相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2014年8月22日提交的美國臨時申請?zhí)?2/040,721和于2015年7月17日提交的美國臨時申請?zhí)?2/194,120的優(yōu)先權(quán)，這些申請的內(nèi)容通過引用而全文并入本文。

本公開內(nèi)容總體上涉及甾醇及其用于治療視覺障礙的用途，該視覺障礙影響患有此類視覺障礙或處于發(fā)展成此類視覺障礙的風險下的患者眼睛的晶狀體的正常功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防視覺障礙的方法，該方法包括向有需要的個體施用有效量的羊毛甾醇及其前藥或藥學上可接受的鹽。

本發(fā)明還提供了一種眼用藥物組合物，其包含藥學上可接受的眼用載體和具有以下式i的結(jié)構(gòu)的羊毛甾醇：

及其前藥或藥學上可接受的鹽。

在所述方法的各個方面，所述視覺障礙為影響眼睛晶狀體的功能、清晰度和/或結(jié)構(gòu)的眼睛障礙。這樣的眼睛疾病包括但不限于眼睛的白內(nèi)障、眼睛的老視以及眼睛晶狀體的核硬化。此外，視覺障礙還指視網(wǎng)膜變性，如雷夫敘姆病(refsumdisease)、smith-lemli-opitz綜合征(slos)和施奈德結(jié)晶狀角膜營養(yǎng)不良(sccd)、無β脂蛋白血癥和家族性低β脂蛋白血癥。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過向受試者施用治療或預(yù)防有效量的式i的甾醇來改善與視覺障礙相關(guān)的至少一種癥狀的方法。在該方法的各個方面，該組合物局部、結(jié)膜下、眼球后、眼周、視網(wǎng)膜下、脈絡(luò)膜上或眼內(nèi)施用。接受本發(fā)明甾醇的受試者可以包括但不限于哺乳動物、禽類、兩棲動物、爬行動物和其他脊椎動物。在一個實施方案中，該受試者為馬、豬、狗、貓、嚙齒動物和/或其他伴侶寵物。在另一個實施方案中，該受試者為人。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含眼用藥學上可接受的載體中的本發(fā)明甾醇的眼用藥物組合物。在一些實施方案中，該藥物組合物包含眼用藥學上可接受的載體中的羊毛甾醇或其衍生物。在本發(fā)明的某些實施方案中，該藥學上可接受的載體為水、緩沖液或氯化鈉溶液。在一些實施方案中，該藥學上可接受的載體是無菌的。在其他實施方案中，該藥學上可接受的載體為軟膏。在其他實施方案中，該藥學上可接受的載體為凝膠。凝膠可以使用本領(lǐng)域公知的凝膠配制材料進行配制，該凝膠配制材料包括但不限于高粘度羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚氧化乙烯和卡波姆(carbomer)。在所述組合物的一些方面，該藥學上可接受的眼用載體為環(huán)糊精。在一個實施方案中，該環(huán)糊精為(2-羥丙基)-β-環(huán)糊精。

本發(fā)明的某些實施方案還涉及包含可用于治療和/或預(yù)防與視覺障礙相關(guān)的癥狀的組分的試劑盒。這樣的試劑盒包含含有在藥學上可接受的載體中的本發(fā)明甾醇的容器，以及關(guān)于施用本發(fā)明甾醇使得與視覺障礙相關(guān)的至少一種癥狀得到改善或預(yù)防的說明。這樣的視覺障礙包括但不限于白內(nèi)障、老視和眼睛晶狀體的核硬化。此外，視覺障礙還指視網(wǎng)膜變性，如雷夫敘姆病、smith-lemli-opitz綜合征(slos)和施奈德結(jié)晶狀角膜營養(yǎng)不良(sccd)、無β脂蛋白血癥和家族性低β脂蛋白血癥。包含在本文涉及的一些試劑盒中的容器是用于施用滴眼劑的滴管。在其他實施方案中，該容器是用于分配軟膏或凝膠的管。在其他實施方案中，該容器是用于藥物遞送的任何合適的容器，包括但不限于注射器或適于藥物的眼部遞送或局部施用的其他容器。

在其他方面，本發(fā)明提供了一種用于抑制或預(yù)防蛋白質(zhì)聚集的方法。在該方法的各個方面，所述蛋白質(zhì)為淀粉狀蛋白形成蛋白或引起功能缺失疾病的蛋白質(zhì)。在一些方面，該淀粉狀蛋白形成蛋白選自hsp27、αa-晶體蛋白、αb-晶體蛋白、βb2-晶體蛋白、βb1-晶體蛋白、γd-晶體蛋白、hsp22、hsp20、tau、α-突觸核蛋白、iapp、β-淀粉狀蛋白、prp、亨廷頓蛋白(huntingtin)、降鈣素、心房鈉尿肽、載脂蛋白ai、血清淀粉狀蛋白a、medin、催乳素、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶膠蛋白(gelsolin)、角膜上皮素(keratoepithelin)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)、免疫球蛋白輕鏈al和s-ibm。在其他方面，引起功能缺失疾病的蛋白質(zhì)選自突變的β-葡糖苷酶、囊性纖維化跨膜受體、己糖胺酶a、己糖胺酶b、β-半乳糖苷酶和α-葡糖苷酶。

根據(jù)以下詳細描述，本公開內(nèi)容的其他特征和優(yōu)點將變得顯而易見。然而，應(yīng)當理解，雖然詳細描述和具體實例說明了本公開內(nèi)容的具體實施方案，但其僅通過示例的方式給出，因為根據(jù)該詳細描述，在本公開內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯而易見。整個文件旨在作為整體的公開內(nèi)容而相關(guān)聯(lián)，并且應(yīng)當理解，考慮了本文描述的特征的所有組合，即使特征的組合沒有在該文件的相同句子或段落或章節(jié)中一起找到。除了前述內(nèi)容以外，作為附加的方面，本發(fā)明還包括以任何方式范圍比以上具體提及的變化方案更窄的本發(fā)明的所有實施方案。例如，如果本發(fā)明的方面被描述為“包含”特征，則也涉及到“由該特征組成”或“基本由該特征組成”的實施方案。

在一個實施方案中，本發(fā)明公開了組合物在制備用于治療和/或預(yù)防受試者的視覺障礙的藥物中的用途，所述組合物包含藥學上可接受的眼用載體和藥學上有效量的羊毛甾醇。所述受試者患有視覺障礙或處于發(fā)展成視覺障礙的風險下，該視覺障礙影響眼內(nèi)晶狀體的正常結(jié)構(gòu)。所述受試者可以選自兩棲動物、爬行動物、禽類和哺乳動物；其中所述哺乳動物可以選自嚙齒動物、貓、狗、豬、馬和人。在另一個實施方案中，所述視覺障礙選自白內(nèi)障、先天性白內(nèi)障、皮質(zhì)混濁(corticalopacities)、后囊下白內(nèi)障、老視核硬化、視網(wǎng)膜退行性病癥、雷夫敘姆病、smith-lemli-opitz綜合征、施奈德結(jié)晶狀角膜營養(yǎng)不良、玻璃疣、年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變，并且羊毛甾醇抑制晶體蛋白聚集。

在又一個實施方案中，本發(fā)明公開了組合物在制備用于治療受試者的白內(nèi)障或失明/視覺損傷的藥物中的用途，所述組合物包含藥學上可接受的眼用載體和藥學上有效量的羊毛甾醇，其中所述羊毛甾醇溶解所述受試者眼內(nèi)的晶狀體晶體蛋白聚集體；其中所述晶狀體晶體蛋白為α–晶體蛋白、β–晶體蛋白或γ–晶體蛋白中的任一種。上述組合物可配制成眼用溶液、眼用軟膏、眼用洗劑、眼內(nèi)輸注溶液、用于前房的洗劑、內(nèi)服藥(internalmedicine)、注射劑或用于提取的角膜的防腐劑。

在又一個實施方案中，本發(fā)明公開了一種用于溶解晶體蛋白的淀粉樣纖維的方法，該方法包括使淀粉樣纖維與羊毛甾醇以足夠的量和持續(xù)時間接觸以便溶解晶體蛋白的淀粉樣纖維的步驟，其中該方法可以在原位、體外或體內(nèi)進行。該方法可以對選自兩棲動物、爬行動物、禽類和哺乳動物的受試者進行；其中所述哺乳動物可以選自嚙齒動物、貓、狗、豬、馬和人。

在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了一種用于治療和/或預(yù)防影響受試者眼睛的正常結(jié)構(gòu)的視覺障礙的試劑盒，該試劑盒包含藥學上有效量的羊毛甾醇、藥學上可接受的載體的制劑，以及關(guān)于施用所述制劑使得所述施用治療和/或預(yù)防所述視覺障礙的說明。在又一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于治療和/或預(yù)防受試者的視覺障礙的眼用藥物組合物，所述組合物包含藥學上可接受的眼用載體和藥學上有效量的羊毛甾醇；其中所述組合物可配制成眼用溶液、眼用軟膏、眼用洗劑、眼內(nèi)輸注溶液、用于前房的洗劑、內(nèi)服藥、注射劑或用于提取的角膜的防腐劑。

在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了一種用于鑒定和/或治療處于發(fā)展成與眼內(nèi)晶狀體晶體蛋白聚集體的形成相關(guān)的白內(nèi)障或失明/視覺損傷的風險下的受試者的方法，該方法包括：a)測定受試者的羊毛甾醇合酶活性的量；b)確定羊毛甾醇合酶活性的量是否小于沒有白內(nèi)障或失明/視覺損傷的對照群體的羊毛甾醇合酶活性的量，其中羊毛甾醇合酶活性的量小于對照群體的羊毛甾醇合酶活性的量指示發(fā)展成與晶狀體晶體蛋白聚集體的形成相關(guān)的白內(nèi)障或失明/視覺損傷的較高風險；以及c)用羊毛甾醇以有效的量和持續(xù)時間治療受試者以便阻止或逆轉(zhuǎn)受試者眼內(nèi)晶狀體晶體蛋白聚集體的形成，從而鑒定和治療處于發(fā)展成與受試者眼內(nèi)晶狀體晶體蛋白聚集體的形成相關(guān)的白內(nèi)障或失明/視覺損傷的風險下的受試者。

在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了一種鑒定和/或治療處于發(fā)展成與受試者眼內(nèi)晶狀體晶體蛋白聚集體的形成相關(guān)的白內(nèi)障或失明/視覺損傷的風險下的受試者的方法，該方法包括：a)確定羊毛甾醇合酶基因的兩個等位基因是否受降低羊毛甾醇合酶表達或活性的突變的影響，其中羊毛甾醇合酶的兩個等位基因中突變的存在增加了發(fā)展成與受試者眼內(nèi)晶狀體晶體蛋白聚集體的形成相關(guān)的白內(nèi)障或失明/視覺損傷的風險；以及b)用羊毛甾醇以有效的量和持續(xù)時間治療受試者以便阻止或逆轉(zhuǎn)受試者眼內(nèi)晶狀體晶體蛋白聚集體的形成，從而鑒定和治療處于發(fā)展成與受試者眼內(nèi)晶狀體晶體蛋白聚集體的形成相關(guān)的白內(nèi)障或失明/視覺損傷的風險下的受試者。在一個實施方案中，羊毛甾醇合酶基因中的突變在密碼子581處，將色氨酸(w)改為精氨酸(r)，或在密碼子588處，將甘氨酸(g)改為絲氨酸(s)。

附圖說明

圖1示出了lss中引起先天性白內(nèi)障的突變的鑒定。圖1a，受影響的家族和白內(nèi)障表型的系譜。正方形和圓形分別表示男性和女性。1，野生型等位基因；w581r和g588s為兩種突變。圖1b，上圖，未受影響的個體和具有純合w581r突變的受影響的兒童(ii-1)的dna測序數(shù)據(jù)；下圖，未受影響的個體和具有純合g588s突變的受影響的兒童(iv-1)的dna測序數(shù)據(jù)。帶下劃線的序列表示核酸變化。圖1c，左圖，在患有全白內(nèi)障的第一系譜中的患者1(iv-1)的右眼的彩色照片；右圖，在患有白內(nèi)障的相同系譜中的患者2(iv-3)的右眼的彩色照片。

