相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)要求2014年8月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)no.62/037,889的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用整體納入本文。

本公開內(nèi)容涉及使用雙陰性t細(xì)胞治療癌癥諸如白血病和淋巴瘤，包括急性髓性白血病(aml)。

背景技術(shù)：

急性髓性白血病(aml)是成人急性白血病的主要原因，占所有成人白血病的～80％(menzin等，2002)。盡管為了開發(fā)更有效的靶向該疾病的方法進(jìn)行了廣泛的研究，但aml仍然與低長(zhǎng)期存活相關(guān)；只有～5％的aml老年患者和～30％的aml年輕患者能夠存活5年或更長(zhǎng)時(shí)間(ungewickellandmedeiros,2012；hoand等,2012)。常規(guī)化療可在>70％的受治療的aml患者中有效地實(shí)現(xiàn)疾病的初期緩解(ungewickellandmedeiros,2012)。然而，由于該疾病的高度異質(zhì)性，～30％的aml患者不響應(yīng)化療(ungewickellandmedeiros,2012；bucisano等,2012)。此外，化療不能在大多數(shù)患者中實(shí)現(xiàn)疾病的完全清除，大于70％的緩解期患者在初期治療后的2年內(nèi)復(fù)發(fā)aml(ungewickellandmedeiros,2012；bucisano等,2012)。對(duì)于復(fù)發(fā)aml的患者沒有標(biāo)準(zhǔn)的治療方案，復(fù)發(fā)的aml與預(yù)后不良相關(guān)(ferrara等,2004)。復(fù)發(fā)的aml是由一種叫做微小殘留病(mrd)的現(xiàn)象引起的，這種現(xiàn)象由具有化療抗性的aml細(xì)胞群介導(dǎo)(garces-eisele,2012；linandlevy,2012)。已知mrd很大程度上是由白血病干細(xì)胞(lsc)群引起的，因?yàn)槠淠軌虺惺軔毫拥沫h(huán)境和條件，諸如化療(ishikawa等,2010；kadowaki和kitawaki,2011；vaz等,2013)。因此，開發(fā)靶向aml-lsc和mrd的治療以實(shí)現(xiàn)疾病的無復(fù)發(fā)的清除是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。

同種異體造血干細(xì)胞移植(同種異體hsct)是aml患者的潛在治愈性治療，并且與常規(guī)化療相比具有更高的無疾病存活率(alatrash和molldrem,2009)。供體來源的t細(xì)胞介導(dǎo)的抗白血病效應(yīng)有助于增加患者的存活，因?yàn)閠細(xì)胞耗竭的移植物導(dǎo)致更高的復(fù)發(fā)率(alatrash和molldrem,2009)。然而，臨床上同種異體hsct的使用受到短缺合適供體、治療的毒性和其他相關(guān)并發(fā)癥的限制(alatrash和molldrem,2009；shlomchik,2007)。強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答可以在正常組織上誘導(dǎo)，導(dǎo)致組織損傷，并且可能在嚴(yán)重病例中導(dǎo)致患者死亡(alatrash和molldrem,2009；shlomchik,2007)，因此構(gòu)成限制使用同種異體細(xì)胞治療的主要障礙。

自從利用t細(xì)胞免疫療法治療黑色素瘤患者的早期工作以來，對(duì)其他癌癥的過繼性t細(xì)胞療法已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，這進(jìn)一步支持了細(xì)胞療法的潛在應(yīng)用以實(shí)現(xiàn)無復(fù)發(fā)的aml清除(rosenberg等,1988)。已鑒定了在白血病細(xì)胞中上調(diào)的抗原，白血病相關(guān)抗原(laa)，并且已在體外和動(dòng)物模型中證實(shí)了laa-特異性t細(xì)胞的抗白血病作用(vaz等,2013；teague和kline,2013)。然而，laa-特異性t細(xì)胞的使用受礙于分離和擴(kuò)增這些細(xì)胞的困難(kochenderfer等,2010；johnson等,2009；parkhurst等,2011；robbins等,2011)。此外，盡管許多l(xiāng)aa在aml中過表達(dá)，但這些抗原在其他組織諸如胸腺中的表達(dá)由于t細(xì)胞特異性的胸腺選擇而阻止了具有對(duì)laa高度親和的受體的成熟t細(xì)胞的發(fā)育(teague和kline,2013)。或者，也已經(jīng)嘗試了使用表達(dá)針對(duì)laa的轉(zhuǎn)基因tcr或嵌合ag受體的轉(zhuǎn)基因cd8+t細(xì)胞，所述laa分別諸如wilms’腫瘤抗原或lewisy(peinert等,2010；xue等,2010)。這些t細(xì)胞具有顯著增加的結(jié)合laa的能力并且顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性(kochenderfer等,2010；johnson等,2009；parkhurst等,2011；robbins等,2011)。然而，與基因治療相關(guān)的潛在副作用，連同復(fù)雜和漫長(zhǎng)的程序，限制了使用這些策略來治療aml。此外，注射超生理數(shù)量的基因工程t細(xì)胞可導(dǎo)致嚴(yán)重的不良事件，包括死亡。因此，開發(fā)對(duì)廣泛的癌癥具有有效作用而不需要鑒定laas的新的細(xì)胞免疫療法將革新白血病免疫療法。

雙陰性t細(xì)胞(dnt細(xì)胞或dnt)是成熟的外周t淋巴細(xì)胞，它們表達(dá)cd3-tcr復(fù)合體但不表達(dá)cd4、cd8或nkt細(xì)胞標(biāo)志物αgalcer-加載的cd1d和jα24-vα14；它們代表了人體中1～3％的外周血單核細(xì)胞(pbmc)(zhang等,2000)。已經(jīng)描述了在化療誘導(dǎo)的完全緩解期間從aml患者中擴(kuò)增dnt的方法，并且已經(jīng)證明aml患者dnt在體外對(duì)獲自同一患者的原代aml細(xì)胞具有顯著的抗白血病活性(young等,2003；merims等,2011)。

先前已經(jīng)證明dnt以劑量依賴性方式通過穿孔素-顆粒酶依賴途徑誘導(dǎo)殺死同種異體aml細(xì)胞系(merims等,2011)。在動(dòng)物模型中，也已證明，與常規(guī)的cd4+或cd8+t細(xì)胞不同，灌注同種異體的小鼠dnt可賦予免疫抑制功能(zhang等,2000；young等,2003；he等，2007)。然而，還未在體內(nèi)研究過dnt對(duì)于患者原代白血病細(xì)胞的活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的一個(gè)方面，已經(jīng)確定雙陰性(dn)t細(xì)胞(dnt)對(duì)于治療癌癥諸如淋巴瘤或白血病是有效的。特別是，使用dnt的免疫療法已被證明對(duì)于急性髓性白血病(aml)的治療是有效的，包括殺死對(duì)化療治療有抗性的白血病細(xì)胞。任選地，dnt可以是自體的，諸如來自患有癌癥或懷疑患有癌癥的受試者的dnt，或同種異體的，諸如來自沒有癌癥的健康供體的dnt。值得注意的是，觀察到dnt在體外以及在異種移植模型中體內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，而在正常細(xì)胞和組織中沒有可檢測(cè)出的毒性。

如實(shí)施例2中所示，已證明注射的dnt在體內(nèi)增殖和存留，并遷移到不同的組織包括血液、脾臟和肺，還在肺、肝臟和骨髓觀察到dnt群體，表明dnt可靶向這些器官中的腫瘤。本發(fā)明人還證明了來自健康供體的同種異體dnt選擇性靶向aml細(xì)胞并顯示癌癥殺傷活性。dnt還顯示出在aml異種移植模型中抑制植入，表明dnt在體內(nèi)可減少白血病細(xì)胞的水平。此外，如實(shí)施例6所示，注射的dnt從血液遷移到骨髓并靶向預(yù)先存在的aml癌細(xì)胞，表明dnt在用于治療患有aml的受試者的臨床環(huán)境中可以是有效的。

許多癌細(xì)胞系也被證明表現(xiàn)出體外對(duì)dnt細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的高度敏感性，包括daudi(b細(xì)胞淋巴瘤(伯基特淋巴瘤))、jurkat(急性t細(xì)胞淋巴瘤)、k562(慢性髓性白血病)、u937(慢性髓性白血病)以及原代和建立的肺癌細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未顯示)。

