相關(guān)申請的交叉參考本專利申請要求2015年3月18日提交的美國臨時(shí)專利申請62/134,747的優(yōu)先權(quán)。本專利申請還要求2014年11月11日提交的美國臨時(shí)專利申請62/078,069的優(yōu)先權(quán)。將前述臨時(shí)申請通過專門提及全文并入本申請作為參考。
背景技術(shù)：
：分子6-環(huán)己基-1-羥基-4-甲基吡啶-2(1h)-酮也被稱作環(huán)吡酮(ciclopirox)，其是可商購的局部抗真菌劑。環(huán)吡酮已被用于治療淺表性真菌病和花斑癬(tineaversicolor)?？缮藤彽木植克幬锂a(chǎn)品中含有環(huán)吡酮的乙醇胺鹽(olaminesalt)。在口服給藥于人后，環(huán)吡酮胺被完全吸收，接著發(fā)生迅速且完全的藥物消除。環(huán)吡酮胺在人中的口服生物利用度還未見報(bào)道。然而，在動物中，口服環(huán)吡酮胺的絕對生物利用度很低。在動物和人中，已將反復(fù)口服給藥環(huán)吡酮的乙醇胺鹽與胃腸毒性關(guān)聯(lián)起來。最后，環(huán)吡酮的乙醇胺鹽不具有配制為可注射藥物產(chǎn)品所需的水溶解度。因此，有利的是對環(huán)吡酮進(jìn)行構(gòu)造以提高水溶解度，目的是通過注射給予所述藥物。在美國，膀胱癌是第五大最常見的癌癥診斷。由于患者具有高的復(fù)發(fā)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，因此就每位患者的壽命而言，膀胱癌是治療起來最昂貴的癌癥。盡管其有如此的發(fā)病率和流行率，但膀胱癌的研究資金不足，導(dǎo)致改善膀胱癌治療的進(jìn)展收效甚微。膀胱癌的范圍內(nèi)包括兩種疾病，非肌層浸潤性膀胱癌(nmibc)(曾被稱作“淺表性膀胱癌”)和肌層浸潤性膀胱癌(mibc)。nmibc可通過內(nèi)鏡切除術(shù)和膀胱滴注(膀胱內(nèi)給藥)給予局部疫苗和藥物來治療。mibc需要更具攻擊性的干預(yù)，通常為根治性膀胱切除術(shù)和/或全身化療的形式。有三種類型的nmibc病變，非浸潤性乳頭狀癌(ta)、固有層的腫瘤浸潤(t1)和原位癌(tis)。ta和t1腫瘤分為低級別腫瘤和高級別腫瘤。高級別ta和t1，以及tis腫瘤具有較高的復(fù)發(fā)率，伴隨中度至高度進(jìn)展至mibc的風(fēng)險(xiǎn)。內(nèi)鏡切除術(shù)和膀胱內(nèi)治療后，半數(shù)nmibc患者會在12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)。根據(jù)腫瘤類型和等級，即使有手術(shù)、免疫療法和化療干預(yù)，nmibc的五年復(fù)發(fā)或新發(fā)病率為31-78％。因此，有利的是對nmibc的改進(jìn)治療，以防止復(fù)發(fā)和進(jìn)展成mibc。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個(gè)實(shí)施方案中，其提供治療膀胱癌的方法。治療膀胱癌的方法可包括:提供藥物組合物，該組合物含有環(huán)吡酮或環(huán)吡酮胺或具有本申請?zhí)峁┑耐ㄊ街坏慕Y(jié)構(gòu)的環(huán)吡酮-pom前藥，或其衍生物或其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽；和將所述藥物組合物給予患有膀胱癌的受試者?？山o予有效量的環(huán)吡酮或環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥。在一個(gè)方面，所述有效量足以抑制notch信號傳導(dǎo)途徑、γ-分泌酶復(fù)合物和notch下游靶標(biāo)蛋白、細(xì)胞周期蛋白d1和c-myc。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制tgfβ信號傳導(dǎo)途徑。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制stat3信號傳導(dǎo)途徑。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制膀胱癌細(xì)胞的生長。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制dna修復(fù)。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制核糖核苷酸還原酶。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制膀胱癌干細(xì)胞的生長。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制s-期膀胱癌細(xì)胞的生長。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制膀胱癌球狀體形成。在一個(gè)方面中，所述治療有效量足以抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，其提供通過全身遞送環(huán)吡酮治療上泌尿道中的膀胱癌疾病的方法。所述方法可包括:提供藥物組合物，該組合物含有環(huán)吡酮或環(huán)吡酮胺或具有本申請?zhí)峁┑耐ㄊ街坏慕Y(jié)構(gòu)的環(huán)吡酮-pom前藥，或其衍生物或其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽；和向患有上泌尿道中的膀胱癌疾病的受試者給予所述藥物組合物。附圖說明通過下面的描述和隨附權(quán)利要求并結(jié)合附圖，上述和下面的信息以及本申請的其他特征會變得更顯而易見。理解的是，這些附圖僅描繪了符合本申請的數(shù)個(gè)實(shí)施方案，并因此不應(yīng)被理解是限制其范圍，將通過使用附圖描述本申請的其他特征和細(xì)節(jié)，其中:圖1圖示說明了制備6-環(huán)己基-1-羥基-4-甲基吡啶-2(1h)-酮的方法，其在本申請中被稱作環(huán)吡酮(方案1)。圖2圖示說明了制備二叔丁基(氯甲基)磷酸酯的方法(方案2)。圖3圖示說明了制備6-環(huán)己基-1-羥基-4-甲基吡啶-2(1h)-酮的前藥的方法(方案3)。圖3a圖示說明了被稱作方案3a的子反應(yīng)方法，該方案可為圖3的方案3的子方法。圖3b所示質(zhì)譜色譜顯示了圖3a的方案3a的反應(yīng)產(chǎn)物。圖3c所示質(zhì)譜色譜顯示了存在((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基二氫磷酸酯的游離酸形式。圖3d顯示了環(huán)吡酮-pom前藥的二聚物型形式。圖3e顯示了圖3d的環(huán)吡酮-pom前藥的二聚物型形式的質(zhì)譜色譜。圖4圖示說明了使((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基二氫磷酸酯成鹽，得到((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽(方案4)；然而，合成可導(dǎo)致所述化合物的任何其他藥學(xué)上可接受的鹽。圖4a所示質(zhì)譜色譜顯示存在圖4的((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽。圖5圖示說明了制備二芐基(氯甲基)磷酸酯的方法(方案5)。圖6圖示說明了制備二芐基(((6-環(huán)己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯的方法(方案6)。圖7圖示說明了制備((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽的方法(方案7)。圖8圖示說明了制備pom反應(yīng)物二芐基(氯甲基)磷酸酯的方法(方案8)。圖9所包括的圖顯示環(huán)吡酮(cpx)在小的濃度范圍內(nèi)抑制nmibc(t24)膀胱癌細(xì)胞增殖。圖10所包括的圖像顯示cpx抑制膀胱癌球狀體形成。圖11所包括的圖顯示環(huán)吡酮(cpx)在較大濃度范圍內(nèi)抑制nmibc(t24)和mibc(253jbv)膀胱癌細(xì)胞增殖。圖12a顯示向每時(shí)間點(diǎn)處理組的六只小鼠給予10mg/kgiv環(huán)吡酮胺(cpx-o),10mg/kgivcpx-pom,30mg/kgpocpx-o和30mg/kgpocpx-pom后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布圖。圖12b顯示向每時(shí)間點(diǎn)每處理組的三只小鼠給予10mg/kgiv和50mg/kgipcpx-pom后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布圖。圖13a顯示向每處理組的六只大鼠給予10mg/kgivcpx-pom和cpx-o后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間半對數(shù)分布圖。圖13b顯示向每處理組的六只大鼠給予20mg/kgivcpx-pom,30mg/kgsqcpx-pom和30mg/kgcpx-o后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布圖。圖14顯示向四只雄性比格犬給予3mg/kgivcpx-pom和cpx-o后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布圖。圖15顯示向四只雄性比格犬給予3mg/kg靜脈內(nèi)(iv)cpx-pom,9mg/kg皮下(sq)cpx-pom和9mg/kg口服(po)cpx-o后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布圖。圖16包括的western印跡顯示來自cpx的t24膀胱癌細(xì)胞的凋亡。圖17包括的western印跡顯示來自cpx的t24膀胱癌細(xì)胞的凋亡。圖18包括的圖顯示相對于孵育時(shí)間，cpx自cpx-pom的形成。圖19包括的圖像顯示，與對照相比在cpx存在下t24細(xì)胞的細(xì)胞生長的差異。圖20包括的圖像顯示，與對照相比在cpx存在下253jbv細(xì)胞的細(xì)胞生長的差異。圖21包括的圖顯示在253jbv和t24細(xì)胞系中，cpx都抑制球狀體形成。圖22包括的圖像顯示在t24膀胱癌細(xì)胞系中cpx誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。圖23a-23c包括的圖顯示在t24膀胱癌細(xì)胞中，cpx抑制細(xì)胞內(nèi)notch,wnt和hedgehog信號傳導(dǎo)途徑。圖24包括的圖和圖像顯示cpx在wt和ncid過表達(dá)的t24細(xì)胞中對細(xì)胞增殖的作用以及對notch1和actin水平的作用。圖25a-25d包括的圖顯示cpx對膀胱癌細(xì)胞的作用。圖26a包括的圖顯示每種cpx-pom處理時(shí)膀胱的重量。圖26b包括的圖顯示每種cpx-pom給藥處理時(shí)的腫瘤階段。圖27a包括的圖像顯示cpx-pom抑制體內(nèi)notch1信號傳導(dǎo)和γ-分泌酶復(fù)合物蛋白。圖27b包括的圖像顯示cpx-pom在bbn誘導(dǎo)的膀胱腫瘤模型中抑制notch下游靶標(biāo)蛋白,細(xì)胞周期蛋白d1和c-myc。圖28顯示cpx-pom在體外和體內(nèi)抑制增殖細(xì)胞核抗原(pcna)。發(fā)明詳述在下面的詳述中會提到附圖，其構(gòu)成本文的一部分。在所述附圖中，相似的符號通常代表相似的組分，除非上下文另有說明。在發(fā)明詳述、附圖和權(quán)利要求中描述的示例性實(shí)施方案并不意在加以限制?？梢允褂闷渌麑?shí)施方案，并且可以進(jìn)行其他改變，這些都不背離本文所呈現(xiàn)的主題的主旨或范圍。容易理解的是，可對本文中大體描述和在附圖中說明的方面以多種不同的形態(tài)進(jìn)行布置、取代、組合、分離和設(shè)計(jì)，這些全部是本文明確考慮的。大體上，本發(fā)明涉及6-環(huán)己基-1-羥基-4-甲基吡啶-2(1h)-酮(也被稱作環(huán)吡酮)及其前藥。本文所述的環(huán)吡酮和環(huán)吡酮前藥可用在治療膀胱癌中，其得到本文數(shù)據(jù)的支持。所述環(huán)吡酮前藥可包括磷?；趸谆?pom)部分，目的是通過提高的水溶解度和通過注射給予所述藥物的能力而向目標(biāo)作用位點(diǎn)遞送活性部分環(huán)吡酮。本發(fā)明的所述環(huán)吡酮-pom前藥也可包括環(huán)吡酮的衍生物，該衍生物包括所述pom前藥部分，該衍生性前藥在本文中通常被冠以術(shù)語環(huán)吡酮-pom或可被具體稱作環(huán)吡酮-pom衍生物。本發(fā)明的環(huán)吡酮-pom前藥可用傳統(tǒng)的化學(xué)技術(shù)制備，例如本文中描述的那些技術(shù)。在膀胱癌治療中，所述環(huán)吡酮可按環(huán)吡酮胺形式使用。所述環(huán)吡酮-pom前藥已被證明提高環(huán)吡酮的水性溶解度，從而使其有機(jī)會通過注射環(huán)吡酮-pom而向整個(gè)泌尿道選擇性遞送顯著濃度的環(huán)吡酮。通過向整個(gè)泌尿道遞送生物活性環(huán)吡酮，通過注射給予所述環(huán)吡酮-pom前藥克服了經(jīng)由膀胱滴注局部遞送的局限，因?yàn)樗幬锉贿f送至上泌尿道包括輸尿管、收集系統(tǒng)和腎臟。因此，所述環(huán)吡酮-pom前藥克服了環(huán)吡酮或其他形式的環(huán)吡酮例如環(huán)吡酮鹽如環(huán)吡酮胺在配制和/或遞送途徑上的局限?，F(xiàn)在，所述環(huán)吡酮-pom前藥改進(jìn)的溶解度可允許獲得改進(jìn)的藥物組合物，該組合物通過注射給予有效量的環(huán)吡酮。所述藥物組合物可被配制為適于可注射的給藥途徑，例如靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)。所述環(huán)吡酮-pom前藥可經(jīng)構(gòu)造以使pom部分通過磷酸酶被斷裂，目的是產(chǎn)生具有生物活性的原始母體藥物環(huán)吡酮。環(huán)吡酮-pom向生物活性的環(huán)吡酮的代謝轉(zhuǎn)化是迅速且完全的。因此，可將所述環(huán)吡酮-pom給予有生命的受試者，然后其在所述受試者的體內(nèi)被酶性加工成生物活性的環(huán)吡酮。盡管所述受試者通常是人，但發(fā)現(xiàn)環(huán)吡酮-pom前藥可適用于多種動物，例如哺乳動物、禽類、爬行動物等。盡管環(huán)吡酮已常規(guī)被用作局部抗真菌劑，但用于本發(fā)明的環(huán)吡酮-pom前藥的不同制劑可為其他疾病提供治療有效量的環(huán)吡酮，所述其他疾病已被證明或被開發(fā)適于環(huán)吡酮治療。因此，所述環(huán)吡酮-pom前藥可被用在用于以下的療法中:抑制、治療和/或預(yù)防真菌；治療、預(yù)防和/或控制癌癥(例如，膀胱癌或其他癌癥)；抑制、治療和/或預(yù)防皮膚炎；抑制、治療和/或預(yù)防淺表真菌病；抑制、治療和/或預(yù)防炎癥(例如，作為抗炎藥或nsaid)；抑制、治療和/或預(yù)防腳癬,股癬和體癬中的一種或多種,紅色毛癬菌,須毛癬菌,絮狀表皮癬菌，和犬小孢子菌,念珠菌病(moniliasis),白色念珠菌,花斑癬(糠疹)或糠秕馬拉色菌，和用于抑制、治療和/或預(yù)防病毒感染包括hiv?，F(xiàn)在，發(fā)現(xiàn)環(huán)吡酮例如環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮前藥可用在膀胱癌的治療中。換言之，該藥物可在沒有前藥部分的情況下使用或在具有前藥部分的情況下以前藥形式使用。環(huán)吡酮的這種用法可如本申請所述加以給藥。而且，所述環(huán)吡酮可包括在局部遞送系統(tǒng)中以經(jīng)由膀胱滴注直接遞送至膀胱癌。還發(fā)現(xiàn)，cpx選擇性消除由hiv-1引起的病毒感染，所述cpx可按環(huán)吡酮、環(huán)吡酮-pom前藥或環(huán)吡酮胺形式遞送。所述環(huán)吡酮-pom前藥提高所述前藥的溶解度，從而實(shí)現(xiàn)全身和泌尿道向環(huán)吡酮的暴露增加。換言之，整個(gè)受試者以及受試者的各細(xì)胞內(nèi)可獲得更多的環(huán)吡酮?？色@得的環(huán)吡酮的量增加提高了生物活性和治療潛能，以及提高了調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程的能力。因此，所述環(huán)吡酮-pom前藥可被用于破壞細(xì)胞中的dna修復(fù),細(xì)胞分裂或核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，環(huán)吡酮-pom可被用于抑制notch信號傳導(dǎo)，從而影響干細(xì)胞特性(stemness)并促進(jìn)膀胱癌的侵入和轉(zhuǎn)移。所述細(xì)胞可為體內(nèi)、離體或體外。因此，所述環(huán)吡酮-pom可被用于抗寬譜癌系，采用的方式是在細(xì)胞中破壞dna修復(fù),細(xì)胞分裂或核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制notch信號傳導(dǎo)和抑制本申請所述的任何其他生物途徑。盡管已描述了環(huán)吡酮的前藥，但所述前藥已被限于與可用羥基和/或氨基形成的常規(guī)酯，例如通過在堿存在下酰化經(jīng)活化的酸。所描述的酯可包括具有以下酯的前藥：苯基酯、脂肪族(c8-c24)酯,酰基氧基甲基酯、氨基甲酸酯和氨基酸酯(參見，wo2010/048712，將其全文并入本申請作為參考)。此外，針對化合物(包括含仲胺和叔胺的藥物)，已生產(chǎn)具有增加的溶解度的前藥。所述前藥的實(shí)例包括n-磷?；趸谆?pom)前藥，其中所述pom部分的甲基基團(tuán)連接至仲胺或叔胺(參見美國專利5,985,856，將其全文并入本申請作為參考)?