圖2顯示lss突變消除了環(huán)化酶的酶功能。圖2a，lss中的w581r和g588在以下若干物種中保守：智人(homosapiens)、黑猩猩(pantroglodytes)、家牛(bostaurus)、小家鼠(musmusculus)、褐家鼠(rattusnorvegicus)、原雞(gallusgallus)和斑馬魚(daniorerio)。圖2b，lss結(jié)構(gòu)的計算機建模以及l(fā)ssw581r和g588s突變的影響。計算機建模分析鑒定了源自c584并終止于e578的環(huán)，其中在該環(huán)的末端處w581的關(guān)鍵側(cè)鏈穩(wěn)定了甾醇。該環(huán)由s–s橋和e578–r639鹽橋固定。g588的酰胺氮n與來自前面的螺旋轉(zhuǎn)角的c584相互作用，并且g588的ca氫與臨界e578非常接近，e578隨后與同一支持螺旋的r639形成牢固的鹽橋。突變g588s導致絲氨酸的側(cè)鏈碰撞到所述環(huán)的e578殘基，并且與該結(jié)構(gòu)不相容。箭頭指示突變側(cè)鏈的位置。圖2c，野生型蛋白(wtlss)和lss突變體的工程化表達對甾醇含量的影響。野生型lss顯著地增加了羊毛甾醇的產(chǎn)量，而w581r和g588s突變體均未表現(xiàn)出任何環(huán)化酶活性。每組n＝3；***p<0.001。

圖3顯示羊毛甾醇減少了多種晶體蛋白突變蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)聚集。圖3a，人晶狀體祖細胞中晶體蛋白聚集體的共聚焦圖像。aa-晶體蛋白的致白內(nèi)障y118d突變體形成p62陽性細胞內(nèi)包涵體或聚集體(aggresomes)。綠色，egfp–晶體蛋白；紅色，p62；藍色，細胞核。用pegfp-n1轉(zhuǎn)染的細胞用作對照。圖3b，lss對晶體聚集體的抑制作用的共聚焦圖像。圖3c，野生型lss(wtlss)和羊毛甾醇而非突變lss或膽固醇對晶體蛋白突變體聚集的抑制。圖3d，通過野生型lss而非lss突變體的共表達引起的可溶性aa-晶體蛋白(y118d)突變蛋白質(zhì)的增加(與pcdna3.1–n-flag共表達的y118d用作對照)。通過對細胞裂解物的上清液或不可溶部分的蛋白質(zhì)印跡分析，使用晶體蛋白的密度測定法進行定量分析。每組n＝3；代表性的蛋白質(zhì)印跡分析示于圖9c中；*p<0.05，**p<0.01。圖3e，預(yù)先形成的晶體聚集體被羊毛甾醇再溶解的共聚焦圖像。圖3f，羊毛甾醇以濃度依賴性方式顯著減少了多種致白內(nèi)障的突變晶體蛋白引起的細胞內(nèi)聚集(n＝3，p<1×10^-4)。膽固醇并不減少細胞內(nèi)聚集(n＝3，p>0.1)。圖3g，羊毛甾醇增加了人晶狀體祖細胞中多種晶體蛋白突變體的可溶部分。n＝3；p<0.001。圖3h，通過連續(xù)活細胞成像，dmso、膽固醇或羊毛甾醇對人晶狀體祖細胞中αa-晶體蛋白y118d聚集體的影響。圖3i，隨時間推移，羊毛甾醇對細胞內(nèi)晶體蛋白聚集體溶解的影響(n＝22，來自3個生物重復品)。平均值±sd值顯示為黑色符號。數(shù)據(jù)通過單指數(shù)衰減過程進行最佳擬合(紅線)。

圖4顯示羊毛甾醇使晶體蛋白的預(yù)先形成的淀粉樣纖維再溶解。圖4a，用脂質(zhì)體媒介物、脂質(zhì)體中的膽固醇或羊毛甾醇處理的aa-晶體蛋白突變蛋白質(zhì)的聚集體的負染色tem照片。右列羊毛甾醇組的圖像在其右側(cè)顯示了該圖像的5倍放大。圖4b，根據(jù)tht熒光，羊毛甾醇對晶體蛋白聚集體的再溶解的影響(n＝3)。圖4b(i)，b/γ-晶體蛋白突變體；圖4b(ii)，a-晶體蛋白突變體。每條的數(shù)據(jù)均來自三個獨立的樣品。

圖5顯示羊毛甾醇降低了白內(nèi)障嚴重性并增加了清晰度。圖5a，經(jīng)羊毛甾醇治療的患有白內(nèi)障的兔子的晶狀體的照片，其顯示晶狀體清晰度增加。圖5a(i)，左圖，治療前；圖5a(ii)，右圖，治療后。圖5b，羊毛甾醇的治療效果的定量的箱線圖(n＝13)。圖5c，經(jīng)羊毛甾醇治療的患有白內(nèi)障的狗的晶狀體的照片，其顯示晶狀體清晰度增加。圖5c(i)，左圖，治療前；圖5c(ii)，右圖，治療后。d，羊毛甾醇的治療效果的定量的箱線圖(n＝7)。示出了范圍、中值(水平線)和平均值(圓圈)。十字形表示測量的最大和最小白內(nèi)障等級。須觸線表示標準差，而方框包含40％置信區(qū)間。

圖6a顯示純合性映射器(homozygositymapper)將全基因組純合性繪制為條形圖。為了強調(diào)感興趣的區(qū)域，任何高于該項目中所達到的最大分數(shù)的80％的分數(shù)均標注為紅色。圖6b顯示純合性分數(shù)相對于含有l(wèi)ss基因的21號染色體上的物理位置作圖。紅色條表示具有最高分數(shù)的區(qū)域。該染色體的右側(cè)含有l(wèi)ss基因所在的長連續(xù)純合區(qū)。

圖7示出了用flag–lss和egfp共轉(zhuǎn)染的細胞的代表性共聚焦圖像。用野生型或突變的lss基因和egfp基因共轉(zhuǎn)染人晶狀體祖細胞4h，并在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h。隨后使用抗-flag抗體對lss的細胞分布進行可視化(紫色)。egfp的分布(綠色)用作對照。將細胞核染色并通過hoechst33342進行可視化(藍色)。

圖8示出了用lss和多種致白內(nèi)障的晶體蛋白突變體共轉(zhuǎn)染的細胞的代表性共聚焦圖像。圖8a，αa-晶體蛋白的r116c突變體。圖8b，αb-晶體蛋白的r120g突變體。圖8c，βb2-晶體蛋白的v187e突變體。圖8d，γc-晶體蛋白的g129c突變體。圖8ae，γd-晶體蛋白的w43r突變體。用野生型或突變的flag–lss基因和突變gfp–晶體蛋白基因共轉(zhuǎn)染人晶狀體祖細胞4h，并在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h。所有的晶體蛋白突變體都形成p62-陽性聚集體，如通過突變晶體蛋白和p62的共定位所示出的。用gfp-晶體蛋白和pcdna3.1-n-flag共轉(zhuǎn)染的細胞用作對照。通過gfp的熒光(綠色)對多種晶體蛋白的細胞內(nèi)聚集體的形成進行可視化。用抗-flag抗體檢測野生型或突變的lss(紅色)，p62用抗-p62抗體進行染色，而細胞核通過hoechst33342染色(藍色)進行染色和可視化。具有聚集體的細胞的定量分析總結(jié)于圖3c中。

圖9顯示在hleb-3細胞(圖9a)或hela細胞(圖9b)中野生型lss和羊毛甾醇對晶體蛋白突變體聚集的抑制。在分析聚集體之前將用lss和晶體蛋白突變體構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)24h。通過向細胞培養(yǎng)基中添加40μm甾醇(羊毛甾醇或膽固醇)進行拯救實驗(rescueexperiment)2h，隨后用新鮮培養(yǎng)基代替甾醇培養(yǎng)基，并將細胞培養(yǎng)另外12h。從十個隨機選擇的視野計算具有晶體蛋白聚集體的細胞的百分比。計算野生型lss組、突變體組或突變體加羊毛甾醇組的值。與對照組相比，野生型lss組和羊毛甾醇組的聚集體顯著較低(p<1×10^-4)，而突變lss組或膽固醇組的聚集體顯示與對照組沒有差異(p>0.1)。圖9c，人晶狀體祖細胞用野生型或突變lss加αa-晶體蛋白(y118d)進行共轉(zhuǎn)染。與pcdna3.1-n-flag共表達的αa-晶體蛋白(y118d)用作對照。在轉(zhuǎn)染4h并在新鮮培養(yǎng)基中溫育另外24h之后，將細胞裂解并離心以分離上清液和不可溶部分。分別用針對flag和gfp的抗體檢測lss和晶體蛋白融合蛋白。紅色箭頭表示在含有wt-lss的細胞的可溶部分中相對于不可溶部分中較高的晶體含量。數(shù)據(jù)根據(jù)三個獨立的實驗進行定量并總結(jié)于圖3d中。

圖10顯示當在hleb-3或hela細胞中測定時，羊毛甾醇以濃度依賴性方式顯著減少了由多種致白內(nèi)障的突變晶體蛋白引起的細胞內(nèi)聚集。圖10a，用多種致白內(nèi)障的晶體蛋白突變體轉(zhuǎn)染的hleb-3細胞的代表性共聚焦圖像。圖10b，用多種致白內(nèi)障的晶體蛋白突變體轉(zhuǎn)染的hela細胞的代表性共聚焦圖像。將細胞用多種晶體蛋白構(gòu)建體轉(zhuǎn)染4h，并在新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外24h。然后將細胞用在1％(hleb-3細胞)或2％dmso(hela細胞)中的10μm、20μm和40μm羊毛甾醇處理2h，并培養(yǎng)另外12h。用1％(hleb-3細胞)或2％dmso(hela細胞)處理的細胞用作對照。多種晶體蛋白的細胞內(nèi)聚集體的形成通過gfp的熒光(綠色)進行可視化，并用hoechst33342將細胞核染色(藍色)。箭頭指示典型的細胞內(nèi)聚集體。圖10c，當在hleb-3細胞中測定時，羊毛甾醇的聚集-溶解作用的濃度依賴性。圖10d，當在hela細胞中測定時，羊毛甾醇的聚集-溶解作用的濃度依賴性。

圖11顯示與對照組或突變lss組相比，羊毛甾醇而非膽固醇處理增加了可溶部分中的致白內(nèi)障的突變晶體蛋白。圖11a，將人晶狀體祖細胞用突變晶體蛋白基因轉(zhuǎn)染4h，隨后在新鮮培養(yǎng)基中溫育另外24h。收獲并裂解細胞。上清液和不可溶部分通過離心進行分離，并通過蛋白質(zhì)印跡分析進行分析。分別用針對flag和gfp標記物的抗體鑒定lss和晶體蛋白融合蛋白。用紅框突出顯示羊毛甾醇處理的組。用1％dmso處理的細胞用作對照。β-肌動蛋白用作全細胞裂解物(tcl)的內(nèi)部蛋白質(zhì)負荷對照。s，上清液；p，不可溶部分。圖11b，通過活細胞成像中的單粒子跟蹤評估的dmso(n＝4)和膽固醇(n＝7)對人晶狀體祖細胞中αa-晶體蛋白(y118d)聚集體的大小變化的影響。圖11c，通過濁度評估羊毛甾醇對晶體蛋白聚集體的溶解的影響。通過在1m鹽酸胍的存在下將5mgm1^-1蛋白質(zhì)溶液在60℃下溫育2h(α-晶體蛋白)或在37℃下溫育48h(β-和γ-晶體蛋白)來形成晶體蛋白聚集體。將預(yù)先形成的聚集體以0.2mgm1^-1的最終蛋白質(zhì)濃度重懸于pbs中，并用在500μmdppc脂質(zhì)體中的500μm甾醇進行處理，并在37℃下溫育24h。將僅用500μmdppc脂質(zhì)體處理的聚集體用作對照。圖11d，通過tht熒光評估的羊毛甾醇對αa-晶體蛋白突變體再溶解淀粉樣纖維的濃度依賴性影響。將僅用500μmdppc脂質(zhì)體處理的聚集體用作對照。