化療是用于aml患者的標(biāo)準(zhǔn)治療，可有效減少白血病負(fù)荷并實(shí)現(xiàn)疾病的初期緩解。然而，化療通常不能實(shí)現(xiàn)完全清除，導(dǎo)致aml患者的高復(fù)發(fā)率。因此，消除對(duì)化療不響應(yīng)的aml細(xì)胞并降低復(fù)發(fā)率的能力預(yù)期將顯著增加aml患者的存活。如實(shí)施例7所示，本發(fā)明人已經(jīng)證明dnt在殺死化療抗性癌細(xì)胞特別是化療抗性aml中是有效的。因此，dnt可用于在不響應(yīng)化療的受試者中進(jìn)行免疫治療或用于預(yù)防或治療復(fù)發(fā)或再發(fā)的癌癥諸如aml和/或化療抗性的微小殘留病(mrd)的病例。

在本發(fā)明的另一方面，已顯示dnt與細(xì)胞周期抑制劑組合有效殺死癌細(xì)胞。如實(shí)施例9所示，使用dnt和細(xì)胞周期抑制劑arac的組合治療相對(duì)于單獨(dú)用arac的治療降低了aml植入的水平。

如實(shí)施例10中所示，同種異體的dnt具有針對(duì)原代aml患者胚細(xì)胞(blast)的強(qiáng)效抗白血病作用，包括體外化療抗性癌細(xì)胞和在異種移植模型中，對(duì)正常細(xì)胞和組織沒有可檢測(cè)出的毒性。未觀察到同種異體dnt攻擊正常外周血單核細(xì)胞(pbmc)或造血祖細(xì)胞/干細(xì)胞，也未在小鼠中引起異種移植物抗宿主病。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括給予所述受試者有效量的如本文所述的dnt。還提供了如本文所述的dnt用于在有需要的受試者中治療癌癥的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是白血病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是急性髓性白血病(aml)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是慢性髓性白血病(cml)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是非霍奇金淋巴瘤(nhl)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是b細(xì)胞淋巴瘤，諸如伯基特淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是急性t細(xì)胞淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是肺癌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥對(duì)化療治療有抗性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是化療抗性aml。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法和用途用于治療患有再發(fā)的或復(fù)發(fā)的癌癥的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是再發(fā)的、復(fù)發(fā)的或難治性白血病或淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是復(fù)發(fā)的癌癥，諸如由微小殘留病(mrd)或白血病干細(xì)胞引起的復(fù)發(fā)的aml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者不處于完全緩解中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)出的癌細(xì)胞，任選地一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)出的白血病或淋巴瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者先前已經(jīng)進(jìn)行了癌癥的化療治療，但是癌細(xì)胞對(duì)所述化療治療不響應(yīng)(即，難治性癌癥)。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者先前已經(jīng)進(jìn)行了癌癥的化療治療，并且具有一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)出的癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者先前沒有進(jìn)行癌癥的化療治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt用于在患有癌癥或懷疑患有癌癥但沒有在進(jìn)行化療的受試者中使用或給藥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖的方法，包括使癌細(xì)胞與一個(gè)或多個(gè)dnt接觸。還提供了如本文所述的dnt用于抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖的用途。任選地，所述癌癥細(xì)胞是在體內(nèi)或體外。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞是白血病細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是aml細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是淋巴瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是對(duì)化療治療有抗性的細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是對(duì)用細(xì)胞周期抑制劑如arac的治療有抗性的aml細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是癌干細(xì)胞，諸如白血病干細(xì)胞。

本文所述的dnt可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得，并且容易與其它類型的t細(xì)胞區(qū)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt不表達(dá)cd4和cd8。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt表達(dá)cd3-tcr復(fù)合物，并且不表達(dá)cd4和cd8。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、γδ-tcr+或αβ-tcr+、cd4-、cd8-、α-gal-、pd-1-、ctla4-。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、γδ-tcr+或αβ-tcr+、cd4-、cd8-、α-gal-、pd-1-、ctla4-、cd44+、cd28-。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、cd4-、cd8-、α-gal-、pd-1-、ctla4-、cd44+。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、cd4-、cd8-、α-gal-、jα24-、vα14-、cd44+、pd-1-、ctla4-、cd45ro+。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt可從包含外周血單核細(xì)胞(pbmc)的樣品獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品是血液樣品。任選地，所述樣品來自健康供體或來自患有癌癥或懷疑患有癌癥的受試者，并且dnt用于治療所述受試者。

任選地，dnt細(xì)胞可在給予或使用它們來治療如本文所述的癌癥以前在體外或離體擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，將dnt配制成通過靜脈內(nèi)注射使用于或給予受試者。

在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt是從受試者諸如患有癌癥或懷疑患有癌癥的受試者獲得的自體dnt。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt來自具有一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)出的癌細(xì)胞、任選地一個(gè)或多個(gè)白血病或淋巴瘤細(xì)胞的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt來自先前已經(jīng)被治療癌癥的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt來自完全緩解的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt來自不完全緩解的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，在化療之前、化療期間或化療之后從受試者獲得dnt。例如，dnt可以在開始化療療程之前、在第一輪化療后、在數(shù)輪化療之間或在一輪或多輪化療之后從受試者獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給予受試者化療劑的同一天、3天內(nèi)、1周內(nèi)、2周內(nèi)、3周內(nèi)或1個(gè)月內(nèi)從受試者獲得dnt。

在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt是同種異體的，諸如從一個(gè)或多個(gè)沒有癌癥的受試者獲得的dnt。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt從一個(gè)或多個(gè)健康供體獲得。

在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt用于或給予受試者以治療癌癥，諸如用于治療白血病或淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt用于或給予沒有在經(jīng)歷化療的受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，dnt在化療之前、化療期間或化療之后用于或給予受試者。例如，dnt可以在開始化療療程之前、在第一輪化療后、在數(shù)輪化療之間或在一輪或多輪化療之后用于或給予受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt在化療的同一天、3天內(nèi)、1周內(nèi)、2周內(nèi)、3周內(nèi)或1個(gè)月內(nèi)給予受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療包括使用或給予一種或多種化療劑，諸如本文所述的細(xì)胞周期抑制劑。

任選地，可以給予或使用兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)劑量的dnt以在有需要的受試者中治療癌癥。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法和用途包括第一劑量的dnt和至少一個(gè)另外劑量的dnt。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)另外的劑量用于在dnt的最后劑量的至少3天后、在dnt的最后劑量的至少5天后、或任選地在dnt的最后劑量的3天至兩周之間之后使用或給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)劑量用于在化療之前、化療期間或化療之后給予或使用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt是已經(jīng)被修飾以表達(dá)一種或多種外源蛋白質(zhì)的重組細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的dnt表達(dá)對(duì)癌生物標(biāo)志物(諸如在癌細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì))具有高親合力的受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt表達(dá)優(yōu)先結(jié)合癌細(xì)胞(諸如白血病細(xì)胞)的嵌合抗原受體(car)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的dnt表達(dá)結(jié)合cd33、cd19、cd20、cd123和/或ley的一種或多種受體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于正常細(xì)胞，dnt優(yōu)先殺死和/或抑制癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于正常細(xì)胞，dnt優(yōu)先殺死和/或抑制白血病細(xì)胞的增殖。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于其他造血細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞(pbmc)，dnt優(yōu)先殺死和/或抑制aml胚細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于正常造血干細(xì)胞，dnt優(yōu)先殺死和/或抑制白血病干細(xì)胞的增殖。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)使用或給予受試者用于治療癌癥時(shí)，dnt不引起同種異體免疫應(yīng)答。

本發(fā)明人已經(jīng)確定，使用dnt和化療劑諸如細(xì)胞周期抑制劑的聯(lián)合治療在殺死癌細(xì)胞、特別是aml方面出乎意料地有效。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療受試者中的癌癥的方法，包括給予所述受試者有效量的dnt和化療劑。還提供了有效量的dnt和化療劑用于治療癌癥的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是細(xì)胞周期抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞周期抑制劑是dna合成抑制劑。任選地，將dnt和化療劑在不同時(shí)間或相同時(shí)間給予所述受試者。

