本發(fā)明涉及在水凝膠中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞組合物，更詳細(xì)地，涉及人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠組合物及其制備方法，更具體地，在水凝膠中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞后，進(jìn)行清洗并向注射器填充，從而可以隨即進(jìn)行給藥，在最終移植細(xì)胞準(zhǔn)備過(guò)程中，無(wú)需進(jìn)行酶處理，且無(wú)需進(jìn)行利用離心分離等的清洗步驟，而是以水凝膠狀態(tài)進(jìn)行清洗，因此，無(wú)細(xì)胞損失，而且生理活性物質(zhì)插入在水凝膠孔(pore)內(nèi)，從而具有從給藥到個(gè)體之后開(kāi)始呈現(xiàn)治療效果的優(yōu)點(diǎn)。

背景技術(shù)：

在利用通過(guò)胰蛋白酶或分散酶等蛋白酶處理來(lái)取得得的所分離的細(xì)胞對(duì)蛋白酶進(jìn)行處理的過(guò)程中，以往的第一代干細(xì)胞治療劑非選擇性地對(duì)暴露于細(xì)胞膜的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，因此，幾乎無(wú)法維持細(xì)胞間結(jié)合和基底膜蛋白質(zhì)等。并且，為了使蛋白酶非活性化，添加胎牛血清(fbs)等動(dòng)物來(lái)源物質(zhì)，并為了去除胎牛血清而執(zhí)行數(shù)次清洗-離心分離過(guò)程，通常在進(jìn)行一次清洗-離心分離過(guò)程發(fā)生5～10％左右的細(xì)胞被損失。因此，使用蛋白酶的細(xì)胞收集過(guò)程為非常低效的方法。

并且，若將所分離的單細(xì)胞移植于疾病部位，則通過(guò)擴(kuò)散及吸收等而從目標(biāo)部位流出，因此，細(xì)胞的停留率低。此外，由于間充質(zhì)干細(xì)胞為附著性強(qiáng)的細(xì)胞，當(dāng)被分離為單細(xì)胞時(shí)，存在會(huì)在6～24小時(shí)內(nèi)被死滅且生存率非常低的缺點(diǎn)。

在wo2006/004951號(hào)中公開(kāi)了從生物相容性支架內(nèi)的成體間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)對(duì)規(guī)定形態(tài)和規(guī)模的軟組織重新(denovo)進(jìn)行體內(nèi)(invivo)合成的方法及通過(guò)該方法制備的組合物。在上述文獻(xiàn)中提出了利用生物相容性支架使用水凝膠聚合物的方法，更具體地，使用聚乙二醇二丙烯酸酯的方法。但是，上述組合物用于修復(fù)軟組織的結(jié)合，在將聚乙二醇二丙烯酸酯作為支架來(lái)使用的情況下，僅預(yù)測(cè)到需要使直徑幾乎無(wú)變化，但對(duì)于在培養(yǎng)后填充于注射器并及時(shí)進(jìn)行給藥的制備過(guò)程，沒(méi)有公開(kāi)或暗示。

韓國(guó)授權(quán)專利第1289834號(hào)中公開(kāi)了包含羊水來(lái)源干細(xì)胞的括約肌再生細(xì)胞治療劑，若上述細(xì)胞治療劑注入于水凝膠復(fù)合體，具體地，注入于藻酸鹽/pf-127/透明質(zhì)酸，則其效果會(huì)增大。但是，在上述文獻(xiàn)中，并沒(méi)有公開(kāi)可通過(guò)改善收集干細(xì)胞的過(guò)程本身來(lái)提高取得率。

韓國(guó)授權(quán)專利684940號(hào)中公開(kāi)了將間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的方法，更具體地，公開(kāi)了通過(guò)將間充質(zhì)干細(xì)胞固定于包含作為生物降解性高分子的纖維蛋白/ha的混合支撐體來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)的方法。但是，在上述文獻(xiàn)中，僅公開(kāi)了在將纖維蛋白/ha作為支撐體來(lái)使用的情況下，無(wú)需添加為了以往的細(xì)胞分化而添加的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tgf-beta)，也可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。

