本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，涉及化合物szeto-schiller-31(ss-31)在治療弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(frda)疾病中的應(yīng)用。

在本申請(qǐng)全文中，通過第一作者和公開年份來引用各種出版物。這些出版物的完整引用信息記錄在說明書后面的參考文獻(xiàn)部分。引用的文件和出版物以及在參考文獻(xiàn)部分的公開內(nèi)容通過引用其全部內(nèi)容并入本申請(qǐng)，以更充分地描述本發(fā)明日期之前的現(xiàn)有技術(shù)狀況。

背景技術(shù)：

frda是一種常染色體單基因突變引起的神經(jīng)退行性疾病，屬于線粒體疾病的范疇。該病發(fā)病年齡常在兒童早期，病程呈進(jìn)程性發(fā)展，多于40到50歲死亡。主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性姿勢(shì)和步態(tài)的共濟(jì)失調(diào)，上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能障礙，如構(gòu)音障礙、腱反射消失、深感覺喪失、心肌病、糖尿病及繼發(fā)性骨骼畸形等(abrahao,pedrosoetal.2015)。

frda的主要病因是人類第9號(hào)染色體上frataxin(fxn)基因的第一個(gè)內(nèi)含子中有g(shù)aa序列大量重復(fù)擴(kuò)增，導(dǎo)致fxn的轉(zhuǎn)錄沉默，使其表達(dá)水平僅為正常的5-30％(campuzano,monterminietal.1996)。fxn的主要功能是參與鐵硫簇的裝配和血紅素的合成。研究表明，frda中fxn的缺乏導(dǎo)致線粒體鐵硫簇缺乏以及鐵硫簇相關(guān)酶的活性降低(如線粒體順烏頭酸酶和電子傳遞鏈復(fù)合物i,ii,iii)，此外fxn的缺乏也造成了線粒體中鐵的累積，這些由fxn缺乏所引起的后果都會(huì)對(duì)線粒體功能乃至細(xì)胞造成損傷。因此，提高frda病人中fxn的蛋白水平是最直接的治療方法，但目前還沒有非常有效的治療方案。

迄今為止，雖然一些臨床試驗(yàn)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但尚未發(fā)現(xiàn)治療frda的有效方法(aranca,jonesetal.2016)。目前對(duì)frda的治療方法主要有三種，第一種是抗氧化劑的應(yīng)用，mitoq和艾地苯醌是抗氧化劑，可以有效清除細(xì)胞中的自由基。iii期臨床試驗(yàn)之前的初步研究表明艾地苯醌可作為治療frda的安全藥物，對(duì)心肌肥大和神經(jīng)功能具有一定的改善作用。然而在iii期臨床試驗(yàn)中艾地苯醌未能表現(xiàn)出很好的療效，因此未被批準(zhǔn)用于frda(diprospero,bakeretal.2007)的治療。由此可見，抗氧化劑用于frda的治療，理論上很美好，但臨床試驗(yàn)結(jié)果被證明是失敗的策略，因此我們要避開僅僅作為抗氧化劑的化合物用于frda的治療這一陷阱。能夠提高fxn的表達(dá)，解決frda發(fā)生的病因才是根本。目前尚未發(fā)現(xiàn)mitoq在frda臨床試驗(yàn)中的研究。第二種是對(duì)表觀遺傳的調(diào)控，通過組蛋白脫乙酰酶抑制劑(hdaci)使異染色質(zhì)乙?；?，從而增強(qiáng)對(duì)fxnmrna和蛋白質(zhì)水平的表觀遺傳調(diào)控(soragni,miaoetal.2014)。不幸的是，最終結(jié)果顯示，在iii期試驗(yàn)中，患者并沒有得到改善。第三種是鐵螯合劑的應(yīng)用。當(dāng)fxn缺乏時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)線粒體鐵積累，由此提出了選擇性鐵螯合的處理來改善frda的策略(boddaert,lequansangetal.2007)。研究表明，低劑量的去鐵酮與艾地苯醌的聯(lián)合治療可能改善神經(jīng)功能和心肌肥大。但因?yàn)殍F缺乏會(huì)下調(diào)fxn的表達(dá)，所以長期使用它可能不是一個(gè)很好的選擇。目前，基因治療方法已經(jīng)在細(xì)胞和動(dòng)物模型中以表現(xiàn)出一些有益的效果(perdomini,belbellaaetal.2014)。最近，研究人員使用合成的dna或rna阻斷r環(huán)形成，因此觸發(fā)基因激活表達(dá)水平接近野生型細(xì)胞的水平，是治療frda的候選戰(zhàn)略。ss-31多肽是szeto和schiller合成篩選的一類線粒體靶向的化合物，其最初的研究目的是為了開發(fā)一類具有中樞活性的阿片類鎮(zhèn)痛藥。該四肽是一類芳香族陽離子多肽，其結(jié)構(gòu)基序?yàn)榻惶娴姆枷悱h(huán)、氨基酸殘基以及2’,6’-二甲基酪氨酸殘基(dmt)。ss-31靶向聚集在線粒體內(nèi)膜上，與心磷脂相互作用，維持線粒體的完整性，維持atp的正常產(chǎn)生(birk,chaoetal.2014)。已經(jīng)證明ss-31在缺血再灌注損傷、心臟衰竭等幾種動(dòng)物疾病模型中顯示出一定的效果(liu,soongetal.2014,nickel,vonhardenbergetal.2015)。但缺血再灌注損傷、心臟衰竭與本申請(qǐng)的疾病frda無論從疾病的發(fā)病機(jī)制，病理生理基礎(chǔ)，還是對(duì)應(yīng)的治療藥物、治療靶點(diǎn)和治療策略都完全不同，無法給出教導(dǎo)和啟示，但是我們還是想大膽的嘗試一下ss-31在調(diào)控frda方面的藥用功能。目前為止，沒有關(guān)于ss-31在調(diào)控線粒體鐵代謝相關(guān)聯(lián)的疾病方面的研究，更沒有和我研究的疾病frda相關(guān)聯(lián)的研究。