在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是細(xì)胞周期抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞周期抑制劑是細(xì)胞周期依賴性化療藥物。示例性細(xì)胞周期抑制劑包括但不限于，多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphlan)、羅斯考維汀(roscovitine)、絲裂霉素c、羥基脲、50氟尿嘧啶、順鉑、ara-c、依托泊苷(etoposide)、吉西他濱(gemcitabine)、硼替佐米(bortezomib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、丙戊酸鈉、hdac抑制劑或達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)。hdac抑制劑的實(shí)例包括但不限于fr01228，曲古抑菌素a(trichostatina)，saha和pdx101。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療受試者的急性髓性白血病(aml)的方法，包括給予所述受試者有效量的dnt和化療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化療劑是細(xì)胞周期抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞周期抑制劑是arac。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者具有再發(fā)的或復(fù)發(fā)的aml，諸如由微小殘留病(mrd)引起的再發(fā)的或復(fù)發(fā)的aml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者患有化療難治的白血病。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含dnt和化療劑的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化療劑是細(xì)胞周期抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞周期抑制劑是arac。任選地，組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，還提供了包含dnt和化療劑的組合物用于治療癌癥的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物用于治療aml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物用于治療對(duì)單獨(dú)使用化療劑的化療有抗性的aml。

根據(jù)以下詳細(xì)說明，本公開內(nèi)容的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。然而應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)說明和具體實(shí)施例雖然指示了本公開內(nèi)容的優(yōu)選實(shí)施方式，但其僅用于解釋，因?yàn)楦鶕?jù)這些詳細(xì)說明，本公開內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。

附圖說明

現(xiàn)在將聯(lián)系附圖說明本公開內(nèi)容的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，其中：

圖1a示出了來自aml患者與健康志愿者的外周血中的dnt的擴(kuò)增，并且dnt可離體和在體外擴(kuò)增。分別測(cè)定了從24名來自緩解期的患者和7名hv的20mlpb的36個(gè)和7個(gè)dnt-擴(kuò)增培養(yǎng)物擴(kuò)增的dnt的數(shù)目。圖1b示出了增殖，圖1c)示出了nsg小鼠模型中離體擴(kuò)增的hvdnt的遷移。2×10⁷個(gè)cfse標(biāo)記的dnt靜脈注射到nsg小鼠，在第0、2、3、和7天，腹膜內(nèi)注射10⁵iuil-2補(bǔ)充液。圖1b示出了在注射后第2、7、10和14天檢測(cè)到的脾臟中人cd45+細(xì)胞的cfse熒光變化的代表性圖。圖1c示出了從血液、脾、骨髓、肝、和肺收獲的人細(xì)胞的頻率和數(shù)目(n＝3)。數(shù)字示出了平均值和sem，誤差棒代表每組的sem。(***p<0.001)。

圖2a示出了新開發(fā)的基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定的代表性圖，以確定原代aml樣品對(duì)dnt細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的體外敏感性。用原代aml樣品090596和來自健康供體的正常pbmc以不同的效應(yīng)物與靶標(biāo)比進(jìn)行該測(cè)定。膜聯(lián)蛋白v熒光用于確定共培養(yǎng)后的凋亡水平。圖2b顯示了使用同種異體dnt對(duì)健康和白血病細(xì)胞進(jìn)行的基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定的結(jié)果。用從三個(gè)健康供體(hd)擴(kuò)增的針對(duì)不同的靶標(biāo)的同種異體dnt進(jìn)行基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定來確定特異性殺傷百分比，所述靶標(biāo)為：aml(實(shí)心)、aml3和兩種原代aml患者胚細(xì)胞，以及獲得自三個(gè)健康供體(空心)的pbmc和造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(hspc)。每個(gè)圖表示進(jìn)行的三次殺傷測(cè)定的平均值，誤差棒表示sem。

圖3a顯示體外篩選患者aml胚細(xì)胞對(duì)dnt細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感性的結(jié)果，并且在一個(gè)實(shí)施方案中證明，hddnt在體外誘導(dǎo)針對(duì)大部分原代aml胚細(xì)胞的強(qiáng)力溶細(xì)胞活性。通過同種異體dnt以4:1效應(yīng)物與靶標(biāo)比介導(dǎo)的21個(gè)原代aml樣品的特異性殺傷百分比。圖3b顯示在注射之前用dnt處理aml顯著降低aml體內(nèi)植入的水平。原代aml胚細(xì)胞#0578在有或沒有dnt的情況下培養(yǎng)18小時(shí)，股骨內(nèi)注射到亞致死照射(225cgy)的nsg小鼠(分別為n＝5和n＝3)。胚細(xì)胞移植的31天后，處死小鼠并收獲注入的骨髓細(xì)胞，所述細(xì)胞用人抗cd45和抗cd33染色，并通過facs分析。aml植入的水平通過人cd45+和cd33+細(xì)胞的頻率來確定。示出了每組的平均％植入，誤差棒代表sem。*表示相比單獨(dú)胚細(xì)胞對(duì)照的顯著差異(*p<0.05)

圖4顯示同種異體的dnt介導(dǎo)抗白血病活性，并且同種異體的dnt可在體內(nèi)靶向原代aml胚細(xì)胞。亞致死照射的nsg小鼠通過股骨內(nèi)注射5.0x10⁶#5786(圖4a)或#090392(圖4b)患者胚細(xì)胞而植入原代aml。#5786或#090392注射的分別10或14天后，小鼠靜脈內(nèi)注射2×10⁷hvdnt或pbs。dnt注射的14-21天后，處死小鼠，用抗人cd38、cd33、cd34、和cd45熒光標(biāo)記的抗體染色來自注射了胚細(xì)胞的骨的細(xì)胞。通過人cd38、cd33、cd33和/或cd45陽性細(xì)胞的百分比來確定注射了胚細(xì)胞的骨中aml細(xì)胞的頻率。

圖5顯示多劑量治療增強(qiáng)了dnt細(xì)胞療法的功效。植入了2.4×10⁶個(gè)胚細(xì)胞(#090240)的nsg小鼠在如上所述注射胚細(xì)胞的10天后用dnt處理、或保持不處理。胚細(xì)胞注射的37天后，處死小鼠，收獲脾臟。在dnt細(xì)胞處理的(▲)或未處理的(■)小鼠的脾臟中發(fā)現(xiàn)的aml胚細(xì)胞以及原代患者aml胚細(xì)胞090240(●)用作基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定中的靶標(biāo)，該測(cè)定用從兩個(gè)健康供體擴(kuò)增的dnt進(jìn)行，如實(shí)施例3所述，確定各靶標(biāo)的特異性殺傷％。為了確定dnt處理后殘余的aml胚細(xì)胞是否對(duì)dnt細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性有抗性，將殘余的胚細(xì)胞從dnt細(xì)胞-和pbs-處理的小鼠的脾中分離。用基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定來確定收獲的殘余aml細(xì)胞和最初用于植入的原代aml胚細(xì)胞對(duì)體外dnt細(xì)胞介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用的敏感性(圖5a)?；谠撚^察，測(cè)試了多劑量dnt細(xì)胞處理的效力。圖5b和5c)顯示，dnt能夠以劑量依賴性方式介導(dǎo)體內(nèi)的抗白血病活性。如上所述給nsg小鼠植入2.4×10⁶個(gè)胚細(xì)胞#090240，在胚細(xì)胞注射后第20天(1×dnt)或者第10和第20天(2×dnt)用2×10⁷的dnt處理，或者保持不處理。在胚細(xì)胞注射后第34天，處死小鼠，如上所述確定在注射胚細(xì)胞的骨髓(圖5b)和脾(圖5c)中植入的aml細(xì)胞的頻率。顯示了平均aml植入％，誤差棒代表sem(*p<0.05,**p<0.01)。

圖6顯示dnt可靶向化療敏感性以及化療抗性的aml。針對(duì)來自化療抗性、難治性(空心)或復(fù)發(fā)的(實(shí)心)患者(圖6a)或化療敏感性患者(圖6b)的原代aml樣品進(jìn)行基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定。以4:1的效應(yīng)物:靶標(biāo)比將細(xì)胞共孵育2小時(shí)。圖6c)示出了從化療抗性(n＝10)和化療敏感性(n＝8)樣品計(jì)算的4:1效應(yīng)物:靶標(biāo)比時(shí)的特異性殺傷百分比的比較。數(shù)字代表平均％特異性殺傷值，帶有sem。n.s.–無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖7顯示體內(nèi)由dnt介導(dǎo)的對(duì)lsc的潛在靶向。植入了高攻擊性胚細(xì)胞090240的nsg小鼠在胚細(xì)胞注射的10天后用2×10⁷dnt或pbs處理。胚細(xì)胞注射后第39天，處死小鼠，分別確定未注射的組織、未注射的骨(圖7a)和脾(圖7b和7c)中aml細(xì)胞的頻率或頻率和數(shù)目。每條線代表平均值，誤差棒代表sem。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)

