本發(fā)明涉及包含新瓊寡糖作為有效成分的敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療用組合物。

背景技術(shù)：

瓊脂（agar）作為很久以前就被廣泛利用為食品添加劑、醫(yī)藥品、化妝品、家畜飼料及工業(yè)原料等的具有代表性的來源于海藻類的多糖類，在韓國，每年生產(chǎn)量達(dá)到3600噸，為較豐富的水產(chǎn)資源之一。然而，在實(shí)際使用方面，只有全部生產(chǎn)量的一部分被簡(jiǎn)單加工處理，來用作廉價(jià)的原料，其剩余的大部分被放置不管，相對(duì)于自然資源量，附加價(jià)值非常低。因此，實(shí)際上大大要求對(duì)豐富的韓國瓊脂的新用途開發(fā)和與附加價(jià)值有關(guān)的研究。

瓊脂由瓊脂糖（agarose）和瓊脂膠（agaropectin）構(gòu)成，但是瓊脂糖為作為半乳糖（dgalactose）和3，6-脫水-l-半乳糖（3，6-anhydro-l-galactose）以β-1，4的形態(tài)相鍵合的單體的瓊脂二糖（agarobiose）反復(fù)而形成的由α-1，3鍵相連接的直鏈結(jié)構(gòu)，凝膠（gel）化能力強(qiáng)，但與此相反，瓊脂膠與瓊脂糖相同，由瓊脂二塘單位構(gòu)成，但是含有硫酸基等的酸性基且凝膠化能力若。

雙瓊脂糖借助作用于β-1，4鍵的β-瓊脂糖酶（β-agarase）來經(jīng)新瓊四糖（neoagarotetraose）分解成新瓊雙糖（neoagarobiose），接著，借助作用于α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶（α-agarase）來最終分解成半乳糖（d-galactose）和3，6-脫水-l-半乳糖。

另一方面，據(jù)悉，作為放線菌的天藍(lán)色鏈霉菌（streptomycescoelicolor）a3（2）生產(chǎn)分解瓊脂的細(xì)胞外（向細(xì)胞外分泌）瓊脂糖酶（agarase）（stanieretal.，1942，j.bacteriol.；hodgsonandchater，1981，j.gen.microbiol.），此瓊脂糖酶借助daga基因來進(jìn)行編碼。在放線菌中，daga基因?yàn)槠浠蛭ㄒ槐还摩?瓊脂糖酶基因，在放線菌中瓊脂糖酶的生產(chǎn)研究中占重要地位。尤其，天藍(lán)色鏈霉菌作為在放線菌的分子生物學(xué)研究中最廣泛使用的菌株，在2002年英國的桑格中心（sangercentre）分析并公開了染色體dna的序列。

另一方面，敗血癥（sepsis）作為在致病性革蘭氏陰性菌感染活體的情況下，作為細(xì)胞壁成分的脂多糖（lipopolysaccharide，lps）以毒素的形式起作用，使活體的免疫體系過度活性化而誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，在全身引起感染癥或在癥狀嚴(yán)重的情況下，還伴隨休克。具體地，敗血癥主要在如惡性重傷、白血病、惡性淋巴瘤、艾滋?。╝ids）、膠原病、腎功能衰竭、肝病、腦血管障礙、糖尿病等的基礎(chǔ)疾病的患者或高齡者、早產(chǎn)兒等具有體液免疫缺陷或細(xì)胞免疫缺陷的抵抗力弱的宿主接受腎上腺類固醇或抗腫瘤劑的化學(xué)療法、鈷照射等的放射線治療或攝入導(dǎo)管、血液透析、器官移植、心臟手術(shù)等的處置、手術(shù)的情況下發(fā)病。敗血癥是住進(jìn)醫(yī)院重患者病房的患者死亡的主要原因，是由此造成的致死率通常在30％以上的非常嚴(yán)重的疾病。盡管醫(yī)學(xué)技術(shù)在進(jìn)步，但仍在全世界范圍內(nèi)因手術(shù)后遺癥被感染而引起敗血癥的情況很多，在如新生兒或老人等體內(nèi)免疫力弱的人被感染的情況下，發(fā)展成敗血癥的情況很多。代表性地，在新生兒敗血癥的情況下，據(jù)悉，足月兒1000名中3名左右發(fā)病，早產(chǎn)兒發(fā)病率增加3倍至4倍。在得敗血癥的情況下，通常接受抗生素治療，但是因適當(dāng)?shù)奶幹幂^慢，而在增殖許多菌的情況或被對(duì)抗生素耐性較強(qiáng)的菌株感染的情況下，不能僅用抗生素進(jìn)行有效治療，由于對(duì)多種抗生素具有耐性的病原菌逐漸增加，急需要開發(fā)新的敗血癥治療劑。