圖12示出了白內(nèi)障晶狀體的分級系統(tǒng)。圖12a，將晶狀體放在網(wǎng)格上，并拍照。將透明度評分為0，清晰的晶狀體且不存在渾濁(網(wǎng)格線清晰可見，a')；1，模糊的晶狀體和輕度的渾濁(網(wǎng)格線最低限度的混濁，但網(wǎng)格線仍然可見，b')；2，混濁的晶狀體且存在涉及幾乎整個晶狀體的彌漫性渾濁(網(wǎng)格線中度混濁，但主要的網(wǎng)格線可見，c')；或3，不透明的晶狀體且存在涉及整個晶狀體的廣泛、密集的渾濁(網(wǎng)格線完全混濁，且網(wǎng)格線根本無法看到，d')。圖12b，在分離出的白內(nèi)障兔子晶狀體中，羊毛甾醇降低了白內(nèi)障的嚴重程度并增加了清晰度。將兔子晶狀體(n＝13)切開并與羊毛甾醇一起溫育6天，隨后評估晶狀體的清晰度和透明度。示出了顯示處理前后的每個白內(nèi)障兔子晶狀體的成對照片，下方為分數(shù)。圖12c，羊毛甾醇降低了狗的白內(nèi)障嚴重程度并增加了晶狀體的清晰度。將患有白內(nèi)障的狗眼睛(n＝7)用羊毛甾醇處理6周，并評估晶狀體的清晰度和透明度。示出了處理前后每個研究眼睛的成對照片，下方為分數(shù)。還呈現(xiàn)了單獨用媒介物處理的三個對照眼睛。

具體實施方式

現(xiàn)將詳細參考本發(fā)明的具體實施方案，包括本發(fā)明人預(yù)期用于實施本發(fā)明的最佳方式。這些具體實施方案的實例在附圖中示出。雖然結(jié)合這些具體實施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)當理解，其并非旨在將本發(fā)明限于所述實施方案。相反，意在涵蓋可被包含在如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的替代方案、修改和等同項。在以下描述中，闡述了具體細節(jié)以提供對本發(fā)明的徹底理解?？梢栽跊]有一些或全部這些具體細節(jié)的情況下實施本發(fā)明。另外，公知的特征可能未進行詳細描述，以避免不必要地使本發(fā)明變模糊。

本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防患有視覺障礙或處于發(fā)展成視覺障礙的風險下的受試者中影響眼睛正常結(jié)構(gòu)的這類視覺障礙的方法和組合物，其包括向這樣的受試者施用包含藥學上可接受的載體和藥學上有效量的具有式i的甾醇的組合物。例如，本發(fā)明的示例性化合物包括向患者施用眼科藥學上有效量的羊毛甾醇(3β-羥基-8,24-羊毛甾二烯；8,24-羊毛甾二烯-3β-醇)。

在其他實施方案中，本公開內(nèi)容描述了甾醇和使用甾醇的方法。例如，將式i的甾醇配制在包含藥學上可接受的眼用載體的眼用藥物組合物中以抑制晶體蛋白聚集。在某些其他實施方案中，本公開內(nèi)容描述了使用式1的甾醇來抑制晶體蛋白聚集的方法。在其他實施方案中，本發(fā)明的化合物能夠逆轉(zhuǎn)晶體蛋白的聚集并抑制晶體蛋白的進一步聚集。治療或預(yù)防視覺障礙的方法

本發(fā)明提供了使用本發(fā)明預(yù)防和/或治療患有視覺障礙或處于發(fā)展成視覺障礙的風險下的受試者中影響眼內(nèi)晶狀體正常結(jié)構(gòu)的這類視覺障礙的眼用藥物組合物和方法。如本文所述，影響眼內(nèi)晶狀體正常結(jié)構(gòu)的視覺障礙(本文中稱為短語“視覺障礙”)是指影響晶狀體結(jié)構(gòu)從而引起視覺功能障礙如眼睛晶狀體的清晰度或硬度變化的狀況。這樣的狀況包括白內(nèi)障、老視和核硬化。另外，視覺障礙還指視網(wǎng)膜變性，如雷夫敘姆病、smith-lemli-opitz綜合征(slos)和施奈德結(jié)晶狀角膜營養(yǎng)不良(sccd)、無β脂蛋白血癥和家族性低β脂蛋白血癥。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用來減輕或逆轉(zhuǎn)晶體蛋白聚集的組合物及其使用方法。在替代實施方案中，提供了用于抑制、預(yù)防和/或治療蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間相互作用的破壞的組合物和方法，該相互作用形成對于晶狀體透明度和折射率而言必需的宏觀結(jié)構(gòu)。

如本發(fā)明中所提及的術(shù)語“白內(nèi)障”意指表現(xiàn)出引起晶狀體表面上和/或內(nèi)部的混濁或不透明的癥狀或者誘發(fā)晶狀體腫脹的癥狀的疾病或狀況，并且該術(shù)語包括先天性白內(nèi)障和后天性白內(nèi)障(參見pdrstaff,“pdrofophthalmicmedicines2013”,pdrnetwork,2012)。在一些實施方案中，所述白內(nèi)障為年齡相關(guān)性白內(nèi)障、糖尿病白內(nèi)障、與外科手術(shù)相關(guān)的白內(nèi)障、由暴露于輻射引起的白內(nèi)障、由遺傳疾病引起的白內(nèi)障、由感染引起的白內(nèi)障或由藥物引起的白內(nèi)障。在一些實施方案中，個體患有早發(fā)性遺傳形式的白內(nèi)障。這類白內(nèi)障的具體實例為先天性白內(nèi)障，如先天性假性白內(nèi)障(congenitalpseudo-cataract)、先天性膜性白內(nèi)障、先天性花冠狀白內(nèi)障、先天性板層白內(nèi)障、先天性點狀白內(nèi)障和先天性絲狀白內(nèi)障；以及后天性白內(nèi)障，如老年性白內(nèi)障、繼發(fā)性白內(nèi)障、褐變白內(nèi)障(browningcataract)、并發(fā)性白內(nèi)障、糖尿病白內(nèi)障、外傷性白內(nèi)障和可由電擊、輻射、超聲波、藥物、全身性疾病和營養(yǎng)失調(diào)誘發(fā)的其他白內(nèi)障。后天性白內(nèi)障進一步包括為了治療白內(nèi)障插入晶狀體而具有在包含該晶狀體的后部中引起混濁的癥狀的術(shù)后白內(nèi)障。

核硬化是指通常在年老的動物中類似地導致晶狀體不透明的狀況。它是由新纖維形成壓縮核中較老的晶狀體纖維而引起的晶狀體核密度的年齡相關(guān)變化。

老視是指一種視覺狀況，其中眼睛的晶狀體失去其柔韌性，這使其難以聚焦于近處的物體。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防視覺障礙的方法，該方法包括向有需要的個體施用有效量的包含具有結(jié)構(gòu)式i的化合物的組合物。在一些實施方案中，該化合物為具有結(jié)構(gòu)式i的甾醇。

根據(jù)本發(fā)明“需要”治療的個體為患有影響眼內(nèi)晶狀體正常功能的視覺障礙的個體。例如，該個體可患有年齡相關(guān)性白內(nèi)障或白內(nèi)障或處于發(fā)展成年齡相關(guān)性白內(nèi)障或白內(nèi)障的風險下。處于發(fā)展成白內(nèi)障的風險下的個體包括但不限于，具有發(fā)展成白內(nèi)障的家族史的個體、具有與白內(nèi)障相關(guān)的突變的個體、暴露于輻射的個體、糖尿病個體等。例如，在一方面，該個體被診斷為一只眼患有白內(nèi)障，且施用所述化合物以預(yù)防或減緩對側(cè)眼中白內(nèi)障的形成。類似地，根據(jù)本發(fā)明“需要”治療的個體為可能患有老視或處于發(fā)展老視的風險下的個體。類似地，根據(jù)本發(fā)明“需要”治療的個體為患有核硬化或處于發(fā)展成核硬化的風險下的個體。優(yōu)選地，該個體為人，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以鑒定患有眼病或處于眼病風險下的動物(需要治療的動物)?？设b定需要治療的哺乳動物，如貓、狗、豬、馬、牛和嚙齒動物。此外，可鑒定需要治療的動物，如禽類、爬行動物、兩棲動物和魚。

“治療”視覺障礙并不需要視覺障礙的100％消除或逆轉(zhuǎn)。在一些實施方案中，與不存在本發(fā)明組合物或方法時(例如，在未暴露于本發(fā)明組合物或本發(fā)明方法的化合物的生物學匹配的對照受試者或標本中)觀察到的水平相比，根據(jù)本發(fā)明方法“治療”視覺障礙將晶狀體的功能障礙例如晶狀體的不透明或柔韌性缺乏減輕、抑制、預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)了例如至少約5％、至少約10％或至少約20％。在一些實施方案中，與不存在本發(fā)明方法的化合物時的晶狀體功能障礙相比，功能障礙(如在晶狀體上或晶狀體中的白內(nèi)障形成、不透明或晶體聚集)被治療了至少約30％、至少約40％、至少約50％或至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或更多(約100％)。晶狀體功能障礙如不透明或混濁或白內(nèi)障通常使用多種光學測試中的任一種進行檢測，該光學測試包括但不限于視敏度測試、檢眼鏡檢查、裂隙燈檢查、角膜曲率測量、眼壓測量、對比測試、眩光敏感度、波陣面映射。

類似地，“預(yù)防”并不需要視覺障礙的100％抑制或遏制。例如，混濁或不透明的任何減少或白內(nèi)障進展的減速都構(gòu)成受試者的有益生物效應(yīng)。同樣例如，眼睛晶狀體中的晶體聚集的任何減少都構(gòu)成有益的生物效應(yīng)。在這方面，與不存在本發(fā)明方法時(例如，在未暴露于本發(fā)明方法的化合物的生物學匹配的對照受試者或標本中)觀察到的水平相比，本發(fā)明使視覺障礙減少了例如至少約5％、至少約10％或至少約20％。在一些實施方案中，視覺障礙減少了至少約30％、至少約40％、至少約50％或至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或更多(約100％)。

抑制、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)功能障礙并不需要100％抑制、預(yù)防、消滅或逆轉(zhuǎn)。例如，對聚集的任何抑制都構(gòu)成受試者中的有益生物效應(yīng)。在這方面，與不存在本發(fā)明方法時(例如，在未暴露于本發(fā)明方法的化合物的生物學匹配的對照受試者或標本中)觀察到的水平相比，本發(fā)明將受試者的影響眼睛晶狀體正常功能的視覺障礙抑制了例如至少約5％、至少約10％或至少約20％。在一些實施方案中，視覺障礙被抑制、預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)了至少約30％、至少約40％、至少約50％或至少約60％。在一些實施方案中，與不存在本發(fā)明方法的化合物時的淀粉狀蛋白形成相比，本發(fā)明方法將淀粉狀蛋白形成抑制了至少約70％、至少約80％、至少約90％或更多(約100％)。

包含式1化合物的眼用藥物組合物的“有效量”為抑制、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)個體晶狀體的功能障礙的量。本發(fā)明的眼用藥物組合物以治療視覺障礙的有效量施用于有需要的受試者。如本文所用的，“治療有效量”意指減輕視覺障礙的體征、癥狀或病因或任何其他所需生物系統(tǒng)改變中的至少一種的劑量。在預(yù)防性應(yīng)用中，術(shù)語“預(yù)防有效量”意指施用于易患特定疾病或處于特定疾病風險下的患者的劑量，其可以是與治療有效量相同或不同的劑量。用于特定個體的組合物的有效量可取決于個體、個體狀況的嚴重程度、施加的制劑的類型、給藥頻率和治療持續(xù)時間。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的眼用藥物制劑例如羊毛甾醇即使在液體滴劑中以相對較低的濃度，例如至少10^-9m、至少0.5x10^-8m至1x10^-8m、至少0.5x10^-7m至1x10^-7m、至少0.5x10^-6m至1x10^-6m、至少0.5x10^-5m至1x10^-5m、至少0.5x10^-4m至1x10^-4m或至少0.5x10^-3m至1x10^-3m，或在這些值之間的范圍(例如，10^-9m至10^-3m)內(nèi)的任何濃度施用，也可以通過每日僅一次、兩次、三次或多次施加來逆轉(zhuǎn)這樣的視覺障礙，并且如此快速地進行。