化合物szeto-schiller-31(ss-31)分子結(jié)構(gòu)式

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的是通過frda疾病相關(guān)的疾病模型，發(fā)現(xiàn)ss-31在制備治療frda及相關(guān)疾病方面新的醫(yī)藥用途。

技術(shù)方案

本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ss-31從翻譯水平上調(diào)frda病人細(xì)胞中frataxin(fxn)的表達(dá)；調(diào)節(jié)frda病人細(xì)胞中的鐵代謝；促進(jìn)線粒體中鐵硫簇的合成；改善線粒體功能；減少病人細(xì)胞中ros的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力。結(jié)果表明ss-31具有治療frda的潛在價(jià)值。

第一個(gè)方面的技術(shù)方案：

化合物ss-31在制備治療frda疾病藥物或者制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，ss-31本身或者其作為主要成分在制備下列藥物上的應(yīng)用：

(1)化合物ss-31在制備治療frda疾病藥物或者制劑中的應(yīng)用，其特征為ss-31能從翻譯水平提高frda患者細(xì)胞中fxn的表達(dá)水平。

(2)化合物ss-31在制備治療frda疾病藥物或者制劑中的應(yīng)用，其特征為化合物ss-31從翻譯水平提高細(xì)胞中fxn的表達(dá)水平并促進(jìn)鐵硫簇的合成和增強(qiáng)線粒體中含鐵硫簇的酶活性。

(3)化合物ss-31在制備治療frda疾病藥物或者制劑中的應(yīng)用，其特征為化合物ss-31改善frda病人線粒體的質(zhì)量，包括提高線粒體膜電位，增加atp水平，促進(jìn)線粒體內(nèi)膜嵴的有序排列等形態(tài)的改善。

(4)化合物ss-31在制備治療frda疾病藥物或者制劑中的應(yīng)用，其特征為化合物ss-31降低frda病人細(xì)胞中ros的水平，提高frda病人細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力，所述抵抗氧化應(yīng)激的能力包括清除ros能力的增強(qiáng)，對(duì)過氧化氫耐受能力的增強(qiáng)。

(5)化合物ss-31在制備治療frda疾病藥物或者制劑中的應(yīng)用，其特征為ss-31提高frda病人細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力。

第二個(gè)方面的技術(shù)方案：

化合物ss-31在制備從翻譯水平提高frda病人細(xì)胞中fxn表達(dá)水平藥物或者制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，ss-31本身或者其作為主要成分在制備下列藥物上的應(yīng)用：

(1)化合物ss-31在制備從翻譯水平提高frda病人細(xì)胞中fxn表達(dá)水平并促進(jìn)鐵硫簇的合成和增強(qiáng)線粒體中含鐵硫簇的酶活性的藥物或者制劑中的應(yīng)用。