本發(fā)明人為了滿足如上所述的要求，進(jìn)行反復(fù)研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過daga酶反應(yīng)制備而成的來源于瓊脂的新瓊寡糖不僅抑制菌的增殖，而且還具有去除從死菌分離的內(nèi)毒素的優(yōu)秀的效果，在與抗生素聯(lián)用的情況下，可使由抗生素引起的副作用最小化，且與單獨(dú)給藥相比，具有顯著的優(yōu)秀的敗血癥治療效果，從而完成了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的在于，提供包含新瓊寡糖作為有效成分的敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療用組合物。

本發(fā)明的另一目的在于，提供包含新瓊寡糖作為有效成分的免疫增強(qiáng)用組合物。

解決問題的方案

為了解決如上所述的問題，本發(fā)明提供包含新瓊寡糖作為有效成分的敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療用藥學(xué)組合物。

并且，本發(fā)明提供包含新瓊寡糖作為有效成分的敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或改善用食品組合物。

并且，本發(fā)明提供包含新瓊寡糖作為有效成分的免疫增強(qiáng)用藥學(xué)組合物。

并且，本發(fā)明提供包含新瓊寡糖作為有效成分的免疫增強(qiáng)用功能性食品。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的新瓊寡糖不僅具有優(yōu)秀的敗血癥預(yù)防效果，而且有效抑制炎癥發(fā)生，進(jìn)而免疫增進(jìn)效果突出，因此可有用地使用在用于敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療及免疫增進(jìn)的醫(yī)藥品及功能性食品中。

附圖說明

圖1為示出puwl201pw載體的地圖的圖。

圖2為示出本發(fā)明的一實(shí)施例的重組載體的地圖的圖。

圖3為示出通過高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（hplc-elsd）對(duì)本發(fā)明的酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析的結(jié)果的圖。

圖4為示出經(jīng)本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及敗血癥誘導(dǎo)動(dòng)物模型隨時(shí)間的存活率的圖。

圖5為示出經(jīng)本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及敗血癥誘導(dǎo)動(dòng)物模型的血清內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子的分泌量的圖。

圖6為示出經(jīng)本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及敗血癥誘導(dǎo)動(dòng)物模型的血清內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶（ast）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alt）及血尿素氮（bun）的濃度的圖。

圖7為示出經(jīng)本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及脂多糖給藥的動(dòng)物模型隨時(shí)間的存活率的圖。

圖8為示出本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及脂多糖給藥動(dòng)物模型的血清內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子的分泌量的圖。

圖9為示出經(jīng)本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及脂多糖給藥的動(dòng)物模型的血清內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及血尿素氮的濃度的圖。

圖10為示出經(jīng)本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及脂多糖給藥的動(dòng)物模型的肺組織內(nèi)炎癥誘發(fā)細(xì)胞的浸潤(rùn)程度的圖。

圖11為示出經(jīng)本發(fā)明的新瓊寡糖預(yù)處理及脂多糖給藥的動(dòng)物模型的脾組織內(nèi)細(xì)胞凋亡程度的圖。

具體實(shí)施方式

以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供包含利用瓊脂(agar)或瓊脂糖(agarose)并通過daga酶反應(yīng)制備而成的新瓊寡糖（neoagarooligosaccharide）作為有效成分的敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療用組合物。

上述組合物包含藥學(xué)組合物及食品組合物。

本發(fā)明的daga指作為β-瓊脂糖酶(β-agarase)且具有序列2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，包含從作為放線菌的天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)生產(chǎn)或從異種菌株生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。并且，在功能完全改變或不失去β-瓊脂糖酶活性的范圍內(nèi)，包含如下的蛋白質(zhì)，上述蛋白質(zhì)按照通常的方法，即，為了有利于純化而包含標(biāo)記氨基酸或?yàn)榱水惙N表達(dá)而變更氨基酸序列等方法重組而成。