圖8顯示dnt-和化學(xué)-組合療法的抗白血病活性。植入了胚細(xì)胞090240的nsg小鼠用pbs(無處理●)、或arac(arac，■)、或arac然后加dnt(arac+dnt，◆)處理。胚細(xì)胞注射后第37天，處死小鼠，確定注射的骨(圖8a)、未注射的骨(圖8b)和脾(圖8c)中aml細(xì)胞的頻率。每條線代表平均值，誤差棒代表sem。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

圖9a示出了化療藥物arac在aml細(xì)胞對(duì)dnt細(xì)胞毒性的敏感性上的效果。kg1a用1ug/mlarac或pbs處理14小時(shí)。然后，kg1a與從健康供體離體擴(kuò)增的dnt以4:1效應(yīng)物與靶標(biāo)比共培養(yǎng)4小時(shí)。如上文所述確定對(duì)于各靶標(biāo)所誘導(dǎo)的特異性殺傷水平。圖9b顯示，ara-c不干擾dnt的細(xì)胞毒性功能。離體擴(kuò)增的dnt用ara-c或pbs預(yù)處理14小時(shí)，并用于針對(duì)aml細(xì)胞系oci-aml3以4:1效應(yīng)物與靶標(biāo)比進(jìn)行的體外殺傷測(cè)定4小時(shí)。如上文所述確定各dnt誘導(dǎo)的特異性殺傷水平。

圖10顯示pbmc和擴(kuò)增后dnt的表型鑒定。pbmc(上圖)和擴(kuò)增的14天后收獲的dnt(下圖)用抗人cd3、cd4、cd8、和αgalcer-cd1d的抗體染色。實(shí)心直方圖代表熒光扣除(fluorescenceminusone，fmo)對(duì)照。圖上的數(shù)字代表各象限或門中的群體的頻率。(***p<0.001)

圖11a和11b顯示，來自健康供體(hd)的dnt在體內(nèi)不攻擊造血干細(xì)胞并影響其分化。cd133⁺cd34⁺人hspc靜脈注射到亞致死照射的nsg小鼠(5×10⁶細(xì)胞/小鼠，n＝13)。hspc注射的八周后，7只小鼠靜脈注射10⁷個(gè)離體擴(kuò)增的同種異體dnt。dnt注射的八周后，從pb收獲細(xì)胞，并用抗小鼠cd45，抗人cd45、cd3、cd19、cd11b、cd56、cd33和cd34抗體染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分析來確定人白細(xì)胞(圖11a)及其子集(圖11b)的百分比。水平棒代表平均值，誤差棒代表各組的sem。

圖12顯示dnt細(xì)胞可以援救注射致死劑量的aml細(xì)胞系的nsg小鼠。亞致死照射的nsg小鼠靜脈注射10⁶mv4-11，并且從第7天開始，接受2×10⁷dnt(n＝9)或pbs(n＝10)的三次注射，每次注射之間相隔4天。箭頭代表dnt或pbs注射的時(shí)間。**p<0.01；***p<0.001。

具體實(shí)施方式

一個(gè)方面，本發(fā)明人已經(jīng)確定dnt可用于治療癌癥，特別是用于治療白血病或淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，還已經(jīng)確定dnt可用于抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖或殺死癌細(xì)胞，包括對(duì)化療有抗性的癌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所述的dnt可用于治療aml，或治療再發(fā)的或復(fù)發(fā)的aml，諸如由微小殘留病引起的aml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的dnt可用于治療淋巴瘤。

如本文所用，術(shù)語“癌癥”是指由可以擴(kuò)散到身體的鄰近組織或其他部分的細(xì)胞的不受控制的異常生長(zhǎng)引起的一組疾病之一。癌細(xì)胞可以形成實(shí)體瘤，其中癌細(xì)胞聚集在一起，或作為分散的細(xì)胞存在，如在白血病中。

術(shù)語“癌細(xì)胞”是指以不受控制的異常生長(zhǎng)和侵入另一組織的能力為特征的細(xì)胞或衍生自這種細(xì)胞的細(xì)胞。癌細(xì)胞包括，例如從患有癌癥的患者獲得的原代癌細(xì)胞或衍生自這樣的細(xì)胞的細(xì)胞系。一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是血液癌細(xì)胞，諸如白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞可以是來自患有aml的受試者的白血病細(xì)胞或是淋巴瘤細(xì)胞諸如來自患有非霍奇金淋巴瘤(nhl)的受試者的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞可以是患有aml的受試者中的白血病癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的dnt可用于在體外、離體或體內(nèi)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的dnt可用于在體外、離體或體內(nèi)殺死癌細(xì)胞。

如本文所用，“化療抗性癌癥”是指不響應(yīng)化療治療或在用化療治療后復(fù)發(fā)的癌癥。例如，化療抗性細(xì)胞可以是從不響應(yīng)化療的受試者獲得的原代癌細(xì)胞，或者是從最初對(duì)化療響應(yīng)并緩解但經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)的受試者獲得的癌細(xì)胞。在一些受試者中，在復(fù)發(fā)后，癌細(xì)胞不再響應(yīng)化療，所述受試者具有化療抗性癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療抗性細(xì)胞是直接從受試者獲得的原代白血病細(xì)胞。

本文所用的術(shù)語“白血病”是指涉及在造血組織、其他器官中并且通常在血液中發(fā)現(xiàn)的數(shù)目增加的異常白細(xì)胞進(jìn)行性增殖的任何疾病?！鞍籽〖?xì)胞”是指以這種細(xì)胞的增加的異常增殖為特征的白細(xì)胞。

如本文所用，“急性髓性白血病”(“aml”)是指髓系血細(xì)胞的癌癥，其特征是異常白細(xì)胞的快速生長(zhǎng)，其累積在骨髓中并干擾正常血細(xì)胞的產(chǎn)生。

如本文所用，“慢性髓性白血病”(“cml”)是指以骨髓中主要是髓系細(xì)胞的增加的和不受調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)以及這些細(xì)胞在血液中的累積為特征的癌癥。

如本文所用，“淋巴瘤”是指特征在于從淋巴細(xì)胞發(fā)育的血細(xì)胞腫瘤的疾病。任選地，淋巴瘤可以是霍奇金淋巴瘤(hl)或非霍奇金淋巴瘤(nhl)。nhl的實(shí)例包括伯基特淋巴瘤和t細(xì)胞淋巴瘤?！傲馨土黾?xì)胞”是指以這種細(xì)胞的增加的異常增殖為特征的淋巴細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“受試者”包括動(dòng)物界的所有成員，包括哺乳動(dòng)物，并且適當(dāng)?shù)刂溉?。任選地，術(shù)語“受試者”包括已經(jīng)診斷患有癌癥或處于緩解的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“受試者”是指患有或懷疑患有血液癌癥的人。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“受試者”是指患有aml或懷疑患有aml、任選地再發(fā)的或復(fù)發(fā)的aml的人。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法和用途提供癌癥的治療。本文使用的術(shù)語“治療”是本領(lǐng)域公知的，是指用于獲得有益或期望的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方式。有益或期望的臨床結(jié)果可以包括但不限于，減輕或改善一種或多種癥狀或狀況，減少疾病程度，穩(wěn)定的(即不惡化的)疾病狀態(tài)(例如維持患者緩解)，預(yù)防疾病或防止疾病的傳播，延遲或減緩疾病進(jìn)展，改善或減輕疾病狀態(tài)，減少疾病的復(fù)發(fā)，和緩解(無論部分或全部)，無論是可檢測(cè)出的還是不可檢測(cè)出的?！爸委煛边€可以指與如果不接受治療的預(yù)期存活相比延長(zhǎng)存活。如本文所用的“治療”還包括預(yù)防性治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療方法包括給予受試者治療有效量的如本文所述的dnt，并任選地由單次給藥組成，或者包括一系列給藥。在一些實(shí)施方案中，本文所述的治療方法和用途包括使用dnt和細(xì)胞周期抑制劑的聯(lián)合治療。