(2)化合物ss-31在制備解決以下疾病或者相關(guān)病理狀態(tài)藥物或者制劑中的應(yīng)用：改善frda病人線粒體的質(zhì)量，包括提高線粒體膜電位，增加atp水平，促進(jìn)線粒體內(nèi)膜嵴的有序排列等形態(tài)的改善；

降低frda病人細(xì)胞中ros的水平，提高了frda病人細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力，所述細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力，包括清除ros能力的增強(qiáng)，對(duì)過氧化氫耐受能力的增強(qiáng)。

(3)化合物ss-31在制備解決以下疾病或者相關(guān)病理狀態(tài)藥物或者制劑中的應(yīng)用：從翻譯水平提高frda病人細(xì)胞中fxn的表達(dá)水平并促進(jìn)鐵硫簇的合成和增強(qiáng)線粒體中含鐵硫簇的酶活性；

改善frda病人線粒體的質(zhì)量，包括提高線粒體膜電位，增加atp水平，促進(jìn)線粒體內(nèi)膜嵴的有序排列等形態(tài)的改善；

降低frda病人細(xì)胞中ros的水平，提高了frda病人細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力，所述細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力，包括清除ros能力的增強(qiáng)，對(duì)過氧化氫耐受能力的增強(qiáng)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明首次將新型靶向線粒體的化合物ss-31用于frda及其相關(guān)疾病的治療，可作為制備治療frda及其相關(guān)疾病藥物的新用途申請(qǐng)，具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值和社會(huì)效益。

2、本發(fā)明提供了ss-31作為藥物主要成分在frda疾病中的應(yīng)用。ss-31能從翻譯水平提高frda患者細(xì)胞中fxn的表達(dá)水平，從病因上解決frda疾病治療中的問題。

3、ss-31改善frda病人線粒體的質(zhì)量，包括提高線粒體膜電位，增加atp水平，促進(jìn)線粒體內(nèi)膜嵴的有序排列等形態(tài)的改善；

4、化合物ss-31降低frda病人細(xì)胞中ros的水平，提高frda病人細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力，所述抵抗氧化應(yīng)激的能力包括清除ros能力的增強(qiáng)，對(duì)過氧化氫耐受能力的增強(qiáng)。

附圖說明：

圖1.ss-31處理frda病人細(xì)胞濃度的篩選(westernblotting結(jié)果)。

圖2.ss-31處理frda病人細(xì)胞時(shí)間點(diǎn)的篩選(westernblotting結(jié)果)。

圖3.ss-31處理提高frda病人細(xì)胞fxn的代表性的結(jié)果，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。(上：westernblotting結(jié)果；下：量化結(jié)果)。

圖4.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞鐵相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的影響，包括病人細(xì)胞中irp2,tfr1,ferritin的蛋白水平(westernblotting結(jié)果)。

圖5.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中胞質(zhì)和線粒體中的不穩(wěn)定鐵池中鐵水平的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖6.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中順烏頭酸酶活性的影響(左圖)，右邊是量化統(tǒng)計(jì)圖，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖7.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物ⅰ/ⅱ/?；钚缘挠绊?，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖8.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，xod)蛋白表達(dá)量(上圖)及其酶活性(下圖)的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖9.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中線粒體膜電位的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖10.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中atp水平的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖11.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中nadh/nad⁺比值的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖12.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中線粒體數(shù)目的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3(實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果)。

圖13.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)的影響(電鏡結(jié)果)。

圖14.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中ros水平的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3(流式細(xì)胞結(jié)果)。

圖15.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中sod,catalase活性的測(cè)定，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3。

圖16.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中sod,catalase蛋白水平的影響(westernblotting結(jié)果)。

圖17.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞對(duì)過氧化氫抵抗力的影響。

圖18.ss-31處理對(duì)frda病人細(xì)胞中fxnmrna水平的影響，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝3(實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果)。

圖19.放線菌素d不能抑制ss-31上調(diào)fxn的效果(上：westernblotting結(jié)果；下：量化結(jié)果)。

圖20.silac檢測(cè)新合成的fxn，數(shù)據(jù)均以mean±sem表示，n＝2(質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果)。

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)材料和方法

本發(fā)明采用frda病人來源的淋巴細(xì)胞系gm15850為研究對(duì)象，以正常人淋巴細(xì)胞系gm15849作為對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)均在37℃，5％co2條件下，用含10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、2mm谷氨酸鹽、100u/ml青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