在以往的方法的情況下，在最終移植細(xì)胞準(zhǔn)備過(guò)程中，進(jìn)行酶處理，因此會(huì)對(duì)細(xì)胞間結(jié)合和基底膜蛋白質(zhì)造成損傷，在細(xì)胞收集、清洗、小瓶填充步驟以及從小瓶重新填充至注射器的各步驟中，會(huì)發(fā)生細(xì)胞損失，并且存在如下的問(wèn)題，即，進(jìn)行酶處理后，僅收集單細(xì)胞并進(jìn)行注射，因此，在細(xì)胞培養(yǎng)期間所合成的如膠原蛋白的大部分活性物質(zhì)被去除。

對(duì)此，在本發(fā)明中，提供在水凝膠中細(xì)胞后，進(jìn)行清洗并可向注射器填充來(lái)及時(shí)進(jìn)行給藥的形態(tài)的組合物，從而在最終移植細(xì)胞準(zhǔn)備過(guò)程中，無(wú)需進(jìn)行酶處理，且無(wú)需進(jìn)行利用離心分離等的清洗步驟，而是以水凝膠狀態(tài)進(jìn)行清洗，因此，幾乎無(wú)細(xì)胞損失，而且生理活性物質(zhì)插入在水凝膠孔內(nèi)，從而從給藥到個(gè)體之后開(kāi)始呈現(xiàn)治療效果，通過(guò)在如上所述的方面重新推究來(lái)完成了本發(fā)明。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

wo2006/004951號(hào)

韓國(guó)授權(quán)專利第1289834號(hào)

韓國(guó)授權(quán)專利684940號(hào)。

非專利文獻(xiàn)

wux，renj，lij.，cytotheray，2012may；14(5)：555-62

liaoht.etal.，j.trauma.，2011jan；70(1)：228-37

wangk.etal.，tissueengparta.，2012dec；18(23-24)：2507-17

fangh.etal.，jhuazhongunivscitechnologmedsci.，2004；24(3)：272-4

inokkimetal.，tissueengparta.，2013；19(21-22)：2373-81.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明的目的在于，提供如下的細(xì)胞組合物的制備方法及由此獲得的組合物，即，為了將從人的脂肪組織分離的間充質(zhì)干細(xì)胞使用于疾病治愈，而最大限度得到改善的方法：1)在充分培養(yǎng)細(xì)胞后收集的過(guò)程中，防止細(xì)胞的損失，2)防止因蛋白酶處理等而發(fā)生的細(xì)胞損失，3)在目標(biāo)部位使細(xì)胞損失最小化。并且，向注射器填充通過(guò)已改善的方法制備的細(xì)胞組合物，從而便于使用。通過(guò)本發(fā)明制備的所填充的細(xì)胞-水凝膠可適用為能夠利用20～25標(biāo)準(zhǔn)尺寸的針來(lái)進(jìn)行局部給藥的所有疾病的治療劑。

解決問(wèn)題的方案

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供在水凝膠中培養(yǎng)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞后利用注射器收集干細(xì)胞-水凝膠的方法。

在本發(fā)明的疾病治療用組合物中，間充質(zhì)干細(xì)胞可以為對(duì)cd29、cd44、cd73、cd90等呈陽(yáng)性且對(duì)cd34及cd45呈陰性的自身或同種來(lái)源細(xì)胞。

在本發(fā)明的一實(shí)施方式，水凝膠可選自由纖維蛋白膠、透明質(zhì)酸或其衍生物、明膠、膠原蛋白、褐藻酸、纖維素及果膠組成的組中，此時(shí)，形成纖維蛋白膠的纖維蛋白原的濃度可以為0.4mg/ml至1.8mg/ml，更具體地，可以為0.9mg/ml至1.6mg/ml。