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，其他化學(xué)技術(shù)可將pom前藥實(shí)體連接至環(huán)吡酮，目的是獲得本發(fā)明的環(huán)吡酮-pom前藥。化學(xué)合成方案可如下所示通過環(huán)吡酮的羥基而不是仲胺或叔胺共軛連接。盡管環(huán)吡酮確實(shí)包括環(huán)氮，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于與氮連接的羥基或氧對于環(huán)吡酮的生物活性可能是重要的，因此這樣的氮不適合與pom相連。因此，本發(fā)明提供的化學(xué)技術(shù)將pom部分與連接于環(huán)吡酮的環(huán)氮的羥基基團(tuán)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括環(huán)吡酮的前藥或其衍生物。所述前藥可包括式1的結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體以及其藥學(xué)上可接受的鹽。在該式中，r1-r14各自獨(dú)立地可包括氫,鹵素,羥基,烷氧基,直鏈脂肪族基團(tuán),支鏈脂肪族基團(tuán),環(huán)狀脂肪族基團(tuán),取代的脂肪族基團(tuán),未取代的脂肪族基團(tuán),飽和的脂肪族基團(tuán),不飽和的脂肪族基團(tuán),芳族基團(tuán),多芳族基團(tuán),取代的芳族基團(tuán),雜芳族基團(tuán)、胺、伯胺,仲胺,叔胺,脂肪族胺,羰基,羧基,酰胺,酯,氨基酸,肽,多肽,它們的衍生物,取代的或未取代的或它們的組合以及其他公知的化學(xué)取代基。r13和/或r14可為陽離子例如鈉離子，從而所述化合物形成鹽。而且，r13和/或r14獨(dú)立地可包括陽離子以與所述前藥或以下中的一個(gè)或多個(gè)形成鹽：氫,鹵素,羥基,烷氧基,直鏈脂肪族基團(tuán),支鏈脂肪族基團(tuán),環(huán)狀脂肪族基團(tuán),取代的脂肪族基團(tuán),未取代的脂肪族基團(tuán),飽和的脂肪族基團(tuán),不飽和的脂肪族基團(tuán),芳族基團(tuán),多芳族基團(tuán),取代的芳族基團(tuán),雜芳族基團(tuán)、胺、伯胺,仲胺,叔胺,脂肪族胺,羰基,羧基,酰胺,酯,氨基酸,肽,多肽或它們的組合。甲基連接基可被擴(kuò)展為較大的脂肪族基團(tuán)，該基團(tuán)視需要為取代的或未取代的，從而n可為約0-20，更優(yōu)選1-10和最優(yōu)選1-4。所述連接基也可具有一個(gè)或兩個(gè)氧原子，從而m可為0、1或2。對于本申請所示的所有通式，n可為1-4和m為1，或n和m都可為1。在一個(gè)實(shí)施方案中，r13和/或r14可獨(dú)立地為多種陽離子中的任一個(gè)。在一個(gè)實(shí)例中，r13和/或r14可獨(dú)立地包括帶有正電荷+1的離子。r13和/或r14可為堿金屬。而且，r13和/或r14可獨(dú)立地為1個(gè)離子的基團(tuán)例如鈉離子。因此，氧和r13和/或r14之間的鍵可為共價(jià)的或離子的。在一個(gè)實(shí)施方案中，r13和/或r14可獨(dú)立地為保護(hù)基。保護(hù)基的實(shí)例可包括叔丁基和芐基；然而，可使用其他基于有機(jī)物的保護(hù)基。這些保護(hù)基可留在所述前藥上用于給藥，或可在給藥前除去。在一個(gè)實(shí)施方案中，r1為短的脂肪族基團(tuán)，例如甲基或其他烷基。在一個(gè)實(shí)施方案中，r2-r12全部為氫。在一個(gè)實(shí)施方案中，r13和/或r14各自獨(dú)立地為氫。在一個(gè)實(shí)施方案中，r13和/或r14各自獨(dú)立地為芐基或叔丁基。在一個(gè)實(shí)施方案中，r13或r14包括環(huán)吡酮-pom，并且另一個(gè)為氫，其顯示在下面的式10中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有式2結(jié)構(gòu)的化合物或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n,m,r1和r13和/或r14可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式3結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n,m,r1和r13和/或r14可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式4結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n和m可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式5結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n和m可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式6結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n和m可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式7結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n和m可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式8結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n和m可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式9結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。n和m可與上面就式1所述的相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式10結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式11的結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。其中，所述化合物具有兩個(gè)帶負(fù)電荷的氧原子，其可與陽離子離子締合，從而形成鹽，例如任意藥學(xué)上可接受的鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式12的結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。其中，所述化合物具有兩個(gè)帶與陽離子締合的氧原子，從而形成鹽，例如任意藥學(xué)上可接受的鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可包括式13的結(jié)構(gòu)或其衍生物或其立體異構(gòu)體。其中所述化合物具有兩個(gè)可失去氫然后變成與陽離子締合的氧原子，從而形成鹽，例如任意藥學(xué)上可接受的鹽。如果可能的話，任何化合物都可以作為藥學(xué)上可接受的鹽制備。可以使用任何常見的藥學(xué)上可接受的鹽離子。這種鹽的實(shí)例可包括堿金屬和堿土金屬鹽，例如鋰，鈉，鉀，鎂，鈣，鍶及它們的水合物；更優(yōu)選鈉，鎂，鈣及它們的水合物；并且更優(yōu)選的是鎂、鈣及它們的水合物。所述鹽還可以包括各種有機(jī)酸的相應(yīng)鹽，例如甲酸，乙酸，丙酸，三氟乙酸，酒石酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，琥珀酸，草酸等，以及各種無機(jī)酸的鹽，例如鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸等。任意其他鹽也為合適的。此外，本文所述并由化學(xué)式表示的任何化合物可以具有任何r基團(tuán)(r1-r14)，其獨(dú)立地選自取代基，該取代基選自：氫,c1-c24烷基,c2-c24烯基,c2-c24炔基,c5-c20芳基,c6-c24烷芳基,c6-c24芳烷基,鹵素,羥基,巰基,c1-c24烷氧基,c2-c24烯基氧基,c2-c24炔基氧基,c5-c20芳基氧基,?；?包括c2-c24烷基羰基(—co-烷基)和c6-c20芳基羰基(—co-芳基)),?；趸?—o-酰基),c2-c24烷氧基羰基(—(co)—o-烷基),c6-c20芳基氧基羰基(—(co)—o-芳基),鹵羰基(—co)—x，其中x為鹵素),c2-c24烷基碳酸酯基(—o—(co)—o-烷基),c6-c20芳基碳酸酯基(—o—(co)—o-芳基),羧基(—cooh),羧酸根(—coo-),氨基甲酰基(—(co)—nh2),單-(c1-c24烷基)-取代的氨基甲?；?—(co)—nh(c1-c24烷基)),二-(c1-c24烷基)-取代的氨基甲?；?—(co)—n(c1-c24烷基)2),單-取代的芳基氨基甲酰基(—(co)—nh-芳基),硫代氨基甲?；?—(cs)—nh2),脲基(—nh—(co)—nh2),氰基(—c≡n),異氰基(—n+≡c-),氰氧基(—o—c≡n),異氰酸基(—o—n+≡c-),異硫氰酸基(—s—c≡n),疊氮基(—n═n+═n-),甲酰基(—(co)—h),硫代甲?；?—(cs)—h),氨基(—nh2),單-和二-(c1-c24烷基)-取代的氨基,單-和二-(c5-c20芳基)-取代的氨基,c2-c24烷基酰胺基(—nh—(co)-烷基),c6-c20芳基酰胺基(—nh—(co)-芳基),亞氨基(—cr＝nh，其中r為氫,c1-c24烷基,c5-c20芳基,c6-c24烷芳基,c6-c24芳烷基,等等),烷基亞氨基(—cr＝n(烷基)，其中r＝氫,烷基,芳基,烷芳基,芳烷基,等等),芳基亞氨基(—cr═n(芳基)，其中r＝氫,烷基,芳基,烷芳基,等等),硝基(—no2),亞硝基(—no),磺基(—so2—oh),硫羰酸根(sulfonato)(—s2—o-)’c1-c24烷基硫基(—s-烷基；也稱作“烷基硫基”),芳基硫基(—s-芳基；也稱作“芳基硫基”),c1-c24烷基亞磺酰基(—(so)-烷基),c5-c20芳基亞磺?；?—(so)-芳基),c1-c24烷基磺酰基(—so2-烷基),c5-c20芳基磺?；?—so2-芳基),磷酸基(—p(o)(oh)2),磷酸根(—p(o)(o-)2),次磷酸根(-p(o)(o-)),磷?；?—po2),膦基(—ph2),它們的衍生物，和它們的組合。藥物組合物在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)吡酮-pom前藥可包括在藥物組合物中。所述藥物組合物可被配制成適合于可注射的給藥途徑，例如靜脈內(nèi),皮下和肌內(nèi)?？梢越o藥到腎臟中，或給藥到膀胱中，或給藥到尿道中，或給藥到通往它們的任何血管的上游。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)吡酮或環(huán)吡酮胺可包括在藥物組合物中。所述藥物組合物可被配制成適合于可注射的給藥途徑，例如靜脈內(nèi),皮下和肌內(nèi)。在一個(gè)實(shí)例中，環(huán)吡酮或環(huán)吡酮胺或cpx-pom可包括在局部遞送系統(tǒng)中，例如可以作為儲庫被施用于膀胱癌或與其相鄰位置的聚合物載體。所述聚合物載體可以是可以被遞送到局部位點(diǎn)的納米顆粒，微粒，水凝膠或其它物質(zhì)，并允許環(huán)吡酮或環(huán)吡酮胺或cpx-pom通過膀胱滴注局部遞送至膀胱癌細(xì)胞。遞送系統(tǒng)可以是可生物降解的遞送系統(tǒng)，或允許試劑從其中擴(kuò)散。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可包括本文所述的環(huán)吡酮-pom前藥。例如，所述藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體。由于環(huán)吡酮-pom前藥現(xiàn)在是高度水可溶的，因此藥學(xué)上可接受的載體可以包括水。然而，為了給予所述環(huán)吡酮-pom前藥，載體可以是充足的，以使其達(dá)到被給藥的受試者例如人或其細(xì)胞的水環(huán)境。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物可包括環(huán)吡酮或環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥，其存在量大于約0.77％，更優(yōu)選大于約1％；或最優(yōu)選大于約2％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物可包括水作為載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)吡酮或其乙醇胺(olamine)或環(huán)吡酮-pom前藥可以根據(jù)已知的遞送環(huán)吡酮或其乙醇胺的方式來遞送。然而，局部直接給藥到膀胱癌細(xì)胞的可為有利的。此外，可注射的給藥途徑，例如靜脈內(nèi)，皮下和肌內(nèi)可為合適的。本文所述的組合物可以通過已知的用于制備可被給予至受試者的藥學(xué)上可接受的組合物的方法來制備，從而使有效量的活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的媒介物組合在混合物中。合適的媒介物描述在例如remington'spharmaceuticalsciences中。在此基礎(chǔ)上，所述組合物包括但不限于與一種或多種藥學(xué)上可接受的媒介物或稀釋劑締合的物質(zhì)的溶液，并且包含在具有合適ph的緩沖溶液中，與生理溶液等滲。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥的有效量在約0.01至約200mg/kg受試者體重的范圍內(nèi)。在一個(gè)方面中，環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥的有效量在約0.5至約50mg/kg體重的范圍內(nèi)。環(huán)吡酮，環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥可被制成含有約1mg至約1000mg環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥的可注射劑型。在一個(gè)方面中，所述組合物可包括約1mg至約200mg環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥/kg受試者體重，并且可被配制成液體劑型或可注射劑型。然而，可使用其他量。例如，藥物可以在寬劑量范圍內(nèi)施用，例如0.5mg/m2至300mg/m2,1mg/m2至200mg/m2,5mg/m2至150mg/m2,10mg/m2至75mg/m2，或任何合適的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括被構(gòu)造用于治療白血病性障礙的藥物組合物。所述組合物可包括有效量的環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥，其可通過口服、局部給藥，或通過靜脈內(nèi),皮下或肌內(nèi)注射給藥。藥物組合物包括但不限于凍干粉末或水性或非水性無菌可注射溶液或懸浮液，其可以進(jìn)一步含有使組合物與預(yù)期接受者的組織或血液基本相容的抗氧化劑，緩沖劑，抑菌劑和溶質(zhì)?？纱嬖谟谒鼋M合物中的其它組分包括例如水，表面活性劑(例如，)，醇，多元醇，甘油和植物油。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末，顆粒劑，片劑或濃縮溶液或懸浮液制備。所述組合物可以以例如但不限于凍干粉末形式供應(yīng)，其在給予患者之前用無菌水或鹽水重構(gòu)。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括基本上化學(xué)惰性和無毒的組合物，其不干擾所述藥物組合物的生物活性的有效性。合適的藥物載體的實(shí)例包括但不限于水，鹽溶液，甘油溶液，乙醇，n-(1(2,3-二油?；趸?丙基)n，n，n-三甲基氯化銨(dotma)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)和脂質(zhì)體。所述組合物應(yīng)該含有治療有效量的化合物以及合適量的載體，以提供用于直接給予患者的形式。本申請描述的所述環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥組合物可例如通過胃腸外，靜脈內(nèi)，皮下，肌內(nèi)，顱內(nèi)，眶內(nèi)，眼內(nèi)，心室內(nèi)，囊內(nèi)，脊柱內(nèi)，腦池內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，氣霧劑，透皮或口服來給予。常用載體或賦形劑可用于制備被設(shè)計(jì)用于所述給藥途徑的藥物組合物。另一方面提供了一種商業(yè)包裝，其包含本文所述的組合物，以及與該組合物相關(guān)的用其治療環(huán)吡酮有效的病癥(例如本文所述的那些)的說明書。例如，所述包裝可包括合適的量，該量用于在需要這種治療的受試者中治療白血病性障礙例如急性髓細(xì)胞性白血病或急性淋巴細(xì)胞性白血病。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述商業(yè)包裝可以包括用于治療慢性骨髓性白血病，淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤的給藥說明書和/或治療方案。另一個(gè)實(shí)施方案提供包含本文所述的組合物的商業(yè)包裝，以及與該組合物相關(guān)的用其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或抑制白血病性障礙細(xì)胞例如白血病細(xì)胞中的存活活性或水平的說明書。這也適用于用環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥治療膀胱癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物沒有乙醇胺。