本發(fā)明采用的ss-31均由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。fxn抗體由本實(shí)驗(yàn)室免疫獲得。涉及到的其他材料均為商購來源，按照生產(chǎn)廠家所提供的使用說明使用。

實(shí)驗(yàn)過程中多次涉及到的westernblotting操作均如下：收集細(xì)胞并離心(1000rpm，5min)去上清，用pbs清洗一遍。根據(jù)細(xì)胞量，加入適量的np40細(xì)胞裂解液，重懸細(xì)胞，置于冰上裂解10min，期間震蕩2～3次。15000rpm，4℃，離心10min。將離心后上清轉(zhuǎn)移至新的已預(yù)冷的eppendorf(ep)管中，并用bradford工作液測(cè)定蛋白濃度，已確保每個(gè)樣品的上樣量一致，并加入適量5×sds-loadingbuffer，100℃加熱5min，使蛋白充分變性。將樣品短暫離心后，用微量進(jìn)樣器將樣品加入到sds-page凝膠加樣孔中，電壓100v進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將凝膠從裝置上取下，除去濃縮膠，將分離膠上的蛋白用電轉(zhuǎn)儀在穩(wěn)流250ma條件下轉(zhuǎn)移到nc膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜放入麗春紅染色液中進(jìn)行染色2min，用ph5.5的酸水洗去未與蛋白結(jié)合的染色液，對(duì)染好的nc膜進(jìn)行拍照。接著將膜置于含5％脫脂奶粉的tris-pm中，室溫下封閉1h。封閉結(jié)束后，加入適當(dāng)稀釋的一抗，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后回收一抗，并用tris-pm洗膜，每次10min，洗4次。將膜與適當(dāng)稀釋的二抗室溫下孵育1h。孵育結(jié)束后用tris-pm洗4次，每次10min。膜上蛋白與化學(xué)發(fā)光底物結(jié)合，用westernblot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并拍照。

實(shí)施例1ss-31給藥濃度和時(shí)間的優(yōu)化，利于提高frda病人細(xì)胞fxn的表達(dá)

1.1實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：frda病人來源的淋巴細(xì)胞系gm15850,正常人淋巴細(xì)胞系gm15849。培養(yǎng)條件：37℃，5％co2條件下，用含10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、2mm谷氨酸鹽、100u/ml青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

ss-31由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，溶解于pbs中，儲(chǔ)存濃度1mm,-80℃保存。

fxn抗體由本實(shí)驗(yàn)室免疫獲得，gapdh抗體購于abgent。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1用0，2，5，10，20，50，100，200nmss-31分別處理病人細(xì)胞，24小時(shí)后收取細(xì)胞沉淀，提取蛋白。以健康人細(xì)胞為對(duì)照，同時(shí)培養(yǎng)24小時(shí)后，收取細(xì)胞沉淀，提取蛋白。westernblotting檢測(cè)fxn蛋白水平，以gapdh作為內(nèi)參。

1.1.2用50nmss-31處理病人細(xì)胞，分別在4，8，12，24，48小時(shí)后收取細(xì)胞沉淀，提取蛋白。以健康人細(xì)胞為對(duì)照，westernblotting檢測(cè)fxn蛋白水平，以gapdh作為內(nèi)參。

1.1.3用50nmss-31處理病人細(xì)胞，分別在8，24小時(shí)后收取細(xì)胞沉淀，提取蛋白。以健康人細(xì)胞為對(duì)照，westernblotting檢測(cè)fxn蛋白水平，以gapdh作為內(nèi)參。

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的ss-31處理frda病人細(xì)胞，其fxn的蛋白水平以劑量依賴性方式增加，20至50nm的濃度是最佳的濃度范圍(圖1)。隨后用50nmss-31處理細(xì)胞，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)fxn的蛋白水平，顯示處理8小時(shí)后就能檢測(cè)到fxn的升高(圖2)。50nmss-31能夠?qū)⒉∪思?xì)胞的fxn水平由正常人水平的30％左右提高至正常人的75％(圖3)。結(jié)果表明ss-31可用于提高frda患者細(xì)胞fxn的表達(dá)水平，從病因上解決frda疾病治療中的問題。

