相關申請

本申請要求2014年10月24日遞交的英國申請第1419013.6號、2014年10月24日遞交的英國申請第1419012.8號和2014年10月24日遞交的英國申請第1319011.0號的優(yōu)先權。這些申請的全部內容在此通過引用明確的并入本文。

本發(fā)明涉及透細胞質膜傳遞的試劑。本發(fā)明的主題內容可以包括，例如，將分子、生物學和藥理學治療劑傳遞到目標區(qū)域，例如，細胞、組織或者器官。

背景技術：

盡管在一些領域已經有了技術上的發(fā)展，但是由于例如分子尺寸、分子電荷等因素的影響，將某些特定分子傳遞進入細胞仍然存在挑戰(zhàn)。質膜或者細胞膜是一種半滲透性的生物膜，能夠起到選擇性隔離的作用，調節(jié)細胞的化學組成。因此，只有特定的某些分子可以通過被動擴散穿過質膜進入細胞。小的、疏水性的分子(例如，o2、co2和n2)以及小的、不帶電荷的極性分子(例如，h2o和甘油)可以通過被動擴散穿過質膜。大的、不帶電的極性分子(比如氨基酸、葡萄糖，和核苷酸)和離子(比如h+、na+、k+和cl-)不能被動地擴散入細胞。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即，通過將細胞與一種包含待傳遞化合物(例如，有效裝載)和能夠可逆的滲透或者溶解細胞膜的試劑的溶液相接觸，所述化合物或者化合物的混合物(組合物)可以被傳遞到真核細胞的細胞質中。優(yōu)選的，所述溶液以噴霧的形式被傳遞到細胞中，例如，五水和的顆粒。例如，所述細胞被噴霧包覆而不是將所述細胞滲透或者浸沒在包含待傳遞化合物的溶液中。能夠滲透或者溶解真核細胞膜的示范性的試劑包括醇類和去污劑，分別例如乙醇和tritonx-100。其他示范性的去污劑(例如，表面活性劑)包括聚山梨酸酯20(例如、吐溫20)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基胺]丙烷磺酸鹽(chaps)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基胺]-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(chapso)、十二烷基硫酸鈉(sds)，和辛基葡糖苷。

用于實現(xiàn)包覆一群被包覆的細胞的情況的實施例包括傳遞微細細粉顆粒噴霧，例如，所述情況不包括向細胞上滴入或者通過移液管加入大量的溶液使細胞群基本上被滲透或者被大量流體淹沒。因此，所述霧或者噴霧包括一定的液體體積與細胞體積比例。作為選擇，所述情況包括霧或者噴霧的體積與暴露的細胞面積(例如，在基本上平的平面上，例如組織培養(yǎng)皿的底部，例如，組織培養(yǎng)皿的小孔中，例如，微滴定組織培養(yǎng)皿中，當細胞以交會層或者基本上交會層的形式存在時暴露的細胞膜面積)的比例。

因此，有需要提供一種不含載體，例如不含病毒載體的方法用于傳遞生物學上相應的有效裝載，例如，化合物或者組合物，使其穿過質膜進入細胞?！柏撦d”或者“有效負載”是用于描述化合物或者組合物的術語，所述化合物或者組合物通過水溶液被傳遞穿過細胞質膜進入細胞內部。

在一個方面中，將有效裝載傳遞通過細胞質膜包括提供細胞群并將此細胞群與一定體積的水溶液接觸。所述水溶液包括有效裝載和醇類，含量大于5濃度百分比。所述水溶液的量可以是細胞群暴露表面面積的函數，或者可以是細胞群中細胞數目的函數。

在另一個方面，用于傳遞有效裝載通過細胞質膜的組合物包括一種水溶液，所述水溶液包括有效裝載、濃度大約百分之5的醇，小于46mm的鹽、小于121mm糖和小于19mm的緩沖劑。例如，所述醇類(例如，乙醇)濃度不超過50％。

一個或者一個以上下列特征可以被歸入以下任意可行的結合中。被傳遞到細胞中的液體的量可以是任意單位，例如，一噴霧；例如，在水性顆粒上的小滴。所述體積相對于單獨的細胞或者相對于交會細胞群或者基本上交會的(例如，至少75％，至少80％交會；例如，85％、90％、95％、97％、98％、100％)細胞群體而描述的。例如，所述體積可以在每個細胞6.0x10^-7微升至每細胞7.4x10^-4微升之間。所述體積在每個細胞4.9x10^-6微升和每細胞2.2x10^-3微升之間。所述體積可以在每細胞9.3x10^-6微升到2.8x10^-5微升之間。.所述體積可以是大約1.9x10^-5微升沒細胞，并且大約是指在百分之10以內。所述體積在每個細胞6.0x10^-7微升和每細胞2.2x10^-3微升之間。所述體積可以在2.6x10^-9微升每平方微米裸露表面面積到1.1x10^-6微升每平方微米裸露表面面積之間。所述體積可以在5.3x10^-8微升每平方微米裸露表面面積到1.6x10^-7微升每平方微米裸露表面面積之間。所述體積可以是1.1x10^-7微升每平方微米的暴露表面面積。大約可以是在百分之十之內。

細胞的交會指的是細胞在一個表面上相互接觸。例如，它可以被表示為一種估計的(或者計算的)百分比，例如，10％交會指的是10％的表面，例如，10％組織培養(yǎng)容器的表面被細胞覆蓋，100％指的是完全覆蓋。例如，粘附細胞在組織培養(yǎng)孔、平皿或者燒瓶表面上兩個維度上生長。非粘附細胞可以通過真空旋出、拉開，或者從細胞群頂部的組織培養(yǎng)基吸出，或者從容器的底部吸出或者真空除去。

通過氣推作用將水溶液形成噴霧，并以此將所述細胞群與大量水溶液相接觸。所述氣體可以是氮氣、環(huán)境空氣或者惰性氣體。所述噴霧是一種離散單元，體積單位的直徑在1納米到100微米，例如，30-100微米范圍內。所述噴霧包括直徑大約在30-50微米范圍內的離散單元?？傮w積為20微升的水溶液可以以噴霧形式被傳遞到大約1.9平方厘米被細胞占領的區(qū)域內，例如24-孔板的孔內?？傮w積為10微升的水溶液可以被傳遞到大約0.95平方厘米的被細胞占領的區(qū)域內，例如，一個48-孔板的孔中。通常，所述水溶液包括有效裝載，可以穿過細胞膜進入細胞，并且第二體積是不包含有效裝載的緩沖劑或者培養(yǎng)基。作為選擇，第二體積(緩沖液或者培養(yǎng)基)還可以包含有效裝載。在一些實施方案中，所述水溶液包括有效裝載和醇類，和不包含醇(和選擇性地不包含有效裝載)的第二體積。在加入第二體積的緩沖液或者培養(yǎng)基浸沒或者懸浮所述細胞群之前，細胞群可以與所述水溶液接觸0.1-10分鐘。所述緩沖液或者培養(yǎng)基可以是磷酸鹽緩沖液(pbs)。在加入第二體積的緩沖液或者培養(yǎng)基浸沒或者懸浮所述細胞群之前，細胞群可以與所述水溶液接觸2秒-5分鐘。所述細胞群可以與水溶液相接觸，例如，與包含所述有效裝載的水溶液接觸30秒到2分鐘，隨后加入第二體積的緩沖液或者培養(yǎng)基，例如，加入不包括有效裝載的緩沖液或者培養(yǎng)基，從而浸沒或者懸浮細胞群。在加入第二體積的緩沖液或者培養(yǎng)基浸沒或者懸浮所述細胞群之前，細胞群可以與所述噴霧接觸1-2分鐘。在向細胞噴霧和加入緩沖液或者培養(yǎng)基這段時間期間，所述細胞通過來自噴霧體的水汽層保持水合狀態(tài)。

所述水溶液可以包括5到30％的乙醇濃度。所述水溶液還可以包括75％到98％的水、2-45％的乙醇、6-91mm的蔗糖，2到35mm的氯化鉀、2到35mm的乙酸銨和1到14mm的(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸)(hepes)中的一個或者一個以上。

所述細胞群可以包括粘附細胞或者非粘附細胞。所述粘附細胞可以包括間充質干細胞、成纖維細胞、單核細胞、巨噬細胞、肺細胞、神經元的細胞、成纖維細胞、人臍靜脈(huvec)細胞、中國倉鼠卵巢(cho)細胞，和人胚腎(hek)細胞或者固定細胞(比如，細胞系)中的至少一種。所述細胞群可以包括非粘附細胞。所述非粘附細胞可以包括主要的造血干細胞(hsc)、t細胞、自然殺傷(nk)細胞、細胞因子誘導的致死(cik)細胞、人臍帶血cd34+細胞、b細胞、或者細胞系(比如jurkatt細胞系)中的至少一個。

所述有效裝載可以包括小化學品分子、肽或者蛋白質，或者核酸。所述小化學品分子可以小于1,000道。所述化學品分子可以包括mitotracker、redcmxros、碘化丙啶、氨甲蝶呤和/或dapi(4',6'-二氨基-2-苯基吲哚)。所述肽可以是5,000道爾頓。所述肽可以包括艾卡拉肽(商品名為kalbitor，這是一種具有60個氨基酸的多肽，用于治療遺傳性血管性水腫并在心胸手術中預防失血)、利拉魯肽(以商品名victoza上市銷售用于治療ii型糖尿病，以商品名saxenda上市銷售用于治療肥胖)和艾替班特(商品名為firazyer，這是一種肽模擬物，用于治療遺傳學血管性水腫的急性發(fā)作)。小干擾性核糖核酸(sirna)分子的長度可以是大約20-25個堿基對，或者可以是大約10,000-15,000道爾頓。所述sirna分子可以減少任意一種基因產物的表達，例如，降低臨床相應目標基因或者模型基因的基因表達，例如，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)sirna、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)sirna-fitc、親環(huán)蛋白bsirna、和/或核纖層蛋白sirna。蛋白質治療劑可以包括肽、酶、結構蛋白質、受體、細胞蛋白質，或者傳播蛋白質、或者其片段。所述蛋白質或者多肽是大約100-500,000道爾頓，例如，是1,000-150,000道爾頓。所述蛋白質可以包括任何治療劑、診斷、或者研究蛋白質或者核酸，例如，β-乳球蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白(bsa)，和/或辣根過氧化酶。在其他實施例中，所述蛋白質可以包括癌癥特異性凋亡蛋白質，例如，腫瘤壞死因子有關的凋亡誘導蛋白質(trail)。

抗體的分子量通常是150,000道爾頓。所述抗體可以包括抗-肌動蛋白抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)抗體、抗src抗體、抗myc抗體和/或抗raf抗體。所述抗體可以包括綠色熒光蛋白質(gfp)質粒、gluc質粒和batem質粒。所述脫氧核糖核酸分子可以大于5,000,000道爾頓。在一些實施例中，所述抗體可以是鼠衍生的單克隆抗體，例如，替伊莫單抗tiuxetin、莫羅單抗-cd3、托西莫單抗、人類抗體，或者人源化的鼠(或者其他種族來源的)抗體。在其他實施例中，所述抗體可以是嵌合的單克隆抗體，例如、阿昔單抗、巴利昔單抗、西妥昔單抗、英夫利昔單抗，或者美羅華。在依舊其他實施例中，所述抗體可以是人源化的單克隆抗體、例如、阿侖單抗、貝伐珠單抗、妥珠單抗、達(克)珠單抗、吉妥單抗、曲妥珠單抗、塔西單抗、伊匹單抗或者帕尼單抗。所述抗體可以包括一種抗體片段，例如，abatecept、阿柏西普、阿法賽特，或者依那西普。本發(fā)明不但包括一種完整的單克隆抗體，而且包括一種免疫活性抗體片段，例如fab或者(fab)2片段；一種工程設計的單鏈fv分子；或者嵌合分子，例如，一種既包括一個抗體結合特異性(例如，鼠起源的抗體)又包括另外一個抗體(例如，人起源的抗體)剩余部分的抗體。

所述有效裝載可以包括治療劑。治療劑，例如，藥物，或者活性試劑指的是任意對治療或者診斷目的有效的化合物，該術語可以被理解為任意能夠對患者施用治療疾病的化合物。因此，治療劑可以包括蛋白質、肽、抗體、抗體片段和小分子。美國專利第7,667,004號(通過引證在此全部并入本文)中描述的治療劑可被用于這里所描述的方法中。所述治療劑可以包括順式鉑氨、阿斯匹林、斯達汀(例如，匹伐他汀、阿伐他汀、洛弗斯特丁、普伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀、丙嗪鹽酸、氯丙嗪鹽酸、甲硫噠嗪鹽酸、硫酸多粘菌素b、二氯羥喹、苯氟雷司鹽酸和苯基偶氮吡啶二胺鹽酸)，和氟苯氧丙胺中的至少一個。所述有效裝載可以包括診斷劑。所述診斷劑可以包括可檢測的標記或者標記物，例如次甲基藍、專利藍和靛氰綠中的一個。所述有效裝載可以包括熒光分子。所述有效裝載可以包括可檢測的納米顆粒。所述納米顆?？梢园孔狱c。

所述細胞群基本上是交會的，例如，大于百分之75的交會。細胞的交會指的是細胞在一個表面上相互接觸。例如，她可以被表示為一種估計的(或者計算的)百分比，例如，10％交會指的是10％的表面，例如，10％組織培養(yǎng)容器的表面被細胞覆蓋，100％指的是完全覆蓋。例如，粘附細胞在組織培養(yǎng)孔、平皿或者燒瓶表面上兩個維度上生長。非粘附細胞可以通過真空旋出、拉開，或者從細胞群頂部的組織培養(yǎng)基吸出，或者從容器的底部吸出或者真空除去。所述細胞群可以形成單細胞層。

所述醇類可以選自甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇和苯甲醇。所述鹽選自nacl、kcl、na2hpo4、kh2po4，和c2h3o2nh。所述糖可以包括蔗糖。所述緩沖劑可以包括4-2-(羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。

本發(fā)明主題內容涉及用于傳遞分子穿過質膜的方法。本發(fā)明的主題內容發(fā)現(xiàn)在細胞內傳遞方面的應用，并且已經用于，例如，將分子、生物學和藥理學治療劑傳遞的到目標區(qū)域，例如，細胞、組織或者器官中。本發(fā)明主題內容涉及的方法包括將分子引入水性組合物中形成基質；將所述基質霧化為噴霧，并將此基質與質膜相接觸。

本發(fā)明主題內容涉及用于傳遞分子穿過質膜的組合物。本發(fā)明的主題內容發(fā)現(xiàn)在細胞內傳遞方面的應用，并且已經用于，例如，將分子、生物學和藥理學治療劑傳遞的到目標區(qū)域，例如，細胞、組織或者器官中。本發(fā)明主題內容所涉及的組合物包括醇類、鹽、糖；緩沖劑；和乙酸銨。

在一些實施方案中，這里說明了一種能夠促進分子細胞內傳遞的滲透技術，不依賴于所述分子和細胞類型。納米顆粒、小分子、核酸、蛋白質及其他分子可以高效地原位傳遞入懸浮液細胞或者粘附細胞(包括初級細胞和干細胞在內)中，并具有低細胞毒性，因此所述技術與高流通量和基于自動細胞的試驗兼容。

這里所描述的實施例方法包括有效裝載，其中所述有效裝載包括醇類。術語“醇類”指的是一種包括附著于至少一個碳原子的羥基(-oh)功能性基團的多原子有機化合物。所述醇類可以是一元醇并且可以包括至少一個碳原子，例如，甲醇。所述醇可以包括至少兩個碳原子(例如乙醇)。在其他方面，所述醇類包括至少三個碳原子(例如異丙醇)。所述醇類可以包括至少四個碳原子(例如，丁醇)，或者至少七個碳原子(例如，苯甲醇)。示例性的有效裝載可以僅僅包括50％(v/v)的醇類，更優(yōu)選的，所述有效裝載包括2-45％(v/v)的醇類，5-40％的醇類，和10-40％的醇類。所述有效裝載可以包括20-30％(v/v)的醇類。

最優(yōu)選的，所述有效裝載可以包括25％(v/v)的醇類。作為選擇，所述有效裝載可以包括2-8％(v/v)的醇類，或者2％的醇類。所述醇類可以包括乙醇并且所述有效裝載包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述乙醇。示例性的方法可以包括甲醇當作所述醇類，并且所述有效裝載可以包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述甲醇。所述有效裝載可以包括2-45％(v/v)的甲醇，20-30％(v/v)，或者25％(v/v)的甲醇。優(yōu)選的，所述有效裝載可以包括20-30％(v/v)的甲醇。進一步地中作為選擇，所述醇類是丁醇并且所述有效裝載可以包括2、4或者8％(v/v)的丁醇。

在本主題內容的一些方面，所述有效裝載處于一種低滲溶液或者緩沖液中。所述有效裝載液具有的滲透濃度為171mosm/l。根據示例性的方法，所述有效裝載液在室溫下具有的滲透濃度為171mosm/l。