給藥途徑

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，將化合物施用于受試者的最適當?shù)姆椒ㄈQ于很多因素。在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的化合物局部施用于眼，例如，局部、結(jié)膜下、眼球后、眼周、視網(wǎng)膜下、脈絡(luò)膜上或眼內(nèi)施用。

對于直接施用于眼睛特別有用的藥物組合物包括配制成滴眼劑的水溶液和/或懸浮液和配制成眼用凝膠(包括凝膠形成溶液)或軟膏的增稠溶液和/或懸浮液，其為眼用溶液、眼用軟膏、眼用洗劑、眼內(nèi)輸注溶液、用于前房的洗劑、內(nèi)服藥、注射劑或用于提取的角膜的防腐劑。用于眼用藥物遞送的其他劑型包括眼用插入物(ocularinsert)、玻璃體內(nèi)注射劑和植入物。可注射溶液可使用細針直接注入角膜、晶狀體和玻璃體或其臨近組織中。該組合物還可以作為眼內(nèi)灌注液施用。

其他預(yù)期的給藥途徑包括但不限于以下途徑中的一種或多種：口服(例如，作為片劑、膠囊或作為可攝取溶液)、經(jīng)粘膜(例如，作為用于吸入的鼻腔噴霧劑或氣霧劑)、經(jīng)鼻、腸胃外(例如，通過可注射形式)、胃腸、脊柱內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、子宮內(nèi)、皮內(nèi)、顱內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、直腸、經(jīng)頰、硬膜外和舌下。

在一些實施方案中，用于將本發(fā)明的組合物遞送至眼睛的方式是經(jīng)由接觸透鏡?？商峁┯盟杌衔镱A(yù)處理的透鏡?；蛘撸撏哥R在具有用于制備鍍膜透鏡的組分的試劑盒中提供，該組分以用于重建的凍干粉或以濃縮的或即用型溶液的形式提供。所述組合物可以以單用途或多用途的試劑盒的形式提供。

在一些實施方案中，用于將本發(fā)明的組合物遞送至眼睛的方式是經(jīng)由眼用棒(rod)(gwon等人,ophthalmology.1986年9月；93(9suppl):82-5)。在一些實施方案中，用于將本發(fā)明的組合物遞送至眼睛的方式是經(jīng)由眼內(nèi)透鏡-水凝膠組件(garty等人,investophthalmolvissci,2011年8月3日；52(9):6109-16)。

劑量

包含所述化合物的組合物以治療有效量提供，該治療有效量在醫(yī)學上可接受的毒性水平下達到所需的生物效果。該組合物的劑量可根據(jù)給藥途徑和疾病的嚴重程度而變化。該劑量還可根據(jù)待治療的每個患者的體重、年齡、性別和/或癥狀程度而調(diào)整。精確的劑量和給藥途徑將最終由經(jīng)治醫(yī)生或獸醫(yī)來決定?？梢岳斫?，可能需要根據(jù)患者的年齡和體重以及待治療的狀況的嚴重程度對劑量作出常規(guī)改變。給藥頻率取決于制劑和上述參數(shù)。例如，可能期望每天施加滴眼劑至少一次，包括每天2、3、4或5次。

普通技術(shù)人員可容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復率。最佳劑量可根據(jù)特定藥物組合物的相對功效和給藥方法而變化?？山邮艿膭┝客ǔ？筛鶕?jù)在體外和體內(nèi)動物模型中發(fā)現(xiàn)有效的ec50(對于測試組中的50％有效的濃度)來估算。通常，劑量為每kg體重0.01μg-100g，并且可每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或甚至每2至20年給予一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地根據(jù)所測量的藥物在體液或組織中的停留時間和濃度來估算給藥的重復率。在成功治療之后，可能期望使患者經(jīng)受維持治療以預(yù)防疾病狀態(tài)的復發(fā)，其中本文所述的治療組合物以在每kg體重0.01μg至100g范圍內(nèi)的維持劑量每日施用一次或多次到每20年施用一次。用于經(jīng)由全身途徑施用于人(約70kg體重)的化合物的示例性劑量為每單位劑量0.1mg至5g，例如1mg至2.5g化合物。

式i化合物的優(yōu)選濃度在約1μg/ml至500μg/ml的范圍內(nèi)，例如，約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約10μg/ml、約20μg/ml、約30μg/ml、約40μg/ml、約50μg/ml、約60μg/ml、約70μg/ml、約80μg/ml、約90μg/ml、約100μg/ml、約120μg/ml、約140μg/ml、約160μg/ml、約180μg/ml、約200μg/ml、約250μg/ml、約300μg/ml、約350μg/ml、約400μg/ml、約450μg/ml或約500μg/ml。抑制劑可與其他藥物活性劑聯(lián)合提供。

本文所述的藥物組合物可以以單劑量或多劑量的形式施用；以單獨的治療劑施用或與其他治療劑聯(lián)合施用；以及與常規(guī)療法相組合(可依次或同時施用)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明眼用制劑在人和/或動物治療中的每日劑量為約每只眼1滴、約每只眼2滴、約每只眼3滴、約每只眼4滴、約每只眼5滴、約每只眼6滴、約每只眼7滴、約每只眼8滴、約每只眼9滴、約每只眼10滴、約每只眼11滴、約每只眼12滴或多于約每只眼12滴。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明眼用制劑在人和/或動物治療中的每日施用計劃為約每天1次、約每天2次、約每天3次、約每天4次、約每天5次、約每天6次、約每天7次、約每天8次、約每天9次、約每天10次、約每天11次、約每天12次或多于約每天12次。例如，可通過外徑為3mm的標準藥典藥用滴管將劑量標準化，該滴管在保持垂直時在25℃下遞送20滴總重量為0.9至1.1克的水。

當根據(jù)上述用藥計劃施用時，在人和/或動物中的治療方案可無限期延續(xù)或直到未觀察到進一步改善。或者，該治療方案可持續(xù)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、150天、200天、250天、300天、400天、500天、750天、1000天或多于1000天。

在治療或預(yù)防白內(nèi)障中有效的化合物

在多個實施方案中，本發(fā)明方法或組合物的化合物為具有式i化合物的羊毛甾醇：

或其前藥或藥學上可接受的鹽。

例如，本發(fā)明方法或組合物的化合物為羊毛甾醇；其前藥或藥學上可接受的鹽。在一個實施方案中，該化合物為羊毛甾醇。在另一個實施方案中，上述化合物的任何前藥或藥學上可接受的鹽均被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

藥物組合物

在本發(fā)明的一些實施方案中，一種或多種治療性化合物的藥物組合物可通過將這些治療性化合物中的一種或多種配制在藥學上可接受的載體中來制備。如本文所用的，“藥學上或治療上可接受的載體”是指不干擾活性成分的生物活性的有效性并且對宿主或患者無毒的載體介質(zhì)。藥物制劑中使用的載體類型將取決于施用該治療性化合物的方法。制備用于多種給藥途徑的藥物組合物的許多方法是本領(lǐng)域公知的。

如本文所用的，“藥學上可接受的眼用載體”是指用于將結(jié)構(gòu)式1的化合物直接或間接遞送至眼睛、眼睛上或眼睛附近的藥學上可接受的賦形劑、載體、粘合劑和/或稀釋劑。因此，本發(fā)明進一步包括包含結(jié)構(gòu)式i的化合物及藥學上可接受的眼用載體的組合物。

任選地，所述組合物包含結(jié)構(gòu)式i的化合物的游離酸、游離堿、鹽(例如，酸或堿加成鹽)、水合物或前藥。如本文所用的短語“藥學上可接受的鹽”或“藥學上可接受的酸”分別是指式i化合物的藥學上可接受的有機或無機鹽或酸。反荷離子可為穩(wěn)定母體化合物上的電荷的任何有機或無機部分。此外，藥學上可接受的鹽(或酸)可在其結(jié)構(gòu)中具有多于一個帶電原子。多個帶電原子為藥學上可接受的鹽(或酸)的一部分的實例可具有多個反荷離子。因此，藥學上可接受的鹽(酸)可具有一個或多個帶電原子和/或一個或多個反荷離子。

示例性的鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、單寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(即，1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。藥學上可接受的鹽可涉及包括另一種分子如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他反荷離子。

所述前藥為包含與載體部分共價結(jié)合的結(jié)構(gòu)式i的化合物的物質(zhì)。該載體部分可在體外或體內(nèi)從結(jié)構(gòu)式1的化合物釋放，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)式i的化合物。前藥形式是本領(lǐng)域公知的，如在sloan,k.b.,prodrugs,m.dekker,newyork,1992以及testa,b和mayer,j.m.,hydrolysisindrugandprodrugmetabolism:chemistry,biochemistry,andenzymology,wiley-vch,zurich,2003中所例示的。

在本發(fā)明的一些實施方案中，通過將本發(fā)明組合物溶解在適當?shù)娜軇┲衼碇苽渌幬锝M合物。適當?shù)娜軇┌ǖ幌抻谒?、鹽溶液(例如，nacl)、緩沖溶液、軟膏、凝膠或其他溶劑。在某些實施方案中，該溶劑為無菌的。

在制備滴眼劑中使用的用于懸浮液的水溶液和稀釋劑可包括蒸餾水、生理鹽水等。這些藥物組合物可通過以下方式配制：根據(jù)常規(guī)方法將化合物任選地與適當?shù)乃幬锾砑觿┤缳x形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑和溶解助劑一起混合、稀釋或溶解，并根據(jù)劑型以常規(guī)方式配制。用于懸浮液的非水溶液和稀釋劑可包括食用(例如植物)油、液體石蠟、礦物油、丙二醇、對辛基十二烷醇、聚山梨醇酯、聚乙二醇、單硬脂酸鋁以及類似的溶劑。

多種添加劑可根據(jù)需要被包含在滴眼劑、眼用凝膠和/或眼用軟膏中。這些添加劑可包括適于接觸眼或在眼周圍使用而沒有過度毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激性、變態(tài)反應(yīng)等的附加成分、添加劑或載體?？稍谶m當情況下向制劑中加入添加劑如溶劑、基質(zhì)、助溶劑、懸浮劑、增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、等滲性調(diào)節(jié)劑、ph調(diào)節(jié)劑、螯合劑、舒緩劑、防腐劑、矯味劑、調(diào)味劑、著色劑、賦形劑、粘合劑、潤滑劑、表面活性劑、吸收促進劑、分散劑、防腐劑、增溶劑等。

例如，可通過將化合物溶解在溶有表面活性劑的無菌水中并任選地添加適當?shù)乃幬锾砑觿┤绶栏瘎⒎€(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和粘度改善劑來配制滴眼劑。

例如，添加緩沖劑以保持ph恒定，并且該緩沖劑可包括藥學上可接受的緩沖劑，如硼酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、酒石酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液或tris-hcl緩沖液(包含三(羥甲基)氨基甲烷和hcl)。例如，ph為7.4的tris-hcl緩沖液包含3g/l的三(羥甲基)-氨基甲烷和0.76g/l的hcl。在又一個方面，緩沖液為10×磷酸鹽緩沖鹽水(“pbs”)或5×pbs溶液。以提供對于預(yù)期的生理條件足夠的緩沖能力的量包含緩沖劑。