在本發(fā)明的一實(shí)施方式，將100000～2000000個(gè)干細(xì)胞與1ml的水凝膠相混合并向12～24孔板中添加1ml～2ml來(lái)制備凝膠后，添加培養(yǎng)基培養(yǎng)3～6天來(lái)制備。培養(yǎng)基可以為(用于治療瘺孔的自身及同種的脂肪來(lái)源基質(zhì)干細(xì)胞組合物，授權(quán)號(hào)：1，328，604)在現(xiàn)有的專利中提出的包含10％的胎牛血清(fbs)及堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)或表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(egf)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dmem)或者包含1～10％的人血清白蛋白和通過(guò)現(xiàn)有專利(包含高濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液的制備方法及由此獲得的組合物)來(lái)制備的1～50％的組合物的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基。

發(fā)明的效果

在包含本發(fā)明的脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠的組合物的制備方法中，在水凝膠中細(xì)胞后，進(jìn)行清洗并隨即向注射器填充來(lái)使用，從而在最終移植細(xì)胞準(zhǔn)備過(guò)程中，無(wú)需進(jìn)行酶處理，且無(wú)需進(jìn)行利用離心分離等的清洗步驟，而是以水凝膠狀態(tài)進(jìn)行清洗，因此，幾乎無(wú)細(xì)胞損失，而且生理活性物質(zhì)插入在水凝膠孔內(nèi)，從而從給藥到個(gè)體之后開(kāi)始呈現(xiàn)治療效果，因此非常有用。

更具體地說(shuō)明，在包含本發(fā)明的脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠的組合物的制備方法中，無(wú)需進(jìn)行利用蛋白酶的隔離(篩選)步驟，防止因以往的細(xì)胞收集過(guò)程而發(fā)生的細(xì)胞損失，從而可有效取得細(xì)胞。并且，可將通過(guò)如上所述的方法取得的干細(xì)胞以高活性狀態(tài)給藥到疾病部位，被給藥的細(xì)胞停留在目標(biāo)部位直到水凝膠被分解而全部被吸收為止，從而可持續(xù)呈現(xiàn)治療效果。而且，在培養(yǎng)步驟中，從間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)以完整地插入水凝膠的方式來(lái)存在，從而相比于以往的治療劑，呈現(xiàn)治療能力明顯有效、可縮短治療期間的有益的效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，在本發(fā)明的脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠中，干細(xì)胞在水凝膠中生存一周以上并維持成纖維細(xì)胞形態(tài)，因此相比于以往的干細(xì)胞治療劑，生存期間明顯增加，并且，在一周期間持續(xù)分泌促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及血管形成的多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，并不僅分泌大量的多種細(xì)胞外基質(zhì)，而且分泌出的細(xì)胞外基質(zhì)停留在水凝膠中，當(dāng)被接種到體內(nèi)時(shí)，提供多種基質(zhì)，從而可容易進(jìn)行傷口治愈。并且，不引發(fā)免疫反應(yīng)，并抑制反而在被激活的免疫細(xì)胞中分泌出的作為炎癥引發(fā)物質(zhì)的腫瘤壞死因子α(tnf-alpha)，來(lái)緩解炎癥，從而具有可有助于傷口治愈的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠照片，圖1的a部分為培養(yǎng)后形成細(xì)胞-水凝膠的狀態(tài)，圖1的b部分為向注射器填充圖1的a部分的細(xì)胞-水凝膠后的照片，圖1的c部分和d部分用照片示出將填充于注射器的細(xì)胞-水凝膠通過(guò)針注射的過(guò)程及注射后維持凝膠的原形態(tài)。

圖2a為利用光學(xué)顯微鏡觀察向注射器填充將纖維蛋白原及凝血酶溶液與分階段進(jìn)行稀釋而制成的纖維蛋白凝膠相混合來(lái)培養(yǎng)的人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞并及時(shí)通過(guò)23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針注射的干細(xì)胞-水凝膠的照片(100倍率)。最后，對(duì)在水凝膠中的纖維蛋白原和凝血酶的稀釋倍數(shù)及濃度進(jìn)行標(biāo)記。