更具體地，本發(fā)明的daga利用由天藍(lán)色鏈霉菌生產(chǎn)的β-瓊脂糖酶從基因進(jìn)行翻譯時(shí)，具有序列2的309個(gè)氨基酸，以分子量為約35kda的狀態(tài)生產(chǎn)，n-末端30個(gè)的氨基酸信號(hào)肽被切割，從而以具有序列2的31位至309位的氨基酸序列的完成的細(xì)胞外型蛋白質(zhì)（為約32kda）狀態(tài)分泌。

天藍(lán)色鏈霉菌的daga基因編碼上述daga，可由序列1的堿基序列表示daga基因。序列1作為存在于天藍(lán)色鏈霉菌a3（2）的基因組的基因的堿基序列，在美國國家生物技術(shù)信息中心（ncbi）數(shù)據(jù)庫上被命名為“sco3471”。通過體外（invitro）實(shí)驗(yàn)得到確認(rèn)，daga基因的轉(zhuǎn)錄由被rna聚合酶的至少不同3種全酶（holoenzyme）所認(rèn)知的4種或5種不同啟動(dòng)子（promoter）所調(diào)節(jié)。通過分析daga基因的轉(zhuǎn)錄過程，示出在編碼序列的上部第32位、77位、125位及220位堿基開始轉(zhuǎn)錄。

可通過培養(yǎng)作為原來daga的生產(chǎn)菌株的天藍(lán)色鏈霉菌來生產(chǎn)本發(fā)明的daga，但是為了提高生產(chǎn)效率，優(yōu)選地，利用作為異種菌株的變鉛青鏈霉菌（streptomyceslividans）的表達(dá)系統(tǒng)，而且可使用如下的方法，即，將上述daga基因插入放線菌用載體中來制備重組載體后，利用上述重組載體轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌，進(jìn)而培養(yǎng)其轉(zhuǎn)化體。在此情況下，優(yōu)選地，重組載體以daga基因借助來源于放線菌的啟動(dòng)子來對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)的方式構(gòu)成。

來源于放線菌的啟動(dòng)子中存在sgtr啟動(dòng)子（sgtrp）、erme啟動(dòng)子（ermep）、tipa啟動(dòng)子（tipap）等多種啟動(dòng)子，因此在制備重組載體時(shí)可選擇使用這些啟動(dòng)子。已開發(fā)以借助這些啟動(dòng)子來對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)的方式構(gòu)成的各種種類的多個(gè)載體，若在此載體克隆sco3471，則可制備借助來源于放線菌的啟動(dòng)子來對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)的重組載體。

利用重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌株來制備轉(zhuǎn)化體，但是根據(jù)宿主菌株，存在多種用于轉(zhuǎn)化的方法，因此可選擇適當(dāng)?shù)姆椒▉硎褂谩＠?，在將變鉛青鏈霉菌作為宿主菌株來使用的情況下，可使用以聚乙二醇（polyethyleneglycol，peg）為媒介的轉(zhuǎn)化方法。

若在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)如轉(zhuǎn)化體等daga生產(chǎn)菌株，則可生產(chǎn)daga，且可通過獲取培養(yǎng)液并利用如超濾法等通常的蛋白質(zhì)純化方法來生產(chǎn)高純的daga。此時(shí)，使瓊脂(agar)或瓊脂糖(agarose)包含在液體培養(yǎng)基中，可更有效地生產(chǎn)daga。

如瓊脂及瓊脂糖等多糖類可通過上述daga的酶反應(yīng)來生成大小相對(duì)小的寡糖，優(yōu)選地，上述酶反應(yīng)在35℃至45℃的溫度及ph為6至8的條件下進(jìn)行，但并不限定于此。

作為上述酶反應(yīng)的產(chǎn)物，生成新瓊寡糖，上述新瓊寡糖可單獨(dú)為新瓊雙糖(neoagarobiose)、新瓊四糖(neoagarotetraose)及新瓊六糖（neoagarohexaose），也可為混合它們的狀態(tài)，但并不限定于此。

本發(fā)明的新瓊寡糖減少傳染癥性細(xì)胞因子、增加抗炎癥性細(xì)胞因子、顯著降低因敗血癥或敗血癥休克的死亡率，從而具有敗血癥的預(yù)防或治療效果。