事實(shí)上，所述前藥可不含乙醇胺。因此，所述組合物可沒有環(huán)吡酮胺或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中所述組合物可沒有缺少前藥部分的環(huán)吡酮。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述環(huán)吡酮,環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥可以治療有效量存在，用作療法。例如，所述治療有效量對于以下的一個(gè)或多個(gè)方面是足夠的:用在治療真菌中；用在治療癌癥中(膀胱癌或其他癌癥)；用在治療皮膚炎中；用于在細(xì)胞中破壞dna修復(fù),細(xì)胞分裂或核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；用在淺表真菌病的治療中；用作抗炎藥；用在治療腳癬,股癬和體癬,紅色毛癬菌,須毛癬菌,絮狀表皮癬菌和犬小孢子菌,念珠菌病(moniliasis),白色念珠菌,花斑癬(糠疹)或糠秕馬拉色菌的一種或多種中；用在治療急性髓細(xì)胞性白血病或急性淋巴細(xì)胞性白血病；慢性髓細(xì)胞性白血病,淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤或其他疾病中；和用于抑制、治療和/或預(yù)防病毒感染包括hiv。而且，所述治療可被用于治療任意合適的癌癥例如膀胱癌。合成通常，獲得環(huán)吡酮，然后通過本文所述的反應(yīng)方案反應(yīng)，以產(chǎn)生環(huán)吡酮-pom前藥。同樣，可以按照本文所述的合成方案獲得環(huán)吡酮衍生物并進(jìn)行反應(yīng)，其中環(huán)吡酮衍生物反應(yīng)物將得到相應(yīng)的環(huán)吡酮-pom衍生物前藥。在一些情況下，環(huán)吡酮或其衍生物可以以鹽如乙醇胺鹽的形式獲得。因此，反應(yīng)方案可以包括在與pom前藥部分結(jié)合之前將所述環(huán)吡酮脫鹽。在圖和下面相關(guān)的就化學(xué)反應(yīng)和相應(yīng)反應(yīng)物的描述中，縮寫用于描述化學(xué)物質(zhì)，其縮寫定義如下:edac為n-(3-二甲基氨基丙基)-n’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；diad為偶氮二羧酸二異丙酯；bbdi為1-叔丁氧基-2-叔丁氧基羰基-1,2-二氫異喹啉；dicd為碳二亞胺二異丙酯；和dbp為二芐基磷酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備6-環(huán)己基-1-羥基-4-甲基吡啶-2(1h)-酮的方法，該方法可包括如圖1中所示的反應(yīng)方案1。方案1的反應(yīng)從環(huán)吡酮的乙醇胺鹽制備環(huán)吡酮。簡言之，可將環(huán)吡酮胺(5g,18.6mmol)溶解在2nhcl中，用etoac萃取，并用己烷沉淀以得到環(huán)吡酮(約84％的收率)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備反應(yīng)物的方法，該反應(yīng)物用在制備6-環(huán)己基-1-羥基-4-甲基吡啶-2(1h)-酮的前藥中，該方法可包括如圖2中所示的反應(yīng)方案2。所述反應(yīng)方案2提供反應(yīng)物，該反應(yīng)物用于制備pom前藥部分(為二叔丁基(氯甲基)磷酸酯)的反應(yīng)物。簡言之，將磷酸二叔丁酯鉀(5g,20mmol)溶解在最少量的冷水中，滴加6nhcl以形成沉淀物，然后將該沉淀物用冷水洗滌，然后過濾并真空干燥以形成磷酸二叔丁酯。然后將所述磷酸二叔丁酯(4g,19mmol)溶解在約100ml丙酮中，滴加四甲基氫氧化銨直到達(dá)到約ph7,然后除去溶劑并真空干燥得到磷酸二叔丁酯四甲基銨。然后使磷酸二叔丁酯四甲基銨(5.11g,18mmol)與碘氯甲烷(ch2cli)(25g,142mmol,7.88當(dāng)量)在約150mldme中反應(yīng)并回流約2小時(shí)，然后過濾以除去沉淀物，除去溶劑，然后溶解在ea/h中，接著通過硅膠墊過濾，除去溶劑并干燥產(chǎn)物得到二叔丁基(氯甲基)磷酸酯。所展示的tlc確認(rèn)了產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備6-環(huán)己基-1-羥基-4-甲基吡啶-2(1h)-酮的前藥(即，((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽)的方法，所述方法可包括如圖3中所示的反應(yīng)方案3。反應(yīng)方案3使環(huán)吡酮與二叔丁基(氯甲基)磷酸酯反應(yīng)形成包括二鈉鹽的環(huán)吡酮-pom。簡言之，將環(huán)吡酮(0.257g,1.25mmol)和二叔丁基(氯甲基)磷酸酯(0.450g,1.74mmol)溶解在5ml中并在0℃與60％nah(0.62g,154.mmol)反應(yīng)30分鐘，然后在室溫反應(yīng)2小時(shí)，之后用水淬滅，然后除去溶劑并通過分離柱(ea/h(1:1))加工，得到二叔丁基(((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯，其通過tlc得到證實(shí)。然后將二叔丁基(((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯溶解在10mlthf/ch2cl2(3:1)中。在室溫孵育2小時(shí)，然后除去溶劑并通過rphplc純化，接著加入等摩爾的na2co3于水/can中并凍干，得到((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基二氫磷酸酯(14mg,0.044mmol)和((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽(15.89mg)，其在本申請中被稱作初級環(huán)吡酮-pom前藥。圖3a顯示被稱作方案3a的子反應(yīng)方法，其為方案3的子方法。方案3a顯示將二叔丁基(((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯轉(zhuǎn)化為叔丁基(((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)氫磷酸酯，其再轉(zhuǎn)化為((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基二氫磷酸酯。圖3b顯示的質(zhì)譜色譜表明存在這些化學(xué)實(shí)體。環(huán)吡酮-pom前藥的游離酸形式(即，((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基二氫磷酸酯)也通過rphplc純化，如圖3c中所示。經(jīng)純化的產(chǎn)物經(jīng)證明具有如圖3c中所示的質(zhì)譜色譜。另外，生成了環(huán)吡酮-pom前藥的另一種二聚物型形式，如圖3d中所示，其被稱為環(huán)吡酮-pom二聚物前藥。所述環(huán)吡酮-pom二聚物前藥得到質(zhì)譜色譜的證實(shí)，如圖3e中所示。圖4說明的方案4為用鈉離子使((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基二氫磷酸酯成鹽的方法，從而得到((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽,這得到質(zhì)譜色譜的證實(shí)，如圖4a中所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括制備pom反應(yīng)物二芐基(氯甲基)磷酸酯的方法，其如圖5的反應(yīng)方案5中所示。簡言之，在約25ml甲苯中使ch2cli(5ml；68.6mmol)與磷酸二芐基酯銀(2g,52mmol)反應(yīng)并回流約1小時(shí)，然后除去溶劑并通過分離柱(1/1ea/h)加工，從而產(chǎn)生二芐基(氯甲基)磷酸酯，其經(jīng)由tlc得到證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備前藥二芐基(((6-環(huán)己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯的方法，其如圖6的方案6所示。簡言之，將環(huán)吡酮(0.431g,2.08mmol)與二芐基(氯甲基)磷酸酯(0.920g,2.81mmol)和60％nah(0.096g,2.38mmol)一起溶解在10mldmf中，在0℃孵育30分鐘，然后在室溫孵育1小時(shí)，接著用水淬滅。然后除去溶劑并通過分離柱(ea/h1:1)加工，從而得到二芐基(((6-環(huán)己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯，其經(jīng)由所示的tlc得到證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將二芐基(((6-環(huán)己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯轉(zhuǎn)化成((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽，如圖7中的方案7所示。簡言之，在100mgpd/c存在下，將二芐基(((6-環(huán)己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯溶解在25mlthf中，在氫氣(h2)在室溫保持3小時(shí)，然后除去溶劑并將產(chǎn)物溶解在acn中。然后加入na2co3于水中并凍干。產(chǎn)物經(jīng)確定為少量的((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基二氫磷酸酯(約0.273g,0.86mmol)，并且主要產(chǎn)物為((6-環(huán)己基-4-甲基吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基磷酸酯二鈉鹽(0.310g)，其經(jīng)由所示的tlc得到證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，另一種制備pom反應(yīng)物二芐基(氯甲基)磷酸酯的方法如圖8的反應(yīng)方案8中所示。簡言之，在0℃至室溫，將二芐基磷酸酯(10.6g；38.08mmol)和氯甲基氯磺酸酯(7.52g,456.6mmol/120mlch2cl2)與nahco3(12.80g,152.32mmol)和n-bu4nhso4(12.94g,38.08mmol)溶解在320ml水和200mlch2cl2中過夜，然后通過分離柱(1/2ea/h,ea)加工。該反應(yīng)得到約48％的二芐基(氯甲基)磷酸酯(6g),其經(jīng)由所示的tlc得到證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供另一種制備前藥二芐基(((6-環(huán)己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯的方法，其如圖6的方案6所示。簡言之，將環(huán)吡酮(1g,4.82mmol)與二芐基(氯甲基)磷酸酯(2g,6.12mmol)以及60％nah(0.375g)溶解在20mldmf中，在0℃孵育30分鐘，然后用水淬滅。接著除去溶劑，并將產(chǎn)物溶解在etoac中，用水洗滌，除去溶劑并通過分離柱(ea/h1:2)和rphplc加工。從而得到67％二芐基(((6-環(huán)己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2h)-基)氧基)甲基)磷酸酯(1.616g)。實(shí)施方案圖和表中的數(shù)據(jù)表明本文所述的環(huán)吡酮-pom前藥對于向受試者給藥而言是一種改進(jìn)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，與向小鼠、大鼠和狗iv給予環(huán)吡酮胺相比，當(dāng)以前藥形式iv給予時(shí)，環(huán)吡酮容易生物利用，因此環(huán)吡酮-pom是化學(xué)制劑方面的改進(jìn)。然而，口服給予小鼠后，生物利用度低，給予乙醇胺鹽后為21％，口服給予環(huán)吡酮-pom前藥后為12％。因此，當(dāng)以前藥形式iv給予時(shí)，環(huán)吡酮容易生物利用。由于iv、口服、皮下和腹膜內(nèi)給藥后不能檢測到血漿和尿液中的前藥，因此看上去當(dāng)前藥到達(dá)全身循環(huán)時(shí)，其被迅速而完全代謝為環(huán)吡酮。因此，從物理化學(xué)性質(zhì)的觀點(diǎn)來看，環(huán)吡酮-pom前藥具有優(yōu)于環(huán)吡酮胺的優(yōu)點(diǎn)，并且可以配制成合適的可注射產(chǎn)品。根據(jù)所述數(shù)據(jù)，有理由相信環(huán)吡酮-pom前藥被快速轉(zhuǎn)化為環(huán)吡酮?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物可用于治療膀胱癌。膀胱癌可以包括nmibc(非肌層浸潤性膀胱癌)和mibc(肌層浸潤性膀胱癌)，以及其他膀胱癌。參見圖9-28。所述化合物(式10)已被證明具有抗膀胱癌活性。通過全身注射給予前藥(例如，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下等)導(dǎo)致有活性的臨床相關(guān)濃度(例如顯著濃度)的活性劑環(huán)吡酮被選擇性遞送至整個(gè)泌尿道。這可治療非肌層浸潤性或淺表性膀胱癌。所述前藥轉(zhuǎn)化為有效抑制膀胱癌中的干細(xì)胞的活性環(huán)吡酮化合物，并且具體靶向notch-1信號傳導(dǎo)途徑。已經(jīng)證明，在化合物存在下，信號傳導(dǎo)被顯著抑制，化合物通過這種機(jī)制影響膀胱癌。對于抑制其中notch信號傳導(dǎo)活躍的膀胱癌和其他癌癥(例如結(jié)腸癌，骨肉瘤)的化合物而言，抑制notch是重要活性。nmibc由泌尿道的外襯層(尿路上皮)(例如，與接觸尿液的層相對的層)的癌癥開始出現(xiàn)，外襯層的癌細(xì)胞開始向內(nèi)侵入膀胱的肌肉中，隨后癌癥遍布全身。然而，環(huán)吡酮的活性和以前藥形式遞送允許藥物抑制與這種特定癌癥的侵襲性相關(guān)的途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以給予所述前藥以提供環(huán)吡酮的抗癌活性，從而治療白血病，淋巴瘤，結(jié)腸直腸癌，肝癌，橫紋肌肉瘤和乳腺癌細(xì)胞系，以及其他癌癥，例如但不限于胰腺癌，腎細(xì)胞癌，血液惡性腫瘤，子宮頸癌，骨髓瘤和其他可能的癌癥?；诃h(huán)吡酮的活性的環(huán)吡酮-pom前藥也可用于誘導(dǎo)自噬，抑制mtor，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白a，b1，d1和e以及cdk2和cdk4和其他活性。使用所述前藥治療膀胱癌的方法可以包括全身給予環(huán)吡酮-pom前藥(例如，前藥)用于治療膀胱癌，其提供如本文所述的令人驚奇和意料不到的結(jié)果。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，環(huán)吡酮-pom前藥的全身給藥導(dǎo)致向整個(gè)泌尿道選擇性遞送臨床顯著濃度的活性抗癌劑環(huán)吡酮(游離酸)。目前對非肌層浸潤性膀胱癌(nmibc,之前稱作淺表性膀胱癌)的治療是經(jīng)由膀胱滴注。目前沒有任何由膀胱滴注以外的任何途徑給藥的治療nmibc的藥物療法。膀胱滴注抗癌劑只能使膀胱癌暴露于抗癌劑的時(shí)間為患者能夠?qū)⒁后w保留在其膀胱中的時(shí)間(例如，兩小時(shí))。其次，膀胱滴注不能將藥物輸送到解剖學(xué)上位于膀胱上方的整個(gè)泌尿道，即輸尿管，收集系統(tǒng)和腎臟。高達(dá)10％的nmibc患者患有上泌尿道疾病。相反，本發(fā)明包括向整個(gè)泌尿道提供活性藥物的全身遞送(例如，注射)。然而，治療劑也可以通過膀胱滴注遞送。膀胱癌表現(xiàn)為兩種疾病，nmibc和肌層浸潤性膀胱癌(mibc)。新診斷的膀胱癌患者中有大約四分之三表現(xiàn)為nmibc。當(dāng)nmibc入侵膀胱肌肉中時(shí)，其成為mibc。mibc經(jīng)常轉(zhuǎn)移，需要全身給藥的化療藥物。現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝且意料不到地證明，環(huán)吡酮在nmibc和mibc膀胱癌中具有抗癌活性，并且環(huán)吡酮-pom前藥的全身遞送向這些膀胱癌細(xì)胞提供環(huán)吡酮。在良好表征的nmibc和mibc細(xì)胞系中，來自環(huán)吡酮-pom前藥遞送的環(huán)吡酮抑制細(xì)胞增殖，集落形成和球狀體形成。雖然環(huán)吡酮的殺真菌活性是通過其螯合鐵的能力介導(dǎo)的，并且中斷鐵依賴性細(xì)胞內(nèi)過程，但環(huán)吡酮的體外抗癌活性獨(dú)立于市售的鐵螯合劑。首次證實(shí)，環(huán)吡酮抑制notch-1信號傳導(dǎo)途徑，這是最近被認(rèn)為在侵襲性膀胱癌中過度表達(dá)的途徑，也是在多種癌癥的癌干細(xì)胞中過表達(dá)的途徑。因此，環(huán)吡酮-pom前藥可用于治療所有形式的膀胱癌，以及用在其中notch信號傳導(dǎo)途徑活躍的許多不同癌癥的癌干細(xì)胞中。環(huán)吡酮-pom前藥選擇性地向整個(gè)泌尿道遞送臨床顯著濃度的環(huán)吡酮我們對小鼠，大鼠和狗進(jìn)行了一系列藥代動力學(xué)研究，證明了以下幾點(diǎn)。環(huán)吡酮-pom前藥在全身給予后，從血漿迅速且完全消失。全身給予環(huán)吡酮-pom前藥后的環(huán)吡酮的生物利用度優(yōu)異，在小鼠，大鼠和狗中的范圍為77-137％。