實(shí)施例2ss-31處理改善病人細(xì)胞鐵代謝的平衡

2.1實(shí)驗(yàn)材料

irp2抗體、tfr1抗體由本實(shí)驗(yàn)室免疫獲得，ferritin購于abcam。

鈣黃綠素甲酯(calcein-am)購于sigma公司；rpa(rhodamineb-[(1,10-phenanthroline-5-yl)-aminocarbonyl]benzylester)購自于squarix公司。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1首先檢測(cè)ss-31對(duì)病人細(xì)胞鐵代謝相關(guān)蛋白水平的影響。用50nmss-31處理病人細(xì)胞8和24小時(shí)后收取細(xì)胞沉淀，westernblotting檢測(cè)irp2,tfr1,ferritin,iscu,fxn的蛋白水平。

2.2.2其次檢測(cè)ss-31對(duì)病人細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體中不穩(wěn)定鐵含量的影響。用50nmss-31處理病人細(xì)胞8和24小時(shí)后，收集細(xì)胞并離心(1000rpm，5min)去上清，用pbs清洗一遍。用適量pbs重懸細(xì)胞沉淀，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，取2×10⁵個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用100μl10μmcalcein-am重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光孵育10分鐘，中間適當(dāng)輕輕振蕩2次。3000r/min離心5min，棄上清。加入pbs緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，3000r/min離心5分鐘，棄上清。加入150μlpbs緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至黑色96孔板中。在激發(fā)波長495nm,發(fā)射波長530nm的條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算胞質(zhì)中鐵的相對(duì)含量。同樣的用線粒體鐵染料rpa進(jìn)行染色后，在激發(fā)波長543nm,發(fā)射波長601nm的條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算線粒體中鐵的相對(duì)含量。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-7所示，ss-31處理24小時(shí)后，病人細(xì)胞中鐵蛋白的表達(dá)水平相對(duì)于健康人細(xì)胞有所上升，表明細(xì)胞中鐵含量增高。盡管病人細(xì)胞中irp2蛋白水平高于健康人，但ss-31處理后，病人細(xì)胞中irp2和tfr1的蛋白水平進(jìn)一步上升，以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)鐵的攝取(圖4)。而用熒光染料calcein-am和rpa分別檢測(cè)胞質(zhì)和線粒體中的不穩(wěn)定鐵的結(jié)果顯示，胞質(zhì)lip水平保持不變(圖5，左圖)，而線粒體lip水平顯著升高(圖5，右圖)，表明線粒體中生物可利用的鐵增加。這些結(jié)果表明ss-31能夠用于減少病人細(xì)胞中鐵的累積，增加frda病人細(xì)胞線粒體可利用鐵的含量，有利于鐵硫簇的合成。

實(shí)施例3ss-31處理對(duì)含鐵硫簇的線粒體呼吸鏈的影響

3.1實(shí)驗(yàn)材料

線粒體復(fù)合體i活性檢測(cè)試劑盒(abcam)

線粒體復(fù)合體ii活性檢測(cè)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)

線粒體復(fù)合體iii活性檢測(cè)試劑盒(biovisioninc.)

黃嘌呤氧化酶測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)

3.2實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1首先是順烏頭酸酶活性的檢測(cè)：按照比例配制8％分離膠(雙蒸水3.64ml，10×tb緩沖液0.94ml，30％acr-bis1.68ml，1m檸檬酸鈉22.5μl，10％aps31μl，temed6.25μl)，將溶液混合均勻。取5ml分離膠灌入制膠裝置中，然后加入1ml50％的乙醇封住凝膠的液面，待分離膠凝固后將乙醇倒掉，不要有殘留，再加入配制的堆積膠(雙蒸水1.16ml，10×tb緩沖液0.11ml，30％acr-bis0.2ml，1m檸檬酸鈉5.25μl，10％aps21μl，temed3.75μl)。將堆積膠加入后立即將梳齒插入，小心不要產(chǎn)生氣泡。待堆積膠凝固后方可將梳齒小心地拔掉。將80μg蛋白樣品和適量4×samplebuffer混合后上樣。在4℃條件下用70v電泳14h，電泳結(jié)束后，將膠小心地放入10ml的染色液中，37℃避光孵育30min，等顯色完畢后，將膠放在雙蒸水中終止反應(yīng)。