如本文所用，“減少癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖”是指作為細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞分裂的結(jié)果由癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)目的減少，包括細(xì)胞死亡。本文所用的術(shù)語“細(xì)胞死亡”包括殺死細(xì)胞的所有形式，包括壞死和細(xì)胞凋亡。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法和用途涉及給予或使用有效量的dnt和任選地細(xì)胞周期抑制劑。如本文所用，短語“有效量”或“治療有效量”是指在實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果所需的劑量和時(shí)間段內(nèi)有效的量。例如在本文的上下文中或?qū)τ谥委煱┌Y諸如aml，有效量是例如與不給予化合物而獲得的響應(yīng)相比，誘導(dǎo)緩解、降低腫瘤負(fù)荷、和/或防止腫瘤擴(kuò)散或白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的量。有效量可根據(jù)諸如動(dòng)物的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重等因素而變化。對(duì)應(yīng)于這樣量的給定化合物的量將根據(jù)各種因素而變化，所述因素諸如所給藥物或化合物、藥物制劑、給藥途徑、疾病或病癥的類型、所治療的受試者或主體的特性等，但是仍然可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地確定。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法和組合物包括給予或使用雙陰性(dn)t細(xì)胞。dnt顯示出將它們與其它類型的t細(xì)胞區(qū)分開的許多特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt不表達(dá)cd4或cd8。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt表達(dá)cd3-tcr復(fù)合物并且不表達(dá)cd4和cd8。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、αβ-tcr+、cd4-、cd8-、cd44-、cd28-。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、αβ-tcr+、cd4-、cd8-、α-gal-、pd-1-、ctla4-、cd44+、cd28-。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、cd4-、cd8-、α-gal-、pd-1-、ctla4-、cd44+。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt具有表型cd3+、cd4-、cd8-、α-gal-、jα24-、vα14-、cd44+、pd-1-、ctla4-、cd45r0+。dnt可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲得，諸如但不限于熒光激活細(xì)胞分選(facs)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可從外周血單核細(xì)胞分離dnt。任選地，dnt可以是自體細(xì)胞或同種異體細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt是從患有癌癥或懷疑患有癌癥的受試者獲得的自體細(xì)胞。任選地，在化療之前、期間或之后從受試者獲得dnt。在一個(gè)實(shí)施方案中，在化療療程之前、期間或之后從受試者獲得dnt。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一輪化療后、或在一輪或多輪化療后獲得dnt。

在一些實(shí)施方案中，dnt可以在使用于或給予受試者之前在體外或離體擴(kuò)增。用于分離和擴(kuò)增dnt的示例性方法描述于美國(guó)專利號(hào)6,953,576“調(diào)節(jié)腫瘤免疫的方法(methodofmodulatingtumorimmunity)”和pct公開號(hào)wo2007/056854“擴(kuò)增雙陰性t細(xì)胞的方法(methodofexpandingdoublenegativetcells)”中，這二者均通過引用整體納入本文。

在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt可以從之后將給予其dnt(即自體細(xì)胞)以治療癌癥、減少癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖或殺死癌細(xì)胞的受試者獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt可以是同種異體的。如本文所用，術(shù)語“同種異體”是指最初從與所述細(xì)胞的預(yù)期接受者是不同的個(gè)體但是與接受者是相同物種的受試者獲得的細(xì)胞。任選地，同種異體細(xì)胞可以是來自細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，dnt從健康供體獲得。如本文所用，術(shù)語“健康志愿者”(“hv”)或“健康供體”(“hd”)是指一個(gè)或多個(gè)沒有癌癥的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，健康供體是沒有可檢測(cè)出的癌細(xì)胞的受試者，例如沒有可檢測(cè)出的白血病細(xì)胞的受試者。

在一個(gè)實(shí)施方案中，dnt可以用本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的制劑來配制以使用于受試者或者來制備以給予受試者。用于選擇和制備合適制劑的常規(guī)方法和成分描述于例如《雷明頓藥物科學(xué)(remington'spharmaceuticalsciences)》(2003–第20版)和1999年出版的《美國(guó)藥典：國(guó)家處方集(theunitedstatespharmacopeia:thenationalformulary)》(usp24nf19)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指與動(dòng)物特別是人的治療相容。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的dnt在與化療劑組合時(shí)出乎意料地有效減少癌細(xì)胞的增殖和/或治療癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是細(xì)胞周期抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞周期抑制劑是dna合成抑制劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療受試者的癌癥的方法，包括給予受試者dnt和化療劑。還提供了dnt和化療劑用于在有需要的受試者中治療癌癥的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是阿糖胞苷(arac)。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是白血病，例如急性髓性白血病(aml)。在一些實(shí)施方案中，dnt與化療劑諸如細(xì)胞周期抑制劑的組合可用于治療化療抗性的癌癥，例如再發(fā)的或復(fù)發(fā)的aml。

如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞周期抑制劑”是指抑制或防止細(xì)胞的分裂和/或復(fù)制的化療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“細(xì)胞周期抑制劑”包括選自以下的化療劑：多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphlan)、羅斯考維汀(roscovitine)、絲裂霉素c、羥基脲、50氟尿嘧啶、順鉑、ara-c、依托泊苷(etoposide)、吉西他濱(gemcitabine)、硼替佐米(bortezomib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、丙戊酸鈉、hdac抑制劑或達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)。hdac抑制劑的實(shí)例包括但不限于fr01228、曲古抑菌素(trichostatin)a、saha和pdx101。

如本文所用，術(shù)語“dna合成抑制劑”是指抑制或防止癌細(xì)胞合成dna的化療劑。dna合成抑制劑的實(shí)例包括但不限于arac(阿糖胞苷)，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，5-氟尿嘧啶，卡培他濱(capecitabine)，氟尿苷，吉西他濱，地西他濱(decitabine)，維達(dá)扎(vidaza)，氟達(dá)拉濱(fludarabine)，奈拉濱(nelarabine)，克拉屈濱(cladribine)，氯法拉濱(clofarabine)，噴司他丁(pentostatin)，thiarabine，曲沙他濱(troxacitabine)，沙帕他濱(sapacitabine)或呋咯地辛(forodesine)。在一個(gè)實(shí)施方案中，dna合成抑制劑是阿糖胞苷或如本文所述的另一種脫氧胞苷類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，dna合成抑制劑是dna延伸終止子，并且以類似于阿糖胞苷的方式起作用，例如氟達(dá)拉濱，奈拉濱，克拉屈濱或氯法拉濱。

如本文所用，“arac”(阿拉伯呋喃糖基胞苷)是指包含胞嘧啶堿基和阿拉伯糖的化合物，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶三磷酸。arac也稱為阿糖胞苷或胞嘧啶阿拉伯糖苷。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將dnt和化療劑同時(shí)給予受試者，任選作為包含dnt和化療劑的組合物，或作為兩個(gè)分開的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，將dnt和化療劑在不同時(shí)間使用于或給予受試者。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在化療劑之前或之后給予dnt。在一個(gè)實(shí)施方案中，在化療劑之前或之后給予dnt，間隔的時(shí)間為至少1分鐘，2分鐘，5分鐘，10分鐘，30分鐘，45分鐘，1小時(shí)，1.5小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)，5小時(shí)，8小時(shí)，10小時(shí)，12小時(shí)，16小時(shí)或24小時(shí)。任選地，在一些實(shí)施方案中，將dnt和化療劑隔開以下時(shí)間給予受試者：超過24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)，3天，4天，5天，6天，1周，10天，12天，兩周，三周，一個(gè)月，6周，2個(gè)月或大于2個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，在化療劑之后的2天和7天之間給予或使用dnt。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含dnt和化療劑的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是dna合成抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，dna合成抑制劑是阿糖胞苷或如本文所述的另一種脫氧胞苷類似物。任選地，本文所述的組合物包括藥學(xué)上可接受的載體，例如《雷明頓藥物科學(xué)(2003–第20版)和1999年出版的《美國(guó)藥典：國(guó)家處方集》(usp24nf19)中描述的那些。還提供了包含dnt和化療劑的組合物用于治療癌癥的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是白血病，任選地是aml。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物用于治療對(duì)單獨(dú)用化療治療有抗性的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有白血病，任選地aml。