根據本發(fā)明主題內容，所述有效裝載可以包括至少一種鹽。所述鹽選自nacl、kcl、na2hpo4、kh2po4，和c2h3o2nh。根據實施例方法，所述有效裝載包括nacl，kcl，na2hpo4，和kh2po4中的一種。所述有效裝載可以包括小于46mm鹽。進一步地，所述有效裝載包括2-35mm鹽，或者10-15mm鹽(例如，12mm鹽)。根據實施例方法，所述鹽是kcl并且所述有效裝載包括2.4，4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mmkcl，并且更優(yōu)選的12mmkcl。

根據本發(fā)明主題內容的示例性方法，所述有效裝載可以包括糖(例如，蔗糖或者二糖)。根據實施例方法，所述有效裝載包括小于121mm糖，6-91mm，或者26-39mm糖。更進一步的，所述有效裝載包括32mm糖(例如，蔗糖)。選擇性地，所述糖是蔗糖并且所述有效裝載包括6.4，12.8，19.2，25.6，32，64，76.8，或者89.6mm蔗糖。

根據本發(fā)明主題內容的示例性方法，所述有效裝載可以包括緩沖劑(例如弱酸或者弱堿)。所述緩沖劑可以包括兩性離子。根據實施例方法，所述緩沖劑是4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。所述有效裝載可以包括小于19mm的緩沖劑(例如，1-15mm，或者4-6mm或者5mm緩沖劑)。根據實施例方法，所述緩沖劑是4-(2-羥乙基)哌嗪乙烷硫酸并且所述有效裝載包括1，2，3，4，5，10，12，14mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。進一步地優(yōu)選的，所述有效裝載包括5mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。

根據本發(fā)明主題內容的實施例方法，所述有效裝載包括乙酸銨。所述有效裝載可以包括小于46mm的乙酸銨(例如，在2-35mm，10-15mm，或者12mm的乙酸銨)。所述有效裝載可以包括2.4，4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mm的乙酸銨。

這里所描述的方法包括第二個主題內容，其中，提供了第二有效裝載(例如，水溶液)包括68mm的nacl，1.4mmkcl、5mmna2hpo4和0.9mmkh2po4。有效裝載的ph值可能是7.4。

大量水溶液的氣推作用可以通過包括壓縮空氣(例如環(huán)境空氣)來完成，還可以通過其他方法，包括惰性氣體，例如，氦氣、氖氣和氬氣。

在本主題內容的某些方面，所述細胞群可以包括粘附細胞(例如，肺細胞，腎細胞，免疫細胞，比如巨噬細胞)或者非粘附細胞(例如，懸浮細胞)。

本主題內容的某些方面中，所述細胞群是基本上交會的，且基本上可以包括大于75％的交會。在優(yōu)選的實施方案中，細胞群可以形成單層。

根據實施例方法，被傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達20,000,000道爾頓。在一些實施例中，被傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達2,000,000道爾頓。在一些實施方案中，被傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達150,000道爾頓。在進一步地實施方案中，被傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達15,000道爾頓、5,000道爾頓、或者1,000道爾頓。

通過細胞質膜被傳遞的有效裝載可以包括小化學分子、肽或者蛋白質、多糖或者核酸或者納米顆粒。小化學品分子可以小于1000道爾頓，肽的分子量大約為5000道爾頓，sirna具有的分子量大約為15,000道爾頓、抗體的分子量大約為150,000道爾頓，并且dna具有的分子量大于或等于5,000,000道爾頓。

根據實施例方法，所述有效裝載包括3.0-150.0微摩的被傳遞分子，更優(yōu)選的，6.6-150.0微摩的被傳遞分子(例如3.0、3.3、6.6，或者150.0微摩的被傳遞分子)。在一些實施方案中，待傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達15,000道爾頓，并且所述有效裝載包括3.3微摩待傳遞的分子。

根據實施例方法，所述被傳遞的有效裝載的平均分子量高達15,000道爾頓，并且所述有效裝載包括6.6微摩待傳遞的分子。在一些實施方案中，所述被傳遞的有效裝載的平均分子量高達1,000道爾頓，并且所述被傳遞的有效裝載包括150.0微摩。

在本發(fā)明主題內容的方面，被提供的待傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達15,000道爾頓。有效裝載可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和6.6微摩待傳遞分子。

根據實施例方法，被傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達15,000道爾頓。有效裝載可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括20％(v/v)的甲醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和6.6微摩待傳遞分子。

在一些實施方案中，被傳遞的分子具有的平均分子量高達15,000道爾頓。有效裝載可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的甲醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和6.6微摩待傳遞分子。

根據實施例方法，被傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達1,000道爾頓。有效裝載可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和150微摩待傳遞分子。

在一些實施方案中，被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。根據實施例方法，有效裝載可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；34mmnacl，0.7mmkcl、2.5mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；34mm乙酸銨；和150.0微摩待傳遞分子。

在一些實施例中，被傳遞的有效裝載具有的平均分子量高達1,000道爾頓。根據實施例方法，所述有效裝載可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括2％(v/v)的丁醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和150微摩待傳遞分子。

根據本主題內容的進一步方面，這里提供了用于傳遞超過一個分子量的分子穿過質膜的方法；所述方法包括以下步驟：向水溶液中引入超過一個分子量的分子；和將水溶液與質膜相接觸。

在一些實施方案中，所述方法包括向有效裝載中引入具有第一分子量的第一分子和具有第二分子量的第二分子，其中所述第一分子和第二分子可以具有不同的分子量，或者其中，所述第一分子和第二分子具有相同的分子量。根據實施例方法，第一分子和第二分子可以是不同的分子。

在一些實施方案中，待傳遞的有效裝載可以包括治療劑、或者診斷劑，包括，例如順式鉑氨、阿斯匹林、各種斯達汀(例如，匹伐他汀、阿伐他汀、洛弗斯特丁、普伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀、丙嗪鹽酸、氯丙嗪鹽酸、甲硫噠嗪鹽酸、硫酸多粘菌素b、二氯羥喹、苯氟雷司鹽酸和苯基偶氮吡啶二胺鹽酸)，和氟苯氧丙胺。其他治療劑包括抗菌劑(氨基環(huán)苷類(例如慶大霉素、新霉素、鏈霉素)、青霉素(例如、羥氨芐青霉素、氨芐青霉素)、糖肽(例如、阿佛帕星、萬古霉素)、大環(huán)內酯(例如、紅霉素、替米考星、泰樂菌素)、喹諾酮(例如、沙氟沙星、enrofloxin)、鏈陽性菌素(例如、維吉尼霉素、喹奴普丁-dalfoprisitin)、碳青霉烯類、脂肽、惡唑烷酮類、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、isoniazrid、對氨基水楊酸，和吡嗪酰胺)。在一些實施例中，包括抗病毒劑(例如、阿巴卡韋、阿昔洛維、恩夫韋地、恩替卡韋、那非那韋、奈韋拉平、nexavir、奧司他韋、雷特格韋、利托那韋、司他夫定和萬乃洛韋)。所述治療劑可以包括基于蛋白質的治療劑，用于治療各種的疾病，例如，癌癥，傳染性的疾病，血友病，貧血，多發(fā)性硬化，并且乙型肝炎或者丙型肝炎。

其他示范性的有效裝載還可以包括可檢測的標記物或者標記，例如次甲基藍、專利藍和靛氰綠。

這里所描述的方法還可以包括有效裝載，所述有效裝載包括可檢測的部分或者可檢測的納米顆粒(例如，量子點)。所述可檢測部分可以包括一種熒光分子或者一種放射性試劑(例如，¹²⁵i).當所述熒光分子暴露于具有固定波長的光時，可以通過熒光檢測其是否存在。其中，最常用的熒光標記化合物是異硫氰酸熒光素、玫瑰精、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白、p-苯二甲醛和熒光胺。所述分子還可以被能夠發(fā)出熒光的金屬標記，例如152eu，或者其他鑭系標記。這些金屬通過使用金屬鰲合基團，例如，二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)或者乙二胺四乙酸(edta)與所述分子相附著。所述分子還可以通過與一種化學發(fā)光化合物耦合來標記。然后通過在化學反應過程中檢測是否出現(xiàn)發(fā)光作用來確定是否存在化學發(fā)光-標記的分子。尤其有效的化學發(fā)光標記化合物是魯注入諾、異氨基苯二酰肼、恒溫吖啶酯、咪唑、吖啶酯鹽和草酸酯。

在一個方面，本發(fā)明的主題內容包括附著于固體載體的細胞，例如條、聚合物、小珠或者納米顆粒。所述支持物或者腳手架可以是多孔的或者無孔的固體支持物。已知的支持物或者載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龍、淀粉酶、天然的和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵礦。為了實現(xiàn)本主題內容的目的，載體的性質可以是在某種程度上可溶解的或者不可溶解的。所述支持物材料事實上可以是任何可能的結構構造。因此，所述支持物結構可以是球形的，例如小珠；或者是圓柱形的，例如試管的內表面，或者是竿的外表面。做為選擇，所述表面可能是平面，比如試驗片條、等等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯磁珠。

在其他方面，所述固體支持物包括聚合物，細胞化學結合、固定在此聚合物上，或者分散在其中，或者與其相關聯(lián)。聚合物支持物可以是聚合物網絡，并且可以以小珠的形式被制備(例如，通過懸浮聚合作用)。在此腳手架上的細胞可以用包含本發(fā)明水溶液的有效裝載噴霧，從而將理想的化合物傳遞到所述腳手架的細胞質上。示范性的腳手架包括斯坦及其他可移植性醫(yī)療器械或者結構。

本發(fā)明主題內容進一步涉及用于傳遞有效裝載通過質膜的儀器、系統(tǒng)、技術和物品。本發(fā)明主題內容還涉及用于傳遞有效裝載(例如，蛋白質或者蛋白質復合物)穿過質膜的儀器。目前的主題內容可以發(fā)現(xiàn)細胞內傳遞方面的應用，并且已經用于，例如，將分子、生物學和藥理學治療劑傳遞的到目標區(qū)域，例如，細胞、組織或者器官中。

在一些實施方案中，用于傳遞有效裝載穿過質膜的儀器可以包括噴霧器，所述噴霧器具有至少一個噴霧發(fā)射裝置和相對于噴霧器固定的支持物。本發(fā)明方法進一步包括在將有效裝載與質膜相接觸之前使有效裝載霧化的步驟。

所述噴霧器選自機械噴霧器、超聲波霧化器、電噴霧、噴霧器和文杜里管。所述噴霧器可以是市場上可買到的噴霧器。所述噴霧器可以是經鼻粘膜的噴霧器。所述噴霧器可以是經鼻粘膜的噴霧器，可以從美國北開羅萊納州lmateleflex公司市場上購買得到。所述噴霧器可以是經鼻粘膜的噴霧器，可以從美國北開羅萊納州lmateleflex公司以mad300的產品樣本號在市場上購買得到。

在使有效裝載和質膜接觸之前，所述噴霧器可以用于提供直徑為30-100微米的顆粒的膠體懸浮液。所述噴霧器可以用于提供直徑為30-80微米的顆粒的膠體懸浮液。所述噴霧器可以用于提供直徑為50-80微米的顆粒的膠體懸浮液。

所述噴霧器可以包括氣體存儲層。所述噴霧器可以包括氣體存儲層，在一定壓力下維持氣體。所述氣體可以選自空氣、二氧化碳和氦氣。所述氣體存儲器包括固定的壓力發(fā)生器。所述氣體存儲器可以處于流體通道中，具有噴霧發(fā)射器。氣體存儲器可以包括氣體導管，氣體導管可以與噴霧發(fā)射器一起處于流體通道中。所述氣體導管用于允許氣體從其中穿過。所述氣體導管包括凹型體。所述氣體導管可以是具有尾部開口的凹形體。所述氣體導管可以包括具有第一和第二尾部開口的凹形體。所述氣體導管可以是具有第一和第二相對的尾部開口的凹形體。第一開口端和第二開口端的直徑可以不同。第一開口端和第二開口端的直徑可以不同。第一開口端的直徑可以大于第二開口端的直徑。第一開口端處于流體通道中并且具有氣體存儲器。所述第二開口端可以處于流體通道中，具有噴霧發(fā)射器。

所述儀器可以包括一種樣品存儲器。所述樣品存儲器可以處于流體通道中，具有噴霧器。所述樣品存儲器可以處于流體通道中，具有噴霧發(fā)射器。所述氣體存儲器和樣品存儲器都可以處于流體通道中，并具有噴霧發(fā)射器。

所述儀器在樣品存儲器和其他存儲器之間可以包括取樣閥。所述儀器在樣品存儲器和氣體導管之間可以包括取樣閥。所述取樣閥適用于調整來自樣品存儲器中的樣品流。取樣閥可以允許持續(xù)的或者半持續(xù)的樣品流動。取樣閥可以允許持續(xù)的或者半持續(xù)的樣品流動。取樣閥可以允許一定量的樣品持續(xù)的或者半持續(xù)的樣品流動。取樣閥可以允許0.5-100微升的樣品持續(xù)的或者半持續(xù)的樣品流動。取樣閥可以允許10微升的樣品持續(xù)的或者半持續(xù)的樣品流動。取樣器可以允許1微升的樣品在0.065-0,085平方厘米范圍內半連續(xù)的樣品流動。

所述噴霧器和支持物可以在空間上相互間隔的。所述支持物包括固體支持物。所述支持物可以包括含有樣品孔的平皿。所述支持物可以包括含有1、6、9、12、24、48、384和1536個孔的平皿。所述支持物可以由惰性材料組成。所述載體可以由塑料、金屬或者金屬合金、或其結合組成。所述支持物包括發(fā)熱元件。所述支持物包括電阻元件。所述支持物可以被互易的安裝在一起上。所述支持物可以相對于所述儀器是可活動的。所述支持物可以相對于所述噴霧器是可活動的。所述支持物可以相對于所述噴霧器發(fā)射器是可活動的。所述支持物可以包括支持物制動器，從而使支持物相對于噴霧器移動。所述支持物可以包括支持物制動器，從而使支持物相對于噴霧發(fā)射器移動。所述支持物可以包括支持物制動器，從而使支持物相對于噴霧發(fā)射器的縱軸移動。所述支持物可以包括支持物制動器，從而使支持物向噴霧發(fā)射器的縱軸橫向移動。

噴霧區(qū)的縱軸可以與支持物的縱軸或者中心點同軸，和/或與支持物的圓孔同軸，所述有效裝載被傳遞至此。噴霧發(fā)射器的縱軸可以與支持物的縱軸或者中心點同軸，和/或與支持物的圓孔同軸，他有效裝載被傳遞至此。噴霧發(fā)射器的縱軸、支持物的縱軸和噴霧區(qū)域的縱軸可以是兩兩同軸的。噴霧器的縱向長度可以大于(可以大2倍以上)噴霧區(qū)的環(huán)形部分直徑(例如，待傳遞的有效裝載所對應的的細胞面積)。

所述儀器在樣品存儲器和噴霧器之間可以包括取樣閥。所述取樣閥可以是電磁操控的閥。所述閥可以是電磁閥。所述閥可以是氣動閥。所述閥可以位于氣體導管。所述閥可以適用于調整氣體導管內的氣體流動。所述閥可以允許持續(xù)的或者半持續(xù)的氣流。所述閥可以允許持續(xù)的或者半持續(xù)的氣流。所述閥可以允許一定時段的樣品持續(xù)的或者半持續(xù)的氣流。所述閥可以在第二間隔時間內允許半持續(xù)的氣流。所述儀器可以包括至少一個過濾器。所述過濾器的孔直徑小于10微米。所述過濾器的孔直徑為10微米。所述過濾器可以位于氣體導管中。所述過濾器可以處于具有氣體導管的流體通道中。

所述儀器可以包括至少一個調節(jié)器。所述調節(jié)器可以是電調節(jié)器。所述調節(jié)器可以是機械調節(jié)器。t所述調節(jié)器可以位于氣體導管中。t所述調節(jié)器可以處于具有氣體導管的流體通道中。所述調節(jié)器可以是調節(jié)閥。氣體導管內部的壓力可以是1.0-2.0bar。氣體導管內部的壓力可以是1.5bar。氣體導管內部的壓力可以是1.0-2.0bar，并且噴霧器和支持物之間的距離小于或者等于31mm。氣體導管內部的壓力可以是1.5bar，并且噴霧器和支持物之間的距離可以是31mm。氣體導管內部的壓力可以是0.05bar每毫米噴霧器和支持物之間的距離。調節(jié)閥可以將氣體導管內部的壓力調整到1.0-2.0bar。調節(jié)閥可以將氣體導管內部的壓力調整到1.5bar。調節(jié)閥可以將氣體導管內部的壓力保持在1.0-2.0bar。調節(jié)閥可以將氣體導管內部的壓力保持在1.5bar。

所述儀器可以包括兩個調節(jié)器。所述儀器可以包括第一和第二調節(jié)器。t所述第一和第二調節(jié)器可以位于氣體導管中。所述第一和第二調節(jié)器可以處于具有氣體導管的流體通道中。第一調節(jié)器可以位于氣體存儲器和過濾器之間。第一調節(jié)器可以將氣體導管內氣體存儲器的壓力調整到2.0bar。第一個調節(jié)器可以適合于將氣體導管內的壓力維持在2.0bar。第二調節(jié)器可以位于氣體存儲器和閥之間。