圖2b在與體內(nèi)溫度相同的37℃保管填充于注射器的細(xì)胞-水凝膠24小時(shí)后通過(guò)23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針注射后利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察的照片(100倍率)。最后，對(duì)在水凝膠中的纖維蛋白原和凝血酶的稀釋倍數(shù)及濃度進(jìn)行標(biāo)記。

圖3為示出在對(duì)根據(jù)以往的技術(shù)第二次培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行收集、清洗、小瓶填充以及注射器填充的各步驟中的細(xì)胞回收率和在對(duì)水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行收集、清洗、向小瓶填充以及向注射器填充的步驟中的細(xì)胞回收率的曲線圖。

圖4為將根據(jù)以往的技術(shù)第二次培養(yǎng)并向小瓶填充的細(xì)胞(比較例1)和在水凝膠中培養(yǎng)并向注射器填充的細(xì)胞-水凝膠(實(shí)施例3)的存活率利用吖啶橙/溴化乙錠(ao/etbr)進(jìn)行染色來(lái)示出的照片。

圖5為利用酶聯(lián)免疫吸附分析法對(duì)作為包含在根據(jù)以往的技術(shù)進(jìn)行第二次培養(yǎng)、收集、清洗、填充的細(xì)胞懸浮液(比較例1)和在水凝膠中進(jìn)行培養(yǎng)、清洗、填充于注射器的細(xì)胞-水凝膠(實(shí)施例3)的細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白ⅰ型的量進(jìn)行定量來(lái)示出的曲線圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供包含脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠的組合物的制備方法，在使用本發(fā)明的制備方法的情況下，在水凝膠中細(xì)胞后，進(jìn)行清洗并及時(shí)向注射器填充來(lái)使用，從而在最終移植細(xì)胞準(zhǔn)備過(guò)程中，無(wú)需進(jìn)行酶處理，且無(wú)需進(jìn)行利用離心分離等的清洗步驟，而是以水凝膠狀態(tài)進(jìn)行清洗，因此，幾乎無(wú)細(xì)胞損失，而且生理活性物質(zhì)插入在水凝膠孔內(nèi)，從而從給藥到個(gè)體之后開(kāi)始呈現(xiàn)治療效果，因此非常有用。

以下，更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。

本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠組合物的制備方法，包括步驟(a)，培養(yǎng)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞；步驟(b)，對(duì)所培養(yǎng)的上述脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞和水凝膠進(jìn)行混合來(lái)形成凝膠；以及步驟(c)，培養(yǎng)上述凝膠。

在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，作為水凝膠，可使用選自由纖維蛋白膠、透明質(zhì)酸、明膠、膠原蛋白、褐藻酸、甲殼質(zhì)、纖維素、果膠、甲基丙烯酸2-羥基乙酯衍生物及其共聚物、聚氧化乙烯以及聚乙烯醇組成的水凝膠組中的一種或兩種以上的復(fù)合體，更具體地，作為水凝膠，可使用選自由纖維蛋白膠、透明質(zhì)酸、明膠、膠原蛋白、褐藻酸、纖維素及果膠組成的組中的一種或兩種以上的復(fù)合體，更具體地，可使用纖維蛋白膠。

在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，上述纖維蛋白膠可包含濃度為0.4mg/ml至1.8mg/ml的纖維蛋白原，更具體地，可包含濃度為0.9mg/ml至1.6mg/ml的纖維蛋白原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，在纖維蛋白膠的最終濃度超過(guò)上述范圍的情況下，不利于細(xì)胞增殖或者發(fā)生細(xì)胞和水凝膠分離現(xiàn)象。

在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，纖維蛋白膠可包含濃度為1i.u./ml至300i.u./ml的凝血酶，具體地，可包含濃度為5i.u./ml至30i.u./ml的凝血酶，更具體地，可包含濃度為10i.u./ml至15i.u./ml的凝血酶。在上述范圍內(nèi)，在細(xì)胞的增殖及細(xì)胞-水凝膠附著性方面上不會(huì)發(fā)生問(wèn)題。