以下非限制性實(shí)施例說明了本公開內(nèi)容：

實(shí)施例1：從健康供體的外周血擴(kuò)增dnt

從hd或化療后完全緩解的aml患者獲得20mlpb。dnt如先前所述擴(kuò)增(merims等人，2011)。簡(jiǎn)言之，通過使用rosettesep^tm從外周血單核細(xì)胞(pbmc)中清除cd4+和cd8+細(xì)胞。用板結(jié)合的抗cd3抗體刺激剩余的cd4-cd8-pbmc3天，洗滌，隨后用可溶性cd3從第7天至第10天再刺激。第3、7和10天用含il-2的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在2周擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，計(jì)數(shù)細(xì)胞并用抗cd3、cd4、cd8、inkttcr(tcrvα24-jα18)抗體和nkt受體抗原(α-半乳糖神經(jīng)酰胺)染色。在用等體積的完全緩解aml患者的pb和hd的pb制備的擴(kuò)增培養(yǎng)物中證明了hddnt比患者dnt具有更高的擴(kuò)增潛力，因?yàn)楫?dāng)從hd的pb擴(kuò)增時(shí)(3.97±18.24×10⁸)，獲得比從患者(3.25±0.9169×10⁷)顯著更高數(shù)量的dnt(圖1a)。此外，dml在約50％的aml病例中不能擴(kuò)增，并且當(dāng)使用hd的pb時(shí)獲得更高純度的dnt群體(90.74％±1.7％)，相比于當(dāng)使用aml患者pb時(shí)的65.0％±19.8％(表1)?；颊遜nt的較低擴(kuò)增潛力和純度可能部分歸因于在患者血液中遭遇aml細(xì)胞而耗盡和/或由強(qiáng)力的化療引起的異常生理學(xué)。不能擴(kuò)增或獲得純dnt用于治療可對(duì)臨床環(huán)境中dnt的使用造成嚴(yán)重限制。然而，這些數(shù)據(jù)表明可以使用hddnt避免這些限制，為專注于同種異體hddnt提供了依據(jù)。

表1：患者和hvdnt細(xì)胞在擴(kuò)增結(jié)束時(shí)的頻率。在患者或hv外周血的擴(kuò)增培養(yǎng)設(shè)置結(jié)束時(shí)dnt細(xì)胞的純度的總結(jié)。

實(shí)施例2:在nsg小鼠模型中表征人類dnt

成功的過繼性t細(xì)胞治療依賴于注射的t細(xì)胞在接受者中的存活和存留，從而這些細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)和消除腫瘤細(xì)胞。理想地，輸注的t細(xì)胞能夠在接受者中進(jìn)一步繁殖，從而需要相對(duì)少量的t細(xì)胞用于注射。由于dnt在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)(在初始樣品收集的2周內(nèi))產(chǎn)生，所以這些dnt可能是早期效應(yīng)器，并且可以在注射后增殖和存留。為了測(cè)試該假設(shè)，使用免疫缺陷nsg小鼠模型。第10天離體擴(kuò)增的dnt用5μmcfse標(biāo)記，2×10⁷個(gè)細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到亞致死量輻射的nsg小鼠中。為了維持人類dnt，向接受者小鼠補(bǔ)充腹膜內(nèi)注射hril-2(10,000國(guó)際單位(i.u.))。在第2天、第4天和第7天收集血液、脾臟、骨髓、肝臟和肺以測(cè)定dnt在體內(nèi)的增殖、遷移和存留。如圖1b所示，從第2天至第4天觀察到cfse稀釋，但第4天至第7天沒有觀察到，表明在過繼轉(zhuǎn)移后，dnt在注射后的前幾天增殖。將收獲的細(xì)胞用抗人cd45抗體染色，并使用facs分析以確定不同組織中dnt隨時(shí)間的頻率。在注射后的血液、脾和肺中檢測(cè)到dnt的相對(duì)較高的頻率，而在注射后最多7天在肝和骨髓中觀察到較小但可觀察到的dnt群體(圖1c)。

實(shí)施例3:開發(fā)基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定

鉻釋放測(cè)定法是廣泛用于測(cè)定靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性水平的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法。然而，由于低的鉻同位素負(fù)載效率和原代aml患者胚細(xì)胞的高自發(fā)死亡率，廣泛使用的鉻釋放測(cè)定法對(duì)于確定原代aml胚細(xì)胞對(duì)體外dnt介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性而言不是最佳的。為了確定離體擴(kuò)增的dnt在體外誘導(dǎo)針對(duì)aml的細(xì)胞毒活性的能力，開發(fā)了新的基于流式細(xì)胞術(shù)的殺傷測(cè)定法。在該測(cè)定中，dnt用熒光膜染料pkh-26標(biāo)記，并與原代aml-胚細(xì)胞以不同的效應(yīng)子與靶標(biāo)比共培養(yǎng)2小時(shí)。單獨(dú)培養(yǎng)靶細(xì)胞和效應(yīng)子細(xì)胞作為對(duì)照以確定自發(fā)性細(xì)胞死亡的水平。在共孵育2小時(shí)后，用表面標(biāo)志物cd33和cd45抗體將細(xì)胞染色，以鑒定cd45^低和/或cd33+的aml，以及用膜聯(lián)蛋白v染色，以鑒定細(xì)胞死亡水平(圖2)。百分比特異性殺傷確定為：

％特異性殺傷＝％膜聯(lián)蛋白v⁺aml-dnt共培養(yǎng)－％膜聯(lián)蛋白v⁺單獨(dú)的aml

與常規(guī)鉻釋放測(cè)定相比，基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定更快，與較低的背景噪聲相關(guān)，并且不需要額外制備靶細(xì)胞，例如同位素負(fù)載。這種新的測(cè)定允許直接監(jiān)測(cè)dnt以劑量依賴性方式介導(dǎo)的aml細(xì)胞凋亡的水平，同時(shí)避免了與標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定相關(guān)的限制。此外，其可以用于確定dnt對(duì)aml群體的不同亞群的影響。然而，基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定法不能確定累積細(xì)胞死亡的水平。

實(shí)施例4:從hd擴(kuò)增的dnt在體外以劑量依賴性方式選擇性靶向aml，但不殺傷正常的同種異體pbmc。

為了測(cè)定同種異體dnt相對(duì)于正常pbmc對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性，使用從3個(gè)不同的健康供體擴(kuò)增的同種異體dnt針對(duì)以下細(xì)胞進(jìn)行基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定：從兩個(gè)hd獲得的正常pbmc，從兩個(gè)hd獲得的hspc，兩個(gè)原代aml患者樣品和aml細(xì)胞系，oci-aml3和kg1a。來自所有三個(gè)供體的dnt顯示以劑量依賴性方式對(duì)兩種原代aml胚細(xì)胞和aml細(xì)胞系的強(qiáng)力殺傷活性，但對(duì)同種異體pbmc和hspc未顯示殺傷活性(圖2b)。由于如實(shí)施例2和圖1c所示dnt可以在接受者中存留，所以將健康pbmc和同種異體dnt的共培養(yǎng)延長(zhǎng)至14小時(shí)。再一次，dnt不誘導(dǎo)正常的同種異體pbmc的殺傷(數(shù)據(jù)未顯示)。這一發(fā)現(xiàn)與小鼠中輸注同種異體dnt不會(huì)在接受者中引起病理?yè)p傷并因此是安全的報(bào)道一致。dnt靶向同種異體白血病細(xì)胞但不靶向健康pbmc的能力表明同種異體dnt可安全用于治療白血病患者。

實(shí)施例5:dnt能夠在體外殺死原代aml胚細(xì)胞并在nsg小鼠中抑制白血病植入。

為了測(cè)定從hd擴(kuò)增的dnt殺死白血病細(xì)胞的能力，對(duì)從一組23名患者獲得的原代aml胚細(xì)胞樣品進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。雖然敏感性水平存在差異，但在19/23例中，患者原代胚細(xì)胞在體外以劑量依賴性方式對(duì)dnt介導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感，而4名患者胚細(xì)胞顯示高水平的抗性(圖3a)。這些數(shù)據(jù)表明同種異體dnt可以有效靶向大多數(shù)原代aml胚細(xì)胞。

盡管體外篩選證明dnt介導(dǎo)的顯著水平的細(xì)胞毒性，但這是否會(huì)轉(zhuǎn)化為較低的aml植入或aml數(shù)目的短暫減少仍然不確定。接下來，為了研究dnt對(duì)體內(nèi)aml植入的效果，使用已建立的aml-nsg異種移植模型(barabe等人，2007)測(cè)定用或不用dnt細(xì)胞處理的aml植入水平。簡(jiǎn)言之，將aml胚細(xì)胞#0578與或不與dnt一起培養(yǎng)18小時(shí)，隨后注射至經(jīng)亞致死照射的nsg小鼠的右股骨。移植的31天后，處死小鼠，并測(cè)定注射的骨中aml的植入。與無處理對(duì)照相比，用與dnt預(yù)孵育的aml胚細(xì)胞注射的小鼠中aml植入水平顯著降低，表明dnt介導(dǎo)的效應(yīng)可降低體內(nèi)白血病細(xì)胞的水平(圖3b)。