噴霧發(fā)射器可以用于通過圓錐形的噴霧區(qū)(例如，通常是環(huán)圓錐形的噴霧區(qū))。所述噴霧發(fā)射器可以用于提供30度的圓錐噴霧區(qū)。所述儀器進一步包括微處理器，來控制儀器的任意部分或者全部部分。所述微處理器可以被安排控制任何或者全部的取樣閥，所述支持物致動器，閥，和調節(jié)器。所述儀器可以包括具有至少一個噴霧發(fā)射器的噴霧器；和相對于噴霧器固定的支持物；所述噴霧器選自機械噴霧器、超聲波噴霧器、電噴霧、噴霧和文杜里管。所述噴霧器可以用于提供直徑為30-100微米的顆粒的膠體懸浮液。所述儀器可以包括樣品存儲器和氣體導管，以及在樣品存儲器和氣體導管之間可以包括取樣閥。取樣閥可以允許10-100微升的樣品半持續(xù)的樣品流動。所述噴霧器和所述支持器可以是空間上相互分離的并且據此定義出一個圓錐噴霧區(qū)；和，所述噴霧器和所述支持器之間的距離可以是需要將分子傳遞進入的細胞面積環(huán)形區(qū)直徑的大約2倍；所述噴霧器和所述支持器之間的距離可以是31mm，并且需要將分子傳遞進入的細胞面積環(huán)形區(qū)直徑可以是15.5mm。所述儀器可以包括氣體導管和氣體導管內部的壓力是1.0-2.0bar。所述儀器包括至少一個過濾器，所述過濾器的孔直徑小于10微米。

結合下面的附圖和說明書描述了具有這里所公開的主題內容及其變體的一種或者一種以上實施方案的細節(jié)。從說明書和附圖中，以及從權利要求書中，具有這里公開的主題內容的其他特征、目的和優(yōu)勢變得顯而易見。

附圖說明

參照以下附圖，本主題內容非限制性的實施方案被進行了描述。

圖1是適用于實施本發(fā)明方法的儀器的示意圖。

圖2是適用于實施本發(fā)明方法的儀器的透視圖。

圖3是過程流程圖，解釋了產生用于將樣品傳遞到一種或者一種以上靶細胞細胞質中的膠體滴的方法。

圖4是一種圖表，顯示了根據本發(fā)明將平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞穿過質膜的作用。

圖5是一種圖表，顯示了根據本發(fā)明將平均分子量高達1,000道爾頓的分子傳遞穿過質膜的作用。

圖6a是顯微照片，顯示了平均分子量為668道爾頓的分子的傳遞。

圖6b是顯微照片，顯示了平均分子量為40,000道爾頓的分子的傳遞。

圖6c是顯微照片，顯示了圖6a和圖6b的重疊，說明平均分子量分別為668道爾頓(圖6a)和40000道爾頓(圖6b)的分子的傳遞。

圖7是一種圖表，顯示了根據本發(fā)明將平均分子量高達500,000道爾頓的分子傳遞穿過質膜的作用。

圖8是一種圖表，顯示了根據本發(fā)明將細胞與一種第二組合物接觸的作用，所述第二組合物包括68mm的nacl，1.4mm的kcl，5mm的na2hpo4和0.9mmkh2po4。

圖9是顯微照片，顯示了使用本發(fā)明主題內容的方法傳遞變化分子量的分子。

圖10是一種圖表，顯示了將平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞的溶質含量作用。

圖11是一種圖表，顯示了將平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞的酒精濃度作用。

圖12是一種圖表，顯示了將平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞的酒精濃度作用。

圖13是一種圖表，顯示了將平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞的含鹽濃度作用。

圖14是一種圖表，顯示了將平均分子量高達1,000道爾頓的分子傳遞的酒精濃度作用。

圖15是一種圖表，顯示了將平均分子量高達1,000道爾頓的分子傳遞的酒精濃度作用。

圖16是一種圖表，顯示了酒精濃度對傳遞平均分子量高達1,000道爾頓的分子的作用。

圖17是顯微照片，顯示了有效裝載在200微升傳遞液中向24孔板中a549細胞的微量吸液管-調節(jié)的傳遞，通過熒光顯微鏡檢查法成像。在整個細胞群中都可以觀察到碘化丙啶(pi)吸收，但是沒有觀察到sirna-fitc或者10kda右旋糖苷alexa488的吸收。所有的顯微照片都以10倍放大顯示。

圖18是顯微照片，顯示了有效裝載在20微升傳遞液中向24孔板中a549細胞的微量吸液管-調節(jié)的傳遞，通過熒光顯微鏡檢查法成像。在一些孔中觀察到了pi吸收，但是在其他孔中沒有觀察到。所有的顯微照片都以10倍放大顯示。

圖19是圖表，顯示了有效裝載在200微升或20微升傳遞液中向24孔板中a549細胞的微量吸液管-調節(jié)的傳遞。通過流式細胞儀(5％mbar)來檢測吸收效率，通過與溶解細胞陽性參照物比較乳酸脫氫酶(ldh)釋放來測定毒性。當有效裝載以200微升被傳遞的，通過流式細胞計檢測到吸收但是毒性水平高(40-50％)。當有效裝載在20微升中傳遞時，毒性有所減少但是吸收同樣被減少并且不一致(n＝3)。mp＝微量吸液管；pi＝碘化丙啶；dex＝10kda葡聚糖-alexa488；sbo＝噴霧緩沖液。

圖20是顯示測試儀的圖像。測試儀的構造能夠實現(xiàn)噴霧調節(jié)的傳遞液向細胞的傳遞。所述測試儀包括空氣壓縮機，所述空氣壓縮機向噴頭傳遞壓縮空氣，所述噴頭安裝在鐵架上。培養(yǎng)皿放置在噴頭的下方。

圖21是一顯微照片，顯示了10kda的右旋糖苷-alexa488通過本主題內容示例性的實施方式向a549細胞的傳遞。使用本主題內容的方法，10kda右旋糖苷-alexa488可以成功的傳遞個a549。吸收被證明穿過單細胞層。顯示照片按10倍放大倍數顯示。

圖22是圖表，顯示了本發(fā)明傳遞方法的效率和毒性。在a549細胞中實現(xiàn)大于50％的10-kda右旋糖苷-alexa488傳遞的效率水平。毒性水平與未處理的參照物類似。當包含有效裝載的傳遞溶液進入培養(yǎng)基時，還可以檢測到一些陽性細胞(n＝3)。

圖23是顯微照片，顯示了在a549細胞在滲透的時間過程。在不存在有效裝載的情況下，噴霧傳遞液，隨后在噴霧60分鐘之后的時間點向培養(yǎng)基中加入pi，檢測被滲透的細胞。盡管pi吸收在噴霧后五分鐘開始明顯，在噴霧30分鐘和60分鐘后，pi-陽性細胞的數目基本上開始減少。顯示照片按10倍放大倍數顯示。

圖24是圖表，顯示了噴頭和細胞之間的距離在傳遞效率和細胞毒性方面的作用。10-kda右旋糖苷-alexa488被傳遞給a549細胞。改變噴頭和細胞之間的距離(包括21毫米、31毫米和41毫米)。31毫米的距離對于效率和毒性都是最佳的(n＝3)。

圖25是圖表，顯示了噴霧壓力對傳遞效率和細胞毒性的作用。10-kda右旋糖苷-alexa488被傳遞給a549細胞。,并且所述噴霧壓力是改變(包括0.5bar，1.5bar和2.5bar)。1.5bar的壓力對于傳遞效率和毒性都是最佳的(n＝3)。

圖26是圖表，顯示了傳遞溶液的體積對傳遞效率和細胞毒性的作用。10-kda右旋糖苷-alexa488以80-90％的交會度在48孔班中被傳遞給a549細胞，并且，傳遞溶液的體積是變化的(包括，5微升、10微升和20微升)。10微升的體積對于傳遞效率和毒性都是最佳的(n＝3)。

圖27是圖表，顯示了傳遞溶液的體積對傳遞效率和細胞毒性的作用。10-kda右旋糖苷-alexa488以80-90％的交會度在48孔板中被傳遞給cho細胞，并且，傳遞溶液的體積是變化的(包括，5微升、10微升和20微升)。10微升的體積對于傳遞效率和毒性都是最佳的(n＝3)。

圖28是圖表，顯示了乙醇濃度對傳遞效率和細胞毒性的作用。10-kda右旋糖苷-alexa488被傳遞給a549細胞，并且傳遞溶液中的乙醇濃度是變化的。25％的濃度對于效率和毒性都是最佳的(n＝3)。

圖29是顯微照片，顯示了右旋糖苷各種分子尺寸的傳遞，包括非常高分子量的右旋糖苷(2000kda)，可以被本主題方案所述的方法傳遞。所述顯微照片顯示10倍放大。

圖30是顯微照片，顯示了各種分子尺寸的傳遞，包括全長抗體，可以被本主題方案所述的方法傳遞。所述顯微照片顯示10倍放大。

圖31是顯微照片，顯示了4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)、mitotrackerredcmxros和毒傘素-alexa488向a549細胞共傳遞的作用。

圖32是顯微照片，顯示了10kda右旋糖苷-alexa488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)向a549細胞共傳遞的作用。所述顯微照片顯示10倍放大。

圖33是顯微照片，顯示了被噴霧轉染入a549細胞的綠色熒光蛋白質(gfp)mrna的傳遞效果。通過熒光顯微術觀察綠色熒光蛋白質(gfp)蛋白質表達。所述顯微照片顯示10倍放大。

圖34是條形圖，顯示了當熒光素酶mrna使用本主題內容示范性的方法被傳遞到a549細胞中時熒光素酶表達的定量分析(通過發(fā)光測試)。

圖35是顯微照片，顯示了被噴霧轉染入a549細胞的pgfp質粒dna的傳遞效果。所述表達的綠色熒光蛋白質(gfp)蛋白質通過熒光顯微照相觀察。所述顯微照片顯示10倍放大。

圖36是條形圖，顯示了當pgluc質粒dna使用本主題內容示范性的方法被傳遞到a549細胞中時，熒光素酶表達的定量分析(通過發(fā)光測試)。

圖37是顯微照片，顯示了當10-kda右旋糖苷-alexa488被送到主要的成纖維細胞是的效果。通過熒光顯微術，右旋糖苷在成纖維細胞中是可見的。所述顯微照片顯示10倍放大。

圖38是條形圖，顯示了被傳遞進入主要成纖維細胞的10kda右旋糖苷-alexa488的傳遞效率和毒性，分別如流式細胞儀和ldh試驗定量。

圖39是顯微照片，顯示了當10-kda右旋糖苷-alexa488被送到間充質干細胞(msc)的效果。通過熒光顯微術右旋糖苷在間充質干細胞(mscs)中是可見的，在10x放大時。

圖40是條形圖，顯示了被傳遞進入間充質干細胞(mscs)的10kda右旋糖苷-alexa488的傳遞效率和毒性，分別如流式細胞儀和ldh試驗定量。

圖41a是顯微照片，顯示了sirna(上欄)、bsa(中間)和ova(下欄)進入u226人多發(fā)性骨髓瘤細胞的傳遞效果。

圖41b是顯微照片，顯示了4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)(上欄)和mitotracker紅(中欄)向jurkat細胞中的傳遞效果。另外，對于綠色熒光蛋白質(gfp)的mrna被傳遞給jurkat細胞，并且在傳遞后24小時觀察綠色熒光蛋白質(gfp)的表達。

圖42是顯微照片，顯示了sirna(上欄)、bsa(中間)和ova(下欄)進入u226人多發(fā)性骨髓瘤細胞的傳遞效率和細胞毒性效果，分別通過流式細胞儀和ldh試驗定量。

圖43是顯微照片，顯示蛋白質傳遞進入中國倉鼠卵巢(cho)細胞的作用。使用fitc標記各種蛋白質，并且傳遞進入cho細胞，所述蛋白質包括β-乳球蛋白在內，辣根過氧化酶(hrp)，卵清蛋白，牛血清白蛋白(bsa)，過氧化氫酶，和去鐵鐵蛋白。

圖44是圖表，顯示了各種各樣的蛋白質通過本主題內容的示范性方法傳遞入cho細胞的傳遞效率，所述效率是通過流式細胞儀來定量的。

圖45是顯微照片，顯示了被傳遞入cho細胞的卵清蛋白-fitc的螢光免疫檢驗。通過螢光免疫檢驗法，使用抗卵白蛋白抗體確認卵清蛋白-fitc向cho細胞中的傳遞。

圖46是圖表，顯示了傳遞β-乳球蛋白進入cho細胞的劑量反應。通過本主題內容向cho中傳遞的β-乳球蛋白-fitc濃度越高，可以觀察到傳遞的效率越高(n＝3)。

圖47是顯微照片，顯示了被傳遞入細胞的hrp活性和定位。使用alexa488-標記的酪胺底物來說明，在使用本主題內容所描述的hrp傳遞之后，hrp在cho細胞中的活性和定位。

圖48是條形圖，顯示了隨著被傳遞進入cho細胞的hrp的劑量越高，熒光dcf產物的產量越高。

圖49是條形圖，顯示了ldh分析，說明實驗對細胞沒有毒性。

圖50是顯微照片，顯示了用q-點標記進行追蹤研究的間充質干細胞(msc)。體外傳遞攜帶有q-點625的主要間充質干細胞(mscs)。

圖51是顯微照片，顯示了用q-點標記進行追蹤研究的間充質干細胞(msc)。將間充質干細胞(mscs)體外注射入小鼠脾中。使用所述cryovis測試儀進行q點熒光分析。

圖52是表，顯示了根據本主題內容示例性的實施方案，每個細胞被傳遞的大約的體積。

圖53是表，顯示了每平方微米暴露細胞表面積傳遞的大約體積。

圖54是表，顯示了一些細胞類型近似平均性質。

圖55是表，顯示了實驗計算和測定的三種不同細胞系(a549，cho和mcss)的面積。

圖56a是剖面圖，顯示了使用移液管加入一定體積的水溶液的孔。

圖56b是剖面圖，顯示了通過噴藥技術加入一定體積的水溶液的孔。

在各個附圖中使用的相同的參考符號指相同的元素。

具體實施方式

本主題內容提供了一種不使用載體(例如，不使用病毒載體)將有效裝載穿過質膜的傳遞。特別是，已經發(fā)現(xiàn)，可以通過將細胞(和/或細胞群)與包括醇類和傳遞材料(例如，有效裝載)的水溶液相接觸來實現(xiàn)材料向細胞內的傳遞。所述醇類發(fā)揮作用來滲透膜，允許有效裝載移動穿過所述膜。但是，當與細胞接觸的水溶液體積過大和/或每次接觸時間過長，則可能嚴重的(例如，不可逆的)破壞細胞。相反，如果與細胞接觸的水溶液的量太小和/或每次接觸時間過短，則不能完成材料的細胞內傳遞。因此，為了實現(xiàn)有效裝載穿過質膜的傳遞并維持細胞活力，應當使用適當量的水溶液和/或控制接觸時間。

根據預計的應用，與細胞群接觸的水溶液的適當的量可以是變化的，例如，根據(例如，是以下因素的函數)細胞群中的細胞數目、暴露的細胞表面積、細胞尺寸、水溶液的組成、有效裝載、向水溶液與細胞群相接觸的技術，等等。在一些實施方案中，水溶液的體積為每細胞6.0x10^-7和7.4x10^-4微升(本申請其他部分表述了其他的范圍)。該范圍相當于向具有基本上單層排列的細胞群(所述細胞分別具有30微米和15微米的平均直徑)的48孔平皿的小孔中傳遞0.5微升和100微升的水溶液。水溶液的體積可以是每平方微米細胞群暴露表面積2.6x10^-9和1.1x10^-6微升水溶液(本申請其他地方描述了其他范圍)。該范圍相當于向具有基本上單層排列的細胞群的24孔平皿和48孔平皿中的小孔中傳遞0.5微升和100微升的水溶液。

將細胞群與水溶液相接觸的技術是可以改變的。例如，所述水溶液也可以被移液管移到細胞群上(例如，當細胞排列在小孔中時).