在全身給藥環(huán)吡酮-pom前藥后，通過環(huán)吡酮和環(huán)吡酮的葡糖苷酸代謝物(cpx-g)的腎清除將該劑量從體內(nèi)消除。藥物消除與就環(huán)吡酮胺(cpx-o)所報(bào)道的一致。當(dāng)環(huán)吡酮-pom前藥的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于最大耐受劑量時(shí)，觀察到的環(huán)吡酮的尿濃度超過在nmibc和mibc細(xì)胞系中測定的體外ic50值。在小鼠、大鼠和狗中進(jìn)行藥代動力學(xué)研究，證明環(huán)吡酮-pom前藥迅速且完全代謝形成環(huán)吡酮。環(huán)吡酮-pom前藥的快速代謝在體內(nèi)發(fā)生，形成環(huán)吡酮。在小鼠，大鼠和狗中iv給藥后未在血漿或尿液中檢測到環(huán)吡酮-pom前藥。在小鼠，大鼠和狗中，緊跟iv靜脈推注給予后(5分鐘內(nèi))，血漿環(huán)吡酮濃度最大，此后下降。眾所周知，pom部分被在血液中循環(huán)的磷酸酶代謝。環(huán)吡酮-pom前藥的完全代謝形成環(huán)吡酮。在向小鼠給予iv環(huán)吡酮-pom前藥后，與iv推注給予環(huán)吡酮胺相比，環(huán)吡酮是完全生物可利用的。環(huán)吡酮-pom前藥在小鼠中的藥代動力學(xué)研究208-02.在小鼠中口服和靜脈內(nèi)給予環(huán)吡酮-pom前藥后環(huán)吡酮的生物利用度。在小鼠中在給予環(huán)吡酮-pom前藥和環(huán)吡酮胺后確定環(huán)吡酮-pom前藥的藥代動力學(xué)原理論證，其中向每處理組的每治療時(shí)間點(diǎn)的六只小鼠分別口服和靜脈內(nèi)給予30mg/kg和10mg/kg的劑量。本研究的目的是表征cpx-pom代謝的速度和程度，并評估口服環(huán)吡酮-pom前藥的可行性，以支持未來的癌癥原理論證研究?？诜挽o脈注射環(huán)吡酮-pom前藥后，血漿中未檢測到所述前藥。此外，與iv給予環(huán)吡酮胺相比，iv給予環(huán)吡酮-pom前藥后的環(huán)吡酮的auc為137％，這證明所述前藥不僅快速而且完全的代謝成環(huán)吡酮(推測是通過血漿磷酸酶)。給予環(huán)吡酮胺(21％)和環(huán)吡酮-pom前藥(12％)后的環(huán)吡酮的口服生物利用度低，表明與該給藥途徑相關(guān)的顯著的首過效應(yīng)。圖12a顯示給予10mg/kgiv環(huán)吡酮胺(cpx-o),10mg/kgiv環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom),30mg/kgpocpx-o和30mg/kgpocpx-pom后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布。表1a總結(jié)了所得的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)。表1a.單劑量iv和口服cpx-o和cpx-pom后，雄性c57/b16小鼠中的血漿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)處理cpx-oivcpx-pomivcpx-o口服cpx-pom口服平均體重(kg)0.0200.0200.0200.020cpx劑量(mg/kg)b10103030c0(ng/ml)11338cmax(ng/ml)8005548520tmax(hr)0.0830.250.25kel(hr-1)1.1361.8900.5490.496t1/2(hr)0.6100.3671.261.40auc0∫n(ng*hr/ml)15332183821476auc0∫∞(ng*hr/ml)15442213957575aumc0∫n(ng*hr2/ml)358aumc0∫∞(ng*hr2/ml)401mrt(hr)0.259cl(ml/hr/kg)6475vdz(ml/kg)5700vss(ml/kg)1680f(％)d13720.612.4an＝每次處理每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只小鼠b所給予的環(huán)吡酮游離酸的劑量,將cpx-o配制在25mm磷酸鹽緩沖液ph7(含有50mm)中，強(qiáng)度為2.0mg/mlcpx；將cpx-pom二鈉鹽配制在25mm磷酸鹽緩沖液ph7中,強(qiáng)度為2.69mg/mlcc0對應(yīng)于從非參數(shù)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析得出的iv推注給藥后的y截距值d使用cpx-oiv作為參照處理確定的絕對生物利用度研究11177.在小鼠中ip給予后環(huán)吡酮-pom前藥的絕對生物利用度。在小鼠中,在10mg/kgiv和50mg/kgip給予環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)后，表征環(huán)吡酮(cpx)的血漿和尿液藥代動力學(xué)。本研究的目的是表征環(huán)吡酮-pom前藥在ip給予后的絕對生物利用度，以支持在膀胱癌驗(yàn)證模型中進(jìn)行的臨床前原理論證研究中的ip給藥。此外，我們將cpx和環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)的尿排泄進(jìn)行表征以描述ip給予cpx-pom后泌尿道向cpx的暴露。將兩個(gè)處理組每組30c57bl/6小鼠用cpx-pom處理。給藥后6個(gè)小時(shí)之前和之后，在每個(gè)選定的血漿采集時(shí)間點(diǎn)處死3只動物。通過心臟穿刺收集血液(血漿)進(jìn)行生物分析。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)將血漿匯集。另外，向兩組六只小鼠分別給予10mg/kgiv和50mg/kgipcpx-pom以表征尿液藥代動力學(xué)。將小鼠置于代謝籠中，并在給藥后24小時(shí)收集尿液(0-8小時(shí)和8-24小時(shí)尿液收集間隔)。與血漿一樣，從六只動物收集的尿樣被匯集用于生物分析。所述10mg/kgiv和50mg/kgip單劑量cpx-pom是良好耐受的。ipcpx-pom的絕對生物利用度為65％。與之前的藥代動力學(xué)原理論證研究一致，在任一種處理后，cpx-pom在25ng/ml的bql時(shí)在血漿中是檢測不到的。如圖12b中所示，在iv和ip給予cpx-pom后實(shí)現(xiàn)了cpx的廣泛全身暴露。在iv推注給予10mg/kg的cpx-pom后，觀察到血漿cpx峰濃度值8,098ng/ml(39μm)，超出體外ic50值數(shù)倍。在ip給予50mg/kgcpx-pom后，在給藥后的0.25小時(shí)觀察到4,127ng/ml(10.0μm)的cmax值。鑒于在非肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系和肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系中體外ic50值為2μm(414ng/ml)，因此50mg/kgipcpx-pom實(shí)現(xiàn)的cpxcmax值是ic50的五倍。所得的血漿藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)總結(jié)在表2a中。與以前的研究208-02一致，ip給藥后cpx的表觀消除速度迅速，平均血漿終末半衰期小于1小時(shí)(0.88小時(shí))。本研究中iv給予cpx-pom后cpx的全身清除率在小鼠中為7,605ml/hr/kg。iv給予cpx-pom后cpx的分布體積在小鼠中為中度的，為約9.0l/kg，同樣大于先前的小鼠研究。圖12b顯示了在向每個(gè)治療組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三只小鼠給予10mg/kgiv和50mg/kgipcpx-pom后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布。表2a.單次iv和ip劑量的cpx-pom后c57/b16小鼠的血漿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)an＝每次治療的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只小鼠b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量,將cpx-pom二鈉鹽配制在25mm磷酸鹽緩沖液ph7中，強(qiáng)度為2.69mg/mlcc0對應(yīng)于從非參數(shù)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析得出的iv推注給藥后的y截距值在10mg/kgiv和50mg/kgipcpx-pom后，在小鼠中獲得的尿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)總結(jié)在下表3a中。在單次iv和ip劑量的cpx-pom后，少于1％的劑量被作為cpx排泄。然而，尿cpx濃度超過體外ic50值(2μm)數(shù)倍。與iv給藥途徑相反，ip給予后，在給藥后整個(gè)24小時(shí)內(nèi)觀察到顯著的cpx尿濃度。cpx-pom劑量的23％至26％作為環(huán)吡酮的無活性葡萄糖醛酸苷代謝物被排泄。表3a.單劑量iv和ipcpx-pom后，雄性c57/b16小鼠中的cpxc和cpx-gc的藥代動力學(xué)參數(shù)an＝每次處理6只小鼠b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量，cpx-pom二鈉可注射制劑，含有5mg/mlcpx的于具有50mm的25mm磷酸酯ph7中c環(huán)吡酮(cpx)；環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)研究11206.在小鼠中單次和重復(fù)ip給藥后環(huán)吡酮-pom前藥的尿液藥代動力學(xué)在小鼠中，在向三個(gè)獨(dú)立組每組6只小鼠以單次(1天)和重復(fù)(10天)(每天一次連續(xù)10天)劑量給予50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)后表征尿環(huán)吡酮(cpx)的藥代動力學(xué)，總結(jié)在下表3b中。進(jìn)行本研究以支持在膀胱癌驗(yàn)證模型中進(jìn)行的體內(nèi)臨床前原理論證研究，其通過證明在按照一定范圍每天一次ip劑量給予cpx-pom前藥后，環(huán)吡酮在尿液中的暴露。在單次和重復(fù)劑量的ip給予50mg/kg,100mg/kg和200mg/kgcpx-pom后，小于1％的劑量被作為cpv經(jīng)24小時(shí)排泄。盡管作為環(huán)吡酮的劑量回收百分比低，但是，在整個(gè)劑量范圍內(nèi)，尿cpx濃度超過體外ic50值(2μm)數(shù)倍。在本研究中收集的任何尿樣中未檢測到cpx-pom，表明前藥完全代謝。在整個(gè)劑量范圍內(nèi)，所給予的劑量的很大一部分被作為無活性環(huán)吡酮葡糖苷酸代謝產(chǎn)物消除了。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，選擇100mg/kg和200mg/kg環(huán)吡酮-pom前藥的亞慢性ip劑量方案，用于隨后在膀胱癌驗(yàn)證模型中進(jìn)行原理論證研究。表3b.在單次和每日一次重復(fù)ip劑量的cpx-pom后，雄性c57/b16小鼠中的尿cpxc和cpx-gc的藥代動力學(xué)參數(shù)an＝每處理組6只小鼠b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量,cpx-pom二鈉可注射制劑，含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的20mg/mlcpx，每天一次ip給予，連續(xù)10天c環(huán)吡酮(cpx)；環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)d作為cpx-g排泄的劑量部分，將其相對分子量進(jìn)行校正在大鼠中的環(huán)吡酮-pom前藥的藥代動力學(xué)研究10954.靜脈內(nèi)給予環(huán)吡酮-pom前藥后，環(huán)吡酮在大鼠中的生物利用度。iv給予10mg/kg環(huán)吡酮胺(cpx-o)和環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)后，在大鼠中表征環(huán)吡酮(cpx)的血漿和尿液藥代動力學(xué)。在該物種中，在表征iv環(huán)吡酮-pom前藥后的環(huán)吡酮的生物利用度中將靜脈內(nèi)環(huán)吡酮胺用作參照。鑒于給予cpx-o和cpx-pom后在小鼠中觀察到低的cpx的口服生物利用度，因此本研究未對該給藥途徑進(jìn)行研究。iv給予cpx-pom和cpx-o后得到的平均血漿環(huán)吡酮濃度-時(shí)間分布如圖13a所示。iv給予兩種處理后，血漿環(huán)吡酮濃度迅速下降，表觀消除半衰期小于1小時(shí)。所得的血漿環(huán)吡酮藥代動力學(xué)參數(shù)總結(jié)在表4a中。在iv給予cpx-pom后，與靜脈內(nèi)給予環(huán)吡酮胺相比，cpx的全身利用度為77％。在iv推注給藥的幾分鐘內(nèi)收集的少數(shù)血液樣品中觀察到前藥的血漿濃度，但是在大多數(shù)收集的樣品中，我們未能檢測到cpx-pom。在收集的任何尿液樣本中未檢測到cpx-pom。在iv給予10mg/kgcpx-pom后，實(shí)現(xiàn)了廣泛的全身暴露于cpx，其中緊跟iv推注給予后的平均初始血漿環(huán)吡酮濃度為9,310ng/ml。鑒于在非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系中2μm(414ng/ml)的體外ic50值，10mg/kgivcpx-pom獲得的cmax值(cmax＝45μm)為ic50的大約二十倍。圖13a顯示了每個(gè)治療組的6只大鼠給予10mg/kgivcpx-pom和cpx-o的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間半對數(shù)分布。表4a.單次iv劑量的cpx-pom和cpx-o后，雄性sprague-dawley大鼠中的血漿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)處理acpx-pomcpx-o平均體重(kg)0.26±0.010.27±0.01cpx劑量(mg/kg)b9.12±0.0510.00±0.06c0(ng/ml)9.310±5,25125,883±13,321kel(hr-1)1.580±0.2861.453±0.634t1/2(hr)0.452±0.0870.615±0.404auc0∫n(ng*hr/ml)2,121±5013,077±427auc0∫∞(ng*hr/ml)2,161±4773,141±349aumc0∫n(ng*hr2/ml)827±275947±608aumc0∫∞(ng*hr2/ml)950±2291,291±1,206mrt(hr)0.455±4770.446±0.474cl(ml/hr/kg)4,060±3993,225±374vdz(ml/kg)2,664±6702,983±2,319vss(ml/kg)1,853±8991,563±1,853f(％)77.0an＝每次處理6只大鼠b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量,cpx-pom二鈉可注射制劑，其含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的5mg/mlcpxcc0對應(yīng)于從非參數(shù)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析得出的y截距值在10mg/kgivcpx-o和cpx-pom后，在大鼠中獲得的尿cpx藥動學(xué)參數(shù)總結(jié)在下表5a中。在單次iv劑量的cpx-pom和cpx-o后，少于1％的劑量被作為cpx排泄。然而，尿cpx濃度超過體外ic50值(2μm)。表5a.在單劑量ivcpx-pom和cpx-o后，在雄性sprague-dawley大鼠中的尿cpxc和cpx-gc藥代動力學(xué)參數(shù)處理cpx-pomcpx-o平均體重(kg)a0.252±0.0060.238±0.006cpx劑量(mg/kg)b9.06±0.029.98±0.07ucpx0-8hr(ng/ml)1,182±498921±112ucpx8-24hr(ng/ml)198±172118±45ucpx0-8hr(μm)4.45±0.548.79±2.41ucpx8-24hr(μm)1.22±0.322.64±1.13dxe/dtcpx0-8hr(μg/hr)0.23±0.090.76±0.26dxe/dtcpx8-24hr(μg/hr)0.07±0.010.13±0.04xecpx(μg)2.88±0.788.18±2.90fecpx(％)0.13±0.030.34±0.12clr(ml/hr)1.272.60clr(ml/hr/kg)5.040.92fecpx-g(％)27.75±10.0217.58±2.46an＝4只大鼠，它們以完全、非隨機(jī)、交叉方式接受全部三種處理b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量,cpx-pom二鈉可注射制劑，其含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的5mg/mlcpxc環(huán)吡酮(cpx)；環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)研究11428.皮下給予環(huán)吡酮-pom前藥和口服環(huán)吡酮胺后在大鼠中環(huán)吡酮的生物利用度.iv給予20mg/kg環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)、皮下(sq)給予30mg/kgcpx-pom和口服給予30mg/kg環(huán)吡酮胺(cpx-o)后，表征大鼠中環(huán)吡酮(cpx)的血漿和尿液藥代動力學(xué)。