其他緩沖液包括但不限于基于以下物質(zhì)的緩沖液：在25℃下pka為7.5且ph在約6.8-8.2范圍內(nèi)的hepes(n-{2-羥乙基}哌嗪-n'-{2-乙磺酸})；在25℃下pka為7.1且ph在約6.4-7.8范圍內(nèi)的bes(n,n-雙{2-羥乙基}2-氨基乙磺酸)；在25℃下pka為7.2且ph在約6.5-7.9范圍內(nèi)的mops(3-{n-嗎啉基}丙磺酸)；在25℃下pka為7.4且ph在約6.8-8.2范圍內(nèi)的tes(n-三{羥甲基}-甲基-2-氨基乙磺酸)；在25℃下pka為7.6且ph在約6.9-8.3范圍內(nèi)的mobs(4-{n-嗎啉基}丁磺酸)；在25℃下pka為7.52且ph在約7-8.2范圍內(nèi)的dipso(3-(n,n-雙{2-羥乙基}氨基)-2-羥基丙烷))；在25℃下pka為7.61且ph在約7-8.2范圍內(nèi)的taps({(2-羥基-3{三(羥甲基)甲基氨基}-1-丙磺酸))；在25℃下pka為8.4且ph在約7.7-9.1范圍內(nèi)的taps({(2-羥基-1,1-雙(羥甲基)乙基)氨基}-1-丙磺酸))；在25℃下pka為8.9且ph在約8.2-9.6范圍內(nèi)的tabs(n-三(羥甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)；在25℃下pka為9.0且ph在約8.3-9.7范圍內(nèi)的ampso(n-(1,1-二甲基-2-羥乙基)-3-氨基-2-羥基丙磺酸)；在25℃下pka為9.5且ph在約8.6-10.0范圍內(nèi)的ches(2-環(huán)己基氨基)乙磺酸)；在25℃下pka為9.6且ph在約8.9-10.3范圍內(nèi)的capso(3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸)；以及在25℃下pka為10.4且ph在約9.7-11.1范圍內(nèi)的caps(3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸)。

除了緩沖液之外，還可以向滴眼劑中添加等滲劑以制備與淚液等滲的制劑。等滲劑包括但不限于糖類，如右旋糖、葡萄糖、蔗糖和果糖；糖醇，如甘露糖醇和山梨糖醇；多元醇，如甘油、聚乙二醇和丙二醇；以及鹽，如氯化鈉、檸檬酸鈉、苯扎氯銨、鹽酸麻黃堿(phedrinechloride)、氯化鉀、鹽酸普魯卡因(procainechloride)、氯霉素(chloramphenicol)和琥珀酸鈉。以使滴眼劑的滲透壓等于淚液滲透壓的量添加等滲劑。

可以添加防腐劑以維持滴眼劑和/或眼用軟膏的完整性。防腐劑的實例包括但不限于山梨酸、苯扎氯銨、芐十二烷基二甲基銨溴化物(benzododeciniumbromide)、對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、芐醇、苯乙醇、依地酸二鈉、山梨酸、聚季銨鹽-1或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他試劑。

在一些實施方案中，使用增稠劑來增加眼用制劑如滴眼劑、眼用凝膠和/或眼用軟膏的粘度?？梢允褂玫脑龀韯┌ǖ幌抻诟视?、聚乙二醇、羧甲基纖維素和羧基乙烯基聚合物。

除了上述物質(zhì)以外，在一些實施方案中，還期望使用附加的試劑，包括但不限于穩(wěn)定劑，如亞硫酸鈉、碳酸鈉和丙二醇；抗氧化劑，如抗壞血酸、抗壞血酸鈉、丁羥甲苯(bht)、丁羥茴醚(bha)、生育酚、硫代硫酸鈉；和/或螯合劑，如乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇-雙-(2-氨基乙基)-n,n,n,n-四乙酸(egta)和檸檬酸鈉。

滴眼劑、眼用凝膠和/或眼用軟膏可通過無菌操作來制備，或者可替代地在制備的合適階段進行滅菌。例如，無菌藥物組合物可以通過無菌地混合無菌成分來制備?；蛘?，該無菌藥物組合物可通過先將成分混合隨后將最終制劑滅菌來制備。滅菌方法可包括但不限于熱滅菌、輻射和過濾。

眼用軟膏(眼膏)可通過將活性成分混合至用于制備眼膏的基質(zhì)中，隨后采用本領(lǐng)域已知的任何方法配制成藥物制劑來無菌制備。用于眼膏的典型基質(zhì)的示例為凡士林、jelene50、plastibase以及聚乙二醇。此外，可以添加表面活性劑以增加親水性。

可使用多種用于活性劑的控制釋放的有效方法。參見，例如，waghv.d.,inamdarb.,samantam.k.,polymersusedinoculardosageformanddrugdeliverysystems.asianjpharm2,2008,12-17以及其中引用的參考文獻，其內(nèi)容通過引用并入本文。特別考慮使用聚合物(例如，纖維素衍生物，如羥丙基甲基纖維素(hpmc)和羥丙基纖維素(hpc)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酸酯、環(huán)糊精和天然樹膠、聚原酸酯(poe)以及粘膜粘附聚合物)；半固體，如凝膠、膜和其他插入物；樹脂，如離子交換樹脂；離子電滲遞送；以及膠粒，如微球和納米顆粒。

本發(fā)明的化合物還可以與其他治療劑聯(lián)合提供。在一些實施方案中，本發(fā)明的化合物可以與其他活性劑共同配制，該活性劑包括但不限于抗感染劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑、消炎藥、抗過敏劑(包括抗組胺藥)、人工淚液血管收縮劑、血管擴張劑、局部麻醉劑、鎮(zhèn)痛劑、眼壓降低劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、維生素和礦物質(zhì)、酶抑制劑或可替代的蛋白酶和肽酶、細胞因子抑制劑等。

在多個實施方案中，本發(fā)明的化合物還可以與眼部治療劑聯(lián)合提供，該眼部治療劑選自安賀拉(acular)(酮咯酸氨丁三醇眼用溶液)0.5％、acuvail(酮咯酸氨丁三醇)、ak-con-a(萘甲唑啉眼藥)、akten(鹽酸利多卡因)、alamast、alphagan(溴莫尼定)、alrex、astepro(鹽酸氮斯汀鼻噴霧劑)、azasite(阿奇霉素)、bepreve(苯磺酸貝他斯汀眼用溶液)、besivance(貝西沙星眼用懸浮液)、betaxon、bss無菌灌洗液、cosopt、durezol(二氟潑尼酯)、eylea(阿柏西普)、lotemax、lucentis(雷珠單抗)、lumigan(比馬前列素眼用溶液)、macugen(哌加他尼)、ocuflox(氧氟沙星眼用溶液)0.3％、ocuhist、ozurdex(地塞米松)、quixin(左氧氟沙星)、rescula(烏諾前列酮異丙基眼用溶液)0.15％、restasis(環(huán)孢菌素眼用乳液)、salagen片劑、travatan(曲伏前列素眼用溶液)、valcyte(鹽酸纈更昔洛韋)、三氟胸苷(viroptic)、vistide(西多福韋)、visudyne(注射用維替泊芬)、vitrasert植入物、福米韋生注射劑、zaditor、zioptan(他氟前列素眼用溶液)、zirgan(更昔洛韋眼用凝膠)、zymaxid(加替沙星眼用溶液)、阿托品、氟比洛芬、毒扁豆堿(physostimine)、派立明(azopt)、慶大霉素、匹魯卡品(proparacaine)、桿菌肽、羥丙甲纖維素眼液(goniosol)、多粘菌素b、聚維酮碘(betadine)、短桿菌肽、潑尼松龍、倍他洛爾、humorsol、丙美卡因、倍他洛爾眼液(betoptic)、hylartin、propine、布林佐胺、高滲nacl、puralube、bss、吲哚菁綠(indocycaninegreen)、玫瑰紅(rosebengal)、卡巴膽堿、伊曲康唑、透明質(zhì)酸鈉、頭孢唑啉、拉坦前列素、舒洛芬、瀟萊威(celluvisc)、甘露糖醇、土霉素、氯霉素、醋甲唑胺、噻嗎洛爾、ciloxan、咪康唑、妥布霉素、環(huán)丙沙星、miostat、曲安西龍、cosopt、muro128、三氟尿苷、demecarium、新霉素、托吡卡胺、地塞米松、甲醋唑胺(neptazane)、trusopt、地匹福林、ocuflox、阿糖腺苷、多佐胺、氧氟沙星、vira-a、腎上腺素、氧四環(huán)素、三氟胸苷、熒光素、苯腎上腺素和適利達(xalatan)。試劑盒

本發(fā)明的一些實施方案涉及用于預(yù)防和/或減輕與眼病相關(guān)的一種或多種癥狀的試劑盒。該試劑盒可包含含有一種或多種本文所述的治療性化合物的一個或多個容器。該化合物可以作為制備的藥物組合物存在于容器中，或者可替代地，該化合物可以是未經(jīng)配制的。在這樣的實施方案中，該試劑盒可以在容器中包含與藥學上可接受的載體分離的未配制的化合物。在使用之前，將該化合物用該藥學上可接受的載體稀釋或與之混合。

本文提供的試劑盒的一些實施方案還包含描述用于以某種方式施用所述藥物組合物的方法的說明，與眼病相關(guān)的一種或多種癥狀包括但不限于視網(wǎng)膜變性、老視、白內(nèi)障和/或眼晶狀體的核硬化。在一些實施方案中，該說明還描述了用于將包含在試劑盒中的治療性化合物與眼用藥學上可接受的載體混合的程序。

在本發(fā)明的一些實施方案中，包含本文所述治療性化合物的容器是用于眼部施用的容器。在某些實施方案中，該容器是用于施用滴眼劑的滴管。在其他實施方案中，該容器是用于施用眼用凝膠或眼用軟膏的管。

本發(fā)明的一些實施方案通過以下實施例進一步闡明，該實施例不應(yīng)被解釋為限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本文描述的本發(fā)明實施方案的實施中運作良好的技術(shù)，并因此可被認為構(gòu)成用于實施這些實施方案的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以在本文公開的具體實施方案中作出許多改變，并且仍可獲得同樣或相似的結(jié)果。

裝置

本發(fā)明的一些實施方案涉及用于將本發(fā)明甾醇施用于受試者的裝置。在一些實施方案中，該裝置包含含有配制在藥學上可接受的載體中的本發(fā)明甾醇的內(nèi)部部分、腔體或儲器。在這樣的實施方案中，該藥學上可接受的載體包括但不限于溶液、凝膠和軟膏。在某些實施方案中，該內(nèi)部部分、腔體或儲器含有本文所述的一種或多種含有本發(fā)明甾醇的藥物制劑。

在一些實施方案中，本文考慮的裝置還包含與該裝置的內(nèi)部部分、腔體或儲器耦合的涂抹器。該涂抹器可以為允許將含有本發(fā)明甾醇的藥物制劑從內(nèi)部部分、腔體或儲器遞送至眼睛的圓柱形、圓錐形或任何其他形狀。在優(yōu)選的實施方案中，該涂抹器為錐形圓筒，其中寬端與內(nèi)部部分、腔體或儲器耦合，并且錐形端形成含有本發(fā)明甾醇的藥物制劑到眼睛的通路的出口。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。雖然與本文所述的那些類似或等同的任何方法、裝置和材料可用于本發(fā)明的實施或測試，但現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的方法、裝置和材料。

本文提及的所有出版物均通過引用而全文并入本文，以用于描述和公開可能與當前描述的發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的出版物中描述的方法的目的。上文和整個文本中討論的出版物僅提供其在本申請的申請日之前的公開內(nèi)容。本文中的任何內(nèi)容都不應(yīng)被解釋為承認發(fā)明人無權(quán)因在先發(fā)明而早于此公開內(nèi)容。

以下實施例旨在說明本發(fā)明，而非以任何方式、形狀或形式明確地或隱含地限制本發(fā)明。雖然它們是可以使用的典型代表，但也可以替代地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他程序、方法或技術(shù)。