例如，圖56a是剖面圖，顯示了使用微量吸液管加入一定體積的水溶液的單細胞層。當水溶液以這種方式被應用時,水溶液可能在小孔的面積中不平均的分布,并且,結果,位于或者接近小孔中心位置(5605所顯示的區(qū)域)的細胞被殺死,而位于小孔邊緣位置(5615顯示的區(qū)域)的細胞還存活但是沒有顯示出更新的有效裝載.在5610區(qū)域內的細胞,在內部和外部區(qū)域(分別5605和5615之間)還處于存活狀態(tài),并有效的、可靠的顯示出有效裝載的吸收。

在一些實施方案中，水溶液被噴霧在細胞群上。例如，圖56b是剖面圖，顯示了通過噴藥技術加入一定體積的水溶液的孔。所述噴霧均勻的將水溶液分布在小孔的區(qū)域內(5620所示區(qū)域)。用這種方式(以及這里描述的其他方式)處理的細胞處于存活狀態(tài),并有效的、可靠的顯示出有效裝載穿過細胞膜進入細胞的細胞質的吸收。所述噴霧可以提供細胞群與水溶液以一種可控的方式均勻接觸，并且顯示出改善的有效裝載的傳遞效率和改善的細胞活力。所述噴霧可以被控制產生尺寸變化的離散單元(例如，液滴)。例如，在一個實施方案中，所述離散單元的體積范圍是直徑為30-100微米。也可以使用其他尺寸并且其他部分描述了一些變化方式。

細胞群與水溶液(包含有效裝載)相接觸的時間可以是短暫的。換句話說，將細胞群與水溶液相接觸的持續(xù)時間是可以改變的。例如，接觸的持續(xù)時間可以是最少6秒、12秒、30秒等等。也可以使用其他持續(xù)時間并且其他部分描述了一些變化方式。由于細胞與水溶液接觸時間過長會導致細胞活力的下降，在于所述水溶液接觸后，細胞群可以用緩沖液或者培養(yǎng)基沖洗。所述緩沖液可以包括或者不包括有效裝載。所述緩沖液可不含有醇類所述細胞可以用緩沖液或者培養(yǎng)基洗滌，來浸沒或者懸浮所述細胞群。在一些實施方案中，可以用氣體吹細胞使水溶液脫離與細胞的接觸，雖然細胞與氣體的過度接觸會使細胞干燥導致細胞活力的下降。

所述水溶液可以包括水、醇類和有效裝載。所述醇類可以包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇或者苯甲醇。所述水溶液還可以包括一個或多個糖，鹽和緩沖劑。所述鹽選自nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4。所述糖可以包括二糖(例如，蔗糖)。所述緩沖劑可以包括弱酸或者弱堿和兩性離子(例如，(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸(hepes))。所述水溶液還可以包括乙酸銨。例如，所述水溶液是低滲的緩沖液，例如，medepalli等的描述(medepalli,k.,etal.,nanotechnology2013；24:20,，通過引證在此全部并入本文),130mm蔗糖，50mm氯化鉀，50mm乙酸鉀，20mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸(hepes)，每小時7.4。在一些實施例中，所述緩沖液被修飾，用乙酸銨替換乙酸鉀。在一些實施例中，用來傳遞有效裝載的緩沖液不包括皂角苷。

水溶液的組分可以用于使細胞的質膜發(fā)生斷裂并允許大生物分子進入穿過質膜。例如，在質膜內，醇溶解脂質，去污劑在質膜內產生孔，酶消化蛋白質在質膜內產生孔。

有效裝載可以被送到細胞的細胞質，以及特定的細胞器(例如，細胞核和線粒體)。所述有效裝載可以包括任何適合于或者用于傳遞的分子。靶向線粒體的分子在許多疾病(例如，癌癥)中是有益的，并且傳遞這種分子可以與線粒體的功能相關，包括產生能量和細胞凋亡。例如，熒光標記的(例如，標記的)分子可以被用于穿插線粒體組分是否存在及其存在位置，能夠靶向線粒體滲透性變化(mpt)的分子(例如，能夠消耗滲透性變化孔復合物(ptpc)開口的化學抑制劑或者肽)、能夠引起線粒體滲透性變化(mpt)的小化學分子、能夠調節(jié)腺嘌呤核苷酸轉位酶(ant)的配位體、能夠誘導反應性氧類(ros)過量生產的化合物、能夠逆轉癌細胞超糖解狀態(tài)的分子、能夠誘導癌細胞到細胞死亡的分子，等等。

所述有效裝載可以包括，但是不局限于小化學品分子、肽、多肽、核酸分子抗體和dna(例如質粒dna)。示范性的小化學品分子包括尺寸高達2,000,000道爾頓的右旋糖苷，包括3kda右旋糖苷、40kda右旋糖苷、70kda右旋糖苷，或者500kda右旋糖苷、碘化丙啶、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi))、毒肽、mitotracker紅或者其任何結合(例如，mitotrackerred可以與毒肽共同傳遞，例如10kda右旋糖苷-alexa488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi))、氨甲蝶呤。示范性的肽、多肽，和蛋白質或者其片段包括尺寸高達500kda的蛋白質、包括β乳球蛋白、辣根過氧化酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白、過氧化氫酶和去鐵鐵蛋白)。示范性的肽可以包括艾卡拉肽、利拉魯肽和艾替班特。示范性的核酸可以涉及多聚核苷酸，比如脫氧核糖核酸(dna)，以及適當的核糖核酸(rna)。所述術語還包括等量的、類似的來自核苷酸類似物的dna或者rna，并可用于本主題內容，可以是單鏈(正義或者反義)或者雙鏈多聚核苷酸。進一步地，核酸實施例可以包括，sirna分子(例如、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)sirna-fitc)、親環(huán)蛋白bsirna，或者核纖層蛋白sirna分子)、雙鏈的核酸分子，例如雙鏈的rna分子、單鏈核酸分子，或者分離的核酸分子)。本主題內容示例性的dna有效裝載包括大于或等于5,000,000da的dna樣品(例如，pgfp、pgluc、和pbatem)。本主題內容示范性的抗體可以包括抗肌動蛋白抗體，抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)抗體，抗-src(原致癌基因酪氨酸蛋白激酶src)抗體，抗-myc抗體或者抗-raf抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆的抗血清或者單克隆抗體。本主題內容不但包括一種完整的單克隆抗體，而且包括一種免疫活性抗體片段，例如fab或者(fab)2片段；一種工程設計的單鏈fv分子；或者嵌合分子，例如，一種既包括一個抗體結合特異性(例如，鼠起源的抗體)又包括另外一個抗體(例如，人起源的抗體)剩余部分的抗體。所述抗體可能是人源化的抗體，其中所述抗體來自于非人類物種，其蛋白質序列已經修飾以增加他們的與人類天然產生的抗體變體的類似性。通常，人源化的抗體中具有一個或者一個以上非人來源被引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基在這里叫做“引入”殘基，其通常來自“引入”抗體結構域，尤其是可變域。

所述細胞群可以包括粘附細胞，粘附細胞生長在培養(yǎng)板的生長表面形成交會(例如，75％交會)單層。粘附細胞可以涉及細胞，細胞系，和細胞系統(tǒng)，不論原核的還是真核的。可以生長成粘附細胞的實施例可以是肝細胞或者肝衍生細胞(例如，主要肝細胞和肝上皮細胞)，上皮細胞，內皮細胞，神經元的細胞，間充質細胞，胰腺細胞，骨骼肌細胞，心肌細胞，癌衍生細胞，骨髓細胞，郎格罕氏細胞，腎上腺髓質細胞，成骨細胞，破骨細胞，胸腺體依賴淋巴細胞，神經元，膠質細胞，神經節(jié)細胞，視網膜細胞，肺細胞(例如，a549細胞)，成纖維細胞，人臍靜脈細胞(huvec)，成纖維細胞，卵巢細胞(例如，中國倉鼠卵巢細胞)，胚腎細胞(例如，人胚腎細胞)，和成肌細胞。還可以使用干細胞(例如，主要的間充質干細胞，神經元干細胞，誘導性多功能干細胞，造血干細胞，小鼠胚胎干細胞，和人胚胎干細胞)。

所述細胞群還可以包括非粘附(例如，懸浮)細胞。示范性的非粘附細胞可以包括干細胞(例如，造血干細胞)、祖細胞(例如造血的祖細胞)、t細胞、自然殺傷(nk)細胞、細胞因子誘導的致死(cik)細胞、人臍帶血cd34+細胞、b細胞、和jurkat細胞。

這里所描述的細胞群以及根據其尺寸(例如，小、中、大)、根據其計算的直徑進行描述，如通過美國典型菌種保藏中心(atcc)、celeromics技術及其他分子生物學參考書目所確定的。如這里所述，以一種非限制性方式，在一些實施例中，小細胞的直徑為10微米(例如，脾細胞或者小神經元)、中型細胞的直徑在10微米到20微米(例如，a549細胞、cho細胞或者mcf7細胞)，大細胞直徑大于20微米(例如，k562細胞和間充質干細胞(mscs))。通常，所述種類(范圍)不起到限制作用，并且實驗條件可以影響所述測量細胞的直徑。

在一些實施方案中，所述細胞群位于三維腳手架上，該腳手架可以被噴霧(或者有效裝載可以使用其他技術傳遞到細胞中)。所述三維腳手架被體內或者體外使用?？梢灶A計，本主題內容的其他方面可以體外或者體內應用。

作為接觸表面積和細胞數的函數確定體積

如這里充分描述的，通過噴藥技術將10微升水溶液與細胞群相接觸將有效裝載有效傳遞入48孔板小孔中的a549細胞中并在大約2分鐘之后與緩沖溶液一起培養(yǎng)。然而，通過將0.5微升到100微升的水溶液與48孔板中不同種類的細胞相接觸實現(xiàn)傳遞，例如，使細胞群接觸0.5微升、5微升、10微升、15微升或者100微升的水溶液。但是傳遞不局限于在48(或者24)孔板的小孔中進行，反而與細胞群接觸的水溶液的體積可以是接觸細胞表面積和/或細胞群數目的函數。例如，為了確定傳遞到每個細胞中水溶液的體積，下面描述了一種非限制性示例性方法，用于計算每細胞傳遞的體積和每微米接觸細胞表面積傳遞的體積。

示范性的粘附細胞的平均直徑大約10-30微米。例如，a549細胞的平均直徑為15微米(相當于0.015厘米)。因此，a549細胞的平均面積是大約1.8x10-6平方厘米。標準48孔細胞培養(yǎng)皿中單個孔面積包括0.95平方厘米的生長區(qū)。因此，細胞數目(例如，a549細胞的直徑為15微米)大約是500,000-500,500個細胞(例如，537,691個細胞)，假定100％交會。舉例來說，每孔傳遞10微升的水溶液，因此，大約1.9x10^-5微升的水溶液被傳遞個每個細胞(例如，a549細胞)。因此、大約每細胞1.9x10^-5微升水溶液接觸所述細胞群。使用水體積(例如；0.5微升、5微升、10微升、15微升和100微升)和各個細胞尺寸(例如，大約30微升間充質干細胞(mscs)、大約15微升a549細胞和大約10微升u266細胞)確定每細胞傳遞的水溶液體積范圍。這些和其他示例性的值顯示在圖52和圖53中。

作為細胞接觸表面積函數的傳遞體積示范性的計算方法，使用細胞培養(yǎng)皿的生長區(qū)。所述24孔板單個孔的表面積是19000平方微米(在48孔板中是9500平方微米，在96孔板中是3200平方微米)。使用水相體積，包括0.5微升、5微升、10微升、15微升和100微升確定每孔中傳遞的水體積范圍。因此，在24孔板中，每平方微米中傳遞的水溶液體積(例如，每孔10微升)包括5.3x10-4微升每孔、在48孔板中為1.1x10-3微升每孔，在96孔板中為3.1x10-3微升每孔。這些和其他示例性的值顯示在圖52中。圖53是其他表，顯示了一些實施例細胞的性質。

水溶液和傳遞

所述水溶液(在這里還叫做組合物)包括醇類，所述醇類選自甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇和苯甲醇。所述組合物可以包括不超過50％(v/v)的醇類。在某些實施方案中，所述醇類是乙醇，并且所述組合物包括5％，10％，20％，25％，30％，或者40％(釩/釩)的所述乙醇。做為選擇，所述醇類是甲醇，并且所述組合物包括5％，10％，20％，25％，30％，或者40％(釩/釩)的所述甲醇。進一步地，所述醇類是丁醇并且所述組合物可以包括2、4或者8％(v/v)的丁醇。在優(yōu)選的實施方案中，所述組合物是包括所述醇類的水溶液。所述組合物優(yōu)選是低滲的，在室溫下及ph值大約為7.4時，其滲透濃度為171毫克滲透壓/升，并且包括至少一個鹽，選自nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4。在優(yōu)選的實施方案中，所述鹽類是kcl并且所述組合物包括2.4、4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mm的kcl。所述組合物可以包括糖，所述糖可以是蔗糖并且所述組合物可以包括6.4，12.8，19.2，25.6，32，64，76.8，或者89.6mm的蔗糖。在這種優(yōu)選的實施方案中，所述組合物另外包括緩沖劑，所述緩沖劑可以選自弱酸或者弱堿。在一種優(yōu)選的實施方案中，所述緩沖劑是4-(2-羥乙基)哌嗪乙烷硫酸并且所述組合物包括1，2，3，4，5，10，12，14mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。另外中，所述組合物可以包括乙酸銨，例如，2.4、4.8，7.2，9.6，12，24，28.8，或者33.6mm的乙酸銨。

這里的方法可以用于傳遞平均分子量高達2,000,000道爾頓的分子，例如，平均分子量高達150,000道爾頓、平均分子量高達15,000道爾頓、平均分子量高達5,000道爾頓和/或平均分子量高達1,000道爾頓的分子。

本方法的引入步驟可以包括引入3.0-150.0微摩的待傳遞分子，選擇性的，3.3-150.0微摩的待傳遞分子，進一步選擇性的6.6-150.0微摩的待傳遞分子。選擇性地，本方法的引入步驟包括引入3.0、3.3、6.6或者150微摩待傳遞分子。當待傳遞的分子的平均分子量高達15,000道爾頓時，所述引入步驟可以包括3.3微摩待傳遞的分子，或者6.6微摩待傳遞分子。做為選擇，當所述待傳遞分子的平均分子量高達1,000道爾頓時，所述引入步驟包括引入150微摩待傳遞分子。可以選擇引入步驟中被引入分子的量。

在某一實施方案方案中，被傳遞的分子具有的平均分子量高達15,000道爾頓。并且本方法包括向組合物中引入6.6微摩待傳遞分子，所述組合物包括水溶液，在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mm乙酸銨。

在另一個實施方案方案中，被傳遞的分子具有的平均分子量高達15,000道爾頓。并且本方法包括向組合物中引入6.6微摩待傳遞分子，所述組合物包括水溶液，在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4；并且包括20％(v/v)的甲醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mm乙酸銨。

當被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓時，本方法包括向組合物中引入150微摩待傳遞分子，所述組合物包括水溶液，在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mm乙酸銨。

在另一個實施方案中，本發(fā)明方法包括當待傳遞分子的平均分子量高達1,000道爾頓時，向組合物中引入150微摩待傳遞分子，所述組合物包括水溶液，在室溫下水溶液滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mm乙酸銨。

本發(fā)明方法包括當待傳遞分子的平均分子量高達1,000道爾頓時，向組合物中引入150微摩待傳遞分子，所述組合物包括水溶液，在室溫下水溶液滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4；并且包括2％(v/v)的丁醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；和12mm乙酸銨。

在一個實施方案中，待傳遞分子的平均分子量高達1,000道爾頓，并且所述方法包括向組合物中引入150微摩待傳遞分子，所述組合物包括水溶液，所述水溶液在室溫下的滲透濃度為171毫克滲透壓/升，ph值大約為7.4，并且包括25％(v/v)乙醇；34mmnacl；0.7mmkcl、2.5mmna2hpo4和0.5mmkh2po4。

根據實施例方法，被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。在一些實施方案中，所述組合物包括醇類，并且可以包括至少兩個碳原子(例如，乙醇)。所述組合物可以包括2-45％(v/v)的所述醇，選擇性地20-30％(v/v)的醇類(例如，25％(v/v)的所述醇)。更進一步選擇性的，所述組合物包括2-45％(v/v)的乙醇，20-30％(v/v)的乙醇，和25％(v/v)的乙醇。優(yōu)選的，所述組合物可以包括20-30％(v/v)的乙醇。所述組合物可以是溶液(例如，水溶液)。在一些實施方案中，所述組合物在室溫下具有的滲透濃度為171mosm/l。優(yōu)選的，所述組合物在室溫下具有的滲透濃度為171mosm/l。在一些實施方案中，所述組合物包括至少一種鹽，選自nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4.所述組合物可以包括小于46mm(例如，2-35mm之間的鹽、10-15mm之間的鹽、或者12mm的鹽)。優(yōu)選的，所述組合物包括12mmkcl。選擇性地、所述組合物的ph值大約為7.4。在一些實施方案中，所述組合物包括糖，選擇性地包括二糖(例如、蔗糖)。所述組合物可以包括小于121mm的糖(例如，6-91mm的糖、26-39mm的糖、或者32mm的糖)。進一步地優(yōu)選的，所述組合物可以包括32毫米蔗糖。在一些實施方案中，所述組合物可以包括緩沖劑，所述緩沖劑可以選自弱酸或者弱堿。選擇性地，所述緩沖劑是4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。選擇性地，所述組合物包括小于19mm的緩沖劑(例如，1-14mm緩沖劑、或者4-6mm緩沖劑或者5mm緩沖劑)。進一步地優(yōu)選的，所述組合物可以包括5mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。根據實施例方法，所述組合物包括小于46毫米乙酸銨，例如，2-35mm乙酸銨、10-15毫米乙酸銨，或者12mm乙酸銨。優(yōu)選的，所述組合物包括150.0微摩待傳遞分子。

在一些實施方案中，被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。在一些實施例中，組合物可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括25％(v/v)的乙醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和150.0微摩待傳遞分子。