在本發(fā)明中，“敗血癥”指被微生物感染而在全身出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)的狀態(tài)。在出現(xiàn)體溫上升至38℃以上的發(fā)熱癥狀或下降至36℃以下的低體溫癥、呼吸次數(shù)增加至每分鐘24次以上（頻呼吸）、每分鐘90次以上的心跳次數(shù)（頻脈）、血液檢查上白血球數(shù)的增加或顯著減少的癥狀中的兩種以上的癥狀的情況下，稱之為全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome；sirs）。當(dāng)這種全身炎癥反應(yīng)綜合征為因微生物感染而引起的癥狀時(shí)，稱為敗血癥。在身體的感染病灶中，病原菌持續(xù)性或間歇性地進(jìn)入血流并落在各種脹器形成病灶，且具有嚴(yán)重的全身癥狀。作為原因菌，包括葡萄球菌、鏈球菌、大腸菌、綠膿菌、結(jié)核菌、肺炎桿菌、真菌、厭氧菌等。

并且，本發(fā)明提供包含利用瓊脂(agar)或瓊脂糖(agarose)并通過daga酶反應(yīng)制備而成的新瓊寡糖(neoagarooligosaccharide)作為有效成分的免疫增強(qiáng)用組合物。

上述組合物包含藥學(xué)組合物及保健品。

本發(fā)明的新瓊寡糖通過抑制傳染癥性細(xì)胞因子的分泌且增加抗炎癥性細(xì)胞因子的分泌來示出免疫增強(qiáng)效果。

上述組合物可利用于免疫疾病的預(yù)防或治療，上述免疫疾病包括由生物的免疫體系異常誘發(fā)的多種炎癥性疾病、過敏性疾病及癌等，例如，可包括感冒、哮喘、肺炎、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、特應(yīng)性皮炎、過敏、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏癥、自身免疫性甲狀腺疾病、炎癥性腸病、再生障礙性貧血、紅斑狼瘡及銀屑病等，但并不限定于此。

本發(fā)明的新瓊寡糖不僅具有優(yōu)秀的敗血癥預(yù)防效果，而且還具有突出的免疫增進(jìn)效果，因此可有用地使用在用于敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療及免疫增進(jìn)的醫(yī)藥品及功能性食品中。

本發(fā)明的組合物還可包含在藥學(xué)組合物的制備中通常使用的適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑及稀釋劑。本發(fā)明的藥學(xué)組合物可根據(jù)各個(gè)通常的方法，以成散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸浮液、乳液、糖漿、氣霧劑等的口服型劑型、外用劑、栓劑及滅菌注射溶液的形態(tài)進(jìn)行劑型化來使用。作為本技術(shù)領(lǐng)域中公知的合適的制劑，優(yōu)選地，使用文獻(xiàn)（remington'spharmaceuticalscience，mackpublishingcompany，eastonpa）中所公開的制劑。

作為可包含在本發(fā)明的藥學(xué)組合物的載體、賦形劑及稀釋劑，可列舉乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇，麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、海藻酸鈉、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油。

在對(duì)本發(fā)明的藥學(xué)組合物進(jìn)行制劑化的情況下，通過使用填充劑、增量劑、結(jié)合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、表面活性劑等的稀釋劑或賦形劑來制備。用于口服給藥的固體制劑包括片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等，這種固體制劑通過在上述有效成分中混合至少一種以上的如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等賦形劑來制備。并且，除了簡(jiǎn)單的賦形劑之外，還使用如硬脂酸鎂、滑石等潤(rùn)滑劑。用于口服給藥的液相制劑有懸浮劑、內(nèi)用液劑、乳劑、糖漿劑等，但是除了作為通常使用的簡(jiǎn)單稀釋劑的水、液體石蠟之外，可包含各種各樣的賦形劑，例如，濕潤(rùn)劑、甜味劑、芳香劑、保存劑等。用于非口服給藥的制劑包括經(jīng)滅菌的水溶液、非水性溶劑、懸浮劑、乳劑、冷凍干燥制劑、栓劑。作為非水性溶劑、懸浮劑，可使用如丙二醇（propyleneglycol）、聚乙二醇、橄欖油、可注射的酯如油酸乙酯等植物性油。作為栓劑的基劑，可使用witepsol、聚乙二醇、吐溫（tween）61、可可油脂、月桂油、甘油明膠等。