實施例1

人晶狀體主要由組裝成對于晶狀體透明度和折射率而言必需的高度有序、相互作用的宏觀結(jié)構(gòu)的晶體蛋白組成。對蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間相互作用的任何破壞都將改變此精細結(jié)構(gòu)，使疏水性表面暴露，并伴有后續(xù)的蛋白質(zhì)聚集和白內(nèi)障形成。在世界范圍內(nèi)白內(nèi)障是失明的最常見病因，其影響數(shù)千萬人，并且當前唯一的治療是手術(shù)去除白內(nèi)障晶狀體。晶狀體蛋白質(zhì)阻止聚集和保持晶狀體透明度的確切機制在很大程度上都是未知的。羊毛甾醇是在晶狀體中富集的兩性分子。它由羊毛甾醇合酶(lss)在膽固醇合成途徑的關(guān)鍵環(huán)化反應(yīng)中合成。這里我們鑒定了患有廣泛先天性白內(nèi)障的兩個家庭的兩種不同的純合lss錯義突變(w581r和g588s)。這兩種突變均影響高度保守的氨基酸殘基并削弱lss的關(guān)鍵催化功能。野生型而非突變的lss的工程化表達阻止多種致白內(nèi)障的突變晶體蛋白的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集。羊毛甾醇而非膽固醇治療顯著減少了在體外和細胞轉(zhuǎn)染實驗中預(yù)先形成的蛋白質(zhì)聚集體。我們進一步證明了羊毛甾醇治療既可以在體外降低切開的兔子白內(nèi)障晶狀體的白內(nèi)障嚴重程度并增加透明度，又可以在體內(nèi)降低狗的白內(nèi)障嚴重程度。我們的研究將羊毛甾醇鑒定為在阻止晶狀體蛋白質(zhì)聚集中的關(guān)鍵分子，并提出了用于白內(nèi)障預(yù)防和治療的新策略。

白內(nèi)障占全世界所有失明病例的半數(shù)以上，且唯一確定的治療包括手術(shù)去除不透明的晶狀體。在發(fā)達國家，由于該疾病在老年人群中的高患病率，使得白內(nèi)障手術(shù)占醫(yī)療保健費用的很大一部分。此外，在發(fā)展中國家中也有與白內(nèi)障相關(guān)的高發(fā)病率，其中手術(shù)治療的機會是有限的。

晶狀體纖維中高濃度的晶體蛋白有助于晶狀體的透明度和折射性能²。晶體蛋白超家族由a-、b-和c-晶體蛋白組成，它們是人體內(nèi)最高度濃縮的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的一些。蛋白質(zhì)聚集是白內(nèi)障形成中的一個最重要的因素³。導致蛋白質(zhì)聚集的因素包括晶體蛋白中的突變，已知這些突變導致先天性白內(nèi)障或氧化應(yīng)激，這轉(zhuǎn)而促成年齡相關(guān)性白內(nèi)障。然而，晶狀體蛋白質(zhì)保持透明度或引起渾濁的確切機制尚未完全了解。

羊毛甾醇合酶(2,3-氧代角鯊烯-羊毛甾醇環(huán)化酶，lss；ec5.4.99.7)由lss基因編碼。lss蛋白催化(s)-2,3-氧代角鯊烯轉(zhuǎn)化為羊毛甾醇，這是膽固醇、類固醇激素和維生素d的生物合成中的關(guān)鍵早期限速步驟(參考文獻4)。發(fā)現(xiàn)lss在晶狀體中表達⁵。據(jù)先前報道，lss和fdft1(法呢基二磷酸酯法呢基轉(zhuǎn)移酶1)上的亞效等位基因突變的特定組合可以降低晶狀體中的膽固醇水平并在shumiya白內(nèi)障大鼠(scr)中導致白內(nèi)障⁶。這里我們在兩個血緣家庭中鑒定lss基因中的新型純合突變，并研究羊毛甾醇減輕蛋白質(zhì)聚集和白內(nèi)障形成的能力。

鑒定了來自高加索人血統(tǒng)的血緣家庭的患有重度先天性白內(nèi)障的三名兒童(圖1a)。進行全外顯子組測序至目標區(qū)域上平均不低于55倍深度覆蓋(表1a)，以便鑒定致病突變。平均在每個外顯子組中檢測到60,800-80,800個snp(表1b)。使用血緣隱性模型和針對包括dbsnp和1000基因組計劃(1000genomesproject)在內(nèi)的公共數(shù)據(jù)庫中的共同變體(次等位基因頻率為0.5％)過濾以及突變功能預(yù)測(通過sift⁷、polyphen2⁸、phylop⁹和mutationtaster¹⁰預(yù)測)，我們縮小了潛在的候選基因變體，并將21號染色體上的lss中的變體(g588s)鑒定為最可能的候選物(表1c)。三名受影響的兒童對于lss中的gra轉(zhuǎn)換(g588s)是純合的，(grch37/hg19:chr21:47615645；nm_001001438.2:c.1762g.a，nm_001001438.1:p.g588s)，而未受影響的父親、母親和其余兒童對于該變化是雜合的(圖1a，圖1b)。全基因組snp基因分型通過homozygositymapper¹¹鑒定了三個長的連續(xù)純合區(qū)(chr2:q22.1–q24.1、chr2:q31.1–q32.1和chr21:q22.3；圖6a和表1d)。lss基因位于21號染色體上的一個純合區(qū)中(圖6b)。此外，我們在154個患有先天性白內(nèi)障的家庭中針對lss基因中的突變進行篩選，并在第二個血緣家庭中鑒定了另一個純合突變，w581r(grch37/hg19:chr21:47615666；nm_001001438.2:c.1741t.c，nm_001001438.1:p.w581r)(圖1a，圖1b，圖1c)。這兩種突變在11,000個對照染色體中是不存在的。

lss中的氨基酸殘基w581和g588是高度保守的(圖2a)。我們進行了計算建模分析，以研究w581r和g588s突變對lss的3d結(jié)構(gòu)和功能的影響。已報道位置581處的氨基酸色氨酸對環(huán)化酶活性的催化位點有貢獻¹²。g588s突變體通過原位替換及隨后的側(cè)鏈精修(refinement)來建模。s588側(cè)鏈精修不能解決絲氨酸側(cè)鏈與e578的骨架羰基之間的范德華力碰撞，該骨架羰基與r639形成關(guān)鍵的鹽橋。e579:c584環(huán)的取向需要扭曲以適應(yīng)該突變。突變s588的側(cè)鏈碰撞到相鄰的環(huán)，表明該突變與lss的正常酶結(jié)構(gòu)和功能不相容(圖2b)。該計算機模擬結(jié)果得到以下證據(jù)的支持：細胞轉(zhuǎn)染實驗中野生型lss的表達顯示出環(huán)化酶活性，并顯著增加了hela細胞的脂質(zhì)部分中羊毛甾醇的產(chǎn)生量，而w581r和g588s突變蛋白質(zhì)均未顯示任何環(huán)化酶活性(圖2c)。相反，膽固醇水平未受野生型或突變lss的表達的影響，這表明可能存在膽固醇體內(nèi)平衡的替代途徑。與野生型lss相比，w581r和g588s突變沒有改變亞細胞定位或?qū)е耹ss蛋白的聚集體，這表明白內(nèi)障表型并非由于通過突變lss蛋白自身形成光散射粒子而產(chǎn)生(圖7)。晶體蛋白——晶狀體中主要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)——的聚集是多種類型的白內(nèi)障的主要病因³。為了模擬白內(nèi)障晶狀體中的蛋白質(zhì)聚集，在人晶狀體祖細胞、人晶狀體上皮細胞系b-3(hleb-3)或hela細胞中表達六種已知的致白內(nèi)障突變晶體蛋白。在全部三種轉(zhuǎn)染的細胞系中，這些突變晶體蛋白形成p62-陽性包涵體/聚集體，這表明聚集是突變晶體蛋白的固有特性(圖3a以及圖8和圖9)¹³。野生型lss和致白內(nèi)障的突變晶體蛋白的共表達顯著減小了細胞內(nèi)晶體蛋白聚集體的數(shù)目和大小，而lss突變體不能單獨實現(xiàn)這一點(圖3b、圖3c以及圖8和圖9)。蛋白質(zhì)印跡分析表明，aa-晶體蛋白的y118d突變體從細胞內(nèi)聚集體中釋放，并且具有野生型lss的變得更易溶(圖3d和圖9c)。此外，在共表達lss突變體和突變晶體蛋白的細胞的培養(yǎng)基中添加羊毛甾醇而非膽固醇成功地減少了晶體蛋白聚集(圖3c以及圖8和圖9)。該結(jié)果表明，羊毛甾醇而非膽固醇可能是從聚集釋放突變晶體蛋白的有效藥劑。

該假設(shè)得到以下證據(jù)的支持：羊毛甾醇以濃度依賴性方式顯著抑制了野生型和突變的晶體蛋白的聚集體形成，而膽固醇沒有效果(圖3e、圖3f和圖10)。羊毛甾醇而非膽固醇增加了細胞裂解物的可溶部分中突變晶體蛋白的量(圖3g和圖11a)。利用表達aa-晶體蛋白的gfp-融合y118d突變體的細胞的連續(xù)活細胞成像，我們證明了添加羊毛甾醇可以有效減少半衰期為22268分鐘的晶體蛋白聚集體(圖3h)，而添加dmso或膽固醇沒有減少聚集體形成(圖11b)?；罴毎械膯瘟Ｗ痈櫱宄仫@示，羊毛甾醇在分解預(yù)先形成的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集體中具有重要作用。

為了研究羊毛甾醇是否對聚集的蛋白質(zhì)的分解具有直接作用，通過在1m鹽酸胍的存在下加熱野生型和突變的晶體蛋白獲得了五種野生型晶體蛋白和九種突變晶體蛋白的聚集體。在該條件下，如由硫代黃素t(tht)熒光的增強、在負染色的透射電子顯微鏡(tem)下的纖維結(jié)構(gòu)以及低濁度值所顯示的(圖4和圖11c)，所有晶體蛋白均形成了淀粉樣纖維。在此獲得的淀粉樣纖維的形態(tài)類似于先前報道的那些晶體蛋白¹⁴。由二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)形成的含pbs的脂質(zhì)體用來增加甾醇化合物的溶解度并模擬甾醇在細胞膜中的狀態(tài)。如由負染色的tem照片中纖維結(jié)構(gòu)的消失和tht熒光強度的減小所示的(圖4和圖11d)，羊毛甾醇而非膽固醇成功地以濃度依賴性方式再溶解了來自淀粉樣纖維的聚集的晶體蛋白。作為一個實例，再溶解的αa-晶體蛋白可以在負染色的tem圖片中得到確認，并且大小為約15nm(圖4a)¹⁵。

為了評估羊毛甾醇對減少晶狀體組織中的白內(nèi)障的作用，從兔子中分離出天然存在的白內(nèi)障晶狀體，并將其在25mm羊毛甾醇溶液中溫育6天，并比較羊毛甾醇治療前后的晶狀體清晰度。如由晶狀體清晰度的增加所示的(p<0.003，wilcoxon檢驗，圖5a，圖5b，表2a以及圖12a、圖12b)，觀察到強烈的白內(nèi)障嚴重程度降低趨勢。我們進一步研究了羊毛甾醇在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)狗的白內(nèi)障的作用。羊毛甾醇治療顯著降低了白內(nèi)障嚴重程度，并增加了晶狀體清晰度(p<0.009，wilcoxon檢驗，圖5c，圖5d；表2b和圖12c)。

影響lss的催化功能的純合突變導致伴有嚴重視覺喪失的廣泛先天性白內(nèi)障。羊毛甾醇在白內(nèi)障預(yù)防中的關(guān)鍵作用得到以下觀察結(jié)果的支持：攜帶復合lss突變的大鼠品系概括了人白內(nèi)障疾病表型⁶。與此見解相一致的是，發(fā)現(xiàn)lss抑制劑(也稱為氧代角鯊烯環(huán)化酶抑制劑)u18666a對lss的抑制導致白內(nèi)障¹⁶。此外，羊毛甾醇治療顯著地減少了在細胞培養(yǎng)物中由突變晶體蛋白引起的蛋白質(zhì)聚集，同時在動物模型中降低了預(yù)先形成的白內(nèi)障嚴重程度，從而增加了晶狀體清晰度?？梢韵胂?，羊毛甾醇的兩性性質(zhì)允許其嵌入并包覆大蛋白質(zhì)聚集體的疏水核區(qū)域，從而有效地使這些聚集再次逐漸變?yōu)樗苄缘摹?/p>