3.2.2線粒體復(fù)合物i/ii/iii和xod活性的測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，線粒體順烏頭酸酶活性(m-aco)在ss-31處理后顯著增加，胞質(zhì)順烏頭酸酶活性(c-aco)也有所上升，但不顯著(圖6)，ss-31處理對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平均沒有改變(圖6，aco2和irp1)。ss-31處理能夠改善呼吸鏈復(fù)合物ii和復(fù)合物iii的活性，復(fù)合物i的活性未得到改善(圖7)。黃嘌呤氧化酶(xod)是一種產(chǎn)生活性氧的酶，同樣需要鐵硫簇作為輔基。我們發(fā)現(xiàn)在ss-31處理后病人細(xì)胞中xod的活性沒有變化(圖8)。同時(shí)，ss-31處理對(duì)非鐵硫簇酶檸檬酸合酶的活性也沒有影響。這些結(jié)果表明ss-31誘導(dǎo)的fxn上調(diào)促進(jìn)線粒體中鐵硫簇的生物合成，特異性地促進(jìn)含鐵硫簇酶的活性，特別是線粒體呼吸鏈的活性，有利于提高frda病人細(xì)胞線粒體的功能。

實(shí)施例4ss-31對(duì)病人細(xì)胞線粒體的質(zhì)量和數(shù)量的影響

4.1實(shí)驗(yàn)材料

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(jc-1)(北京索萊寶科技有限公司)

基因組dna小量抽提試劑盒(離心柱式)(碧云天生物科技有限公司)

nadh/nad⁺檢測(cè)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)

atp含量的檢測(cè)試劑盒(sigma公司試劑盒)

4.2實(shí)驗(yàn)方法

4.2.1線粒體膜電位是線粒體完整性的重要指標(biāo)。用50nmss-31處理病人細(xì)胞0，8和24小時(shí)后，收集細(xì)胞并離心(1000rpm，5min)去上清，用pbs清洗一遍。用適量pbs重懸細(xì)胞沉淀，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，取2×10⁵個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用熒光探針jc-1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，20分鐘后離心，去除染料，用pbs清洗細(xì)胞，然后用熒光酶標(biāo)儀分別讀出紅色熒光和綠色熒光的強(qiáng)度，計(jì)算其比值，比值越大說明線粒體膜電位越高。

4.2.2atp是線粒體功能的指標(biāo)。用50nmss-31處理病人細(xì)胞0，8和24小時(shí)后，收集細(xì)胞并離心(1000rpm，5min)去上清，用pbs清洗一遍，離心獲得細(xì)胞沉淀。atp含量的測(cè)定嚴(yán)格按照atp檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

4.2.3nadh/nad+能夠反應(yīng)線粒體的氧化磷酸化水平，比值越低，說明細(xì)胞氧化磷酸化很活躍，有利于atp的生成。用50nmss-31處理病人細(xì)胞，分別在0，24和48小時(shí)后收取細(xì)胞沉淀。按照試劑盒說明書分別測(cè)定nadh和nad+，計(jì)算各自含量，求其比值。

4.2.4對(duì)于線粒體數(shù)量的測(cè)定，用50nmss-31處理病人細(xì)胞，分別在0，24和48小時(shí)后收取細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取基因組dna，以基因組dna為模板，通過熒光定量pcr檢測(cè)線粒體基因cytb和核基因組基因actin的拷貝數(shù)，從而比較線粒體的相對(duì)數(shù)目。

4.2.5電子顯微鏡觀察線粒體：獲取處理后的細(xì)胞，用pbs重懸細(xì)胞沉淀，800×g離心5分鐘，棄上清；向ep管中加入1ml的2.5％戊二醛，重懸細(xì)胞沉淀進(jìn)行固定，800×g離心5分鐘，棄上清。pbs清洗兩次。用1％四氧化鋨重懸細(xì)胞沉淀進(jìn)行后固定，800×g離心5分鐘，棄上清。pbs清洗兩次，用30％-100％丙酮逐級(jí)脫水10-30分鐘，將樣品包埋于環(huán)氧樹脂中，進(jìn)行超薄切片，ib-5型離子濺射噴鍍儀噴金，jem-1011型透射電子顯微鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)變化。

4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在ss-31處理后，病人細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度的比值表明病人細(xì)胞的mmp上升(圖9)；ss-31處理顯著提高了病人細(xì)胞中的atp水平(圖10)，表明氧化磷酸化水平增強(qiáng)；ss-31處理使病人細(xì)胞中nadh/nad⁺的比值降低至健康細(xì)胞的水平(圖11)；這些結(jié)果表明ss-31處理患改善了病人細(xì)胞中線粒體的質(zhì)量。此外，我們量化線粒體dna的拷貝數(shù)，并發(fā)現(xiàn)ss-31處理能夠輕微增加病人細(xì)胞中線粒體的拷貝數(shù)(圖12)。電鏡結(jié)果也證實(shí)ss-31處理改善了病人細(xì)胞的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，由原來的異常龜背狀嵴變?yōu)檎Ｓ行虻恼郫B結(jié)構(gòu)(圖13)?？傊?，ss-31處理顯著改善了病人細(xì)胞線粒體的質(zhì)量，一定程度上增加線粒體數(shù)量，可用于治療明顯具有“線粒體疾病”特征的frda疾病。