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“給藥”指以任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ騻€(gè)體提供一定的本發(fā)明的組合物。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物的優(yōu)選的給藥量隨著個(gè)體的狀態(tài)及體重、疾病的程度、藥物形態(tài)、給藥途徑及期間而不同，但是可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡x擇。為了優(yōu)選的效果，1日可給藥0.001mg/kg至1000mg/kg的本發(fā)明的組合物?？梢悦咳战o藥一次，也可以分幾次進(jìn)行給藥。上述給藥量在任何方面都不會(huì)限定本發(fā)明的范圍。

可通過多種途徑向個(gè)體給藥本發(fā)明的藥學(xué)組合物?？深A(yù)期給藥的所有方式，例如，能夠以口服、注射于直腸或靜脈、肌肉、皮下、子宮內(nèi)膜或腦血管內(nèi)的方式進(jìn)行給藥。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥學(xué)組合物能夠以注射劑形態(tài)進(jìn)行給藥。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物除了包含上述有效成分之外，還可包含一種以上具有敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療或免疫增強(qiáng)效果的公知的物質(zhì)。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物包含上述有效成分之外，還可包含支氣管擴(kuò)張劑、抗組胺藥或消炎止痛藥。

例如，作為上述支氣管擴(kuò)張劑，可使用β-激動(dòng)劑、抗膽堿能劑、甲基黃嘌呤等，作為上述抗組胺藥，可使用阿伐斯?。╝crivastine）、西替利嗪（cetirizine）、地氯雷他定（desloratadine）、非索非那定（fexofenadine）、鹽酸左西替利嗪片（levocertirizine）、氯雷他定（loratadine）、咪唑斯汀（mizolastine）、阿利馬嗪（ailmemazine）、chlocertirizine、氯馬斯?。╟lemastine）、賽庚啶（cypropheptadine）、羥嗪（hydroxyzine）、甲哌噻庚酮（ketotifen）、鹽酸異丙嗪（promenthazine）等，作為上述消炎止痛藥，可使用阿司匹林（aspirin）、雙氯芬酸（diclofenac）、非諾洛芬（fenoprofen）、氟比洛芬（flurbiprofen）、布洛芬（ibuprofen）、吲哚美辛（indomethacin）、酮洛芬（ketoprofen）、萘普生（naproxen）、吡羅昔康片（piroxicam）、舒林酸（sulindac）、塞來昔布（celecoxib）、伐地考昔（valdecoxib）、羅非考昔（rofecoxib）等。

在本發(fā)明中，“功能性食品”指以在食品中利用物理、生化、生物技術(shù)、方法等來使該食品的功能作用、表達(dá)于特定目的的方式賦予附加價(jià)值的食品組或以使食品組合具有的生物防御節(jié)奏調(diào)節(jié)、疾病防治和恢復(fù)等相關(guān)的體內(nèi)調(diào)節(jié)功能充分表達(dá)的方式設(shè)計(jì)并加工的食品。

上述功能性食品可包含食品學(xué)上可接受的食品輔助添加劑，進(jìn)一步地，還可包含通常使用于功能性食品的制備的適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑及稀釋劑。

在將本發(fā)明的組合物用作食品添加劑的情況下，可直接添加上述組合物來使用或者與其他食品或食品成分相混合來使用，且可根據(jù)通常的方法適當(dāng)?shù)厥褂?。有效成分的混合量可根?jù)使用目的（預(yù)防、健康或治療性處置）適當(dāng)?shù)貨Q定。通常，當(dāng)制備食品或飲料時(shí)，相對(duì)于原料，添加15重量百分比以下的本發(fā)明的組合物，優(yōu)選地，添加10重量百分比的的本發(fā)明的組合物。然而，在以健康及衛(wèi)生為目的或調(diào)解健康為目的而長(zhǎng)期攝取的情況下，可以在上述范圍以下，由于在安全性方面不存在任何為題，因此可使用上述范圍以上的有效成分。