在該物種中，在表征sq環(huán)吡酮-pom前藥后的環(huán)吡酮的生物利用度中將靜脈內(nèi)cpx-pom用作參照。測定了在給予乙醇胺鹽后cpx的口服生物利用度，以建立可注射的cpx-pom與由hoechstag產(chǎn)生的(通過為支持乙醇胺局部抗真菌產(chǎn)品進(jìn)行的注冊研究)臨床前安全性數(shù)據(jù)之間的藥代動力學(xué)“橋”。給予iv和sqcpx-pom以及口服給予環(huán)吡酮胺后，所得到的平均血漿環(huán)吡酮濃度-時(shí)間分布如圖13b所示。與研究10954一致，iv給予cpx-pom后血漿環(huán)吡酮濃度迅速下降，其中表觀消除半衰期小于1小時(shí)。由sqcpx-pom產(chǎn)生的血漿環(huán)吡酮濃度-時(shí)間分布與ivcpx-pom明顯不同?？诜o予環(huán)吡酮的乙醇胺鹽后的血漿環(huán)吡酮濃度相對較低。所得的血漿環(huán)吡酮藥代動力學(xué)參數(shù)總結(jié)在表6a中。sqcpx-pom與ivcpx-pom相比表現(xiàn)出優(yōu)異的生物利用度，為80％。iv和sq給予的cpx-pom導(dǎo)致的血漿環(huán)吡酮濃度超過體外ic50值(2μm)數(shù)倍?？诜o予乙醇胺鹽后，環(huán)吡酮的血漿環(huán)吡酮濃度相當(dāng)?shù)?。與ivcpx-pom相比，口服給藥的該鹽形式的絕對生物利用度為4.6％。在本研究中收集的任何血液或尿液樣本中未檢測到cpx-pom。圖13b顯示了在給予20mg/kgivcpx-pom，30mg/kgsqcpx-pom和30mg/kgcpx-o至每處理組的六只大鼠后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布。表6a.單次劑量ivcpx-pom，sqcpx-pom和口服cpx-o后，雄性sprague-dawley大鼠中的血漿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)an＝每次處理6只大鼠b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量，cpx-pom二鈉可注射制劑，其含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的5mg/mlcpxc對應(yīng)于從非參數(shù)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析得出的y截距值在20mg/kgivcpx-pom，30mg/kgsqcpx-pom和30mg/kg口服cpx-o后，在大鼠中獲得的尿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)總結(jié)在下表7a中。與口服給予的cpx-o相比，iv和sq給予cpx-pom導(dǎo)致較高的環(huán)吡酮尿濃度。iv和sqcpx-pom劑量在這些動物中耐受性良好，并且導(dǎo)致尿的環(huán)吡酮濃度超過體外ic50值數(shù)倍。sqcpx-pom導(dǎo)致環(huán)吡酮顯著的全身和泌尿道暴露。表7a.單劑量ivcpx-pom，sqcpx-pom和口服cpx-o后，在雄性sprague-dawley大鼠中的尿cpxc和cpx-gc藥代動力學(xué)參數(shù)an＝4只大鼠，它們以完全、非隨機(jī)、交叉方式接受全部三種處理b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量,cpx-pom二鈉可注射制劑，其含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的5mg/mlcpxc環(huán)吡酮(cpx)；環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)在狗中的環(huán)吡酮-pom前藥藥代動力學(xué)研究10953.在狗中靜脈內(nèi)給予環(huán)吡酮-pom前藥后的環(huán)吡酮的生物利用度。iv給予10mg/kg環(huán)吡酮胺(cpx-o)和環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)后，對狗中環(huán)吡酮(cpx)的血漿和尿液藥代動力學(xué)進(jìn)行表征。在該物種中，在表征iv環(huán)吡酮-pom前藥后的環(huán)吡酮的生物利用度中，將靜脈內(nèi)環(huán)吡酮胺用作參照。鑒于給予cpx-o和cpx-pom后在小鼠中觀察到低的cpx的口服生物利用度，因此本研究未對該給藥途徑進(jìn)行研究。圖14示出了向四只雄性比格犬給予3mg/kgivcpx-pom和cpx-o后的平均血漿cpx濃度-時(shí)間分布。在iv給予cpx-pom后，cpx的全身利用度為85％。在iv推注給藥后幾分鐘內(nèi)，在極少數(shù)血液樣本中檢測到血漿cpx-pom濃度，然而，在大多數(shù)所測定的血漿樣品中未檢測到所述前藥。在任何尿液樣本中都未檢測到cpx-pom。ivcpx-pom后，活性劑環(huán)吡酮的絕對生物利用度優(yōu)異，其值為85％，其中以ivcpx-o作為參照。3mg/kg的前藥iv劑量實(shí)現(xiàn)的平均初始血漿環(huán)吡酮濃度為2,907ng/ml，其相當(dāng)于14μm。鑒于在非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系中2μm的體外ic50值(414ng/ml)，觀察到的平均cmax值為所述ic50的大約七倍。圖14顯示了向4只雄性比格犬給予3mg/kgivcpx-pom和cpx-o后的平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布。表8a.單次iv劑量的cpx-pom和cpx-o后，雄性比格犬中的血漿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)處理cpx-pomcpx-o平均體重(kg)a9.65±0.389.64±0.34ivcpx劑量(mg/kg)b2.82±0.013.10±0.02c0(ng/ml)c2,970±9695,996±1,387kel(hr-1)0.242±0.0300.185±0.019t1/2(hr)2.90±0.3293.77±0.40auc0∫n(ng*hr/ml)2,571±4363,314±655auc0∫∞(ng*hr/ml)3,075±5914,008±802aumc0∫n(ng*hr2/ml)5,485±1,2937,293±1,520aumc0∫∞(ng*hr2/ml)11,680±3,68216,665±3,972mrt(hr)3.74±0.582.20±0.09cl(ml/hr/kg)1,006±209777.2±192.5vdz(ml/kg)4,133±3634,253±1,266vss(ml/kg)3,686±4313,218±810f(％)85.1±9.69an＝4只狗以完全、交叉的研究設(shè)計(jì)接受處理，在每次處理前對動物進(jìn)行稱重以確定所給予的劑量體積，并因此確定每次處理在體重上的輕微差異b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量，cpx-pom二鈉可注射制劑，其含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的5mg/mlcpxcc0對應(yīng)于從非參數(shù)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析得出的y截距值在3mg/kgivcpx-o和cpx-pom后，在狗中獲得的尿cpx藥動學(xué)參數(shù)總結(jié)在下表9a中。在單次iv劑量的cpx-pom和cpx-o后，少于1％的劑量被作為cpx排泄。然而，在cpx-pom和cpx-o的3mg/kgiv劑量下，尿cpx濃度超過了體外ic50值(2μm)。無活性環(huán)吡酮葡糖苷酸代謝物代表了在尿中排泄的主要物質(zhì)。表9a.單次iv劑量的cpx-pom和cpx-o后，雄性比格犬中的尿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)處理cpx-pomcpx-o平均體重(kg)a9.65±0.389.64±0.34cpx劑量(mg/kg)b2.82±0.013.10±0.02ucpx0-8hr(ng/ml)838±1491,006±370ucpx8-24hr(ng/ml)112.0±56.172.5±54.5ucpx0-8hr(μm)4.04±0.724.86±1.79ucpx8-24hr(μm)0.541±0.2710.350±0.263dxe/dtcpx0-8hr(μg/hr)9.88±0.3.8912.58±5.61dxe/dtcpx8-24hr(μg/hr)0.97±0.190.43±0.42xecpx(μg)94.5±32.6107.5±39.9fecpx(％)0.345±0.1110.358±0.123clr(ml/hr)31.90±18.2526.43±9.63clr(ml/hr/kg)3.284±1.8102.730±0.916fecpx-g(％)51.11±5.3162.67±12.15an＝4只狗，以完全、交叉的研究設(shè)計(jì)接受處理，在每次處理前對動物進(jìn)行稱重以確定所給予的劑量體積，并因此確定每次處理在體重上的輕微差異b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量，cpx-pom二鈉可注射制劑，含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的5mg/mlcpx研究11429.在狗中皮下給予環(huán)吡酮-pom前藥和口服環(huán)吡酮胺后環(huán)吡酮的生物利用度.iv給予3mg/kg環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)，皮下(sq)給予9mg/kgcpx-pom和口服給予9mg/kg環(huán)吡酮胺(cpx-o)后，對狗中的環(huán)吡酮(cpx)的血漿和尿液藥代動力學(xué)進(jìn)行表征。在該物種中，在表征sq環(huán)吡酮-pom前藥后的環(huán)吡酮的生物利用度中，將靜脈內(nèi)cpx-pom用作參照。測定了在給予乙醇胺鹽后cpx的口服生物利用度，以建立可注射的cpx-pom與由hoechstag產(chǎn)生的(通過為支持乙醇胺局部抗真菌產(chǎn)品進(jìn)行的注冊研究)臨床前安全性數(shù)據(jù)之間的藥代動力學(xué)“橋”。向狗給予iv和sqcpx-pom以及口服給予環(huán)吡酮胺后得到的平均血漿環(huán)吡酮濃度-時(shí)間分布如圖15所示。與研究10953一致，iv給予cpx-pom后血漿環(huán)吡酮濃度迅速下降，其中表觀消除半衰期小于1小時(shí)。由sqcpx-pom產(chǎn)生的血漿環(huán)吡酮濃度-時(shí)間分布與ivcpx-pom顯著不同。口服給予環(huán)吡酮的乙醇胺鹽后的血漿環(huán)吡酮濃度相對較低。所得血漿環(huán)吡酮藥代動力學(xué)參數(shù)總結(jié)在表10a中。sqcpx-pom與ivcpx-pom相比表現(xiàn)出優(yōu)異的生物利用度，為106％。iv和sq給予的cpx-pom導(dǎo)致血漿環(huán)吡酮濃度超過體外ic50值(2μm)數(shù)倍?？诜o予乙醇胺鹽后，環(huán)吡酮的血漿環(huán)酮濃度相當(dāng)?shù)汀Ｅcivcpx-pom相比，口服給予的該鹽形式的絕對生物利用度為17.4％。在本研究中收集的任何血液或尿液樣本中未檢測到cpx-pom。圖15顯示了在給予3mg/kgivcpx-pom、9mg/kgsqcpx-pom和9mg/kg口服cpx-o至4只雄性比格犬后，平均血漿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間直線分布。表10a.單劑量ivcpx-pom、sqcpx-pom和口服cpx-o后，雄性比格犬中的血漿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)處理acpx-pomivcpx-pomsqcpx-o口服平均體重(kg)9.58±0.499.91±0.819.48±0.64cpx劑量(mg/kg)b3.10±0.029.28±0.099.39±0.04c0(ng/ml)3,770±1280ccmax(ng/ml)1,988±3741,017±271tmax(hr)0.264±0.1220.250±0.129kel(hr-1)0.153±0.0720.137±0.0310.126±0.009t1/2(hr)5.54±2.925.27±1.185.52±0.39auc0∫n(ng*hr/ml)3,622±25511,518±2,6321,901±650auc0∫∞(ng*hr/ml)5,262±124319,614±61612,697±1013aumc0∫n(ng*hr2/ml)8,836±1,186aumc0∫∞(ng*hr2/ml)38,965±29,492mrt(hr)6.76±3.76cl(ml/hr/kg)615±145vdz(ml/kg)4,486±1366vss(ml/kg)3,776±1,266f(％)106±22.3d17.4±5.65dan＝4只狗，它們以非隨機(jī)、完全、交叉的方式接受全部三種處理b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量,cpx-pom二鈉可注射制劑，其含有于25mm磷酸鹽ph7(含有50mm)中的5mg/mlcpxcc0對應(yīng)于從非參數(shù)藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析得出的y截距值d給定28％,39％和29％的auc0∫∞，使用auc0∫n確定絕對生物利用度，該絕對生物利用度由外推的auc組成在3mg/kgivcpx-pom、9mg/kgsqcpx-pom和9mg/kg口服cpx-o后，在狗中獲得的尿cpx藥代動力學(xué)參數(shù)總結(jié)在下表11a中。與口服給予的cpx-o相比，iv和sqcpx-pom給藥導(dǎo)致環(huán)吡酮的尿濃度相對較高(調(diào)整的劑量)。iv和sqcpx-pom劑量在這些動物中耐受性良好，導(dǎo)致尿的環(huán)吡酮濃度超過體外ic50值數(shù)倍。sqcpx-pom導(dǎo)致環(huán)吡酮的顯著的全身和泌尿道暴露。表11a.單劑量ivcpx-pom，sqcpx-pom和口服cpx-o后，在雄性比格犬中尿cpxd和cpx-gd的藥代動力學(xué)參數(shù)處理acpx-pomivcpx-pomsqccpx-o口服平均體重(kg)9.58±0.499.91±0.819.48±0.64cpx劑量(mg/kg)b3.10±0.029.28±0.099.39±0.04ucpx(ng/ml)0-24hr957±5082,530±9581,602±750ucpx(μm)0-24hr4.62±2.4512.2±4.67.74±3.62xecpx(μg)0-24hr208±117339±206299±208fecpx(％)0.70±0.380.38±0.240.32±0.21xe/dtcpx(μg/hr)0-8hr19.8±15.223.0±16.631.6±26.2xe/dtcpx(μg/hr)8-24hr3.10±3.339.67±9.492.90±1.70clr(ml/hr)43.2±33.6clr(ml/hr/kg)4.51+3.51fecpx-g(％)49.2±34.443.0±19.737.0±18.7an＝4只狗，它們以非隨機(jī)、完全、交叉的方式接受全部三種處理b所給予的環(huán)吡酮游離酸劑量,cpx-pom二鈉可注射制劑，其含有于25mm磷酸鹽ph7(含50mm)中的5mg/mlcpxcn＝3d環(huán)吡酮(cpx)；環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)環(huán)吡酮葡糖苷酸在膀胱癌患者尿中的體外穩(wěn)定性環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)是在給予cpx-pom以及環(huán)吡酮的乙醇胺鹽后，在小鼠、大鼠、狗和人中觀察到的主要尿代謝物。作為抗-膀胱癌藥物，cpx-g不是活性的。cpx-g被β-葡糖苷酸酶代謝形成活性環(huán)吡酮，實(shí)際上是使活性抗膀胱癌劑再活化?；谌伺判箶?shù)據(jù)[kellner等，arzneimittel-forschung.31(8a):1337-1353]以及膀胱癌患者在尿中具有增加的葡糖苷酸酶活性這樣的證據(jù)[paigen,k.,peterson,j.,paigenb.(1984)roleofurinaryβ-glucuronidaseactivityinhumanbladdercancer.cancerres44:3620-3623]，我們進(jìn)行體外代謝研究以表征從膀胱癌患者獲得的環(huán)吡酮葡糖苷酸在尿中的穩(wěn)定性(濃度為150μm)，與從健康志愿者收集的對照尿液相比。在將cpx-g于從六名nmibc患者獲得的匯集的患者尿液中孵育6小時(shí)后，膀胱癌患者尿液中的150μmcpx-g的水解，導(dǎo)致形成7.9μm環(huán)吡酮，形成率為5％。與使用健康志愿者標(biāo)本的尿液孵育相比，膀胱癌患者尿中環(huán)吡酮形成的程度大約為11.4倍。在匯集的膀胱癌患者尿液中，β-葡糖苷酸酶介導(dǎo)的環(huán)吡酮葡糖苷酸水解速率為對照尿液的5.6-11.5倍。在nmibc患者和健康志愿者獲得的尿液中，尿β-葡糖苷酸酶的活性分別為69.5u/ml和1.39u/ml(膀胱癌患者尿液中高118倍的酶活性)。膀胱癌患者尿液中cpx-g的選擇性水解導(dǎo)致活性抗癌劑環(huán)吡酮的再活化。預(yù)測iv給予環(huán)吡酮-pom前藥后人尿的環(huán)吡酮濃度口服給予于人的環(huán)吡酮胺(cpx-o)在尿液中快速且完全消除，其中87％的劑量在6小時(shí)內(nèi)排泄，和約95％的劑量在給藥的12小時(shí)內(nèi)排泄[kellner等，arzneimittel-forschung.31(8a):1337-1353]。