在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，在步驟(c)之后，還可包括向安瓶、小瓶或注射器填充間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠組合物的步驟(d)?？墒褂?0～25標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針對(duì)通過(guò)上述本發(fā)明的制備方法來(lái)制備的脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠組合物進(jìn)行局部給藥。

在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，在步驟(d)中制備的在填充于安瓶、小瓶或注射器的間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠中計(jì)數(shù)而得的細(xì)胞數(shù)可以為對(duì)在步驟(c)中取得的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)而得的細(xì)胞數(shù)的70％以上，更具體地，可以為80％以上。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，在使用以往的方法的情況下，在填充于注射器的狀態(tài)下測(cè)定的結(jié)果，約70％以上的細(xì)胞被損失，相反地，在使用本發(fā)明的制備方法的情況下，只有不到20％左右的細(xì)胞被損失，因此，相比于以往的方法，使用本發(fā)明的制備方法則明顯降低細(xì)胞的損失率。

本發(fā)明提供包含通過(guò)上述方法來(lái)制備的間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠組合物作為有效成分的細(xì)胞治療劑。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞治療劑”是指從人分離、培養(yǎng)及通過(guò)特殊操作來(lái)制備的細(xì)胞及組織，作為治療、診斷及預(yù)防的目的來(lái)使用的醫(yī)藥品。尤其，是指為了修復(fù)細(xì)胞或組織的功能而通過(guò)在體外對(duì)自身、同種或異種細(xì)胞進(jìn)行增殖篩選或者利用其他方法來(lái)使細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生變化等一系列行為，作為治療、診斷及預(yù)防的目的來(lái)使用的醫(yī)藥品。根據(jù)細(xì)胞的分化程度，將細(xì)胞治療劑分為體細(xì)胞治療劑、干細(xì)胞治療劑，更具體地，本發(fā)明涉及脂肪來(lái)源干細(xì)胞治療劑。

在本發(fā)明中，“個(gè)體”是指可通過(guò)給藥本發(fā)明的細(xì)胞治療劑來(lái)預(yù)防或治療的疾病已發(fā)病或者可能會(huì)發(fā)病的、包括人在內(nèi)的所有動(dòng)物。

以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。但是下述實(shí)施例僅用于容易地理解本發(fā)明，本發(fā)明的要求保護(hù)范圍并不限定于此。

實(shí)施例1.人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法

通常，可通過(guò)抽脂手術(shù)來(lái)取得脂肪組織，但并不限定于此。

從通過(guò)抽脂來(lái)取得的脂肪組織通過(guò)如下的方法分離脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞。為了去除血液而利用與脂肪組織體積相同的體積的磷酸緩沖鹽溶液(pbs)對(duì)脂肪組織進(jìn)行3～4次清洗。放入與脂肪組織體積相同的體積的膠原酶溶液，在37℃的水浴中進(jìn)行反應(yīng)。將脂肪組織移動(dòng)至離心分離用管中，在20℃、1500rpm下，進(jìn)行離心分離10分鐘。去除作為上層液的脂肪層，小心平穩(wěn)地分離下層的膠原酶溶液。放入基質(zhì)培養(yǎng)進(jìn)行懸浮后，在在20℃、1200rpm下，進(jìn)行離心分離5分鐘。此時(shí)，沉淀下來(lái)的是基質(zhì)-血管組分，并去除了上層液。使基質(zhì)-血管組分懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基并接種于培養(yǎng)容器，在37℃、5％的co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。去除培養(yǎng)液后，利用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗，利用基質(zhì)培養(yǎng)基或者在基質(zhì)培養(yǎng)基中以1ng/ml的濃度包含的堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子的增殖培養(yǎng)基或者在基質(zhì)培養(yǎng)基中以5ng/ml的濃度包含的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖。若脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)容器的80～90％左右，則通過(guò)進(jìn)行胰蛋白酶處理并分離為單細(xì)胞來(lái)取得。