除了上述成分之外，本發(fā)明的組合物可包含各種營(yíng)養(yǎng)劑、維生素、電解質(zhì)、風(fēng)味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)膠體增稠劑、ph調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、酒精、使用于碳酸飲料的碳酸化劑等。此外，本發(fā)明的組合物可包含用于制備天然果汁、果汁飲料及蔬菜汁的果肉。這些成分可單獨(dú)使用或組合使用。這些添加劑的比例雖然不是很重要，但是，通常，本發(fā)明的組合物在每100重量份中選自0.01重量份至0.1重量份的范圍中。

以下，根據(jù)實(shí)施例更詳細(xì)說明本發(fā)明。但是，下述實(shí)施例僅用于更加容易理解本發(fā)明而例示的，本發(fā)明的內(nèi)容并不限定于實(shí)施例。

實(shí)施例1．daga生產(chǎn)

以天藍(lán)色鏈霉菌a3（2）的染色體dna為模板，通過使用下述的asm-f及asm-r引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）擴(kuò)增daga基因片段（編碼daga的信號(hào)肽及完成型肽的947bp片段，在序列1中包含有引物的一部分序列的狀態(tài)），通過利用片段的限制酶部位（ndei/bamhi）來在圖1中所示的puwl201pw載體中克隆daga基因，以使daga基因的轉(zhuǎn)錄可由erme啟動(dòng)子調(diào)節(jié)，從而制備重組載體，如圖2所示。

asm-f引物：5′-gacatatggtggtcaaccgacgtgatc-3′（ndei）（序列3）

asm-r引物：5′-ggtggatccctacacggcctgatacg-3′（bamhi）（序列4）

將利用上述重組載體轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌(streptomyceslividans)tk24來獲取的轉(zhuǎn)化菌株使用于daga的生產(chǎn)中。

將此菌株接種于包含有0.3％（w/v）的瓊脂的r2ye液體培養(yǎng)基，并在28℃的溫度下以120rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)至72小時(shí)。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)過程后進(jìn)行本培養(yǎng)，各培養(yǎng)時(shí)間為2.5日。對(duì)通過本培養(yǎng)獲取的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離來去除菌體后，利用防滲膜（5kdacut-offmembrane）過濾上清液，并分離劑純化未通過過濾膜的蛋白質(zhì)。通過冷凍干燥獲取的濃縮液（酶液）來保管并使用。

實(shí)施例2．daga的瓊脂糖酶活性測(cè)定

利用還原當(dāng)量測(cè)定方法（dnsmethod）測(cè)定對(duì)上述實(shí)施例1的daga的瓊脂糖酶活性。在上述實(shí)施例1中獲取的10μl的酶液混合0.5ml的溶解有0.5％（w/v）的瓊脂糖的20mm的三（羥甲基）氨基甲烷（tris-hcl）溶液（ph7），在40℃的溫度下反應(yīng)15分鐘后，加入0.5ml的dns試劑（6.5g的二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid）、325ml的2m的氫氧化鈉（naoh）、45ml的甘油（glycerol）、1l的蒸餾水），加熱10分鐘后，冷卻后測(cè)定吸光度（?540nm）。將酶1u定義為在反應(yīng)15分鐘后生成吸光度（?540nm）0.001的活性。

實(shí)施例3．通過daga酶反應(yīng)的瓊脂或瓊脂糖的分解

制備1l的溶解有0.5％（w/v）至5％（w/v）的瓊脂或瓊脂糖等的20mm的三（羥甲基）氨基甲烷溶液，在100℃的溫度下加熱10分鐘來充分溶解后，降溫至40℃，并處理2000u至50000u的daga酶并進(jìn)行24小時(shí)酶反應(yīng)。

為了去除在酶反應(yīng)產(chǎn)物中未分解的瓊脂糖，通過離心分離回收上清液后，利用薄層分析法（thinlayerchromatography，tlc）確認(rèn)酶反應(yīng)生成物。通過超濾法并利用5kda防滲膜對(duì)回收的上清液進(jìn)行部分純化。

實(shí)施例4．通過高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（hplc-elsd）進(jìn)行分析的daga酶反應(yīng)產(chǎn)物的組成確認(rèn)