根據實施例方法，被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。在一些實施方案中，所述組合物包括醇類，并且可以包括至少一個碳原子(例如，甲醇)。優(yōu)選的，所述組合物包括乙醇。所述組合物可以包括2-45％(v/v)的所述醇，選擇性地20-30％(v/v)的醇類，或者25％(v/v)的所述醇類。在一些實施方案中，所述組合物包括2-45％(v/v)的甲醇，20-30％(v/v)的甲醇，和選擇性地20％(v/v)的甲醇。優(yōu)選的，所述組合物可以包括20-30％(v/v)的甲醇。在一些實施方案中，所述組合物是溶液(例如，水溶液)。選擇性地或者另外，所述組合物在室溫下具有的滲透濃度為171mosm/l，選擇性地在室溫下。優(yōu)選的，所述組合物在室溫下具有的滲透濃度為171毫克滲透壓/升。在一些實施方案中，所述組合物包括至少一種鹽，所述鹽選自nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4.所述組合物可以包括小于46mm(例如，2-35mm之間的鹽、10-15mm之間的鹽、或者12mm的鹽(例如，12mm的kcl)。所述組合物的ph值大約為7.4。在一些實施方案中，所述組合物包括糖、二糖或者蔗糖。所述組合物可以包括小于121mm的糖，例如，6-91mm的糖、26-39mm的糖、或者32mm的糖(例如，32mm的蔗糖)。在一些實施方案中，所述組合物可以包括緩沖劑，所述緩沖劑可以選自弱酸或者弱堿。選擇性地，所述緩沖劑是4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。選擇性地，所述組合物包括小于19mm的緩沖劑(例如，1-14mm緩沖劑、和4-6mm緩沖劑和5mm緩沖劑)。進一步地優(yōu)選的，所述組合物可以包括5mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。在一些實施方案中，所述組合物包括小于46毫米乙酸銨，例如，2-35mm乙酸銨、10-15毫米乙酸銨，或者12mm乙酸銨。優(yōu)選的，所述組合物包括150.0微摩待傳遞分子。

被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。在一些實施方案中，組合物可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括20％(v/v)的甲醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和150.0微摩待傳遞分子。

根據實施例方法，被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。所述組合物包括醇類，所述醇類包括至少四碳原子(例如在內，丁醇)。更進一步，所述組合物包括2-8％(v/v)的醇類，或者2、4或者8％(v/v)的醇類(例如，優(yōu)選的，所述組合物包括2％(v/v)的丁醇)。在一些實施方案中，所述組合物是溶液(例如，水溶液)。在一些實施方案中，所述組合物在室溫下具有的滲透濃度為171mosm/l。優(yōu)選的，所述組合物在室溫下具有的滲透濃度為171毫克滲透壓/升。在一些實施方案中，所述組合物包括至少一種鹽，選自nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4.所述組合物可以包括小于46mm(例如，2-35mm之間的鹽、10-15mm之間的鹽、或者12mm的鹽)。優(yōu)選的，所述組合物包括12mmkcl。所述組合物的ph值大約為7.4。在一些實施方案中，所述組合物包括糖、選擇性地二糖，選擇性地蔗糖。選擇性地，所述組合物可以包括小于121mm的糖，例如，6-91mm的糖、26-39mm的糖、或者32mm的糖(例如，32mm的蔗糖)。在一些實施方案中，所述組合物可以包括緩沖劑，所述緩沖劑可以選自弱酸或者弱堿。選擇性地，所述緩沖劑可能是4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。選擇性地，所述組合物包括小于19mm的緩沖劑，1-14mm緩沖劑、4-6mm緩沖劑和5mm緩沖劑。進一步地優(yōu)選的，所述組合物可以包括5mm的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸。在一些實施方案中，所述組合物包括小于46毫米乙酸銨，例如，2-35mm乙酸銨、10-15毫米乙酸銨，或者12mm乙酸銨。優(yōu)選的，所述組合物包括150.0微摩待傳遞分子。

被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。在一些實施方案中，組合物可以包括在室溫下滲透濃度為171毫克滲透壓/升并且ph值大約為7.4的水溶液；并且包括2％(v/v)的丁醇；12mmkcl；32mm蔗糖；5mm4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸；12mm乙酸銨；和150.0微摩待傳遞分子。

根據實施例方法，被傳遞的分子具有的平均分子量高達1,000道爾頓。所述組合物包括醇類，所述醇類包括至少兩個碳原子(例如，乙醇)。在一些實施方案中，所述組合物包括2-45％(v/v)的所述醇，(例如，20-30％(v/v)的所述醇，和25％(v/v)的所述醇)。進一步地方案中，所述組合物包括2-45％(v/v)的所述醇，(例如，20-30％(v/v)的所述醇，或者25％(v/v)乙醇。在一些實施方案中，所述組合物是溶液(例如，水溶液)。根據示例性的方法，所述組合物具有的滲透濃度為171mosm/l(例如，在室溫下)。根據實施例方法，所述組合物包括至少一種選自nacl，kcl，na2hpo4，和kh2po4中的鹽。所述組合物可以包括34毫米nacl或者0.7毫米kcl。所述組合物可以包括2.5mmna2hpo4。所述組合物包括0.5mm的kh2po4。優(yōu)選的，所述組合物包括34mmnacl、0.7mmkcl、2.5mmna2hpo4，和0.5mmkh2po4中的至少一個。優(yōu)選的，所述組合物包括34mmnacl、0.7mmkcl、2.5mmna2hpo4，和0.5mmkh2po4。優(yōu)選的，所述組合物包括150.0微摩待傳遞分子。

在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括以下步驟：向組合物中引入分子形成基質；霧化基質；和通過以噴霧的形式將1微升基質傳遞到0.065-0.085平方厘米范圍內，使基質與質膜相接觸。

本發(fā)明的方法包括通過以噴霧的形式將1微升的基質傳遞到0.065-0.085平方厘米范圍內，選擇性的0.065-0.085平方厘米范圍內，使基質與質膜相接觸。在某些實施方案中，使基質與質膜相接觸包括傳遞10-100微升的基質，選擇性的傳遞20微升的基質。在一個優(yōu)選的實施方案中，使基質與質膜相接觸包括以煙霧機的形式傳遞所述基質，其中，本發(fā)明進一步包括在使基質與質膜相接觸前霧化所述基質的步驟。如這里所述，使用噴霧器可以實現(xiàn)上述霧化步驟。優(yōu)選的，本發(fā)明方法包括在使基質與質膜相接觸前霧化所述基質，提供直徑為30-100微米的顆粒膠體懸浮液。

在本發(fā)明主題內容的方法中，所述霧化步驟包括提供一般(環(huán)形)圓錐噴霧帶，如圖1所示。在優(yōu)選的實施方案中，所述霧化步驟包括常規(guī)圓錐形的噴霧帶，其中，所述噴霧帶的縱向長度大于所述噴霧帶的環(huán)形部分直徑。在優(yōu)選的實施方案中，所述霧化步驟包括常規(guī)圓錐形的噴霧帶，其中，所述噴霧帶的縱向長度是所述噴霧帶的環(huán)形部分直徑的大約兩倍。噴霧帶的環(huán)形部分等于將要傳遞分子的細胞面積的環(huán)形部分。因此，在某些實施方案中，所述霧化步驟包括常規(guī)圓錐形的噴霧帶，其中，所述噴霧帶的縱向長度小于或等于31mm，并且要將分子傳遞到其中的所述噴霧帶的環(huán)形部分面積是15.5mm。所述接觸步驟優(yōu)選在基質傳遞面積的中點，例如，其中，所述噴霧帶的縱軸與將要傳遞分子至其中的細胞面積環(huán)形部分的縱軸或者中點同軸。

本發(fā)明方法可以包括在使基質與質膜接觸前進一步將細胞與待傳遞基質相接觸。在某些實施方案中，所述接觸步驟包括除去細胞周圍液體量，例如，通過抽吸。在另外優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括以下步驟：向組合物中引入分子形成基質；霧化基質；將細胞與待傳遞基質相接觸，和通過以噴霧的形式將1微升基質傳遞到0.065-0.085平方厘米范圍內，使基質與質膜相接觸。

所述方法可以進一步地包括培養(yǎng)所述暴露細胞、選擇性地與緩沖溶液、比如磷酸鹽緩沖鹽水一起培養(yǎng)。因此，本主題內容的實施方案定義了一種方法，所述方法包括以下步驟：向組合物中引入分子形成基質；霧化基質；去掉要將基質傳遞至其中的細胞中的上清液，洗滌細胞，和通過以噴霧的形式將1微升基質傳遞到0.065-0.085平方厘米范圍內，使基質與質膜相接觸。

本方法還可以包括在室溫下進一步培養(yǎng)所述細胞0.1秒-2分鐘，選擇性的，培養(yǎng)2分鐘。

出乎意料的發(fā)現(xiàn)，本方法可以包括其他步驟：將細胞與第二組合物相接觸，所述第二組合物包括68mmnacl、1.4mmkcl、5mmna2hpo4和0.9mmkh2po4。第二組合物是一種溶液，選擇性地所述水溶液的ph值為7.4。在一種優(yōu)選的實施方案中，所述其他步驟包括在室溫下30秒內向0.0052-0.0068平方厘米面積內傳遞1微升的第二組合物。

在其他接觸步驟之后，本方法可以進一步包括暴露基質要傳遞到其中的細胞，例如通過抽吸作用除去細胞周圍大量的液體。

所述方法進一步包括在暴露步驟之后培養(yǎng)細胞，例如，通過向細胞中引入適當的培養(yǎng)基并在潮濕的環(huán)境下，5％co2，37℃下培養(yǎng)細胞。

因此，在一種優(yōu)選的實施方案中，本方法包括其他步驟：將細胞與第二組合物相接觸，所述第二組合物包括68mmnacl、1.4mmkcl、5mmna2hpo4和0.9mmkh2po4；將細胞與待傳遞基質向接觸；并在暴露步驟之后培養(yǎng)細胞。

因此，本主題內容還涉及本主題內容的第二方面，其中提供了一種第二組合物，第二組合物包括68mm的nacl，1.4mmkcl、5mmna2hpo4和0.9mmkh2po4，并且其中所述組合物是水溶液。

本主題內容還涉及用于傳遞超過一定分子量的分子傳遞通過質膜的方法；所述方法包括以下步驟：將超過一定分子量的分子引入組合物形成基質；并使所述基質與質膜相接觸。

用于傳遞的示例性裝置

本主題內容進一步涉及傳遞膠體懸浮顆粒穿過質膜，例如，通過控制膠體液滴尺寸。尤其是，已經發(fā)現(xiàn)當一定體積的水溶液與細胞群接觸時能夠實現(xiàn)材料的細胞內傳遞?？梢钥刂婆c細胞群接觸的水溶液的體積，例如，通過產生水溶液控制的噴霧。使用特定尺寸(或者尺寸范圍)的膠體懸浮液滴將材料的膠體懸浮液應用于細胞膜。但是，當膠體液滴被用于細胞膜且膠體液滴尺寸過大(和/或總體積也過大)時，可能發(fā)生對細胞的破壞作用，并且細胞活力可逆的受到影響。相反，當膠體液滴被用于細胞膜且所述膠體尺寸過小(和/或總體積也過小)時，則不能實現(xiàn)材料的細胞內傳遞。因此，控制的膠體液滴尺寸(或者產生的尺寸在一定范圍內的膠體液滴)可以實現(xiàn)細胞內材料的傳遞。在一些實施方案中，所述有效裝載在尺寸上可以是非膠體，例如，直徑為小于1納米或者大于1000納米。

如圖1所示，圖1顯示了儀器10的示意圖，根據本主題內容示例性的實施方案，儀器10適用于傳遞分子通過質膜。

在壓力下輸入樣品(例如，傳遞材料的膠體懸浮液)可以使用噴霧器產生小滴，例如，使用注射器。產生的液滴尺寸與使用的壓力值有關，因此較低的壓力產生較大的液滴尺寸。由于輸入壓力不能立刻改變，所以壓力從0緩沖(例如，變化)到低壓力再到更高的壓力，并且銅鹽從較高的壓力緩沖(例如，變化)到較低的壓力，會產生各種尺寸的液滴。產生的膠體液滴的一部分可能由于太大而不適合特定的細胞內傳遞應用。由于一部分產生的膠體液滴過大，盡管產生適當規(guī)模的膠體液滴也可能發(fā)生細胞死亡。如上所述，在一些應用中不希望發(fā)生細胞死亡。另外，通過噴霧器產生的膠體液滴部分也可能過小，這會導致材料低效或者無效的細胞內傳遞。

現(xiàn)有主題內容能夠產生特定尺寸或者尺寸范圍的膠體液滴。另外，產生的膠體液滴的尺寸可以是一致的，例如，產生的液滴尺寸在需要尺寸或者尺寸范圍以外的液滴被減少和/或基本上清除。使用高-開關-速度閥可以實現(xiàn)對膠體液滴尺寸的控制，所述高-開關-速度閥帶有一個腔室，和/或確保頂部由足夠空間供給輸入空氣，這能夠使噴霧器的輸入壓力快速上升和下降。所述噴霧器被設計與注射器一起使用。

根據不同的應用(例如，待傳遞材料和靶細胞種類，液滴的組成，無論是過大還是過小都是可以變化的)。因此，通過產生膠體液滴和控制膠體液滴的尺寸可以實現(xiàn)材料的細胞內傳遞。在一些實施方案中，以某種方式產生所述膠體液滴從而使基本上所有被應用于靶細胞上的膠體液滴都具有一定的尺寸，或其尺寸在一個已知/理想的范圍內，能實現(xiàn)細胞內傳遞。在一些實施方案中，尺寸在已知/理想范圍以外的膠體液體的形成被最小化。

儀器10包括噴霧器12和用于支持細胞的支持物16，噴霧器12具有至少一個噴霧發(fā)射器14.

將基質與質膜相接觸包括以煙霧劑形式傳遞所述基質，這可以使用噴霧器實現(xiàn)。

所述噴霧器12選自機械噴霧器、超聲波霧化器、電噴霧器、噴霧器和文杜里管；并且，本領域普通技術人員可以根據傳遞分子穿過質膜的需要來選擇噴霧器。所述噴霧器可以是市場上可買到的的噴霧器，例如從美國北開羅萊納州lmateleflex公司市場上購買得到的噴霧器。

所述噴霧器12用于提供顆粒的膠體懸浮液，每個顆粒直徑為30-100微米。在某些實施方案中，所述噴霧器12適合于提供膠體懸浮的顆粒，其中顆粒的直徑為50-80微米。所述顆粒是包括待傳遞到細胞中的分子的液滴。

所述噴霧器12可以包括氣體存儲層18。所述儀器10可以包括氣動發(fā)生器或者氣體存儲器18(還被認為是氣動發(fā)生器)。氣體存儲器18中的氣體在壓力下保持。所述氣體可以選自空氣、二氧化碳和氦；但是可以理解，本領域普通技術人員可以選擇或者使用其他合適的氣體。氣體存儲器18可以包括壓力頭發(fā)生器，選擇性地包括固定的壓力頭發(fā)生器來壓縮氣體存儲器18中的其他并在壓力下維持氣體。氣體存儲器18的實施例包括瓶裝氣體。

所述氣體存儲器18處于流體通道中，具有噴霧發(fā)射器14。煤氣儲液器18與噴霧器發(fā)射極14一起處于流體通道中，因此氣體可以從氣體存儲器18中流到噴霧發(fā)射器14中。在某些實施方案中的，氣體存儲器18包括氣體導管20，氣體導管18與噴霧發(fā)射器14一起處于流體通道中。因此，所述氣體導管20用于允許氣體從其中穿過。氣體導管20是凹型的，例如具有開口端的凹形體。在一個實施方案中，所述氣體導管20是凹形體，具有第一22和第二22'開口端，選擇性的第一22和第二22'對向開口。

在一個實施方案中，第一開口端22和第二開口端22'的直徑可以不同。優(yōu)選的，第一開口端22的直徑大于和第二開口端22'的直徑。第一開口端22處于流體通道中并且具有氣體存儲器18。所述第二開口端22'可以處于流體通道中，具有噴霧發(fā)射器14。當氣體在一定壓力下從氣體存儲器18通過氣體導管20被注入時，所述氣體導管20由于第一開口端22的直徑大于第二開口端22'的直徑所產生的收縮部分會使氣流的速度增加，從而在第二開口端22產生壓降。

所述儀器10可以進一步地包括一種樣品存儲器24。所述樣品存儲器24處于流體通道中，具有霧化器12。在一個示范性的實施方案中，樣品存儲器24處于流體通道中，帶有霧化器發(fā)射體14。在優(yōu)選的實施方案中，氣體存儲器18和樣品存儲器24均處于流體通道中，帶有霧化器發(fā)射體14。在這種布置中，可以利用氣體導管20的第二開口端22'處的壓降從樣品存儲器24中吸取樣品。從而將樣品引入氣流中從氣體存儲器18穿過氣體導管20流動到霧化器發(fā)射體14.