實(shí)施例6:dnt在體內(nèi)以劑量依賴性方式介導(dǎo)抗原代aml的抗白血病活性。

圖3b中觀察到的aml植入的減少可能是在輸注之前體外殺死aml細(xì)胞的結(jié)果。為了進(jìn)一步確定輸注的dnt是否可以遷移到白血病植入部位并消除骨髓中預(yù)先存在的aml(這更接近地類似于臨床環(huán)境中的條件)，將dnt處理給予植入有aml胚細(xì)胞的nsg小鼠，如先前所述(barabe等，2007)。簡(jiǎn)言之，將小鼠用2.5×10⁶–5.0×10⁶個(gè)原代aml胚細(xì)胞#5786或#090392注射到右股骨中。10到14天后，此時(shí)人白血病細(xì)胞植入了接受者，將aml植入的小鼠靜脈內(nèi)注射pbs或2×10⁷個(gè)dnt。在dnt注射的14-21天后處死小鼠，并收獲來自用aml細(xì)胞注射的骨的細(xì)胞，用熒光標(biāo)記的抗人cd3、cd33、cd45，cd19、cd34和cd38抗體染色以通過facs分析確定aml植入的水平。在dnt-和pbs-處理的組之間比較aml細(xì)胞的植入頻率。與pbs處理組相比，aml胚細(xì)胞#5786和#090392的頻率在dnt處理組的注射骨中顯著降低(圖4a和4b)。這些結(jié)果表明，dnt可以從血液遷移到骨髓(aml源自此處)，并且靶向骨髓中預(yù)先存在的aml。

雖然dnt處理顯著降低了aml植入的頻率，但在dnt處理組中觀察到一些殘留的胚細(xì)胞。兩種可能性可解釋殘留的aml細(xì)胞：1)這些細(xì)胞對(duì)dnt介導(dǎo)的細(xì)胞毒性有抗性，2)單劑量dnt治療可能不足以消除大量預(yù)先存在的aml細(xì)胞。為了確定剩余的aml細(xì)胞是否對(duì)dnt介導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感，從dnt處理的和未處理的組中分離殘留的aml胚細(xì)胞，并將其與在我們的基于流動(dòng)的殺傷測(cè)定中最初用于植入的原代aml胚細(xì)胞一起用作靶標(biāo)。從dnt處理的小鼠獲得的殘留aml胚細(xì)胞對(duì)于dnt在體外介導(dǎo)的殺傷作用與原代aml細(xì)胞和從pbs處理組獲得的aml細(xì)胞同樣敏感(圖5a)，表明aml細(xì)胞的持續(xù)不可能是由于它們對(duì)dnt殺傷的抗性。此外，我們觀察到dnt減少aml植入的能力與接受者中預(yù)先存在的aml細(xì)胞的頻率負(fù)相關(guān)(圖5b)，支持了多于一劑的dnt治療可能進(jìn)一步降低aml植入水平的觀點(diǎn)。為了測(cè)試這種假設(shè)，nsg小鼠用高移植胚細(xì)胞#090240股骨內(nèi)注射。在aml細(xì)胞注射的10天后，如前所述用一劑dnt靜脈內(nèi)輸注接受者小鼠。再過10天后，用第二劑量的來自相同供體的dnt處理一半的dnt處理的小鼠。對(duì)照小鼠注射pbs作為對(duì)照。用兩個(gè)劑量的dnt處理的組顯示在骨髓和脾臟中最低水平的aml植入(圖5b和5c)。在脾臟中，與用單劑量的dnt處理的組相比，第二劑量的dnt顯著降低了胚細(xì)胞的頻率(圖5c)。盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，但是對(duì)于骨髓觀察到相同的趨勢(shì)(圖5b)，這可能是由于骨髓中預(yù)先存在的aml細(xì)胞的頻率非常高?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明dnt能夠在異種移植模型中消除aml細(xì)胞和抑制白血病植入。因此，有可能的是多次注射可以增強(qiáng)dnt治療的功效。此外，在通過常規(guī)化療消除大部分aml細(xì)胞后，dnt可作為輔助療法特別有效用于靶向mrd。初始給予或使用化療如arac可幫助消除大多數(shù)癌細(xì)胞，接著dnt劑量可以更有效地對(duì)抗相對(duì)較少的剩余的化療抗性細(xì)胞。

實(shí)施例7:化療抗性aml對(duì)dnt敏感。

化療是用于aml患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。化療有效減少白血病負(fù)荷并實(shí)現(xiàn)疾病的初期緩解。然而，其通常不能實(shí)現(xiàn)疾病的完全清除，導(dǎo)致aml患者的復(fù)發(fā)率高。

因此，aml患者治療的主要限制之一是不能有效地靶向化療抗性aml，這導(dǎo)致高的aml復(fù)發(fā)率。為了研究dnt是否可以靶向化療抗性aml，將從化療敏感和抗性患者獲得的aml樣品在我們的體外殺傷測(cè)定中用作dnt的靶標(biāo)。值得注意的是，10個(gè)化療抗性aml患者樣品中的7個(gè)(圖6a)和8個(gè)化療敏感aml患者樣品中的7個(gè)(圖6b)顯示對(duì)dnt的顯著敏感性。此外，平均特異性殺傷水平在化療敏感和化療抗性組中相當(dāng)，分別為19.8±3.7％和16.6±4.1(圖6c)。通過對(duì)獲自化療抗性、無響應(yīng)(#5786，圖4a)和復(fù)發(fā)(#090240，圖5b和5c)患者的樣品進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了dnt對(duì)化療抗性aml的殺傷，如實(shí)施例6所述。dnt處理顯著降低了兩種樣品中的aml負(fù)荷。這些結(jié)果表明dnt可以用作潛在的免疫療法以治療化療無響應(yīng)患者，并突出了dnt對(duì)抗化療抗性mrd以實(shí)現(xiàn)無復(fù)發(fā)的緩解的臨床應(yīng)用潛力。

實(shí)施例8:dnt介導(dǎo)的潛在lsc-靶向活性。

以前，證明了dnt對(duì)lsc的潛在細(xì)胞毒活性，因?yàn)閐nt靶向具有cd34(由lsc表達(dá)的標(biāo)志物)表達(dá)的aml(merims等人，2011)。然而，由于不是所有的cd34+細(xì)胞都代表lsc群體，dnt對(duì)lsc的作用仍然不能確定。用高侵襲性aml樣品#090240進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，在非注射組織、脾和非注射骨中有高水平的aml植入。由于它們的癌癥起始和成群特征，aml在非注射組織中的植入被認(rèn)為是由lsc介導(dǎo)的。本文提供的結(jié)果提供了dnt介導(dǎo)lsc的潛在殺傷的證據(jù)，因?yàn)閐nt處理降低了非注射骨(圖7a)和脾(圖7b和7c)中的aml植入水平。不清楚這種減少是由于在植入部位殺死非lscaml還是殺死移植物誘導(dǎo)的lsc而引起的。

實(shí)施例9:dnt-和化學(xué)-聯(lián)合療法的功效

化療對(duì)于大量減少白血病的規(guī)模和實(shí)現(xiàn)疾病的初期緩解是有效的。然而，它在實(shí)現(xiàn)疾病的完全清除方面不是非常有效，因此具有mrd介導(dǎo)的復(fù)發(fā)的aml的限制。相反，dnt治療在特異性靶向aml(包括不能通過化療殺死的癌癥)方面是有效的，如實(shí)施例7所示。然而，aml負(fù)荷的水平似乎是dnt療法的功效的重要決定因素，和用細(xì)胞療法對(duì)抗其他癌癥一樣。為了確定是否可以組合使用dnt療法和化療來克服與單獨(dú)治療相關(guān)的限制，將#090240-aml植入的nsg小鼠腹膜內(nèi)注射標(biāo)準(zhǔn)化療藥物阿拉伯呋喃糖基胞苷(arac)，60mg/kg，5天，從胚細(xì)胞注射的13天后開始。在最后一次ara-c注射的3天后，如前所述向小鼠注射具有il-2補(bǔ)充物的dnt或pbs。dnt注射的14天后，處死小鼠，收獲骨髓和脾。在注射骨(圖8a)、非注射骨(圖8b)和脾(圖8c)中使用聯(lián)合療法的aml的頻率顯著降低。雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，但是在所有三種組織中，聯(lián)合療法也比單獨(dú)的治療中的任一種實(shí)現(xiàn)了更低的平均aml植入頻率。在脾中，接受聯(lián)合療法的組具有比接受單獨(dú)arac療法的組顯著更低的aml植入水平(圖8c)。這些數(shù)據(jù)綜合起來證明了由dnt療法和化療介導(dǎo)的疊加的抗白血病效應(yīng)，以及在臨床中在化療后使用dnt療法以靶向化療后的殘留胚細(xì)胞的潛力。因此，與使用dnt的免疫療法或者化療單獨(dú)相比，使用dnt和化療劑諸如arac的組合療法可能更有效地治療aml。以前，不知道化療后使用dnt是否會(huì)在減少癌細(xì)胞方面產(chǎn)生任何益處。如上所述，arac和dnt似乎靶向不同的aml細(xì)胞，因此與任一單獨(dú)的治療相比，組合療法可以產(chǎn)生顯著的益處。

