮片的硬度也會(huì)有增加的趨勢(shì)，而且浮動(dòng)的跳躍性很大。而十八醇質(zhì)量輕巧并且密度較低,越多漂浮片硬度越強(qiáng)，在水中成不溶性,在羥丙甲基纖維素形成的凝膠體制中,對(duì)藥物起到緩釋作用，在一定程度上輔助hpmc達(dá)到助漂作用。丙烯酸樹(shù)脂ⅱ號(hào)由甲基丙烯酸與甲基丙烯酸甲酯所按一定比例混合而成，可用于增加藥物的穩(wěn)定性，改變藥物的釋放性能等，在本實(shí)施例中，它可以與hpmc與十八醇共同作用增加釋藥穩(wěn)定性。乳糖作為致孔劑并且擁有一定的水溶性，可增加藥物的緩釋作用。試驗(yàn)表明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化該制劑的處方科學(xué)、穩(wěn)定、可行。本實(shí)驗(yàn)對(duì)今后的漂浮片制劑的處方優(yōu)化，輔料的研究有一定的現(xiàn)實(shí)可行性意義。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12