實(shí)施例2.纖維蛋白膠水凝膠的濃度決定

向在上述實(shí)施例1取得的5×10⁵個(gè)/ml的脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞中以1：10、1：20、1：40的比例添加凝血酶溶液(400～600i.u.)。將纖維蛋白原(71.5～126.5mg/ml)分別以1：20、1：40、1：80的比例進(jìn)行稀釋來(lái)準(zhǔn)備。利用雙筒注射器系統(tǒng)向12孔板的各孔(well)中分別添加500～700μl的包含纖維蛋白原和凝血酶的細(xì)胞懸浮液。若凝膠完全凝固，則添加包含10％的胎牛血清、1ng/ml的堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基后，在37℃、5％的co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)5天。利用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基清洗3次后添加包含1ng/ml的堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，在37℃、5％的co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)約12小時(shí)。去除上層液，利用1ml的注射器收集細(xì)胞-水凝膠。將23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針連接在注射器，將細(xì)胞-水凝膠推入皿后，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

圖1的a部分為將在12孔中培養(yǎng)的細(xì)胞-水凝膠移動(dòng)至皿后進(jìn)行觀察的照片，示出形成水凝膠后在培養(yǎng)期間維持原狀態(tài)。

圖1的b部分示出向注射器填充細(xì)胞-水凝膠，細(xì)胞-水凝膠填充于注射器之后也維持凝膠的原狀態(tài)。

圖1的c部分為在填充有細(xì)胞-水凝膠的注射器連接23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針后注射細(xì)胞-水凝膠的過(guò)程，可從圖1的d部分看出，通過(guò)23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針注射的細(xì)胞-水凝膠仍然維持水凝膠的原形態(tài)。

圖2a為向注射器填充以各比例制備的細(xì)胞-水凝膠并通過(guò)23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針向孔板注射后利用光學(xué)顯微鏡觀察的照片。圖2a示出，纖維蛋白膠的稀釋濃度越低，細(xì)胞的增殖越優(yōu)秀，在纖維蛋白膠的最終濃度為0.9～1.6mg/ml或0.4～0.8mg/ml的情況下，細(xì)胞的增殖優(yōu)秀，且細(xì)胞和纖維蛋白膠水凝膠很好地融合在一起。沒(méi)有觀察到基于凝血酶濃度的顯著差異。

圖2b為向注射器填充以各比例制備的細(xì)胞-水凝膠并通過(guò)在37℃放置24小時(shí)的23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針向孔板注射后利用光學(xué)顯微鏡觀察的照片。圖2b示出，在纖維蛋白原的最終濃度為1.8～3.2mg/ml和0.4～0.8mg/ml的情況下，細(xì)胞和水凝膠幾乎分離，但當(dāng)纖維蛋白原的最終濃度為0.9～1.6mg/ml時(shí)，細(xì)胞很好地融合在水溶膠內(nèi)直到經(jīng)過(guò)24小時(shí)。沒(méi)有觀察到基于凝血酶濃度的顯著差異。

實(shí)施例3.細(xì)胞-水凝膠培養(yǎng)液的制備

向在上述實(shí)施例1取得的5×10⁵個(gè)/ml脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞中以1：20的比例添加凝血酶溶液，將纖維蛋白原以1：40的比例進(jìn)行稀釋來(lái)準(zhǔn)備后，按照實(shí)施例2進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行清洗后，向注射器填充。

比較例1.使用以往細(xì)胞治療劑的培養(yǎng)法的制備

作為以往的細(xì)胞治療劑培養(yǎng)法，使用如下的方法。

在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞后，當(dāng)填至80％左后時(shí)，添加胰蛋白酶-乙二胺四乙酸分離為單細(xì)胞后，利用包含胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基使酶非活性化，收集至離心分離用管后，以1500rpm進(jìn)行離心分離。去除上層液后，為了去除胎牛血清而添加達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基來(lái)使細(xì)胞懸浮后，再以1500rpm進(jìn)行離心分離，去除上層液。供清洗3次，在最后步驟中，將細(xì)胞懸浮為適當(dāng)體積的細(xì)胞懸浮劑后，向小瓶填充。將所填充的細(xì)胞移動(dòng)至連接有23標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的針的1ml的注射器。