在示范性的實施方案中，所述儀器10進一步包括固定在樣品存儲器24和氣體存儲器18之間的取樣閥26。樣品閥26可以調整來自樣品存儲器的樣品流。所述樣品閥26可以被用于產生持續(xù)的或者半持續(xù)的樣品流。在一個示范性實施方案中，樣品閥適用于產生定義數量的樣品的樣品流。例如，所述樣品閥適合于從樣品存儲器24中產生0.5-100微升樣品的半連續(xù)的樣品流。在一個示范性實施方案中，樣品閥26適用于從樣品存儲器24中產生20微升樣品半連續(xù)的樣品流。然而，可以理解，所屬技術領域的專業(yè)人員可以選擇樣品流，據此樣品閥可以使1微升的半連續(xù)的樣品流被應用到0.065-0.085cm²的面積上。

所述噴霧器12和支持物16在空間上相互間隔的。所述支持物16可以向著霧化器12固定，從而使霧化器12產生的噴霧流(噴霧區(qū)域)被支持器接受或者噴在其上。所述支持物16包括固體支持物。在一些實施方案中，所述支持物16包括平皿，平皿中包括樣品井。在選擇性的實施方案中，所述支持物16包括適合于接受或者維持包括所述樣品孔的平皿的固體支持物。所述支持物16或者所述平皿可以包括選自1，6，9，12，24，48，96，384，和1536孔的樣品，例如，所述支持物16或者所述平皿可以是1，6-，9-，12-，24-，48-，96-，384-，或者1536孔平皿。所述支持器16可以是，例如生物膜，例如生物組織，例如皮膚組織或者管狀組織；或者在一些實施方案中，生物器官。所述支持物可以由惰性材料組成。

在示例性實施方案中，所述固體支持物由塑料或者金屬或者合金組成，當然可以理解，本領域普通技術人員可以選擇并使用任何其他適當的材料。在一些實施方案中，所述支持物16可以是人工膜，例如鋁膜或者塑料膜。

在示范性的實施方案中，所述支持物16包括發(fā)熱元件，其可以是電阻元件或者可以在支持物16上增加或者降低溫度。

所述支持物16可以互易地固定在儀器10上，允許支持物16相對于儀器10可以互動。在一些實施方案中，所述支持物16可以相對于霧化器12或者霧化器發(fā)射器14相互活動。在這種布置中，所述支持物16可以相對于霧化器發(fā)射器14移動，實現(xiàn)最佳噴霧帶(噴霧區(qū))用于傳遞分子穿過質膜。所述支持物16包括支持物制動器使支持物16相對于霧化器12或者霧化器發(fā)射器14(選擇性的，霧化器發(fā)射器14的縱軸)相互移動，從而調整支持物16和霧化器發(fā)射器14之間的距離。另外，所述支持物16可以包括支持器制動器使支持物16沿著霧化器發(fā)射器14的縱軸橫向相互移動，從而調整支持物16和霧化器發(fā)射器的相對位置。

在一個示范性的實施方案中，霧化器12或者霧化器發(fā)生器14與支持物16之間的距離小于或等于31mm。霧化器12和支持物16的空間間隔定義了位于期間的噴霧區(qū)域。在一個實施方案中，所述噴霧區(qū)的縱向長度為31毫米。

噴霧區(qū)的縱軸優(yōu)選與支持物16的縱軸同軸。另外，霧化器發(fā)射體14的縱軸優(yōu)選與支持物16的縱軸同軸。在此布置下，霧化器發(fā)射器14的縱軸、支持物16的縱軸和噴霧區(qū)的縱軸是同軸的，從而保證霧化器發(fā)射體14和與霧化器發(fā)射體14相關的噴霧區(qū)向支持物16聚集(例如，平皿的環(huán)形孔)進行傳遞。

所述儀器10可以進一步地包括固定在樣品存儲器18和噴霧器12之間的取樣閥。所述閥28可以是一電磁操作閥，比如螺線管操縱閥。做為選擇，所述閥28可以是氣動閥。優(yōu)選的，所述閥28位于氣體導管20中并且可以用于調整氣體導管20內的氣流。例如，閥28可以在關閉位置和開放位置之間轉化，所述閉合位置用于防止氣體從霧化器12中活化，所述開放位置允許一定壓力下的氣體激活噴霧器12產生膠體液滴。所述開放位置可以部分開放從而控制霧化器12收到的壓力。所述閥28可以允許持續(xù)的或者半持續(xù)的氣流。在一個示例性的實施方案中，所述閥28適合于在一定時間間隔內產生半連續(xù)的氣流，例如，在一秒時間間隔內產生半連續(xù)的氣流。

所述閥28可以允許持續(xù)的或者半持續(xù)的氣流。在一種優(yōu)選的實施方案中，所述閥28適合于在一定時間間隔內產生半連續(xù)的氣流，例如，在一秒時間間隔內產生半連續(xù)的氣流。

為了確保無菌并除去雜質顆粒，儀器10可以進一步地包括至少一個過濾器30。在一些實施方案中，每個過濾器30都具有小于10微米的孔徑，但是本領域技術人員可以容易的確定所需使用或選擇的孔徑。每個過濾器30位于氣體導管20中，并且每個過濾器30在氣體導管20的流體通道中。

所述儀器10可以包括至少一個調節(jié)器32，其可以是電調節(jié)器或者機械調節(jié)器。每個調節(jié)器32位于氣體導管20中，并且每個調節(jié)器32在氣體導管20的流體通道中。每個調節(jié)器32可以是調節(jié)閥和可以將氣體導管內部20的壓力調整到1.0-2.0bar。每個調節(jié)閥還可以將氣體導管內部20的壓力保持在1.0-2.0bar。在示例性的實施方案中，每個調節(jié)閥還可以將氣體導管內部20的壓力保持在1.5bar。本主題內容示范性的實施方案可以包括兩個調節(jié)器32.例如，所述儀器10可以包括第一調節(jié)器32和第二調節(jié)器32'。第一調節(jié)器32和第二調節(jié)器32'位于氣體導管20中，并且分別在氣體導管20的流體通道中。在一個示范性的實施方案中，第一調節(jié)器32位于氣體存儲器18和過濾器30之間。第一調節(jié)器32可以用于在氣體導管20內部調整來自氣體存儲器18的壓力到2.0bar，并且維持氣體導管20內部的壓力在2.0bar。第二調節(jié)器32’位于氣體存儲器30和閥28之間。

根據一些實施方案，所述噴霧發(fā)射器14能夠提供圓錐形的噴霧區(qū)。所述噴霧發(fā)射器14可以用于提供30度的圓錐噴霧區(qū)。

所述儀器10可以進一步包括微處理器，從而控制儀器10的部分或者全部；例如，所述微處理器可以設置來控制任意或者全部樣品閥26、閥28和調節(jié)器32.

在一些實施方案中，儀器10被設計將1微升的樣品傳遞到0.065-0.085平方厘米范圍內，選擇性的傳遞到0.065-0.085平方厘米范圍內。所述樣品可以以噴霧的形式被傳遞，通過在使樣品與質膜接觸前霧化樣品。霧化器12可以形成樣品液滴，每個液滴的橫截面尺寸為30-100微米，更優(yōu)選的，為50-80微米。選擇性地或者另外，所述霧化器形成樣品液滴，每個液滴的橫截面尺寸小于10微米。優(yōu)選的，設置儀器10從而傳遞在被傳遞樣品所在面積的中心點進行。

材料和方法

除非另有說明，這里使用的所有無機材料都是“analar”級材料。除非另有說明，所有材料都是組織培養(yǎng)等級并購買自西格馬公司。

100毫升的第一溶液(溶液a)被制備，最終在分子級水中含有濃度為43mm的蔗糖、16mm的氯化鉀、16mm的乙酸銨和7mm的hepes，通過加入1.15毫升1mnaoh調節(jié)ph值至7.4并使用孔徑為0.2微米的過濾器過濾殺菌，隨后與乙醇以3:1的比例混合。

制備100毫升的第二溶液(溶液b)，最終在分子級水中具有濃度為68mm的nacl、1.4mm的kcl、5mm的na2hpo4和0.9mm的kh2po4。通過向所得溶液中加入1.13毫升1m的naoh將所得溶液的ph值調節(jié)到ph7.4，并且通過高壓鍋滅菌。

被傳遞給細胞的分子包括碘化丙啶(668da)、mirna(15,000da)(thermoscientific公司)、sirna分子(15,000da)(生命技術公司)、右旋糖苷(3000-2,000,000da)(生命技術公司)。

從sigmaaldrich公司以p4864的商品目錄號購入碘化丙啶溶液(在水中1.0毫克/毫升)；從thermoscientific公司以cp-004500-01-05的商品目錄號購入dy547標記的非目標mirna；從生物科學公司以13750062的商品目錄號獲得熒光素-標記的雙鏈rna低聚物(sirna)；和從生命技術公司獲得熒光素-標記的右旋糖苷，右旋糖苷40,000的商品編目號為d1845；右旋糖苷70,000的商品編目號為d1823；右旋糖苷2,000,000的商品編目號為d7137；和右旋糖苷500,000的商品編目號為d7139。

待傳遞到細胞中的分子被加入溶液a中形成基質。待傳遞的分子的量與被加入到溶液a中的分子的量無關。在目前的實施方案中，被加入到溶液a中的分子的量足夠使基質包括150微摩碘化丙啶(668da)、3.3或者6.6微摩mirna(15,000da)和3.3或者6.6微摩sirna分子(15,000da)。

細胞和細胞培養(yǎng)。從美國典型菌種保藏中心(atcc)處獲得的t24人膀胱癌細胞、u373惡性膠質瘤細胞、skbr3人超三倍體細胞、hela人上皮腺癌細胞、cho-k1中國倉鼠卵巢細胞、cos-7sv40轉化的腎成纖維細胞、c2c12小鼠成肌細胞；a549腺癌人肺泡上皮細胞和beas2b人支氣管上皮細胞系。從caltag醫(yī)療系統(tǒng)(caltagmedsystems)獲得的人胚腎(hek)細胞-n人表皮角質化細胞-新生和hdf正常人皮膚的成纖維細胞系。

所有細胞系在濕潤的氣氛下，5％二氧化碳，37攝氏度下生長。每72小時進行常規(guī)防腐亞培養(yǎng)，或者實現(xiàn)75-90％交會，以先發(fā)生為準。

為了進行實驗，在24孔平板中以大約4×103細胞/孔的密度接種細胞，并允許粘附24小時，從而使細胞在傳遞的時候實現(xiàn)75-90％的交會。

分子的傳遞。從美國的北卡羅萊納州lmateleflex公司商業(yè)購得經鼻粘膜噴霧器，商品編目號為mad300，并且其中包括噴霧發(fā)射器，如下設置：噴霧發(fā)射器放置的位置距離24孔板31毫米，并且在平皿每個孔的中點上。調節(jié)噴霧發(fā)射器的壓力至1.5bar。使用計時器將噴霧從噴霧發(fā)射器中1秒內分配出來。用包含待傳遞分子的溶液a漂洗噴霧發(fā)射器三次。

平板的每個小孔被如下處理：用微量吸液管除去孔中的細胞培養(yǎng)基。選擇性地，所述孔用微量吸液管吸取250微升的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)漂洗兩次。使用霧化器將包含待傳遞分子的20微升的溶液a被傳遞到細胞中。根據待傳遞的分子尺寸，在室溫下培養(yǎng)孔板30秒至2分鐘，隨后使用微量吸液管加入250微升的溶液b。然后在室溫下培養(yǎng)孔板30秒，在此時，使用微量吸液管從孔中除去溶液b。使用微量吸液管向孔中加入500微升培養(yǎng)基。所有細胞系在濕潤的氣氛下，5％二氧化碳，37攝氏度下生長。

熒光顯微術。按照使用說明書使用異硫氰酸熒光素(fitc)-和dylight亞磷酰胺(dy547)-標記分子。待傳遞到細胞中的區(qū)的標記分子被加入溶液a中，如上所述被傳遞到細胞中。在傳遞后，將孔板放置在熒光顯微鏡(奧林帕斯ckx41)上，使用濾光鏡觀察細胞，目測熒光。獲得熒光照片。

流式細胞儀。在傳遞后，使用200微升胰蛋白酶除去孔板每個孔中的細胞。使用200微升培養(yǎng)基使胰蛋白酶失活。通過離心作用在259相對離心力(rcf)作用下離心細胞5分鐘將細胞壓制成丸，使用微量吸液管將細胞丸再懸浮在200微升pbs中。將細胞懸浮液裝載入流式細胞儀[accuri流式細胞儀，bd生物科學公司)并根據使用說明書進行熒光分析。

細胞生存能力.傳遞之后，按照使用說明書使用celltiter96aqueous單溶液細胞增殖實驗(mts)(promega)評價細胞生存能力。簡而言之，將培養(yǎng)基從小孔中吸出，并替換為200微升新鮮培養(yǎng)基并向其中加入40微升mts試劑。在37攝氏度下培養(yǎng)孔板1小時，避光保存。從孔中除去100微升的溶液并放置到96孔板中，使用glomax96微板光度計(promega公司)在450納米下閱讀吸光率。

共-定位觀察。按照使用說明書使用異硫氰酸熒光素(fitc)-和dylight亞磷酰胺(dy547)-標記分子。在傳遞后，將孔板放置在熒光顯微鏡奧林帕斯ckx41上，使用濾光鏡觀察細胞，目測熒光。獲得熒光照片。

本主題內容進一步涉及傳遞膠體懸浮顆粒穿過質膜，例如，通過控制膠體液滴尺寸。尤其是，已經發(fā)現(xiàn)，當使用特定尺寸(或者尺寸范圍)的膠體懸浮液液滴將材料的膠體懸浮液應用于細胞膜時，可以實現(xiàn)材料的細胞內傳遞。但是，當膠體液滴被用于細胞膜且膠體液滴尺寸過大時，可能發(fā)生對細胞的破壞作用，并且細胞活力可逆的受到影響。相反，當膠體液滴被用于細胞膜且所述膠體尺寸過小時，則不能實現(xiàn)材料的細胞內傳遞。因此，控制的膠體液滴尺寸(或者產生的尺寸在一定范圍內的膠體液滴)可以實現(xiàn)細胞內材料的傳遞。

在壓力下輸入樣品(例如，傳遞材料的膠體懸浮液)可以使用噴霧器產生小滴，例如，使用注射器。產生的液滴尺寸與使用的壓力值有關，因此較低的壓力產生較大的液滴尺寸。由于輸入壓力不能立刻改變，所以壓力從0緩沖(例如，變化)到低壓力再到更高的壓力，并且同樣從較高的壓力緩沖(例如，變化)到較低的壓力，會產生各種尺寸的液滴。產生的膠體液滴的一部分可能由于太大而不適合特定的細胞內傳遞應用。由于一部分產生的膠體液滴過大，盡管產生適當規(guī)模的膠體液滴也可能發(fā)生細胞死亡。如上所述，在一些應用中不希望發(fā)生細胞死亡。另外，通過噴霧器產生的膠體液滴部分也可能過小，這會導致材料低效或者無效的細胞內傳遞。

現(xiàn)有主題內容能夠產生特定尺寸或者尺寸范圍的膠體液滴。另外，產生的膠體液滴的尺寸可以是一致的，例如，產生的液滴尺寸在需要尺寸或者尺寸范圍以外的液滴被減少和/或基本上清除。使用高-開關-速度閥可以實現(xiàn)對膠體液滴尺寸的控制，所述高-開關-速度閥帶有一個腔室，和/或確保頂部由足夠空間供給輸入空氣，這能夠使噴霧器的輸入壓力快速上升和下降。所述噴霧器被設計與注射器一起使用。

根據不同的應用(例如，待傳遞材料和靶細胞種類，液滴的組成，無論是過大還是過小都是可以變化的)。因此，通過產生膠體液滴和控制膠體液滴的尺寸可以實現(xiàn)材料的細胞內傳遞。在一些實施方案中，以某種方式產生所述膠體液滴從而使基本上所有被應用于靶細胞上的膠體液滴都具有一定的尺寸，或其尺寸在一個已知/理想的范圍內，能實現(xiàn)細胞內傳遞。在一些實施方案中，尺寸在已知/理想范圍以外的膠體液體的形成被最小化。

所述儀器10可以進一步地包括固定在樣品存儲器18和噴霧器12之間的取樣閥。所述閥28可以是電磁操作閥，比如電磁閥。所述閥28可以是氣動閥。所述閥28位于氣體導管20中并且可以用于調整氣體導管20內的氣流。例如，閥28可以在關閉位置和開放位置之間轉化，所述閉合位置用于防止氣體從霧化器12中活化，所述開放位置允許一定壓力下的氣體激活噴霧器12產生膠體液滴。所述開放位置可以部分開放從而控制霧化器12收到的壓力。所述閥28可以允許持續(xù)的或者半持續(xù)的氣流。在一個示例性的實施方案中，所述閥28適合于在一定時間間隔內產生半連續(xù)的氣流，例如，在一秒時間間隔內產生半連續(xù)的氣流。

在一些實施方案中，所述閥28的開關速度可以小于250毫秒。所述開關速度可以閥28在關閉位置和開放位置(和/或反之亦然)所需要的時間。在一些實施方案中，所述閥28的開關速度小于200毫秒。在一些實施方案中，所述閥28的開關速度在50和200毫秒之間。也可以有其他實施方案。