在尿中回收的95％的劑量中，83％被鑒定為環(huán)吡酮(4％)和環(huán)吡酮葡糖苷酸(79％)。cpx葡糖苷酸在體外不具有活性。我們根據(jù)以下假設(shè)模擬尿環(huán)吡酮(cpx)濃度-時(shí)間數(shù)據(jù):32mg/m2靜脈內(nèi)劑量的環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)是良好耐受的(注意，80mg/m2的口服cpx-o當(dāng)每天一次給予時(shí)是良好耐受的)；32mg/m2靜脈內(nèi)劑量的cpx-pom中的百分之四被作為環(huán)吡酮排泄，類似于給予單一口服劑量的10mgc14cpx-o后的cpx百分比；在膀胱癌患者中，百分之五的cpx-g被水解為cpx；并且新確診的膀胱癌患者的常見尿液生成率為1ml/hr/kg。圖18顯示在本發(fā)明尿液中和對照尿中自前藥形成環(huán)吡酮。另見圖19-20。全身給予環(huán)吡酮-pom前藥選擇性地將cpx遞送至整個(gè)泌尿道基于這些假設(shè)，我們預(yù)測，在非肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系中，iv和sq給予環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)所導(dǎo)致的尿cpx濃度超過體外ic50值的數(shù)倍。cpx-pom的可注射給藥途徑優(yōu)于口服給藥，從而避免胃腸道毒性以及差的口服生物利用度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，每天四次給藥的口服環(huán)吡酮胺(cpx-o)導(dǎo)致劑量限制性胃腸道毒性(minden等，amjhematol89(4):363-368,2014)。已經(jīng)進(jìn)行了體外研究以了解環(huán)吡酮作為治療nmibc和mibc的有效和新型治療劑的作用。分別對人nmibc和mibc細(xì)胞系253jbv和t24進(jìn)行了充分表征。由于細(xì)胞培養(yǎng)基缺乏將cpx-pom代謝為環(huán)吡酮(cpx)所必需的酶(磷酸酶)，因此通過向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入cpx-o使膀胱癌細(xì)胞系暴露于cpx來進(jìn)行作用機(jī)制的研究。為了確定cpx對t24(mibc)和253-jbv(nmibc)細(xì)胞中膀胱癌細(xì)胞增殖的影響，將每孔5000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板上并生長過夜。然后用增加劑量的cpx在含有10％fbs的rpmi培養(yǎng)基中處理細(xì)胞。處理期后細(xì)胞增殖的分析通過己糖胺酶測定法進(jìn)行估計(jì)。簡言之，除去培養(yǎng)基，加入于檸檬酸鹽緩沖液ph5(7.5mm)，對硝基苯酚-n-乙?；?β-d-氨基葡萄糖苷酶(sigmaaldrich)中的己糖胺酶底物溶液，每孔75μl。將板在37℃，100％濕度下孵育30分鐘。用112.5μl含有5mmedta(ph10.4)的50mm甘氨酸終止反應(yīng)。在405nm測量吸光度。以n＝6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后重復(fù)至少三次。將數(shù)據(jù)作為對照的百分比進(jìn)行分析，其中對照孔只用當(dāng)量的dmso處理。對于ic50計(jì)算，產(chǎn)生藥物濃度和氨基己糖苷酶活性之間的曲線，數(shù)據(jù)線性或指數(shù)擬合。最佳擬合用于進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)。通過測定在處理48小時(shí)后導(dǎo)致50％細(xì)胞死亡的化合物的濃度來獲得ic50。環(huán)吡酮在nmibc和mibc中表現(xiàn)出抗癌活性:已發(fā)現(xiàn)，環(huán)吡酮(cpx)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。圖9,10和11顯示，cpx抑制膀胱癌細(xì)胞系的增殖。將細(xì)胞與指定劑量的化合物孵育長達(dá)72小時(shí)。cpx處理導(dǎo)致t24和253jbv細(xì)胞中細(xì)胞增殖的劑量和時(shí)間依賴性降低。如圖9和11所示，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cpx以劑量和時(shí)間依賴的方式顯著抑制細(xì)胞系的增殖。在24小時(shí)內(nèi)觀察到這種效果，其在接下來的48小時(shí)內(nèi)仍然持續(xù)。對于253jbv和t24細(xì)胞，化合物的ic50值在48小時(shí)時(shí)分別為2和4μm。環(huán)吡酮在2維和3維模型系統(tǒng)中抑制膀胱癌生長:我們接下來使用集落生成測定法確定環(huán)吡酮(cpx)對膀胱癌細(xì)胞的長期作用。對于該測定，將6孔板用500個(gè)活細(xì)胞接種，并使其生長過夜。然后將細(xì)胞在存在或不存在各種濃度(1和5μm)的cpx下孵育48小時(shí)。然后除去含cpx的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在pbs中洗滌并在完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)10天。每次處理一式三份進(jìn)行。所獲得的菌落用pbs洗滌并在室溫下在10％福爾馬林中固定10分鐘，然后用pbs洗滌，接著用結(jié)晶紫染色。將菌落與未處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。如圖19-20所示，與對照相比，cpx抑制菌落的數(shù)量和大小，表明將細(xì)胞用化合物短期孵育對細(xì)胞的活力具有長期的抑制作用。圖19-20顯示cpx抑制膀胱癌細(xì)胞生長。將t24和253-jbv膀胱癌細(xì)胞鋪板并用ic50濃度的cpx(指示劑量)處理48小時(shí)。更換新鮮培養(yǎng)基并使其生長10天。將菌落用結(jié)晶紫染色，并與未處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。環(huán)吡酮抑制膀胱癌球狀體:最近的研究已經(jīng)證明了腫瘤中的異質(zhì)性，并且在腫瘤內(nèi)發(fā)生少量干細(xì)胞，其具有自我更新能力并具有產(chǎn)生分化后代的能力。球狀體測定法有時(shí)也被稱為3d測定法，作為在體外傳播上皮干細(xì)胞的方法而開發(fā)，現(xiàn)在是干細(xì)胞活性的標(biāo)準(zhǔn)替代報(bào)告物。該測定(在這種情況下稱為bladdosphere測定)是基于這樣的假設(shè)，即在膀胱癌中存在的獨(dú)特的未分化細(xì)胞將在懸浮培養(yǎng)中存活，而其他細(xì)胞將通過失巢凋亡而死亡。因此，我們在bladdosphere測定中表征環(huán)吡酮(cpx)的作用。這里，將癌細(xì)胞鋪板在超低結(jié)合板中，所得的球狀體被認(rèn)為代表來自干細(xì)胞的生長。為了形成球狀體，將細(xì)胞在rpmi1640(mediatech)中培養(yǎng)，所述rpmi1640(mediatech)補(bǔ)充有20ng/mlbfgf(invitrogen)(10ml，每500ml50xb27補(bǔ)充劑(invitrogen)，egf20ng/ml(invitrogen))和抗生素和抗真菌溶液。將細(xì)胞以低密度(5000細(xì)胞/ml)接種在6孔低粘附板中。用增加濃度的cpx(從細(xì)胞增殖測定計(jì)算的ic50的0.5x，1x，2x-對于253jbv為2μm，和對于t24為4μm)處理細(xì)胞。7天后，拍攝球狀體(第一代)。收集對照球狀體和用cpx處理的球狀體(1xic50)，胰蛋白酶消化和再次鋪板進(jìn)行次級球形體生長(ii代)，然后進(jìn)行第三級球狀體發(fā)育(iii代)。圖21顯示cpx抑制膀胱癌球狀體。將細(xì)胞接種在超低附著板中并用cpx處理并與指定劑量的化合物一起孵育。cpx處理導(dǎo)致t24和253-jbv膀胱癌細(xì)胞(i代)形成的球狀體的大小和數(shù)量的顯著減少。cpx處理也顯著減少次級和第三級球狀體的生長。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖21所示，證明當(dāng)用cpx處理細(xì)胞時(shí)，t24和253jbv膀胱癌細(xì)胞球狀體的球狀體大小和數(shù)量顯著減少。次級和第三級球狀體發(fā)育被cpx處理顯著抑制。這些數(shù)據(jù)表明該化合物影響膀胱癌內(nèi)的癌干細(xì)胞。也參見圖10。環(huán)吡酮阻滯處在細(xì)胞周期s期的細(xì)胞:進(jìn)行基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞周期分析研究以確定環(huán)吡酮(cpx)對t24細(xì)胞中細(xì)胞周期進(jìn)程的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。研究表明cpx誘導(dǎo)s-期細(xì)胞周期停滯(數(shù)據(jù)未顯示)。在1xic50和2xic50濃度下，cpx在g0/g1期阻滯細(xì)胞。用cpx處理細(xì)胞，并進(jìn)行基于流式細(xì)胞儀的分析。cpx處理顯著增加在s期和g0/g1-期被阻滯的細(xì)胞的百分比。經(jīng)確定，cpx誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們接下來確定化合物是否可以通過凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。為此，我們用cpx(4μm)處理t24膀胱癌細(xì)胞，并用fitc綴合的膜聯(lián)蛋白v標(biāo)記細(xì)胞以檢測凋亡細(xì)胞。結(jié)果如圖22所示，表明cpx處理具有高水平的fitc+細(xì)胞，這意味著cpx誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。圖22顯示cpx在膀胱癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。將細(xì)胞與指定劑量的化合物一起孵育長達(dá)48小時(shí)。cpx處理導(dǎo)致t24細(xì)胞中細(xì)胞死亡的顯著增加，從膜聯(lián)蛋白v-fitc標(biāo)記的細(xì)胞的增加可以看出這一點(diǎn)。環(huán)吡酮影響癌干細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑:我們進(jìn)行了rt-pcr陣列分析，作為初步研究，以確定受環(huán)酮(cpx)影響的途徑。使用rt2profilertmpcr陣列(sabiosciences,frederick,md,usa)按制造商的說明進(jìn)行表達(dá)分析。使用人類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)現(xiàn)者聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)陣列(目錄號pahs-014za)。簡言之，使用trizol反應(yīng)物從t24細(xì)胞分離的總rna在隨機(jī)六核苷酸引物(均來自invitrogen，carlsbad，ca)的存在下用superscriptii逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄。將互補(bǔ)dna(2μg)與1,275μlrt2sybrgreenqpcrmastermix(pa-010；sabiosciences)混合，構(gòu)成總體積為2,550μl。每孔接受25μl所述混合物。根據(jù)sabiosciences推薦的檢測方案，在bio-radcfx機(jī)上進(jìn)行qpcr。mrna表達(dá)的變化表示為相對于對照的倍數(shù)變化。圖23a-23c顯示cpx抑制csc信號傳導(dǎo)途徑。cpx處理顯著降低notch及其下游信號傳導(dǎo)蛋白的mrna表達(dá)。此外，cpx抑制t24細(xì)胞中參與wnt和hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的基因的表達(dá)。如圖23a-23c所示，cpx處理顯著降低參與csc信號傳導(dǎo)途徑如notch，wnt和hedgehog的基因的表達(dá)(mrna水平)。環(huán)吡酮影響notch信號傳導(dǎo)途徑:我們進(jìn)行了rt-pcr陣列分析，以確定受環(huán)吡酮(cpx)影響的途徑。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，cpx處理影響了notch信號傳導(dǎo)途徑。當(dāng)配體與相鄰細(xì)胞上的notch跨膜受體相互作用時(shí)，引發(fā)notch信號傳導(dǎo)。這引發(fā)了notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(nicd)的γ-分泌酶介導(dǎo)的蛋白水解釋放，nicd隨即轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與其轉(zhuǎn)錄輔因子cbf1/rbpj相互作用，并反式激活靶基因，導(dǎo)致增殖和轉(zhuǎn)移增加。notch信號傳導(dǎo)已被證明在癌癥干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且早期研究表明，抑制notich途徑可能是基于干細(xì)胞的治療的良好機(jī)制。以前的研究表明，高水平的notch1活性與膀胱癌腫瘤進(jìn)展相關(guān)，notch1可能是治療膀胱癌的潛在治療靶點(diǎn)。進(jìn)行western印跡研究以檢測cpx對參與notch信號傳導(dǎo)途徑的蛋白的表達(dá)的影響。將細(xì)胞裂解物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并印跡到immobilon聚偏氟乙烯膜上(millipore,bedford,ma,usa)?？贵w購自cellsignalingtechnology(beverly,ma,usa),abcaminc.(cambridge,ma,usa)和santacruzbiotechnologyinc.(santacruz,ca,usa)，并且通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測特異性蛋白質(zhì)(gehealthcare,piscataway,nj,usa)。用cpx膀處理胱癌細(xì)胞系顯著抑制早老素1，nicastrin，aph-1和pen-2等γ-分泌酶復(fù)合物蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致經(jīng)切割的活化notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(nicd1)的降低。cpx還減少了jagged1，一種notch受體的配體。此外，cpx處理后，包括hes1和細(xì)胞周期蛋白-d1在內(nèi)的途徑的下游靶標(biāo)的水平也顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明cpx顯著抑制notch細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑蛋白，從而抑制csc生長。見圖16-17。圖16-17顯示cpx抑制notch1信號傳導(dǎo)和γ-分泌酶復(fù)合物蛋白。cpx處理顯著降低notch1活化及其配體jagged1。其也減少了下游靶蛋白hes-1和細(xì)胞周期蛋白d1。此外，cpx在t24細(xì)胞中抑制γ-分泌酶復(fù)合物蛋白早老素1，nicastrin，aph-1和pen-2的表達(dá)。右側(cè)顯示notch信號傳導(dǎo)途徑。環(huán)吡酮通過使γ-分泌酶復(fù)合物失活來抑制細(xì)胞生長:我們確定nicd的異位表達(dá)是否逆轉(zhuǎn)環(huán)吡酮(cpx)介導(dǎo)的對細(xì)胞增殖的抑制。對于本研究，用編碼notch-1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(nicd)的質(zhì)粒ef.hicn1.cmv.gfp或空載體ef.v-cmv.gfp(addgeneinc.)轉(zhuǎn)染t24細(xì)胞，隨后用cpx(4μm)處理。使用己糖胺酶測定檢測細(xì)胞增殖。western印跡分析顯示，在t24細(xì)胞系中nicd異位表達(dá)后notch-1的表達(dá)增加。nicd的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)cpx介導(dǎo)的對細(xì)胞增殖的抑制。這些數(shù)據(jù)表明cpx抑制γ-分泌酶復(fù)合物，從而影響notch信號傳導(dǎo)。notch-1表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，并且涉及侵襲性膀胱移行細(xì)胞癌的致癌作用和進(jìn)展(jclinoncol30，2012(suppl5；摘要299))。有人提出，notch-1代表治療膀胱癌的治療靶點(diǎn)(oncogene(2008)27,5132-5137)。notch-1信號傳導(dǎo)也可能代表nmibc進(jìn)展成mibc的潛在診斷標(biāo)志(jclinoncol30，2012(suppl5；abstr299))。我們實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明cpx通過抑制notch-1信號傳導(dǎo)途徑體外抑制膀胱癌生長。圖24顯示cpx通過使γ-分泌酶復(fù)合物蛋白失活來抑制細(xì)胞生長。