實(shí)驗(yàn)例1.細(xì)胞回收率測(cè)定試驗(yàn)

在上述實(shí)施例3的各步驟中，添加tryple表達(dá)酶使纖維蛋白膠溶解后，測(cè)定細(xì)胞數(shù)。同樣，在比較例1的各步驟中，測(cè)定細(xì)胞數(shù)。

圖3a為當(dāng)按照以往的制備方法(比較例1)制備細(xì)胞治療劑時(shí)，將在各步驟中的細(xì)胞回收率與最初收集步驟(胰蛋白酶-乙二胺四乙酸非活性化)進(jìn)行比較來(lái)示出的曲線圖，圖3a示出，在各步驟中減少了10～25％，最終，在向注射器填充之后，相對(duì)于最初收集步驟，僅回收了約30％的細(xì)胞。

圖3b為當(dāng)按照本發(fā)明的制備方法(實(shí)施例3)制備細(xì)胞治療劑時(shí)，將在各步驟中的細(xì)胞回收率與最初收集步驟(結(jié)束培養(yǎng)后)進(jìn)行比較來(lái)示出的曲線圖，圖3b示出，在各步驟中細(xì)胞減少了1～5％，最終，至向注射器填充的步驟，回收了約80％以上的細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)例2.在細(xì)胞-水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞的存活率及細(xì)胞形態(tài)

按照上述實(shí)施例3在水凝膠中培養(yǎng)并向1ml的注射器填充后，在常溫下進(jìn)行保管，在0、24、48小時(shí)及7天后，利用吖啶橙/溴化乙錠(acridinorange/etidiumbromide)進(jìn)行染色來(lái)測(cè)定細(xì)胞存活率。作為對(duì)照組，利用在上述實(shí)施例3中按照以往的方法來(lái)制備并向小瓶填充的細(xì)胞。

如圖4所示，通過(guò)以往的方法來(lái)制備并向小瓶填充的細(xì)胞在0小時(shí)維持95％以上的高存活率，但在第24小時(shí)細(xì)胞開(kāi)始被死滅且細(xì)胞膜被破壞而無(wú)法維持細(xì)胞形態(tài)或者凝結(jié)，在第72小時(shí)幾乎所有細(xì)胞被死滅而沒(méi)有被觀察。相反，在細(xì)胞-水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞一直生存至第7天，而且維持成纖維細(xì)胞的原形態(tài)。

實(shí)驗(yàn)例3.包含在細(xì)胞-水凝膠的細(xì)胞外基質(zhì)

對(duì)按照上述實(shí)施例3在水凝膠中培養(yǎng)并填充于1ml的注射器的細(xì)胞-水凝膠進(jìn)行酶處理并使其溶解后，利用酶聯(lián)免疫吸附分析法(elisa)對(duì)膠原蛋白i型的量進(jìn)行分析。作為對(duì)照組，利用按照上述實(shí)施例3的以往的方法進(jìn)行培養(yǎng)后填充于1ml的注射器細(xì)胞懸浮液。

如圖5所示，按照以往的細(xì)胞治療劑制備方法來(lái)培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮液中幾乎不含有膠原蛋白，但在細(xì)胞-水凝膠含有3μg/ml以上的膠原蛋白。

產(chǎn)業(yè)上可利用性

在包含本發(fā)明的脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠的組合物中，在水凝膠中細(xì)胞后，進(jìn)行清洗并及時(shí)向注射器填充來(lái)使用，從而在最終移植細(xì)胞準(zhǔn)備過(guò)程中，無(wú)需進(jìn)行酶處理，且無(wú)需進(jìn)行利用離心分離等的清洗步驟，而是以水凝膠狀態(tài)進(jìn)行清洗，因此，幾乎無(wú)細(xì)胞損失，而且生理活性物質(zhì)插入在水凝膠孔內(nèi)，從而從給藥到個(gè)體之后開(kāi)始呈現(xiàn)治療效果，因此在產(chǎn)業(yè)上非常有用。