所述閥28可以包括腔。

在一些履行，所述霧化器12可以產生直徑在30和100微米之間的膠體液滴。在一些實施方案中，所述霧化器12可以產生直徑在30和50微米之間的膠體液滴。在一些實施方案中，由于儀器10的特點(例如，比方說快速的閥26開關時間)，輸入到霧化器12中的壓力導致大于百分之八十的有霧化器12產生的膠體液滴的直徑在30微米至100微米之間(當在一秒內測定時，其中閥從關閉位置到開放位置，或者從開放位置至閉合位置至少變化一次)。.在一些實施方案中，輸入到霧化器12中的壓力導致大于百分之99的有霧化器12產生的膠體液滴的直徑在30微米至100微米之間(當在一秒內測定時，其中閥從關閉位置到開放位置，或者從開放位置至關閉位置至少變化一次)。

操作中，本主題內容可以實現(xiàn)分子的細胞內傳遞。圖3是過程流程圖，解釋了產生用于將樣品傳遞到一種或者一種以上靶細胞細胞質中的膠體滴的方法800。在810中，通過氣動發(fā)生器或者其他存儲器18產生氣體，所述氣體具有一定壓力。在820，閥可以在關閉位置和開放位置之間轉化，所述閉合位置用于防止氣體在壓力下激活噴霧器12，所述開放位置允許一定壓力下的氣體激活噴霧器12產生膠體液滴。所述閥28可以在氣動發(fā)生器或者氣體存儲器8和霧化器12之間。從樣品存儲器提供樣品用于霧化器產生膠體液滴。也可以有其他實施方案。

其他實施例如下進行。

實施例1：技術的發(fā)展

將分子傳遞入活細胞中在多種應用中都是非常需要的。通常，所涉及的分子類型根據分子量可以分為：(i)通常平均分子量<1,000da的小化學品分子；(ii)通常所具有的平均分子量大約為5000da的肽；(iii)通常所具有的平均分子量大約為15,000da的sirna；(iv)通常所具有的平均分子量大約為150,000da的抗體；和(v)核酸，例如dna，通常所具有的平均分子量大約為5,000,000da。

采取多種方法來傳遞分子通過質膜進入細胞，各個方法取決于待傳遞分子的尺寸和化學性質。有機溶劑，比如二甲亞砜，已經被用于傳遞小化學品分子。而這些分子基于二甲亞砜對質膜的作用，這一作用還不清楚，已知二甲亞砜能夠顯示出三種不同的作用方式，每種適應不同的濃度范圍。在低濃度下，二甲亞砜誘導質膜變薄并增加質膜疏水核的流動性。在更高的濃度下，二甲亞砜在質膜上誘導不穩(wěn)定的水孔。在依舊更高的濃度下，單獨的脂質分子被質膜不可逆的吸收，隨后導致質膜雙層結構破壞性崩解。

大的、生物分子的引入，例如低聚肽、多肽或者蛋白質和核酸(例如質粒dna、低聚核苷酸和sirna)被認為是“轉染”。使用傳統(tǒng)的傳遞組合物，例如，二甲亞砜，不能有效實現(xiàn)這些大分子的傳遞。sirna分子通常通過脂質體-調解的轉染(lipofection)傳遞。通常使用生物(病毒)、化學品(脂質-基或者化學品聚合物)或者物理(例如電穿孔、磁轉染、注射)方法傳遞質粒dna。然而，這些方法不能便利的傳遞蛋白質和肽，并且，許多細胞型，尤其是初級細胞和干細胞，是“難以轉染的”即使攜帶有高毒性的核酸分子，這是一個常見的問題。

各種各樣的方法用來從化學上來分析“滲透”細胞和組織。但是，這些方法中的大多數不針對“可逆的滲透作用”并傳遞入活體細胞。相反，這些方法通常針對“不可逆的滲透作用”，用于傳遞“標記物”，所述標記物附著在細胞或者組織內部的分子或者結構上，從而實現(xiàn)，例如觀測或者定量分析的目的(例如，螢光免疫檢驗法)。在這些位置，所述細胞和組織在滲透后死亡。通常在這些方法中使用的化學品包括醇類(在質膜中溶解脂質)、去污劑(在質膜上產生孔)和酶(消化蛋白質并在之質膜上產生孔)。

已經有少量研究被報道可以使用去污劑成功的實現(xiàn)可逆滲透。去污劑(例如，表面活性劑)廣泛的被被用于生物科學，用于從細胞膜中提取蛋白質并用作膜滲透劑。tritonx-100(tx100)是最廣泛使用的非離子型表面活性劑中的一種，用于賴氨酸細胞或者用于滲透活體細胞膜用于轉染。其他示范性的表面活性劑包括polysorbae20(例如、吐溫20)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基胺]丙烷磺酸鹽(chaps)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基胺]-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(chapso)、十二烷基硫酸鈉(sds)，和辛基葡糖苷。然而，細胞生存能力在很小的表面活性劑濃度范圍內是極端敏感的，并且很難控制用于轉染的tx100濃度。vandenven等人報告了使用tx100將分子量在1000mw到150,000mw的分子傳遞到培養(yǎng)細胞(vandevenk.,etal.,j.biomedopt2009:14(2),，通過引證在此全部并入本文)medepalli等人報道了使用皂角苷和一種低滲緩沖液(蔗糖、kcl、乙酸鉀、hepes)一起將納米尺寸的量子點傳遞到培養(yǎng)細胞中(medepalli,k.,etal.,nanotechnology2013；24:20，通過引證在此全部并入本文)。使用這種低滲緩沖液支持細胞存活力，通過向細胞提供離子和ph緩沖液，同時還是低滲的，從而保證水流入所述被滲透的細胞并在其中攜帶有效裝載(請注意水本身對細胞是有毒性的)。然而，vandeven和medepalli等人報道的實驗不可重復。

基于可逆滲透作用的不含載體的傳遞方法被開發(fā)，從而促進有效裝載傳遞進入細胞，并且傳遞方式能夠保持細胞生存能力和有效裝載的功能性。由于其他基團已經進行了，因此使用下列假設：第一，滲透作用可以通過細胞膜上的化學修飾作用誘導；第二，通過使用低滲傳遞溶液產生滲透壓，據此水流入滲透細胞促進了有效裝載的流入，從而增加傳遞；和第三，如果所述低滲溶液同時是緩沖液和生理活性液，則可以增加細胞存活率。根據最初的觀察，進一步的假設被開發(fā)并改善，如下所述。對于化學滲透作用，最常見的滲透劑是去污劑，其與細胞膜的某些組分相互作用，產生孔洞(hapala,i.,critrev.biotech.1997；17(2):105-22).medepalli等人報道通過在4℃下特異性低滲生理緩沖液(叫做“s緩沖液”(78mm蔗糖、30mmkcl、30mm乙酸鉀、12mmmm))中培養(yǎng)細胞5分鐘可以將量子點傳遞進入培養(yǎng)細胞(medepallik.etal.,nanotechnology2013；24(20)).在一些實施例中，在所述s緩沖液中乙酸鉀被替換為乙酸銨。他們還描述了通過向溶液中增加皂角苷可以提高傳遞。然而，在此條件下會觀察到高水平的細胞損壞和分離的a549細胞，而并沒有觀察到標記的sirna和右旋糖苷分子的吸收。有機溶劑(例如醇類)可以通過溶解細胞膜的脂質滲透細胞。產生了使用乙醇作為滲透劑的可逆滲透方案。

檢測一部分包括水和pbs以及各種濃度的s緩沖液的乙醇濃度系列稀釋物?；趯毎さ淖饔茫靡宜徜@替換s緩沖液中的乙酸鉀并產生更好的傳遞效力。一種優(yōu)選的傳遞溶液組合物包括75％h2o、25％乙醇、32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨和5mmhepes，其能夠產生理想的初始結果，除非另有說明，在此點使用的是這種傳遞溶液。然而，當使用移液管直接將這種溶液大量滴在細胞上時會產生顯著的毒性，從而滲透或者淹沒所述細胞，圖56a。當200微升包含pi的傳遞溶液(24孔板中的每孔)被直接滴在暴露細胞上時，絕大多數細胞對pi直接顯陽性(圖17)。傳遞后24小時測定ldh釋放，說明大約50％細胞被毀壞(圖19)。相反，沒有觀察到大分子，例如10-kda右旋糖苷-alexa488或者sirna-fitc的傳遞(圖17)。所述細胞被過度滲透到致命損傷的程度，其中，pi可以進入并與核dna相連，但是不能建立滲透壓梯度傳遞所述大的有效裝載。

因此，為了使毀壞發(fā)生最小化，所述傳遞過程應該盡可能快，使最大量的有效裝載在最小的體積和最短的可行時間內被傳遞。細胞在第0天被接種到24-孔板中，從而在第1天進行傳遞時實現(xiàn)80-90％的交會。從目標孔中除去上清液并向小孔中滴入20微升傳遞溶液，所述傳遞溶液包含pi、10-kda右旋糖苷-alexa488或者sirna-fitc。在室溫下(rt)培養(yǎng)細胞2分鐘促進吸收。為了進一步促進吸收并防止細胞脫水，向其中加入200微升0.5x-pbs，并進一步培養(yǎng)細胞30秒。然后去掉該溶液并加入400微升培養(yǎng)基。然后通過熒光顯微術分析所述細胞。在此方法中，pi吸收出現(xiàn)在孔的邊緣而不在孔中間(圖18)。傳遞結果與該方法不一致。相反，沒有觀察到10-kda右旋糖苷-alexa488或者sirna-fitc的傳遞(圖17和圖18)。然而與較大的200微升體積相比，ldh水平減少(圖19)。一些細胞發(fā)生過滲透作用和其他細胞發(fā)生滲透作用。滲透溶液向所有細胞的同時傳遞勝過使用微量吸液管的“滴落”體積(其中不是所有的細胞同時作為目標)。而且，所述到達細胞的體積應該足夠使水流入細胞，但是不足以將細胞帶到破碎點。換句話說，所述體積應當被滴定與細胞的吸收能力相配。噴霧調節(jié)的傳遞可以實現(xiàn)這些結果，據此，噴霧在非常短的時間內以一種均勻的方式最優(yōu)化有效裝載與靶細胞細胞膜的接觸，從而保持細胞生存能力以及有效裝載通過細胞膜可靠的和強健的吸收進入細胞內(圖56b)。

儀器。為了實施該方法，配置包括x、y和z的儀器(圖20)。所述儀器用來傳遞10-kda右旋糖苷到a549細胞。向48孔平板中接種細胞，從而使細胞單層面積與噴霧之間相配。從目標孔中除去上清液，并向細胞上噴霧10微升的傳遞溶液，所述傳遞溶液包含10-kda右旋糖苷。在室溫下培養(yǎng)2分鐘之后，加入200微升0.5x-pbs并進一步培養(yǎng)30秒。然后去掉所述溶液并加入400微升培養(yǎng)基。該方法能夠成功傳遞10-kda右旋糖苷進入細胞，有效率大于50％，與未被處理的細胞相比毒性很小或者沒有毒性(圖21和圖22)。

已經建立了一個用于可逆的滲透細胞的技術，檢驗細胞恢復所需的時間。在不存在有效裝載的情況下，噴霧傳遞溶液，隨后在噴霧之后的1小時內時間點向培養(yǎng)基中加入碘化丙啶(pi)，檢測被滲透的細胞。盡管pi吸收在噴霧后五分鐘開始明顯，在噴霧30分和60分后，pi-陽性細胞的數目基本上開始減少，如圖23所示。

實施例最佳參數。

在本技術發(fā)展過程中，一些參數被優(yōu)化。噴霧頭到細胞的距離、噴霧壓力、向每孔噴霧的傳遞溶液體積和乙醇濃度被優(yōu)化實現(xiàn)最佳的傳遞效率和最小的毒性(圖25-29)。噴霧頭與細胞之間的距離為31毫米，噴霧壓力為1.5bar，對于48孔板體積為10微升且乙醇濃度為25％是產生最佳傳遞效率和毒性水平的參數。

實施例2:

根據本發(fā)明將平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞穿過質膜的作用。

在此實施例中，fitc-標記的sirna分子的平均分子量為15,000da，使用本主題內容的儀器將其傳遞到細胞中。所述sirna分子被引入一種組合物，所述組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，20、30或者40％(體積/體積)的乙醇；和6.6微摩待傳遞分子；形成基質。1微升的基質被傳遞到0.065-0.085平方厘米的面積內，從而將基質與細胞的質膜相接觸，或者直接用微量吸液管或者使用這里所描述的儀器。評價待傳遞分子的相對量(熒光值)和細胞的生存能力(活體細胞量)并以百分比表示。結果顯示在圖4中。

如圖4所示，具有平均分子量高達15,000da的分子通過本主題內容所述的方法完成的傳遞(黑條帶)增加了分子的傳遞速率(例如，顯示分子成功傳遞的細胞百分比)，與通過微量吸液管直接將分子與細胞質膜相接觸的傳遞相比(灰條帶)。實際上，在包括30％或者40％(體積/體積)的乙醇的組合物中，和直接使用微量吸液管完成的基質傳遞中，在活細胞中沒有分子傳遞。

實施例3：

根據本發(fā)明將平均分子量高達1,000道爾頓的分子傳遞穿過質膜的作用。

在此實施例中，碘化丙啶分子的平均分子量為668da，使用本主題內容的方法將其傳遞到細胞中。所述分子被引入一種組合物，所述組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，20或者40％(體積/體積)的乙醇；和150微摩待傳遞分子；形成基質。1微升的基質被傳遞到0.065–0.085平方厘米的面積內，從而將基質與細胞的質膜相接觸，或者直接用微量吸液管或者使用這里所如上所述的儀器。結果顯示在圖4中。

如圖5所示，具有平均分子量高達668da的分子在基質中通過本主題內容所述方法完成傳遞(黑條帶)增加了分子的傳遞速率(例如，顯示分子成功傳遞的細胞百分比)，(y軸顯示傳遞百分比，x周顯示乙醇百分比)，與通過微量吸液管直接將分子與細胞質膜相接觸根據傳遞相比(灰條帶)。實際上，在包括40％(體積/體積)的乙醇的組合物中，和直接使用微量吸液管完成的基質傳遞中，在活細胞中沒有分子傳遞。

實施例4：

將超過一個分子量的分子傳遞通過質膜。在此實施例中，具有668da平均分子量的碘化丙啶作為第一分子，將具有40,000分子量的fitc-標記的葡聚糖作為第二分子，使用本主題內容所述儀器將第一分子和第二分子同時傳遞到細胞中。所述第一和第二分子同時被引入一種組合物，所述組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，25％(體積/體積)的乙醇；和150微摩待傳遞分子；形成基質。1微升的基質被傳遞到0.065–0.085平方厘米的面積內，使用本主題內容所示的方法以煙霧劑的形式將基質與細胞的質膜相接觸。結果顯示在圖6a-6c中。

如圖6a所示，使用本主題內容在基質中具有平均分子量為668da的第一分子的傳遞使所述分子被傳遞入細胞中。如圖6b所示，使用本主題內容在相同基質中具有平均分子量為40,000da的第二分子的傳遞使所述第二分子同時被傳遞入細胞中。同時傳遞的結果顯示在圖6c中。

實施例5：

根據本發(fā)明將平均分子量高達500,000道爾頓的分子傳遞穿過質膜的作用。

在此實施例中，fitc-標記的葡聚糖分子的平均分子量為10,000da，使用本主題內容的儀器將其傳遞到細胞中。所述分子被引入一種組合物，所述組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，25％(體積/體積)的乙醇；和150微摩待傳遞分子；形成基質。1微升的基質被傳遞到0.065–0.085平方厘米的面積內，從而將基質與細胞的質膜相接觸，或者直接用微量吸液管或者使用這里所的所述介紹題材的儀器。結果顯示在圖7中。

如圖7所示，具有平均分子量高達500,000da的分子在基質中通過本主題內容所述方法完成傳遞(黑條帶)增加了分子的傳遞速率(例如，指示分子成功傳遞的細胞百分比)，(y軸顯示傳遞百分比，x軸顯示乙醇百分比)，與通過微量吸液管直接將分子與細胞質膜相接觸根據傳遞相比(灰條帶)。實際上，在包括25％(體積/體積)的乙醇的組合物中，和直接使用微量吸液管完成的基質傳遞中，在活細胞中沒有分子傳遞。

實施例6：

將細胞與一種第二組合物接觸的作用，所述第二組合物包括68mm的nacl，1.4mm的kcl，5mm的na2hpo4和0.9mmkh2po4。

在此實施例中，fitc-標記的sirna分子的平均分子量為15,000da，使用本主題內容的儀器將其傳遞到細胞中。在將分子傳遞入細胞中后，將細胞與200微升第二組合物相接觸30秒，所述第二組合物包括：含有胎牛血清(fbs)的dulbecco's修飾的伊格爾培養(yǎng)基(dmem)；不含有胎牛血清(fbs)的dmem；蒸餾水(h2o)；包括137mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4和1.8mmkh2po4(1xpbs)的水溶液；或者包括13.7mmnacl、0.3mmkcl、1.0mmna2hpo4和0.18mmkh2po4(1xpbs)的水溶液，隨后加入培養(yǎng)基并使用這里所描述的熒光顯微術評價傳遞。所述結果顯示在圖8中，進行說明。

如圖8所示，包括68mmnacl、1.4mmkcl、5mmna2hpo4、和0.9mmkh2po4(0.5xpbs)的水溶液優(yōu)選用于本發(fā)明所述方法中，維持細胞生存能力(y軸顯示傳遞百分比)。