用cpx處理表達(dá)nicd的細(xì)胞，隨后測定其增殖。nicd的異位表達(dá)挽救了cpx介導(dǎo)的對細(xì)胞增殖的抑制。環(huán)吡酮-pom前藥(cpx-pom)或環(huán)吡酮葡糖苷酸(cpx-g)在體外顯示出非常小的抗癌活性:我們通過進(jìn)行增殖測定，確定并比較了cpx與cpx-pom和cpx-葡糖苷酸在體外的作用。為了確定cpx、cpx-pom和cpx-葡糖苷酸對t24(mibc)和253-jbv(nmibc)細(xì)胞中的膀胱癌細(xì)胞增殖的作用，將每孔5000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板上并生長過夜。然后用增加劑量的cpx，cpx-pom和cpx-葡糖苷酸(于含有10％fbs的rpmi培養(yǎng)基中)處理細(xì)胞。通過己糖胺酶測定法評估治療期后細(xì)胞增殖的分析。簡言之，除去培養(yǎng)基，加入于檸檬酸鹽緩沖液ph5(7.5mm)，對硝基苯酚-n-乙?；?β-d-氨基葡萄糖苷酶(sigmaaldrich)中的己糖胺酶底物溶液，每孔75μl。將板在37℃在100％濕度下孵育30分鐘。用112.5μl含有5mmedta的50mm甘氨酸(ph10.4)終止反應(yīng)。在405nm測量吸光度。在n＝6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后重復(fù)至少三次。將數(shù)據(jù)作為對照的百分比進(jìn)行分析，其中對照孔只用等量的dmso處理。對于ic50計(jì)算，產(chǎn)生藥物濃度和己糖胺酶活性之間的曲線，并且將數(shù)據(jù)線性擬合或指數(shù)擬合。通過測定在處理48小時(shí)后導(dǎo)致50％細(xì)胞死亡的化合物的濃度來獲得ic50。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cpx以劑量和時(shí)間依賴性方式顯著抑制兩種細(xì)胞系(t24和253jbv)的增殖(在t24和253jbv細(xì)胞中，ic50分別為ic50＝>4μm和3μm)。而cpx-pom對增殖的影響非常小(在t24和253jbv細(xì)胞中，ic50分別為ic50＝>45μm和48μm)，并且cpx-葡糖苷酸在兩種細(xì)胞中在長達(dá)72h的處理中均未顯示任何顯著的效果。在總結(jié)的時(shí)候，正在進(jìn)行評估cpx-pom在細(xì)胞培養(yǎng)基中的化學(xué)穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)，從而評估cpx-pom是否在體外形成cpx。人尿中預(yù)測的cpx濃度顯示出足夠的抗癌活性:我們確定人尿中預(yù)測的cpx濃度是否足以產(chǎn)生抗癌活性。在正常尿液(從kumc的生物標(biāo)本儲存庫獲得)存在下，用cpx處理細(xì)胞以模擬膀胱中的環(huán)境。同時(shí)，進(jìn)行百分比劑量曲線以確定可用于進(jìn)一步研究的對細(xì)胞無毒的尿百分比(圖25a)。圖25a顯示正常尿液對細(xì)胞的影響。將253jbv細(xì)胞與指定百分比的正常尿液一起孵育長達(dá)72小時(shí)。發(fā)現(xiàn)尿液濃度小于20％對細(xì)胞無毒性。將253jbv細(xì)胞與各種百分比的尿在完全rpmi培養(yǎng)基中孵育長達(dá)12小時(shí)。12小時(shí)后，用100％完整的rpmi培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。使細(xì)胞生長達(dá)72小時(shí)。進(jìn)行己糖胺酶測定，以確定不同時(shí)間點(diǎn)(24h，48h和72h)尿的作用。經(jīng)確定，20％正常尿液可用于進(jìn)一步研究，因?yàn)樵诮o定時(shí)間段(12h)未發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞有毒性。為了確定預(yù)測的人尿中的cpx濃度是否足以產(chǎn)生抗癌活性，將nmibc細(xì)胞與cpx在正常尿液中(于完全rpmi培養(yǎng)基中的20％正常尿液)一起孵育，其中細(xì)胞暴露于50μmcpx兩小時(shí)，然后暴露于25umcpx兩小時(shí)，然后暴露于12.5umcpx兩小時(shí)，然后暴露于6.25umcpx兩小時(shí)，接著暴露于3.125umcpx兩小時(shí)，最后，暴露于1.5625umcpx兩小時(shí)。通過己糖胺酶測定法測定不同cpx濃度在12小時(shí)以后(24h，48h和72h)cpx的作用。將cpx在正常尿液中的作用與cpx在完全培養(yǎng)基中的作用進(jìn)行比較。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖25b所示，其表明cpx在人尿中的預(yù)測尿濃度足以抑制細(xì)胞增殖。發(fā)現(xiàn)cpx表現(xiàn)出12小時(shí)以上的抗增殖作用，效果持續(xù)至72h。接下來，我們確定在每日處理至處理長達(dá)72小時(shí)(3天處理)的情況下，cpx在正常尿液中對t24和253jbv細(xì)胞的作用。該實(shí)驗(yàn)背后的想法是觀察人尿液中預(yù)測濃度的cpx對膀胱癌細(xì)胞的影響，因?yàn)榛颊叩陌螂酌刻毂┞队陬A(yù)測濃度的cpx。使用三組板，每組一片用于cpx(50-1.5625um)的一天處理、兩天處理和三天處理。將t24和253jbv細(xì)胞與cpx在正常尿液中(于完全rpmi培養(yǎng)基中的20％正常尿液)孵育。在一天處理中，將細(xì)胞暴露于50μmcpx兩小時(shí)，然后暴露于25μmcpx兩小時(shí)，隨后暴露于12.5μmcpx兩小時(shí)，然后暴露于6.25μmcpx兩小時(shí)，然后暴露于3.125umcpx兩小時(shí)，最后暴露于1.5625umcpx兩小時(shí)。通過己糖胺酶測定法測定不同cpx濃度在12小時(shí)以后(24h，48h和72h)cpx的作用。在兩天的治療中，將細(xì)胞暴露于50um-1.5625um兩天，并通過己糖胺酶測定在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的作用。在3天的治療中，將細(xì)胞暴露于50um-1.5625um三天，并通過己糖胺酶測定在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的作用。圖25c顯示，每天用人尿中的預(yù)測濃度的cpx處理t24細(xì)胞顯示出顯著的抗癌活性。將t24細(xì)胞與cpx在正常尿液中(于完全rpmi培養(yǎng)基中的20％正常尿液)一起孵育。在一天處理中，將細(xì)胞暴露于不同cpx濃度(50um-1.5625um)12小時(shí)。通過己糖胺酶測定法測定不同cpx濃度在12小時(shí)以后(24h，48h和72h)的cpx的作用。在兩天的處理中，將細(xì)胞暴露于50um-1.5625um兩天，并通過己糖胺酶測定在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)測定作用。在3天的治療中，將細(xì)胞暴露于50um-1.5625um三天，并通過己糖胺酶測定在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)測定其作用。與cpx孵育的t24細(xì)胞在增殖方面顯示時(shí)間依賴性減少，其中處理了3天的細(xì)胞顯示出對增殖的最大抑制(20％)。圖25d顯示，每天用于人類尿液中的預(yù)測濃度的cpx處理253jbv細(xì)胞具有顯著的抗癌活性。將253jbv細(xì)胞與cpx在正常尿液中(于完全rpmi培養(yǎng)基中的20％正常尿液)一起孵育。在一天處理中，將細(xì)胞暴露于不同cpx濃度(50um-1.5625um)12小時(shí)。通過己糖胺酶測定法測定不同cpx濃度下12小時(shí)以后(24h，48h和72h)cpx的作用。在兩天的治療中，將細(xì)胞暴露于50um-1.5625um兩天，并通過己糖胺酶測定在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)測定其作用。在3天的治療中，將細(xì)胞暴露于50um-1.5625um三天，并通過己糖胺酶測定在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)測定其作用。與cpx孵育的253jbv細(xì)胞在增殖方面顯示時(shí)間依賴性降低，其中處理3天的細(xì)胞顯示出對增殖的最大抑制(35％)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖25c-25d所示，表明人尿中cpx的預(yù)測尿濃度顯示出時(shí)間依賴性降低細(xì)胞增殖。在兩種細(xì)胞系例如t24和253jbv中，cpx處理3天顯示增殖的最大抑制，分別為20％和35％。圖26a-26b均包括顯示cpx-pom降低bbn誘導(dǎo)的膀胱腫瘤的膀胱重量的圖。在cpx-pom處理的動物中，與對照組相比，經(jīng)過四周每日一次100mg/kg和200mg/kg的ipcpx-pom劑量，膀胱重量(作為腫瘤體積的量度)顯著降低(p＝0.013)。兩個(gè)cpx-pom處理組之間膀胱重量無顯著差異。與對照的健康膀胱相比，只給予bbn的動物由于腫瘤的誘導(dǎo)和生長而顯示膀胱重量增加。在100和200mg/kg處理劑量下，cpx-pom處理顯著降低膀胱重量。cpx-pom處理與腫瘤階段之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。從對照(僅bbn)動物獲得的膀胱組織主要含有高等級(t3)腫瘤，而cpx-pom處理的動物顯示出向低階段腫瘤的明顯遷移。僅bbn組的動物的蘇木精和伊紅染色的膀胱組織切片顯示非常高頻率的t3階段腫瘤。cpx-pom處理的膀胱的組織切片顯示t3階段頻率顯著降低，表明cpx-pom在腫瘤的早期階段遏制該腫瘤。以前的研究表明，高水平的notch1活性與膀胱癌腫瘤進(jìn)展相關(guān)，notch1可能是治療膀胱癌的潛在治療靶點(diǎn)。來自cpx-pom處理的膀胱組織的組織切片顯著抑制諸如早老素1等γ-分泌酶復(fù)合物蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致斷裂的活化notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(nicd1)的降低。此外，cpx-pom處理后，包括hey1在內(nèi)的所述途徑的下游靶點(diǎn)水平也得到顯著抑制。這些數(shù)據(jù)表明cpx-pom顯著抑制notch細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑蛋白，從而在體內(nèi)抑制癌癥干細(xì)胞(csc)生長。圖27a包括的圖像顯示，在體內(nèi)cpx-pom抑制notch1信號傳導(dǎo)和γ-分泌酶復(fù)合物蛋白。cpx-pom處理顯著降低notch1活化和γ-分泌酶復(fù)合物蛋白，即早老素1，并減少下游靶蛋白如hey-1。兩個(gè)cpx-pom處理組均觀察到對notch信號傳導(dǎo)途徑的抑制作用。圖27b包括的圖像顯示，在bbn誘導(dǎo)的膀胱腫瘤模型中，cpx-pom抑制notch下游靶標(biāo)蛋白，細(xì)胞周期蛋白d1和c-myc。cpx-pom顯著降低notch下游靶標(biāo)蛋白，如細(xì)胞周期蛋白d1和c-myc，其在細(xì)胞生長中起重要作用。因此，cpx-pom處理也導(dǎo)致了在bbn誘導(dǎo)的膀胱腫瘤模型中對notch下游靶標(biāo)蛋白細(xì)胞周期蛋白d1和c-myc的抑制。這些下游靶標(biāo)蛋白通過細(xì)胞周期在細(xì)胞進(jìn)展中起主要作用?？傊?，我們在膀胱癌小鼠驗(yàn)證模型中建立了體內(nèi)臨床前原理證據(jù)。我們證明，在注射給予cpx-pom后，在目標(biāo)作用位點(diǎn)(即，泌尿道)可獲得足夠濃度的環(huán)吡酮，在穩(wěn)態(tài)下持續(xù)足夠長的時(shí)間(即超過24小時(shí))。其次，我們已經(jīng)確定環(huán)吡酮在所述作用位點(diǎn)與提出的靶標(biāo)(例如notch信號傳導(dǎo)途徑)結(jié)合，第三，我們已經(jīng)確定在作用位點(diǎn)環(huán)吡酮靶向的結(jié)合作用導(dǎo)致與提出的作用機(jī)制(腫瘤大小減少，腫瘤階段遷移)一致的藥物活性。cpx-pom在體外和體內(nèi)都能抑制增殖的細(xì)胞核抗原(pcna)。我們檢測了非肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系和cpx-pom處理的膀胱腫瘤組織中的pcna含量，western印跡研究顯示在cpx-pom處理的t24細(xì)胞中pcna水平隨時(shí)間依賴性降低。cpx-pom降低體內(nèi)pcna的水平。此外，研究顯示notch細(xì)胞內(nèi)途徑和pcna之間呈正相關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室生成的數(shù)據(jù)表明，cpx-pom通過抑制notch-1信號傳導(dǎo)途徑、notch下游靶標(biāo)蛋白和增殖細(xì)胞核抗原來體內(nèi)抑制膀胱癌生長。圖28顯示cpx-pom在體外和體內(nèi)都抑制增殖細(xì)胞核抗原(pcna)?？ㄍ▓D解釋了pcna在將dna聚合酶中與dna維持在一起中所發(fā)揮的作用，其在dna復(fù)制中起重要作用。western印跡研究顯示cpx處理的t24細(xì)胞中，pcna水平隨時(shí)間依賴性降低。cpx-pom也降低pcna在體內(nèi)的水平。另外，臨時(shí)申請(并入本文)的數(shù)據(jù)顯示：cpx抑制t24細(xì)胞系中的notch、wnt和hedgehog途徑；cpx抑制t24細(xì)胞系中notch途徑相關(guān)基因；cpx抑制t24細(xì)胞系中wnt信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因；cpx抑制t24細(xì)胞系中的hedgehog途徑相關(guān)基因。本文提供的數(shù)據(jù)提供以下信息。眾所周知，pom部分被血液中循環(huán)的磷酸酶代謝。發(fā)生cpx-pom的完全代謝形成環(huán)吡酮。ivcpx-pom給予小鼠后，環(huán)吡酮與iv推注給予環(huán)吡酮胺相比是完全生物可利用的。在給予大鼠ivcpx-pom后，與iv推注給予環(huán)吡酮胺相比，環(huán)吡酮的生物利用度為77％。將ivcpx-pom給予狗后，與iv推注給予環(huán)吡酮胺相比，環(huán)吡酮的生物利用度為85％。在參與藥代動力學(xué)研究的小鼠，大鼠和狗中，在iv，sq和口服給予所述前藥后，在血漿和尿液中很少檢出cpx-pom。cpx-pom通過可注射的給藥途徑以良好耐受的劑量給予導(dǎo)致血漿和尿中環(huán)吡酮的濃度超過報(bào)道的體外ic50值。在通過皮下給藥途徑在大鼠和狗中給予cpx-pom后，環(huán)吡酮是生物可利用的。在給予良好耐受的iv劑量的cpx-pom后，血漿環(huán)吡酮濃度超過了所報(bào)道的體外ic50值。cpx-pom耐受性良好的iv和sq劑量后的血漿環(huán)吡酮濃度超過了體外ic50值。對于在小鼠，大鼠和狗中的非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌，在iv，sq和口服給予cpx-pom后，尿環(huán)吡酮濃度超過體外ic50值。向小鼠給予ipcpx-pom劑量的50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg導(dǎo)致尿環(huán)吡酮濃度超過報(bào)道的體外ic50值數(shù)倍。iv10mg/kg和ip50mg/kgcpx-pom劑量導(dǎo)致環(huán)吡酮的單劑量尿濃度超過體外ic50值數(shù)倍。在給予大鼠iv和sq劑量的cpx-pom后，環(huán)吡酮的尿濃度超過在良好耐受劑量下2-4μm范圍內(nèi)的體外ic50值。在給予狗iv和sq劑量的cpx-pom后，環(huán)吡酮的尿濃度超過在良好耐受劑量下2-4μm范圍的體外ic50值。人尿中預(yù)測的cpx濃度足以產(chǎn)生抗癌活性(例如，抗膀胱癌或本文所述的其它癌癥)。每天用于人尿中預(yù)測濃度的cpx進(jìn)行的治療方法顯示出對細(xì)胞的最大抑制作用。此外，本發(fā)明的化合物可用于治療上泌尿道疾病。本文提供的數(shù)據(jù)清楚地表明，環(huán)吡酮，環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥可用于本文所述的治療。具體地，任何一種膀胱癌治療都可以用環(huán)吡酮，環(huán)吡酮胺或環(huán)吡酮-pom前藥進(jìn)行。總之，cpx-pom在給予后迅速并完全地體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性劑環(huán)吡酮。小鼠研究208-02表明，環(huán)吡酮暴露的程度基本相同(137％)，無論是iv給予cpx-pom還是環(huán)吡酮的乙醇胺鹽。大鼠研究10954表明，環(huán)吡酮暴露的程度基本上相同(77％)，無論是iv給予cpx-pom還是環(huán)吡酮的乙醇胺鹽。狗研究10953表明，環(huán)吡酮暴露的程度基本相同(85％)，無論是iv給予cpx-pom還是環(huán)吡酮的乙醇胺鹽。同樣，如所有研究所述，我們無法在任何研究中檢測血漿中或尿液中的cpx-pom。這些研究表明，cpx-pom的iv給藥途徑是可行的途徑。cpx-pom的皮下給藥途徑是生物可利用的。大鼠研究11428證實(shí)，在sq給予cpx-pom后，環(huán)吡酮的絕對生物利用度為80％，并且在sqcpx-pom后，尿的環(huán)吡酮濃度超過體外ic50值。狗研究11429證明，在sq給予cpx-pom后，環(huán)吡酮的絕對生物利用度為106％，并且在sqcpx-pom之后，環(huán)吡酮的尿濃度超過體外ic50值。