實(shí)施例5ss-31對(duì)病人細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力的影響

5.1實(shí)驗(yàn)材料

ros檢測(cè)試劑盒(碧云天)、sod活性檢測(cè)試劑盒(南京建成)、catalase活性檢測(cè)試劑盒(南京建成)

5.2實(shí)驗(yàn)方法

5.2.1首先用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ros含量，步驟如下：六孔板培養(yǎng)細(xì)胞，ss-31處理適當(dāng)時(shí)間。處理結(jié)束后，離心收集細(xì)胞；按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋dcfda，使其終濃度為10μm。將收集好的細(xì)胞懸浮于稀釋好的dcfda，細(xì)胞濃度為1×10⁵-2×10⁷個(gè)/ml，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20分鐘；孵育結(jié)束后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，為了充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的dcfda；500×g離心5分鐘；棄上清，加入500μlpbs重懸細(xì)胞沉淀，500×g離心5分鐘；重復(fù)上步驟三次；加入500μlpbs重懸細(xì)胞沉淀后轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中ros的含量。

5.2.2其次分別用westernblotting檢測(cè)sod和catalase的蛋白水平，用相關(guān)試劑盒檢測(cè)酶活性。最后用cck8檢測(cè)ss-31處理后的病人細(xì)胞對(duì)過氧化氫的抵抗力。

5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在病人細(xì)胞中的ros水平高于在健康對(duì)照細(xì)胞中的ros水平(圖14，左圖)。ss-31處理顯著降低了病人細(xì)胞中的ros水平(圖14，右圖)；ss-31處理增加了過氧化氫酶的表達(dá)和活性(圖15，左圖和圖16)；ss-31處理沒有改變病人細(xì)胞中sod1和sod2的蛋白水平，但是在ss-31處理8小時(shí)后，總sod活性顯著增加(圖15，右圖和圖16)；ss-31處理增強(qiáng)了病人細(xì)胞對(duì)h2o2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抵抗能力(圖17)?？傊@些數(shù)據(jù)表明ss-31處理降低了病人細(xì)胞中ros水平，并增強(qiáng)了其抗氧化的能力，可用于減輕frda病人細(xì)胞遭遇的氧化脅迫的壓力。

實(shí)施例6確定ss-31從轉(zhuǎn)錄還是翻譯水平調(diào)控fxn的表達(dá)

6.1實(shí)驗(yàn)材料

放線菌酮d(sigma)

tripure(北京百泰克)

2×sybrreal-timepcrpremixturekit(invitrogen)

6.2實(shí)驗(yàn)方法

6.2.1檢測(cè)fxnmrna的水平：用ss-31處理病人細(xì)胞后收集細(xì)胞沉淀，用trizol法提取rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，熒光定量pcr檢測(cè)fxnmrna的水平。

6.2.2最后通過actinomycind抑制mrna的合成，檢測(cè)ss-31對(duì)fxn蛋白水平的影響：將病人細(xì)胞分為兩組，一組用50nmss-31單獨(dú)處理8小時(shí)，一組用50nmss-31和0.5μg/ml放線菌酮d同時(shí)處理8小時(shí)，收集細(xì)胞沉淀，westernblotting檢測(cè)fxn的蛋白水平。

6.2.3檢測(cè)新合成的fxn的蛋白水平：將病人細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基中，分為兩組，一組加ss-31，一組不加ss-31，24小時(shí)后收取細(xì)胞沉淀；裂解細(xì)胞，分別取1mg總蛋白，通過免疫沉淀獲得目的蛋白fxn。將洗脫的樣品做質(zhì)譜檢測(cè)，同時(shí)根據(jù)同位素的信號(hào)強(qiáng)度判斷新合成的fxn的蛋白差異。