為了確認(rèn)在上述實(shí)施例3中獲取的酶反應(yīng)產(chǎn)物的組成而通過高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法進(jìn)行分析。使用nh2p-504emultimodecolumn（250×4.6mm），作為移動(dòng)相，使用乙腈（acetonitrile）和水的混合溶液（乙腈：水=65：35），其結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，反應(yīng)產(chǎn)物中由新瓊雙糖（neoagarobiose,以下稱為“dp2”）、新瓊四糖（neoagarotetraose,以下稱為“dp4”）及新瓊六糖（neoagarohexaose，以下稱為“dp6”）構(gòu)成的新瓊寡糖的重量占65±20％（重量），以上述新瓊寡糖的總量為基準(zhǔn)，dp2、dp4、dp6分別占0～10％、50～70％、30～50％（重量）。

實(shí)驗(yàn)例1．基于新瓊寡糖給藥的敗血癥預(yù)防效果分析

為了分析基于新瓊寡糖給藥的敗血癥夜訪效果分析，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

1-1．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及存活率分析

作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用6周齡的雌性balb/c小鼠。向小鼠的腹腔腹腔折射新瓊寡糖來進(jìn)行預(yù)處理后，1小時(shí)后，注射10⁷cfu/mice的大腸埃希氏菌k1（e.colik1）（dissolvedinlbbroth）來誘導(dǎo)敗血癥。在圖4中示出誘導(dǎo)敗血癥的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的各小鼠基于時(shí)間的存活率。

如圖4所示，確認(rèn)對(duì)照組在敗血癥誘導(dǎo)18小時(shí)后均死亡。與此相反，與對(duì)照組相比，經(jīng)新瓊寡糖預(yù)處理的組的存活率顯著增加。

1-2．血清分析

敗血癥誘導(dǎo)12小時(shí)后，從各小鼠分離血清來分析血清內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子-α（tnf-α）、白介素-6（il-6）、白介素-1β（il-1β）、白介素-12p70（il-12p70）及白介素-10（il-10））、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血尿素氮的數(shù)值。此時(shí)，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（elisa）試劑盒（ebiosciences，圣地亞哥（sandiego），ca）測(cè)定細(xì)胞因子的濃度，其結(jié)果如圖5及6所示。

如圖5所示，確認(rèn)因敗血癥而增加的小鼠血清內(nèi)作為傳染癥性細(xì)胞因子的腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-1β及白介素-12p70的量，在進(jìn)行新瓊寡糖預(yù)處理的情況下，被顯著抑制。與此相反，確認(rèn)作為抗炎癥性細(xì)胞因子的白介素-10的分泌因新瓊寡糖預(yù)處理而增加。

并且，如圖6所示，確認(rèn)與肝及腎臟毒性有關(guān)的血清內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及血尿素氮的濃度因敗血癥而增加，但是，在對(duì)小鼠進(jìn)行新瓊寡糖預(yù)處理的情況下，被顯著抑制。

實(shí)驗(yàn)例2．基于新瓊寡糖給藥的免疫增強(qiáng)效果分析

為了基于新瓊寡糖給藥的免疫增強(qiáng)效果，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

2-1．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及存活率分析

作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用6周齡的雌性balb/c小鼠。向小鼠的腹腔腹腔折射100mg/kg的新瓊寡糖來進(jìn)行預(yù)處理后，1小時(shí)后，注射20mg/kg的脂多糖。之后，在圖7中示出實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的各小鼠基于時(shí)間的存活率。

如圖7所示，對(duì)照組在給藥脂多糖24小時(shí)后均死亡。與此相反，確認(rèn)與對(duì)照組相比，經(jīng)新瓊寡糖預(yù)處理的組的存活率顯著增加，且確認(rèn)以依賴于新瓊寡糖的濃度的方式增加。

2-2．血清分析

給藥脂多糖12小時(shí)后，從各小鼠分離血清來分析血清內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-1β、白介素-12p70及白介素-10）、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血尿素氮的數(shù)值。此時(shí)，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（ebiosciences，圣地亞哥，ca）測(cè)定細(xì)胞因子的濃度，其結(jié)果如圖8及9所示。

如圖8所示，確認(rèn)因脂多糖給藥增加的小鼠血清內(nèi)作為傳染癥性細(xì)胞因子的腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-1β及白介素-12p70的量，在進(jìn)行新瓊寡糖預(yù)處理的情況下，被顯著抑制。與此相反，確認(rèn)作為抗炎癥性細(xì)胞因子的白介素-10的分泌因新瓊寡糖預(yù)處理而增加。