這些研究以及小鼠研究208-02也證明環(huán)吡酮胺的口服生物利用度相當(dāng)?shù)?。這種給藥途徑也與藥物的較低尿液濃度有關(guān)，從而確定了皮下給藥途徑是有益的，特別是在需要重復(fù)給予cpx-pom的情況下(如i型糖尿病患者服用胰島素那樣)。數(shù)據(jù)表明，cpx-pom可用于治療膀胱癌，如驗(yàn)證的膀胱癌小鼠模型所示。小鼠研究11177確定腹膜內(nèi)(ip)給藥途徑(用于小鼠膀胱癌研究)是生物可利用的。小鼠研究11206確定當(dāng)使用經(jīng)選擇用于小鼠膀胱癌研究的劑量方案時(shí)，在作用位點(diǎn)(即，泌尿道)的環(huán)吡酮暴露(例如，尿液濃度)超過體外ic50值數(shù)倍。研究證實(shí)，在可注射給予cpx-pom后，在作用部位(即血液，尿液)處獲得足夠濃度的活性藥物(環(huán)吡酮)。小鼠bbn研究確定，100mg/kg和200mg/kg每日劑量的cpx-pom導(dǎo)致膀胱重量顯著降低(腫瘤大小和體積的量度)以及向較低階段腫瘤的遷移。研究還確定，在從cpx-pom處理的動物獲得的膀胱組織中，notch信號傳導(dǎo)被抑制，并且下游notch靶蛋白降低。分析cpx-pom處理的動物中的膀胱癌組織表明，環(huán)吡酮與作用位點(diǎn)(膀胱組織)處的靶標(biāo)(例如notch信號傳導(dǎo)途徑)結(jié)合。在膀胱癌組織中觀察到的作用與在nmibc和mibc人細(xì)胞系體外產(chǎn)生的數(shù)據(jù)一致。研究還確定，每日注射給予cpx-pom產(chǎn)生的藥理作用(例如腫瘤的大小和體積降低，較低的腫瘤階段)與環(huán)吡酮是抗癌劑的假設(shè)一致，注射給予cpx-pom遞送足夠的活性藥物至作用部位以產(chǎn)生抗癌應(yīng)答。本文所用的術(shù)語“烷基”或“脂肪族”是指通常但不必然含有1至約24個(gè)碳原子的支鏈或非支鏈飽和烴基，例如甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，辛基，癸基等，以及環(huán)烷基如環(huán)戊基，環(huán)己基等。通常但同樣非必然地，本文的烷基含有1至約18個(gè)碳原子，或1至約12個(gè)碳原子。術(shù)語“低級烷基”意指具有1至6個(gè)碳原子的烷基。被稱為“c1-c6烷基”或“低級烷基”的取代基含有1至3個(gè)碳原子，或這些取代基含有1或2個(gè)碳原子(即甲基和乙基)?！叭〈耐榛笔侵溉〈幸粋€(gè)或多個(gè)取代基的烷基，術(shù)語“含雜原子的烷基”和“雜烷基”是指其中至少一個(gè)碳原子被雜原子替換的烷基，如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。如果沒有另外說明，術(shù)語“烷基”和“低級烷基”分別包括直鏈，支鏈，環(huán)狀，未取代的，取代的和/或含雜原子的烷基或低級烷基。本文所用的術(shù)語“烯基”是指含有至少一個(gè)雙鍵的2至約24個(gè)碳原子的直鏈，支鏈或環(huán)狀烴基，例如乙烯基，正丙烯基，異丙烯基，正丁烯基，異丁烯基，辛烯基，癸烯基，十四碳烯基，十六碳烯基，二十碳烯基，二十四碳烯基等。通常但同樣非必然地，烯基在本文中含有2至約18個(gè)碳原子，或2至12個(gè)碳原子。術(shù)語“低級烯基”表示2至6個(gè)碳原子的烯基，具體的術(shù)語“環(huán)烯基”表示環(huán)狀烯基，或具有5至8個(gè)碳原子。術(shù)語“取代的烯基”是指取代有一個(gè)或多個(gè)取代基的烯基，術(shù)語“含雜原子的烯基”和“雜烯基”是指其中至少一個(gè)碳原子被雜原子替換的烯基。如果沒有另外指出，術(shù)語“烯基”和“低級烯基”分別包括直鏈，支鏈，環(huán)狀，未取代的，取代的和/或含雜原子的烯基和低級烯基。本文所用的術(shù)語“炔基”是指含有至少一個(gè)叁鍵的2至24個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基，例如乙炔基，正丙炔基等。通常但非必然地，炔基在本文中包含2至18個(gè)碳原子，或2至12個(gè)碳原子。術(shù)語“低級炔基”表示2至6個(gè)碳原子的炔基。術(shù)語“取代的炔基”是指取代有一個(gè)或多個(gè)取代基的炔基，術(shù)語“含雜原子的炔基”和“雜炔基”是指其中至少一個(gè)碳原子被雜原子替換的炔基。如果沒有另外指出，術(shù)語“炔基”和“低級炔基”分別包括直鏈，支鏈，未取代的，取代的和/或含雜原子的炔基和低級炔基。本文所用的術(shù)語“烷氧基”意指通過單個(gè)末端醚連接基結(jié)合的烷基；也就是說，“烷氧基”基團(tuán)可以表示為-o-烷基，其中烷基如上所定義?！暗图壨榛趸北硎竞?至6個(gè)碳原子的烷氧基，并且包括例如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，異丙氧基，叔丁氧基等。被稱為“c1-c6烷氧基”或“低級烷氧基”的取代基含有1至3個(gè)碳原子，或這些取代基含有1或2個(gè)碳原子(即甲氧基和乙氧基)。本文所用的術(shù)語“芳基”，除非另有說明，是指芳族取代基，其含有單個(gè)芳族環(huán)或多個(gè)稠合在一起的直接連接或間接連接(使得不同的芳環(huán)與一個(gè)共同的基團(tuán)如亞甲基或亞乙部分結(jié)合)的芳環(huán)。芳基的實(shí)例包含5至20個(gè)碳原子，或芳基包含5至14個(gè)碳原子。示例性芳基包含一個(gè)芳環(huán)或兩個(gè)稠合或連接的芳環(huán)，例如苯基，萘基，聯(lián)苯基，二苯基醚，二苯胺，二苯甲酮等。“取代的芳基”是指取代有一個(gè)或多個(gè)取代基的芳基部分，術(shù)語“含雜原子的芳基”和“雜芳基”是指其中至少一個(gè)碳原子被雜原子替代的芳基取代基，如下文將進(jìn)一步詳細(xì)描述。如果沒有另外指出，術(shù)語“芳基”包括未取代的，取代的和/或含雜原子的芳族取代基。本文所用的術(shù)語“芳基氧基”是指通過單個(gè)末端醚連接基結(jié)合的芳基，其中“芳基”如上所定義。芳基氧基可以表示為-o-芳基，其中芳基如上所定義。芳基氧基的實(shí)例含有5至20個(gè)碳原子，或芳基氧基含有5至14個(gè)碳原子。芳基氧基的實(shí)例包括但不限于苯氧基，鄰-鹵素-苯氧基，間-鹵素-苯氧基，對-鹵素-苯氧基，鄰甲氧基-苯氧基，間甲氧基-苯氧基，對甲氧基-苯氧基，2,4-二甲氧基-苯氧基，3,4,5-三甲氧基-苯氧基等。術(shù)語“烷芳基”是指具有烷基取代基的芳基，術(shù)語“芳烷基”是指具有芳基取代基的烷基，“芳基”和“烷基”如上所述。芳烷基的實(shí)例包含6至24個(gè)碳原子，或芳烷基含有6至16個(gè)碳原子。芳烷基的實(shí)例包括但不限于芐基，2-苯基-乙基，3-苯基-丙基，4-苯基-丁基，5-苯基-戊基，4-苯基環(huán)己基，4-芐基環(huán)己基，4-苯基環(huán)己基甲基，4-芐基環(huán)己基基甲基等。烷芳基基團(tuán)包括例如對甲基苯基，2,4-二甲基苯基，對環(huán)己基苯基，2,7-二甲基萘基，7-環(huán)辛基萘基，3-乙基-環(huán)戊-1,4-二烯等。術(shù)語“環(huán)狀”是指可以是也可以不是取代的和/或含雜原子的脂環(huán)族或芳族取代基，并且可以是單環(huán)，雙環(huán)或多環(huán)。術(shù)語“鹵素”和“鹵代”在常規(guī)意義上用于指氯，溴和氟或碘取代基。在“含雜原子的烷基”(也稱為“雜烷基”)或“含雜原子的芳基”(也稱為“雜芳基”)中的術(shù)語“含雜原子”是指其中一個(gè)或多個(gè)碳原子被除碳以外的原子(例如氮，氧，硫，磷或硅，通常為氮，氧或硫)替換的分子、連接基或取代基。類似地，術(shù)語“雜烷基”是指含雜原子的烷基取代基，術(shù)語“雜環(huán)”是指含雜原子的環(huán)狀取代基，術(shù)語“雜芳基”和雜芳族基團(tuán)“分別表示含有雜原子的“芳基”和“芳香族”取代基等。雜烷基的實(shí)例包括烷氧基芳基、烷基硫基取代的烷基，n-烷基化的氨基烷基等。雜芳基取代基的實(shí)例包括吡咯基，吡咯烷基，吡啶基，喹啉基，吲哚基，嘧啶基，咪唑基，1,2,4-三唑基，四唑基等，并且含雜原子的脂環(huán)族基團(tuán)的實(shí)例是吡咯烷子基，嗎啉代，哌嗪子基，哌啶子基等等。術(shù)語“烴基”是指含有1至約30個(gè)碳原子，或1至約24個(gè)碳原子，或1至約18個(gè)碳原子，或約1至12個(gè)碳原子的單價(jià)烴基，包括直鏈，支鏈，環(huán)狀，飽和和不飽和基團(tuán)，例如烷基，烯基，芳基等?！叭〈臒N基”是指被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的烴基，并且術(shù)語“含雜原子的烴基”是指至少一個(gè)碳原子被雜原子替換的烴基。除非另有說明，術(shù)語“烴基”應(yīng)解釋為包括取代的和/或含雜原子的烴基部分。如在“取代的烷基”、“取代的芳基”等中的“取代的”如在上述一些定義中所提及的，是指在烷基、芳基或其它部分中，與碳(或其它)原子結(jié)合的至少一個(gè)氫原子被一個(gè)或多個(gè)非氫取代基替換。另外，如果特定的基團(tuán)允許的話，上述官能團(tuán)可以進(jìn)一步取代有一個(gè)或多個(gè)另外的官能團(tuán)或取代有一個(gè)或多個(gè)烴基部分，例如上面具體列舉的那些。類似地，上述烴基部分可以進(jìn)一步取代有一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)或另外的烴基部分，例如具體列舉的那些。當(dāng)術(shù)語“取代的”出現(xiàn)在所列舉的可能取代基組之前時(shí)，該術(shù)語適用于該組的每個(gè)成員。例如，“取代的烷基，烯基和芳基”這個(gè)短語被解釋為“取代的烷基，取代的烯基和取代的芳基”。類似地，當(dāng)術(shù)語“含雜原子”出現(xiàn)在所列舉的可能含雜原子的基團(tuán)組之前時(shí)，該術(shù)語適用于該組的每個(gè)成員。例如，短語“含雜原子的烷基，烯基和芳基”被解釋為“含雜原子的烷基，含雜原子的烯基和含雜原子的芳基”。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對于本文公開的這個(gè)和其它過程和方法，可以以不同的順序來實(shí)現(xiàn)在過程和方法中執(zhí)行的功能。此外，概述的步驟和操作僅作為示例提供，并且一些步驟和操作可以是任選的，組合成更少的步驟和操作，或擴(kuò)展到額外的步驟和操作，而不會降低所公開的實(shí)施方案的本質(zhì)。本公開不限于在本申請中描述的具體實(shí)施方案，其旨在對各方面進(jìn)行說明。在不背離其精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行許多修改和變化，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。通過之前的描述，除了本文列舉的那些之外，本公開范圍內(nèi)的功能上等同的方法和設(shè)備對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的修改和變化旨在落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本申請僅由所附權(quán)利要求以及這種權(quán)利要求所賦予的等同形式的全部范圍來限制。應(yīng)當(dāng)理解，本公開不限于特定方法，反應(yīng)物，化合物組合物或生物系統(tǒng)，它們當(dāng)然可以發(fā)生變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施例的目的，而不意在進(jìn)行限制。關(guān)于在本文中使用的基本上任何復(fù)數(shù)和/或單數(shù)術(shù)語，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以根據(jù)上下文和/或應(yīng)用的需要，從復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)換為單數(shù)形式和/或從單數(shù)轉(zhuǎn)換為復(fù)數(shù)形式。為了清楚起見，可以在本文中明確闡述各種單數(shù)/復(fù)數(shù)排列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，一般來說，本文使用的術(shù)語，特別是所附權(quán)利要求(例如，所附權(quán)利要求的主體)中使用的術(shù)語通常旨在作為“開放”術(shù)語(例如，術(shù)語“包括”應(yīng)當(dāng)被解釋為“包括但不限于”，術(shù)語“具有”應(yīng)被解釋為“至少具有”，術(shù)語“包括”應(yīng)被解釋為“包括但不限于”等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解，如果一個(gè)權(quán)利要求意圖保護(hù)具體數(shù)值，則這樣的意圖應(yīng)明確寫在權(quán)利要求中，如果不寫則沒有該意圖。例如，為了幫助理解，所附權(quán)利要求可以包含介紹性短語“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多個(gè)”來描述權(quán)利要求。然而，這些短語的使用不應(yīng)被解釋為意味著在權(quán)利要求中引入不定冠詞“一個(gè)”或“一種”就將含有該引入內(nèi)容的任何具體權(quán)利要求限制為僅含有一個(gè)這樣描述的實(shí)施方案，即使當(dāng)同一權(quán)利要求包括介紹性短語“一個(gè)或多個(gè)”或“至少一個(gè)”和不定冠詞如“一個(gè)”或“一種”(例如，“一個(gè)”和/或“一種”應(yīng)該解釋為“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”)；對于使用用于引入聲明陳述的定冠詞也是如此。此外，即使權(quán)利要求明確地?cái)⑹隽司唧w數(shù)值，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這種敘述應(yīng)該被解釋為是指至少一個(gè)所述數(shù)值(例如，“兩個(gè)…”的簡單描述，沒有其他修飾語，指至少兩個(gè)…，或兩個(gè)或更多個(gè)…)。此外，在使用類似于“a，b和c等中的至少一個(gè)”的慣用語的情況下，通常這種語法結(jié)構(gòu)意思是本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解所述慣用語(例如，“具有a，b和c中的至少一個(gè)的系統(tǒng)”將包括但不限于僅具有a，僅具有b，僅具有c，a和b一起，a和c一起，b和c一起的系統(tǒng)，和/或a，b和c一起等)。在使用類似于“a，b和c等中的至少一個(gè)”的慣用語的情況下，通常這種語法結(jié)構(gòu)意思是本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解所述慣用語(例如，“具有a，b和c中的至少一個(gè)的系統(tǒng)”將包括但不限于僅具有a，僅具有b，僅具有c，a和b一起，a和c一起，b和c一起的系統(tǒng)，和/或a，b和c一起等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解，實(shí)際上，無論在說明書、權(quán)利要求還是附圖中，呈現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)可供選擇術(shù)語的任何連詞和/或短語應(yīng)被理解為考慮了以下可能性：包括一個(gè)所述術(shù)語，任何一個(gè)所述術(shù)語，或兩個(gè)術(shù)語。例如，短語“a或b”將被理解為包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。此外，在本公開的特征或方面根據(jù)馬庫什基團(tuán)描述的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本公開也因此根據(jù)馬庫什基團(tuán)成員的任何單獨(dú)成員或亞組來描述。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，對于任何和所有目的，例如在提供書面描述方面，本文公開的所有范圍還包括任何和所有可能的子范圍及其子范圍的組合。任何列出的范圍都可以容易地被認(rèn)為是充分的描述，并使相同的范圍被分解成至少相等的一半，三份、四份、五份、十份等。作為非限制性示例，本文討論的每個(gè)范圍可以容易地分解成下三分之一，中三分之一和上三分之一等。如本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解的，所有語言，諸如“高達(dá)”，“至少”等包括所述的數(shù)字，并且指的是可以隨后分解成如上所述的子范圍的范圍。最后，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，范圍包括每個(gè)單獨(dú)的成員。因此，例如，具有1-3個(gè)細(xì)胞的基團(tuán)是指具有1，2或3個(gè)細(xì)胞的組。類似地，具有1-5個(gè)細(xì)胞的組是指具有1，2，3，4或5個(gè)細(xì)胞的組等等。從上述可以理解，為了說明的目的，本文中已經(jīng)描述了本公開的各種實(shí)施例，并且在不脫離本公開的范圍和精神的情況下可以進(jìn)行各種修改。因此，本文所公開的各種實(shí)施例并不旨在是限制性的，其真實(shí)范圍和精神由所附權(quán)利要求書表示。所引用的所有參考文獻(xiàn)或并入本文的參考文獻(xiàn)通過具體參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容并入本文。本專利申請通過參考并入:2013年10月21日提交的美國專利申請14/059,287，其是2011年12月2日提交的美國專利申請13/310,087的分案，其要求2010年12月2日提交的美國臨時(shí)申請61/419,218的權(quán)益。當(dāng)前第1頁12