總之，羊毛甾醇在抑制晶狀體蛋白質(zhì)聚集和減少白內(nèi)障形成方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，這提出了預(yù)防和治療白內(nèi)障的新策略。白內(nèi)障是失明的主要病因，并且每年有數(shù)百萬患者接受白內(nèi)障手術(shù)以去除不透明的晶狀體。該手術(shù)雖然非常成功，但伴隨有并發(fā)癥和發(fā)病率。因此，用于逆轉(zhuǎn)白內(nèi)障的藥理學治療可具有巨大的健康和經(jīng)濟影響。此外，通過鼓勵研究小分子方法，如本文所示的方法，我們的結(jié)果對于治療蛋白質(zhì)聚集疾病可具有更廣泛的意義，該蛋白質(zhì)聚集疾病包括神經(jīng)變性疾病和糖尿病，它們共同成為老年人群中發(fā)病率和死亡率的重要病因。

方法

研究參與者。所有參與者均進行標準的全面眼科檢查和影像學研究。在首次訪視時收集人口數(shù)據(jù)、風險因素和血液樣品。我們招募了一個由兩名成人和四名兒童組成的血緣家庭。父母是嫡堂表親，并且他們四個孩子中的三個被診斷為患有視網(wǎng)膜變性和白內(nèi)障(圖1a)。我們在另外154個先天性白內(nèi)障系譜中針對lss突變進行篩選，并鑒定了另一個具有純合w581r突變的家庭。

外顯子組捕獲和測序。使用agilentsureselecthumanallexon試劑盒(溶液中)根據(jù)制造商的方案進行外顯子組捕獲。簡而言之，通過covaris將基因組dna樣品進行隨機片段化，其中所得片段的堿基對峰為150-200bp，并且銜接子與片段的兩端連接。使用agencourtampurespri珠子對銜接子連接的模板進行純化，并且切下插入片段大小約為250bp的片段。提取的dna通過連接介導的pcr進行擴增，純化，并與sureselectbiotinylatedrna文庫(baits)雜交以供富集。雜交的片段與鏈霉親和素珠子結(jié)合，而非雜交的片段在24h后被洗出。使捕獲的連接介導的pcr產(chǎn)物在agilent2100生物分析儀上分析以估算富集的量級。隨后將每個捕獲的文庫加載到illuminagenomeanalyzerii平臺上，并以讀長90bp進行配對末端測序，這為每個樣品提供了至少50×的平均覆蓋深度。由采用默認參數(shù)的illumina堿基判定軟件處理原始圖像文件。

讀序作圖和變體檢測。使用bwa¹⁷(0.5.9–r16版)將每個個體的序列讀序與人參考基因組(ncbi版本37，hg19)進行比對。隨后利用基因組分析工具箱(genomeanalysistoolkit)(gatk2.8版)用gatk¹⁸最佳實踐管線(bestpracticepipeline)處理由bwa創(chuàng)建的bam文件，以進行再比對和變異(snv和插入缺失)檢測。提取通過vqsr過濾標準的變異以供后續(xù)分析。

使用推薦的參數(shù)通過soapsnp(v1.03)和bwa(0.5.9–r16版)對目標區(qū)域中的共有基因型進行判定。phred樣質(zhì)量至少為20且覆蓋深度至少為4×的共有基因型被認為是高可信度基因型。提取與參考不同的基因型作為候選snp，并且如下過濾snp結(jié)果：phred樣snp質(zhì)量≥20，總深度為4×至200×，拷貝數(shù)估計值<2，并且兩個鄰近snp之間的距離不小于5bp。

遺傳變體的功能注釋。變體使用annovar進行功能注釋并分類為錯義突變、無義突變、連讀突變和剪接位點突變，它們與同義突變和非編碼突變相比很可能是有害的?；谶@些注釋，首先針對非同義、剪接受體位點和供體位點對變體進行過濾，隨后針對可獲得的公共數(shù)據(jù)庫(dbsnp129和1000基因組變體數(shù)據(jù)庫)進行過濾。被發(fā)現(xiàn)在所述三位受影響的受試者中是純合突變且在攜帶者(父母)中是雜合突變但在公共數(shù)據(jù)庫中不存在的變體，被認為是候選致病變體。

lss和基因的突變篩選。進行sangerdna測序以驗證lss中的g588s突變。將lss基因中的22個外顯子通過pcr進行擴增，并在遺傳分析儀(geneticanalyzer)3130(appliedbiosystems)上進行測序。用來擴增lss中的外顯子的引物示于表3a中。我們在154個患有先天性白內(nèi)障的家庭中針對lss基因中的突變進行了篩選，并在第二個血緣家庭中鑒定了另一個純合突變w581r。這兩種突變在11,000個對照染色體(包括來自sandiego的未受影響的對照人群和1000基因組計劃的2,000個染色體，以及來自華盛頓大學外顯子組測序數(shù)據(jù)庫的8,000個染色體)中不存在。由于先前報道fdft1突變修飾白內(nèi)障表型，因此我們篩選了fdft1基因中的變體，鑒定了僅一個共同的非同義變體rs4731(grch37/hg19:chr8:11666337；nm_001287742.1:c.134a.g,nm_001274671.1:p.k45r)。因為未受影響的女兒攜帶相同的純合變化，并且相對較高頻率的一般人群具有該變體(在1000基因組計劃數(shù)據(jù)中次等位基因頻率為.4％)(表1e)，所以該變體作為致病突變被排除。

g588s突變的3d建模。由ruf等人²⁰確定并且以條目1w6k和1w6j¹²登錄在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的兩個結(jié)構(gòu)來構(gòu)建g588s突變體的模型。使用x射線坐標構(gòu)建該酶的全原子模型，并且使用內(nèi)坐標力學程序(internalcoordinatemechanicsprogram)(icm)及其pdb轉(zhuǎn)換方案²¹將該模型精細化。為了分析g588s突變誘導的碰撞對羊毛甾醇結(jié)合的影響，我們使用1w6k結(jié)構(gòu)分析了與羊毛甾醇相互作用的酶的口袋所涉及的所有側(cè)鏈。將接觸面積計算為具有羊毛甾醇與不具有羊毛甾醇的每個殘基的溶劑可及面積之間的差，并且使用icm程序²²按大小對接觸面積進行排序。

質(zhì)粒構(gòu)建體和定點誘變。含有l(wèi)sscdna的克隆購自thermoscientificinc.。將野生型lss的編碼序列克隆并插入pcdna3.1-n-flag質(zhì)粒(invitrogen)中。通過使用pcr的重疊延伸經(jīng)由定點誘變來構(gòu)建突變體。共同pcr引物為：ndei正向，59-catatgacggagggcacgtgtct-39，以及xhoi反向，59-ctcgagtcaggggtggccagcaag-39。用于構(gòu)建w581r和g588s突變體的引物為：w581r正向，59-tgggaaggctcccggggagtttgct-39；反向，59-gtgaagcaaactccccgggagccttc-39；g588s正向，59-gcttcacctacagcacctggtttg-39；g588s反向，59-ccaaaccaggtgctgtaggtgaag-39。將含有野生型或突變的lss基因的重組pcdna3.1-n-flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(e.coli)dh5a細胞中。如先前所述^23-26，從人晶狀體的總cdna克隆aa-、ab-、bb2-、cc-和cd-晶體蛋白的cdna。使用表3b中列出的引物通過定點誘變構(gòu)建突變體。擴增的片段用xhoi和bamhi消化，隨后插入真核表達載體pegfp-n1或原核表達載體pet28a中。使用plasmidmaxiprep試劑盒(vigorous)獲得質(zhì)粒，并通過dna測序進行驗證。將晶體蛋白基因構(gòu)建體制備為c-末端egfp融合蛋白，而將lss制備為n-末端flag標記的蛋白質(zhì)。

細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。hela細胞和人晶狀體上皮b-3細胞(hleb-3)從atcc獲得。從人胎兒眼中分離出人晶狀體祖細胞²⁷。將hela細胞在含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基(gibco)中培養(yǎng)。將hleb-3細胞在含有20％fbs的f12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而將人晶狀體祖細胞在含有20％fbs和10mgml^-1fgf的mem培養(yǎng)基(gibco)中培養(yǎng)。所有細胞均在37℃下在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞經(jīng)常規(guī)測試為支原體污染陰性。

為了評估lss表達對甾醇含量的影響，將hela細胞用在編碼區(qū)的n-末端處與flag標記物融合的野生型lss或lss突變體進行轉(zhuǎn)染。在24h轉(zhuǎn)染后收獲細胞并提取脂質(zhì)部分以供lc–ms分析。用載體pcdna3.1-n-flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞用作對照。通過使用小鼠抗-flag(f1804；sigma-aldrich)和小鼠抗肌動蛋白抗體(bs6007m；bioworldtechnology)的蛋白質(zhì)印跡分析對野生型和突變lss的表達水平進行歸一化。

為了評估羊毛甾醇對晶體蛋白聚集的影響，將人晶狀體祖細胞用lss和多個晶體蛋白構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染4h。用晶體蛋白突變體和pcdna3.1-n-flag共轉(zhuǎn)染的細胞用作對照。在分析聚集體之前將用lss和晶體蛋白突變體構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的人晶狀體祖細胞培養(yǎng)12h。在16h后通過向細胞培養(yǎng)基中添加40mm甾醇(羊毛甾醇或膽固醇，sigma-aldrich)進行拯救實驗2h，隨后將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基并培養(yǎng)細胞24h。從十個隨機選擇的視野計算具有晶體蛋白聚集體的細胞的百分比。計算野生型lss組、突變體組和突變體加羊毛甾醇組的值。用1％dmso處理的細胞用作對照。

在單盲觀察者研究中評估lss和羊毛甾醇對細胞內(nèi)晶體蛋白聚集的影響。實驗重復至少三次。使用studentt檢驗計算p值。熒光顯微鏡檢查。將等量的人晶狀體祖細胞、hleb-3細胞或hela細胞接種在用tc(solarbio)預(yù)處理的玻璃蓋玻片上。在培養(yǎng)24小時達到90％匯合后，將細胞用含有不同lss或晶體蛋白基因的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，或用含有某個晶體蛋白基因的質(zhì)粒和含有野生型或突變的lss基因的質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染。對照是用含有pegfp-n1和/或pedna3.1-n-flag的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞。使用lipofectamine3000(invitrogen)根據(jù)制造商的說明進行轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染。

根據(jù)flag–lss和晶體蛋白–gfp在人晶狀體祖細胞、hleb-3細胞或hela細胞中的共表達來評估野生型或突變的lss對多種致白內(nèi)障的晶體蛋白突變體的細胞內(nèi)聚集的影響。使用gfp或抗flag抗體對蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)分布進行可視化。在共轉(zhuǎn)染4h之后，將細胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，隨后通過顯微鏡檢查進行分析。

通過用含有不同晶體蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞來研究羊毛甾醇或膽固醇對多種晶體蛋白的聚集體形成的影響。將細胞溫育24h以實現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)表達和聚集體形成。隨后用在1％(對于人晶狀體祖細胞)或2％dmso(對于hela細胞)中的0–40mm甾醇處理細胞。用1％或2％dmso處理的細胞用作對照。在處理2h之后，將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基。在12h之后，將細胞用于顯微鏡分析。

如下制備顯微鏡檢查樣品：將玻片用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)洗滌三次。將細胞用4％低聚甲醛固定40min，接著用pbs另外洗滌三次。將細胞用在pbs中的0.1％tritonx-100(sigma)透化處理10min，并用在pbs中的5％正常山羊血清在37℃下封閉1h。如下進行免疫染色：添加在含有5％正常山羊血清的pbs緩沖液中的小鼠抗-flag抗體(1:500)或小鼠抗-p62抗體(1:200，ab56416；abcam)，并在37℃下溫育1h。隨后將玻片用pbs洗滌三次，并進一步與alexa649綴合的山羊抗小鼠igg(1:250)一起在環(huán)境溫度下溫育1h。用hoechst33342(invitrogen)對細胞核進行復染。使用carlzeisslsm710共聚焦顯微鏡分析所固定的細胞。