6.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，ss-31對(duì)fxn的mrna水平?jīng)]有影響(圖18)。放線菌酮d是真核生物mrna合成的抑制劑，當(dāng)病人細(xì)胞同時(shí)用ss-31和actinomycind處理時(shí)，fxn的蛋白質(zhì)水平仍然升高(圖19)，證明ss-31從翻譯水平而不是轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)fxn的表達(dá)。接著我們使用silac技術(shù)來觀察翻譯是否通過ss-31增強(qiáng)。我們發(fā)現(xiàn)ss-31顯著增加了新合成的fxn(圖20)，這表明ss-31處理促進(jìn)了fxn新的合成，上調(diào)了fxn翻譯水平。本研究從機(jī)制上揭示ss-31提高fxn的水平，用于治療frda病人是因?yàn)閟s-31在翻譯水平調(diào)控fxn的表達(dá)，從根本上解決了因fxn表達(dá)量的減少造成frda疾病的棘手的難題。

參考文獻(xiàn)

abrahao,a.,j.l.pedroso,p.braga-neto,e.bor-seng-shu,p.d.c.aguiarando.g.p.barsottini(2015)."milestonesinfriedreichataxia:morethanacenturyandstilllearning."neurogenetics16(3):151-160.

aranca,t.v.,t.m.jones,j.d.shaw,j.s.staffetti,t.ashizawa,s.h.kuo,b.l.fogel,g.r.wilmot,s.l.perlman,c.u.onyike,s.h.yingandt.a.zesiewicz(2016)."emergingtherapiesinfriedreich'sataxia."neurodegenerdismanag6(1):49-65.

birk,a.v.,w.m.chao,c.bracken,j.d.warrenandh.h.szeto(2014)."targetingmitochondrialcardiolipinandthecytochromec/cardiolipincomplextopromoteelectrontransportandoptimizemitochondrialatpsynthesis."brjpharmacol171(8):2017-2028.

boddaert,n.,k.h.lequansang,a.rotig,a.leroy-willig,s.gallet,f.brunelle,d.sidi,j.c.thalabard,a.munnichandz.i.cabantchik(2007)."selectiveironchelationinfriedreichataxia:biologicandclinicalimplications."blood110(1):401-408.

campuzano,v.,l.montermini,m.d.molto,l.pianese,m.cossee,f.cavalcanti,e.monros,f.rodius,f.duclos,a.monticelli,f.zara,j.canizares,h.koutnikova,s.i.bidichandani,c.gellera,a.brice,p.trouillas,g.demichele,a.filla,r.defrutos,f.palau,p.i.patel,s.didonato,j.l.mandel,s.cocozza,m.koenigandm.pandolfo(1996)."friedreich'sataxia:autosomalrecessivediseasecausedbyanintronicgaatripletrepeatexpansion."science271(5254):1423-1427.

diprospero,n.a.,a.baker,n.jeffriesandk.h.fischbeck(2007)."neurologicaleffectsofhigh-doseidebenoneinpatientswithfriedreich'sataxia:arandomised,placebo-controlledtrial."lancetneurol6(10):878-886.liu,s.,y.soong,s.v.seshanandh.h.szeto(2014)."novelcardiolipintherapeuticprotectsendothelialmitochondriaduringrenalischemiaandmitigatesmicrovascularrarefaction,inflammation,andfibrosis."amjphysiolrenalphysiol306(9):f970-980.

nickel,a.g.,a.vonhardenberg,m.hohl,j.r.loffler,m.kohlhaas,j.becker,j.c.reil,a.kazakov,j.bonnekoh,m.stadelmaier,s.l.puhl,m.wagner,i.bogeski,s.cortassa,r.kappl,b.pasieka,m.lafontaine,c.r.lancaster,t.s.blacker,a.r.hall,m.r.duchen,l.kastner,p.lipp,t.zeller,c.muller,a.knopp,u.laufs,m.bohm,m.hothandc.maack(2015)."reversalofmitochondrialtranshydrogenasecausesoxidativestressinheartfailure."cellmetab22(3):472-484.

perdomini,m.,b.belbellaa,l.monassier,l.reutenauer,n.messaddeq,n.cartier,r.g.crystal,p.aubourgandh.puccio(2014)."preventionandreversalofseveremitochondrialcardiomyopathybygenetherapyinamousemodeloffriedreich'sataxia."natmed20(5):542-547.

soragni,e.,w.miao,m.iudicello,d.jacoby,s.demercanti,m.clerico,f.longo,a.piga,s.ku,e.campau,j.du,p.penalver,m.rai,j.c.madara,k.nazor,m.o'connor,a.maximov,j.f.loring,m.pandolfo,l.durelli,j.m.gottesfeldandj.r.rusche(2014)."epigenetictherapyforfriedreichataxia."annneurol76(4):489-508。