并且，如圖9所示，確認(rèn)與肝及腎臟毒性有關(guān)的血清內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及血尿素氮的濃度因脂多糖給藥而增加，但是，在對(duì)小鼠進(jìn)行新瓊寡糖預(yù)處理的情況下，被顯著抑制。

2-3．組織分析

給藥脂多糖12小時(shí)后，從各小鼠去除肺及脾組織，并根據(jù)公知的方法進(jìn)行石蠟切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅（h&e）染色，并通過顯微鏡觀察，其結(jié)果如圖10及圖11所示。

如圖10所示，確認(rèn)在進(jìn)行新瓊寡糖預(yù)處理的情況下，與對(duì)照組相比，在肺組織中炎癥誘發(fā)細(xì)胞的浸潤(rùn)被顯著抑制。

并且，如圖11所示，確認(rèn)在進(jìn)行新瓊寡糖預(yù)處理的情況下，與對(duì)照組相比，在脾組織中的細(xì)胞凋亡被顯著抑制。

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)新瓊寡糖的優(yōu)秀的敗血癥及敗血癥性休克的預(yù)防效果，并且，確認(rèn)有效抑制炎癥發(fā)生，進(jìn)而免疫增進(jìn)效果突出。

以下，說明本發(fā)明的藥學(xué)組合物及食品組合物的制劑例，這用于具體說明本發(fā)明，而不是限定本發(fā)明。

制劑例1．藥學(xué)組合物的制備

1-1．散劑的制備

新瓊寡糖20mg

乳糖100mg

滑石10mg

混合如上所述的成分，通過填充于氣密布來制備散劑。

1-2．片劑的制備

新瓊寡糖10mg

玉米淀粉100mg

乳糖100mg

硬脂酸鎂2mg

混合如上所述的成分后，按照通常的片劑的制備方法，通過壓片來制備片劑。

1-3．膠囊劑的制備

新瓊寡糖10mg

結(jié)晶纖維素3mg

乳糖14.8mg

硬脂酸鎂0.2mg

混合如上所述的成分后，按照通常的膠囊劑的制備方法，通過填充于明膠膠囊來制備膠囊劑。

1-4．注射劑的制備

新瓊寡糖10mg

甘露醇180mg

注射用滅菌蒸餾水2974mg

磷酸氫二鈉（na2hpo4·2h2o）26mg

按照通常的注射劑的制備方法，以每一次用量的針劑（2ml）的如上所述的成分含量制備。

1-5．液劑的制備

新瓊寡糖10mg

異構(gòu)糖10g

甘露醇5g

純化水定量

按照通常的液劑的制備方法向純化水中加入各個(gè)成分，使其溶解，加入適量的檸檬香后，混合如上所述的成分后，加入純化水并加入所有純化水，調(diào)節(jié)為100ml后，填充到褐色瓶并進(jìn)行滅菌來制備液劑。

制劑例2．食品組合物的制備

2-1．保健食品的制備

新瓊寡糖100mg

維生素混合物適量

維生素a醋酸鹽70g

維生素e1.0mg

維生素b10.13mg

維生素b20.15mg

維生素b60.5mg

維生素b120.2g

維生素c10mg

生物素10g

煙酰胺1.7mg

葉酸50g

泛酸鈣0.5mg

無機(jī)物混合物適量

硫酸亞鐵1.75mg

氧化鋅0.82mg

碳酸鎂25.3mg

磷酸二氫鉀15mg

磷酸氫鈣55mg

檸檬酸鉀90mg

碳酸鈣100mg

氯化鎂24.8mg

如上所述的維生素及礦物混合物的組成比通過優(yōu)選實(shí)施例混合比較適合保健食品的成分來組成，但是對(duì)其配合比進(jìn)行任何變形也無妨，可按照通常的制備方法混合如上所述的成分后，制備顆粒，并按照通常的方法使用于保健食品的制備中。

<110>達(dá)因比奧有限公司

<120>包含新瓊寡糖作為有效成分的敗血癥或敗血癥性休克的預(yù)防或治療用藥學(xué)組合物

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<213>天藍(lán)色鏈霉菌

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<213>反向引物（asm-r）

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