活細胞成像。將人晶狀體祖細胞用含有αa-晶體蛋白(y118d)突變體的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。在24h轉(zhuǎn)染期之后，通過在含有0.8mgm1^-1g418的培養(yǎng)基中溫育7天來篩選具有αa-晶體蛋白(y118d)突變體的穩(wěn)定表達的細胞。隨后，將獲得的細胞接種到玻璃底細胞培養(yǎng)皿(invitroscientific)上，并用1％dmso、在1％dmso中的40mm膽固醇或在1％dmso中的40mm羊毛甾醇處理4h。添加新鮮培養(yǎng)基，并通過連續(xù)活細胞成像來分析細胞。用olympusix81顯微鏡觀察活細胞圖像并用cellsensdimension軟件(olympus)捕獲圖像。通過在活細胞成像中使用單粒子跟蹤測量p62-陽性聚集體的熒光密度進行聚集體大小的定量分析。使用三個生物重復品(每個重復1-8次)進行活細胞成像。

細胞的脂質(zhì)提取。使用bligh和dyer的方法²⁸進行脂質(zhì)的提取。簡而言之，將約1×10⁶-10⁷個hela細胞用pbs洗滌3-5次，隨后在400-ml冰冷的甲醇中刮下，并轉(zhuǎn)移至添加有200ml氯仿的1.5mleppendorf管中。將樣品渦旋攪拌1min，隨后與300ml的1mkcl混合。通過在4℃下以20,817×g微量離心5min來分離有機相和水相。分離后，收集下部的有機相。隨后使用300ml氯仿將剩余的水相再萃取兩次。使用speedvac樣品濃縮器在真空下干燥收集的有機相。將干燥的樣品在280℃下儲存以供進一步的lc-ms分析。

lc–ms分析。將干燥的脂質(zhì)提取物重懸于100ml甲醇中。將樣品渦旋攪拌10min，通過80w超聲波降解法處理30min，在20,817g下微量離心10min，隨后將上清液轉(zhuǎn)移至新的eppendorf管中。微量離心處理重復三次。使用替代的氣壓化學電離(apci)源，通過agilent1290/6460三級四極(triplequadrupole)lc/ms分析得到的樣品。使用agilentsb-c18柱分離脂質(zhì)。使用電子電離模式進行選擇性離子監(jiān)測。使用高純度的羊毛甾醇和膽固醇作為對照。使用350℃的氣體溫度、4lmin^-1的氣體流速、60p.s.i.的噴霧器、350℃的汽化器、3,500v的毛細管和4ma的電暈電流進行ms測定。為了優(yōu)化靈敏度和特異性，針對每種化合物的ms分析選擇兩種限定離子(qualifierion)(對于膽固醇為369.3/161.1和369.3/147，而對于羊毛甾醇為409.2/191.3和409.2/109)。蛋白質(zhì)印跡法。在含有50mmtris(ph8.0)、150mmnacl、1％tritonx-100、1mmedta、0.5％脫氧膽酸鈉和0.1％sds的ripa緩沖液中制備細胞裂解物。通過離心分離上清液和沉淀部分。通過12.5％sds–page分離蛋白質(zhì)并將該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至pvdf膜(gehealthcare)。分別使用小鼠抗flag抗體(f1804；sigma-aldrich)或抗gfp抗體(mb2005；bioworldtechnology)鑒定超表達的lss和晶體蛋白。使用軟件gelpro(mediacybernetics)來實現(xiàn)對蛋白質(zhì)印跡條帶的定量。從三個獨立實驗計算所呈現(xiàn)的定量數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)表達和純化。使his標記的重組野生型和突變b-和c-晶體蛋白在大腸桿菌中超表達，并使用ni-nta親和柱及隨后的凝膠過濾色譜法，采用如別處所述^23,24,26,29的相同方案進行純化。如先前所述³⁰進行非標記的αa-和αb-晶體蛋白的超表達和純化。如通過12.5％sds–page、10％非變性page上的一個均質(zhì)條帶和尺寸排阻色譜圖中的單峰所評估的，蛋白質(zhì)的純度被估計為95％以上。通過使用bsa作為標準，根據(jù)bradford法測定蛋白質(zhì)濃度³¹。在含有150mmnacl、1mmedta和1mmdtt的20mmpbs緩沖液中制備所有蛋白質(zhì)樣品。

蛋白質(zhì)聚集和聚集體分解。通過在60℃下加熱含有1m鹽酸胍(超純，sigma-aldrich)的濃度為5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液2h獲得野生型和突變的αa-和αb-晶體蛋白的聚集體。通過在37℃下加熱含有1m鹽酸胍的蛋白質(zhì)溶液48h制備野生型和突變的b-和c-晶體蛋白的聚集體。聚集體的形成通過tht熒光、濁度(400nm下的吸光度)和透射電子顯微鏡(tem)觀察來確認。將預(yù)先形成的聚集體以0.2mg/ml(約10mm)的最終濃度重懸于20mmpbs中。在37℃下用在由500mmdppc(sigma-aldrich)形成的脂質(zhì)體中的500mm羊毛甾醇或膽固醇處理重懸的聚集體。用500mmdppc脂質(zhì)體處理的聚集體用作陰性對照。在處理24h之后，將蛋白質(zhì)溶液用于tht熒光、濁度和負染色的tem觀察。通過將蛋白質(zhì)溶液沉積到新鮮輝光放電的碳涂覆的銅網(wǎng)格上來制備tem樣品。通過用1.25％乙酸鈾酰對網(wǎng)格染色30s獲得負染色樣品。在電壓為120kv且放大倍數(shù)為48,000的hitachih-7650b透射電子顯微鏡上得到負染色的tem圖片。

白內(nèi)障兔子晶狀體的處理。通過吸入co2對兔子施以安樂死且立即切開晶狀體，并用媒介物或溶解于媒介物中的羊毛甾醇處理以制成25mm溶液。將晶狀體組織在室溫下、黑暗中在這些溶液中溫育6天。在顯微鏡下檢查白內(nèi)障并拍照。白內(nèi)障的程度由不知情的檢查者使用先前描述的渾濁分級系統(tǒng)進行評估，如下所示^32,33。通過目測和分級對晶狀體清晰度和透明度的改善進行定量。通過透光性、晶狀體下面的網(wǎng)格圖像的清晰度(圖12)以及晶狀體總體清晰度的改善或皮質(zhì)性白內(nèi)障局部區(qū)域的清晰度的改善來對晶狀體清晰度進行評分。使用wilcoxon檢驗來評估治療效果。

白內(nèi)障分級系統(tǒng)。0級：不存在渾濁(網(wǎng)格線清晰可見)；n1級：輕微程度的渾濁(網(wǎng)格線最低程度的混濁，但網(wǎng)格線仍然可見)；n2級：存在涉及幾乎整個晶狀體的彌漫性渾濁(網(wǎng)格線中度混濁，但主要的網(wǎng)格線可見)；n3級：存在涉及整個晶狀體的廣泛、密集的渾濁(網(wǎng)格線完全混濁，且網(wǎng)格線根本不可見)。

載藥納米顆粒的制備。通過修改的納米沉淀法³⁴將羊毛甾醇負載到脂質(zhì)-聚合物混合納米顆粒中。簡而言之，將所需濃度的羊毛甾醇與溶解在乙腈中的聚己內(nèi)酯(pcl)聚合物混合。以該pcl聚合物重量的20％，將卵磷脂和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-羧基(聚乙二醇)2000(dspe-peg-cooh)溶解在4％乙醇水溶液中，并加熱至60℃以上。隨后在輕柔攪拌下將羊毛甾醇/pcl溶液添加至預(yù)熱的脂質(zhì)溶液中，接著劇烈渦旋3min。隨后將該混合溶液攪拌2h以使納米顆粒形成并使乙腈蒸發(fā)。然后，使用截留分子量為10kda的amiconultra-4離心過濾器(millipore)將納米顆粒溶液洗滌三次，以去除剩余的有機溶劑和游離分子。隨后將所得納米顆粒重懸于pbs緩沖液中以供后續(xù)使用。通過動態(tài)光散射表征載藥納米顆粒的大小、大小分布和表面ζ電位。通過高效液相色譜法對羊毛甾醇的負載量進行定量。

狗的白內(nèi)障晶狀體的治療。為了評估羊毛甾醇治療對活動物的白內(nèi)障的效果，采用肌肉內(nèi)注射乙酰丙嗪(acepromaxine)和布托啡諾對狗進行預(yù)先藥物治療。20min之后，通過靜脈內(nèi)施用異丙酚進行麻醉誘導。隨后立即給狗插管并保持2lmin^-1的氧氣和2％異氟烷。首先使用28號針頭將負載羊毛甾醇(100mg)的納米顆粒注射到測試眼的玻璃體腔中，隨后在實驗期間每3天給予一次。治療眼或假治療眼是隨機的。向?qū)φ昭劢o予具有空納米顆粒載體的注射劑作為陰性對照。采用在局部滴眼劑中的羊毛甾醇(參見以下滴眼劑配方)對治療眼進行治療。在6周內(nèi)，每日三次將一滴50-ml羊毛甾醇施用于測試眼。通過裂隙燈檢查白內(nèi)障嚴重程度并在6周治療期開始和結(jié)束時拍照。在檢查之前，用1％托品酰胺和10％苯腎上腺素散瞳。白內(nèi)障嚴重程度由不知情的檢查者來評估，并根據(jù)如下所示的犬白內(nèi)障階段進行評分³⁵。對晶狀體清晰度和透明度的改善進行定量。使用wilcoxon檢驗評估治療效果。

犬白內(nèi)障的分級系統(tǒng)。0級：不存在渾濁(無白內(nèi)障)；n1級：輕微程度的渾濁(初期)；n2級：存在涉及幾乎整個晶狀體的彌漫性渾濁(未成熟期)；n3級：存在涉及整個晶狀體的廣泛、密集的渾濁(成熟期)局部媒介物溶液。將雙蒸h2o添加至與0.055g烷基二甲基芐基氯化銨組合的1.1g(edta)2na中，直到最終體積達到1.1l(ph5.66)。局部媒介物溶液中的25mm羊毛甾醇。將雙蒸h2o添加到12.5g羊毛甾醇、1.1g(edta)2na、0.055g烷基二甲基芐基氯化銨和200mletoh的混合物中至最終體積為1.1l。

在一個實施方案中，羊毛甾醇滴眼劑溶液的配方為：

配方

僅含媒介物的溶液：

隨后添加ddh2o直到最終體積為1.1l(ph5.66)

在媒介物中含有5mm羊毛甾醇的溶液：

隨后添加ddh2o直到最終體積為1.1l(ph5.66)

表1外顯子組測序和變體

表1a.外顯子組測序數(shù)據(jù)生成的總結(jié)

表1b.檢測的變體的總結(jié)

表1c.外顯子組測序后的變體優(yōu)先化管線

*在受影響的兒童中為純合的，在攜帶者中為雜合的，在未受影響的兒童中沒有純合突變體

表ld.全基因組基因分型數(shù)據(jù)的總結(jié)

表le.在基因fdft1上檢測到的編碼變體

表2羊毛甾醇在兔子白內(nèi)障晶狀體和狗白內(nèi)障中的治療效果

表2a.羊毛甾醇在兔子白內(nèi)障晶狀體中的治療效果

表2b.羊毛甾醇在狗白內(nèi)障中的治療效果

表3用于對人lss基因中的每個外顯子進行測序和構(gòu)建晶體蛋白突變體的引物

表3a.用于pcr擴增和對人lss基因中的每個外顯子進行測序的引物

表3b.用于構(gòu)建晶體蛋白突變體的引物

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