為了確定arac和dnt組合治療的優(yōu)良的抗白血病活性是由于兩者的協(xié)同效應(yīng)還是僅僅為兩種不同治療的加和效應(yīng)，對(duì)白血病干細(xì)胞樣aml細(xì)胞系kg1a進(jìn)行體外殺傷測(cè)定。用arac或pbs處理14小時(shí)的kg1a與dnt共溫育。arac使得kg1a對(duì)dnt顯著更敏感，因?yàn)閐nt誘導(dǎo)的殺傷％對(duì)未處理的kg1a為15.38±0.51％，對(duì)arac處理的kg1a為45.59±2.34％(圖9a)。然而，在針對(duì)oci-aml3的體外殺傷測(cè)定之前用arac處理dnt細(xì)胞14小時(shí)對(duì)dnt介導(dǎo)的細(xì)胞毒性沒有影響，表明dnt可以與化療藥物同時(shí)使用(圖9b)。

實(shí)施例10:同種異體雙陰性t細(xì)胞對(duì)急性髓性白血病的選擇性細(xì)胞毒活性

如下所述，本發(fā)明人已經(jīng)確定，同種異體的人類dnt在體外以及異種移植模型中對(duì)原代aml患者胚細(xì)胞(包括化療抗性的那些)具有強(qiáng)力的抗白血病效應(yīng)，對(duì)正常細(xì)胞和組織沒有可檢測(cè)出的毒性。這些發(fā)現(xiàn)支持了使用從hd擴(kuò)增的dnt作為aml患者的新的細(xì)胞療法，以克服當(dāng)前治療的局限性并增加患者存活。

離體擴(kuò)增的同種異體dnt在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)原代aml患者胚細(xì)胞的強(qiáng)力細(xì)胞溶解活性。

之前在體外證明了從處于完全緩解中的aml患者的外周血(pb)離體擴(kuò)增的dnt對(duì)自體cd34⁺白血病胚細(xì)胞的細(xì)胞毒性(merims等人，2011)，但是只有30％的患者dnt能夠被擴(kuò)增(36個(gè)培養(yǎng)物中的12個(gè)擴(kuò)增至3×10⁷個(gè)dnt或更高)。

這里，本發(fā)明人令人驚訝地說明，dnt可以從測(cè)試的所有hd擴(kuò)增，其dnt的總數(shù)為從aml患者擴(kuò)增的平均10倍高(圖1a)，純度顯著更高(hddnt為90.74％±1.7％vs.患者dnt為65.0％±19.8％)(圖10)。

dnt的輸注不攻擊正常的同種異體pbmc和cd34⁺hspc

為了進(jìn)一步確定同種異體dnt對(duì)正常hspc植入和分化的潛在作用，將nsg小鼠通過移植cd34⁺cd133⁺hdhspc而人源化并用來自不同hd的dnt處理。如其他人報(bào)道的(mcdermott等，2010，drake等，2011)，在移植的小鼠的脾臟和bm中觀察到一致地高嵌合性(～70-80％)，而外周血中的嵌合性為～15％。重要的是，在dnt處理和未處理小鼠之間沒有觀察到頻率(圖11a)和譜系分化(圖11b)的差異。這些發(fā)現(xiàn)表明，dnt不靶向hspc也不干擾hspc分化為造血譜系。總之，通過證明離體擴(kuò)增的同種異體dnt具有強(qiáng)力的抗白血病活性，但對(duì)正常組織和造血細(xì)胞不具細(xì)胞毒性，這些結(jié)果支持了dnt作為新的癌癥免疫療法的安全性。

同種異體dnt延長(zhǎng)具有致死性aml的nsg小鼠的存活

與大多數(shù)原代aml胚細(xì)胞相反，aml細(xì)胞系mv4-11對(duì)nsg小鼠是致死的。當(dāng)給予mv4-11注射的nsg小鼠三次dnt注射時(shí)，在dnt處理組中觀察到顯著的存活益處(圖12)?？偟膩碚f，這些結(jié)果證明離體擴(kuò)增的同種異體dnt在體外對(duì)化療抗性原代aml胚細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，并且可有效減少異種移植模型中的白血病負(fù)荷。

討論

盡管在過去十年中廣泛使用化療來治療aml患者，但是由于化療抗性而導(dǎo)致的高復(fù)發(fā)率仍然是患者存活的主要挑戰(zhàn)(lin&levy,2012,hourigan&karp,2013)。同種異體-hsct是aml患者的潛在治愈性治療，但其應(yīng)用受相關(guān)毒性和供體可用性的限制(brissot&mohty,2015,vyas等，2015,macdonald等,2013)。如在hsct、t細(xì)胞和nk細(xì)胞治療中所明顯的，在同種異體環(huán)境中的移植物抗白血病效應(yīng)比自體環(huán)境中的那些更強(qiáng)，因?yàn)楣w免疫細(xì)胞識(shí)別同種異體抗原，引起對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)(arpinati&curti,2014,campbell&hasegawa,2013,ruggeri等，2002,6月,2007)。來自健康個(gè)體的同種異體dnt可在體外(圖2b,3a,6a和6b)和體內(nèi)(圖4和6c)有效地靶向大量原代aml胚細(xì)胞。此外，dnt治療后殘留的胚細(xì)胞顯示出對(duì)dnt殺傷的高度敏感性，這種敏感性與未處理組以及最初用于植入的原代胚細(xì)胞對(duì)應(yīng)的敏感性相當(dāng)(圖5a)。這表明，與化療不同，aml胚細(xì)胞在治療之后不發(fā)展對(duì)dnt的抗性。與此一致，多次dnt治療進(jìn)一步降低白血病負(fù)荷(圖5b和5c)。更重要的是，dnt有效地靶向化療抗性的aml細(xì)胞(圖5b、5c和6)。這些數(shù)據(jù)說明dnt通過與化療不同的機(jī)制靶向aml細(xì)胞，并且dnt可單獨(dú)用于化療不響應(yīng)的aml或者與化療組合以靶向引起復(fù)發(fā)的化療抗性aml，從而克服aml患者治療中的當(dāng)前的限制。

與沒有同種異體反應(yīng)(圖2b和12)一致，來自單個(gè)供體的dnt可以殺傷一系列的原代aml細(xì)胞，并且來自單個(gè)患者的aml胚細(xì)胞被來自不同供體的dnt裂解至相似程度(數(shù)據(jù)未顯示)。這些特征指向dnt作為細(xì)胞療法的更廣泛的適用性，并且避免了從每個(gè)患者產(chǎn)生治療性細(xì)胞的需要。此外，隨著最近在治療淋巴瘤中的成功(maude等，2014)，利用car技術(shù)靶向aml的研究變得更加活躍(kenderian等，2015，lichtenegger等，2015，tettamanti等，2014，wang等，2015)。鑒于它們易于擴(kuò)增和具有抗癌免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子的組成型高表達(dá)(merims等人，2011)，dnt可作為car技術(shù)的良好細(xì)胞載體以進(jìn)一步增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性。此外，由于從化療抗性和復(fù)發(fā)患者獲得的原代胚細(xì)胞在體外和體內(nèi)對(duì)dnt介導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感(圖6和7)，dnt可以用作一線療法治療化療難治性患者或作為常規(guī)化療之后的鞏固療法以靶向化療抗性的微小殘留病。

雖然已經(jīng)參照目前被認(rèn)為是優(yōu)選的實(shí)施例描述了本公開內(nèi)容，但是應(yīng)當(dāng)理解，本公開內(nèi)容不限于所公開的實(shí)施例。相反，本公開內(nèi)容旨在覆蓋包括在所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的各種改動(dòng)和等同安排。

所有公開、專利和專利申請(qǐng)通過引用整體納入本文，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的公開、專利或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和單獨(dú)地指出通過引用整體納入。

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