實施例7：

將不同的分子量的分子傳遞通過質膜。

在這些實施例中，使用本主題內容介紹的一起將碘化丙啶分子(668道爾頓)、fitc-標記的sirna(15,000道爾頓)、dy547-標記的mirna(15,000道爾頓)、fitc-標記的葡聚糖(40,000道爾頓)和fitc-標記的葡聚糖(500,000道爾頓)分別傳遞到細胞中。所述分子分別被引入一種組合物，所述組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，其中所述組合物包括25％(體積/體積)的乙醇；和150微摩待傳遞分子；形成基質。1微升的各個基質(每個包含不同的待傳遞分子)被傳遞到0.065–0.085平方厘米的面積內，從而將基質與細胞的質膜相接觸，或者直接用微量吸液管或者使用本主題內容的方法。在0小時(碘化丙啶)或者傳遞后24小時觀察細胞(sirna-fitc、mirna-dy547和葡聚糖-fitc)。使用奧林帕斯ix71倒置顯微鏡獲得顯微照片顯示(a)熒光和(b)相襯顯微鏡。結果顯示在圖9中。

如圖9所示，使用本主題內容所述的一起可以成功的將具有改變分子量的分子傳遞入細胞中。另外，具有改變分子量的葡聚糖(例如，3kda、40kda、70kda、500kda和2000kda)、和蛋白質(例如，β-乳球蛋白、hrp、卵清蛋白、bsa、過氧化氫酶和去鐵鐵蛋白)可以成功的被傳遞，分別如圖29和43所示。

因此，本主題內容提供了用于傳遞分子穿過質膜的儀器，能夠通過對每個細胞進行可逆滲透將分子傳遞到活體細胞中?？赡娴臐B透使每個細胞變得可滲透，選擇性地暫時可滲透，從而允許吸收的分子進入所述細胞。有益地，在不可接受的大量細胞死亡發(fā)生前，所述滲透是可逆的。

實施例8：

將平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞的溶質含量作用。

在該實施例中，按照上面描述的方法將平均分子量為15,000道爾頓的sirna分子傳遞到細胞中。使用的組合物是一種ph值大約為7.4的水溶液，其中，所述組合物包括25％(體積/體積)的乙醇和3.3微摩待傳遞分子。通過加入蔗糖、kcl、乙酸銨和hepes使其最終濃度為32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨和5mmhepes可以制得1x溶液。進一步制備具有不同溶解物的檢測溶液(蔗糖、kcl、乙酸銨和hepes)，濃度分別為0.2x、0.4x、0.6x、0.8x、2x、2.4x和2.8x。結果顯示在圖10中。

如圖9所示，用于傳遞的分子的平均分子量高達15,000道爾頓，優(yōu)選包含1x-2x溶質濃度的蔗糖、kcl、乙酸銨和hepes的組合物，或者1x是優(yōu)選的(黑條帶)，已知在此濃度下細胞毒性(白色條帶)最小。這等于32-64mm蔗糖、12-24mmkcl、12-24mm乙酸銨和5-10mmhepes的溶質濃度；進一步選擇性的，是32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨和5mmhepes。

實施例9：

酒精濃度對平均分子量高達15000道爾頓的分子傳遞的作用。

在該實施例中，按照上面描述的方法將平均分子量為15,000道爾頓的sirna分子傳遞到細胞中。使用的組合物是一種水溶液，所述水溶液包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，6.6微摩待傳遞分子，和5、10、20、30或者40％(體積/體積)的乙醇。結果顯示在圖11中。

如圖11所示，用于傳遞的分子的平均分子量高達15,000道爾頓，優(yōu)選一種組合物，包括2-45％(體積/體積)的醇類、選擇性的20-30％(體積/體積)的醇類，進一步選擇性的25％(體積/體積)的醇類(黑條帶)，同時具有最小的細胞毒性(白條帶)。

在比較試驗中，平均分子量為15,000da的sirna分子按照如上所述的方法被傳遞到細胞中，所使用的組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes、ph大約為7.4、6.6微摩待傳遞分子和5、10、20和30％(v/v)的甲醇。結果顯示在圖12中。

如圖12所示，用于傳遞的分子的平均分子量高達15,000道爾頓，優(yōu)選一種組合物，包括2-45％(體積/體積)的醇類、選擇性的10-20％(體積/體積)的醇類，進一步選擇性的20％(體積/體積)的醇類(黑條帶)，同時具有最小的細胞生存能力(白條帶)。

實施例10：

含鹽量對平均分子量高達1,000道爾頓的分子傳遞的作用。

在該實施例中，按照上面描述的方法將平均分子量為668道爾頓的碘化丙啶分子傳遞到細胞中。使用的組合物是一種ph值大約為7.4的水溶液，其中，所述組合物包括25％(體積/體積)的乙醇150微摩待傳遞分子。用25％的0.5x、1x、2x和4x磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)制備檢測溶液，對應的鹽含量為19.0mm、37.9mm、75.8mm和151.6mm。結果顯示在圖12中。

實施例11：

乙醇濃度對平均分子量高達1,000道爾頓的分子傳遞的作用。

在該實施例中，按照上面描述的方法將平均分子量為668道爾頓的碘化丙啶分子傳遞到細胞中。使用的組合物是一種水溶液，所述水溶液包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，150微摩待傳遞分子，和5、10、20、30或者40％(體積/體積)的乙醇。結果顯示在圖14中。

如圖14所示，用于傳遞的分子的平均分子量高達1,000道爾頓，優(yōu)選一種組合物，包括2-45％(體積/體積)的醇類、選擇性的20-30％(體積/體積)的醇類，進一步選擇性的25％(體積/體積)的醇類。

在比較試驗中，平均分子量為668da的碘化丙啶按照如上所述的方法被傳遞到細胞中，所使用的組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes、ph大約為7.4、150微摩待傳遞分子和5、10、20和30％(v/v)的甲醇。結果顯示在圖14中。

如圖15所示，用于傳遞的分子的平均分子量高達1,000道爾頓，優(yōu)選一種組合物，包括5-20％(體積/體積)的醇類、選擇性的5、10或20％(體積/體積)的醇類(黑條帶)，同時具有最小的細胞生存能力(白條帶)。

在比較試驗中，平均分子量為668da的碘化丙啶按照如上所述的方法被傳遞到細胞中，所使用的組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes、ph大約為7.4、150微摩待傳遞分子和2％(v/v)的丁醇。結果顯示在圖16中。

如圖16所示，用于傳遞的分子的平均分子量高達5,000道爾頓，優(yōu)選包括2％(體積/體積)丁醇的組合物(黑條帶)具有最小的細胞毒性(白條帶)。

因此，本主題內容提供了用于傳遞分子穿過質膜的方法，能夠通過對每個細胞進行可逆滲透將分子傳遞到活體細胞中?？赡娴臐B透使每個細胞變得可滲透，選擇性地暫時可滲透，從而允許吸收的分子進入所述細胞。有益地，在不可接受的大量細胞死亡發(fā)生前，所述滲透是可逆的。

實施例12：

根據本發(fā)明將平均分子量高達40,000道爾頓的分子傳遞穿過質膜的作用。

在此實施例中，fitc-標記的葡聚糖分子的平均分子量為40,000da，使用本主題內容的儀器將其傳遞到細胞中。所述分子被引入一種組合物，所述組合物是一種水溶液，包括32mm蔗糖、12mmkcl、12mm乙酸銨、5mmhepes，ph大約為7.4，40％(體積/體積)的乙醇；和150微摩待傳遞分子；形成基質。1微升的基質被傳遞到0.065–0.085平方厘米的面積內，從而將基質與細胞的質膜相接觸，或者直接用微量吸液管或者使用這里所的描述的儀器。

如圖7所示，具有平均分子量高達40,000da的分子通過本主題內容所述的方法完成的傳遞(黑條帶)增加了分子的傳遞速率(例如，顯示分子成功傳遞的細胞百分比)，與通過微量吸液管直接將分子與細胞質膜相接觸的傳遞相比(灰條帶)。實際上，在包括40％(體積/體積)的乙醇的組合物中，和直接使用微量吸液管完成的基質傳遞中，在活細胞中沒有分子傳遞。

實施例13：

具有不同分子種類和尺寸的分子的傳遞作用

在這些實施例中，檢驗了噴霧方法解決傳遞多種分子種類和尺寸的挑戰(zhàn)的能力。具有增加尺寸的葡聚糖，包括3kda、40kda、70kda、500kda和2,000kda的葡聚糖被成功的傳遞進入a549細胞，如圖29所示。還可以傳遞其他種類其他尺寸的分子，例如，線性sirna分子(大約15kda)和大抗體分子(150kda)，如圖30所示。而且，不同類型的分子以各種結合的方式被傳遞。例如：，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)，毒肽和mitotracker紅被成功地共同傳遞入a549細胞，如10-kda葡聚糖-alexa488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)組合物的傳遞一樣，如圖31所示。

由于噴霧是一種不含載體的方法，尤其注意的是使用本方法能夠傳遞mrna和質粒dna。編碼綠色熒光蛋白質(gfp)和熒光素酶的報道m(xù)rnas被噴霧轉染進入cho細胞。通過熒光顯微術觀察綠色熒光蛋白質(gfp)表達并通過發(fā)光測試檢測熒光素酶表達，使用lipofectamine2000作為參照進行對比(圖33和圖34).同樣，當被噴霧轉染進入cho細胞時，編碼綠色熒光蛋白質(gfp)和熒光素酶的dna質粒被表達(圖35和圖36)。這些數據說明在傳遞入細胞中之后所述核酸有效裝載的功能。而且，能夠解決粘附細胞并具有極低的毒性對于主要和干細胞群是十分重要的，這些細胞不能大量獲得并且需要最小的處理和通過步驟。

實施例14：

傳遞穿過不同細胞種類的作用，包括粘附細胞系、主要的成纖維細胞、主要的干細胞和懸浮細胞。

在本實施例中評價了穿過不同細胞種類的傳遞方法。根據不同種類的粘附細胞類型成功地配置傳遞技術，所述粘附細胞類型包括a549和cho細胞系以及主要的成纖維細胞(如圖37所示)和主要的間充質干細胞(msc)(如圖39所示)。而且，所述草案可以成功的解決懸浮細胞，例如u226人多發(fā)性骨髓瘤細胞，如圖41a所示。將細胞懸浮液放入多孔細胞培養(yǎng)平板中并在20-45秒的時間內施加短時溫和真空環(huán)境，大約-0.5到-0.68bar，在噴霧之前去掉上清液(圖41a和圖42)。

另外，本方案可以成功用于解決懸浮細胞，例如，jurkat細胞，t-淋巴細胞，如圖41b所示。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)和mitotracker紅成功地被傳遞入jurkat細胞(分別如圖41b頂部和中間圖所示)。而且，編碼綠色熒光蛋白質(gfp)的mrna被傳遞給jurkat細胞，并且在傳遞后24小時觀察綠色熒光蛋白質(gfp)的表達。

實施例15：

評價蛋白質細胞內傳遞的傳遞技術。

傳遞技術的一種顯著應用就是細胞內傳遞蛋白質。根據其尺寸、性質和化學作用不同，蛋白質是一種很多樣的基團，限行很少的方法可以有效傳遞這種分子。用fitc或者alexa-488標記具有增加尺寸(從18.3kda到443kda)的大量蛋白質，并檢驗其噴霧傳遞。所有的蛋白質成功地被傳遞(圖43和圖44)入cho細胞。觀察到隨著蛋白質尺寸的增加傳遞效率下降(圖44)。為了進一步證實蛋白質被傳遞到細胞中，傳遞卵清蛋白-fitc并隨后用抗卵白蛋白抗體進行螢光免疫檢驗法檢測(圖45)。對于給定的蛋白質，在這種情況下，β-乳球蛋白、其劑量反應是噴霧的蛋白質濃度越高傳遞效率越高(圖46)。

實施例16：

評價傳遞入細胞之后蛋白質的功能。

檢驗傳遞入細胞之后蛋白質的功能。多種實驗可以用于檢測辣根過氧化物酶(hrp)活性，并且噴霧入cho細胞之后，使用兩個實驗來檢測辣根過氧化物酶活性。第一，采用酪胺信號放大(tsatm)試驗，通常使用hrp催化活性產生高密度目標蛋白標記物或者核酸序列原位標記物。alexafluor488-標記的酪胺底物被用于說明噴霧傳遞后hrp在cho細胞中的活性和位置(圖47)。第二，dcfh-da實驗被用于定量hrp活性。2′,7′-雙氯熒光素雙醋酸鹽(dcfh-da)是一種疏水性非熒光分子，能夠快速穿透細胞并通過細胞內酯酶水解產生dcfh分子，dcfh分子可以被氧化成其熒光產物2′,7′雙氯熒光素(dcf)，這是可測量的。hrp被噴霧轉染進入cho細胞并且用dcfh-da培養(yǎng)所述細胞。傳遞的hrp劑量越高觀察到的dcf產量越高(圖48)。此實驗未觀察到毒性(圖49)。

實施例17：

評價了用于進行目標器官追蹤的噴霧標記的主要間充質干細胞(msc)。

一些細胞類型，包括間充質干細胞(msc)被用于體內細胞療法應用。然而，由于缺少細胞在體內流動方面的了解，許多方案都因此而不成功。很難調查向靶器官流通的效力以及與非靶器官的多價螯合作用，通常在動物研究中使用標記的細胞來了解這些過程。目前不能實現(xiàn)快速有效的細胞標記。標準熒光標記，例如fitc及其他熒光團，通常亮度不足以在組織和動物中原位檢測到。最近研發(fā)了一些較亮的標記，例如量子點(q-點)，但是這要求更長的細胞培養(yǎng)時間，通常是整夜，從而實現(xiàn)滿意的標記水平。本主題內容的方法是一種快速傳遞方法，據此，有效裝載可以在幾分鐘內被傳遞到靶細胞中。本發(fā)明方法將q點傳遞到主要間充質干細胞(msc)的能力被檢測，并且檢測了這些是否可以在體外注射的小鼠脾臟中被檢測到。

q點被噴霧轉染進入培養(yǎng)的主要小鼠間充質干細胞(msc)中，如圖50所示。解剖小鼠脾臟，并且向脾臟中注射處于100微升培養(yǎng)基中的2x105噴霧轉染的間充質干細胞(msc)。使用cryovis儀器，通過三維cryo成像技術檢驗脾中的熒光度。如圖51所示，在脾中檢測到q點。

實施例18：

實驗測量a549細胞、cho細胞和間充質干細胞(mscs)中沒細胞傳遞的體積。

實驗計算和測定的三種不同細胞系(a549，cho和mcss)的面積(圖55)。對于a549細胞、cho和mcs細胞，每個細胞系的平均面積分別為932平方微米、372平方微米和2054平方微米。因此，對a549、cho和mcs細胞計算的每孔細胞數(根據48-孔板尺寸)分別為102,500、255,000和46200。在傳遞10微升時，對a549細胞大約每細胞傳遞9.8x10^-5微升、對于cho細胞大約每細胞傳遞3.9x10^-5微升，并且對于間充質干細胞(mscs)大約每細胞傳遞2.2x10-4微升每細胞。這三個實施例中每細胞實驗測量的傳遞體積在理論計算范圍(例如，6.0x10^-7微升每細胞和7.4x10^-4微升每細胞)內，所述理論計算范圍是使用atcc，celeromics技術公司的細胞直徑估計所得，或者根據本領域普通技術人員已知的其他細胞培養(yǎng)參考書獲得的。

在如上說明書和權利要求書中，在一系列元素或者特征后常常使用詞語例如“至少一個”或者“一個或者一個以上”。術語“和/或”還可以用于兩個或者更多元素或者特征之間。除非上下文中另有含蓄的或者明確的相反定義，這些詞語指的是任意列出的元素或者特征或者任何敘述的元素或者特征可以與其他任何另一個元素或者特征相結合。例如，所述詞語“a和b中的至少一個”“a和b中的一個或者一個以上”以及“a和/或b”值得是只有a、只有b或者a和b一起。類似的解釋還可以用于包括三個選項的列表。例如，詞語“a、b和c中的至少一個”、“a、b和c的一個或者一個以上”以及“a、b和/或c”指的是只有a、只有b、只有c、a和b、a和c、b和c，或者a和b和c一起。另外，如上所述術語“基于”在上述說明書和權利要求書中的使用指的是“至少部分基于”因此還可以包括未記敘的特征或者元素。

這里所描述的主題內容可以被包括在根據理想結構的系統(tǒng)、儀器、方法和/或物品中。前述描述中闡明的實施方案不代表所有與這里描述的主題內容一種的實施方案。相反，他們僅僅是與本發(fā)明描述的主題內容有關的方面的一些實施例。盡管上面已經闡述了一些變化，但是可以進行其他修飾或者加成。尤其是，除了這里所闡述的那些，還可以提供進一步的特征和/或變化。例如，如上所述的實施方案可以指向這里所公開的特征和/或結合的不同的組合和變形，以及這里描述的一些特征的進一步變形。另外，在附圖和/或這里所描述的邏輯流程不需要按照顯示的具體順序進行，或者連續(xù)進行，只要能實現(xiàn)理想的結果即可。其他實施方案也可以包括在下面權利要求的范圍內。