本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療肝纖維化或肝硬化的藥物組合物，更具體地，涉及一種具有含金藥劑的、用于預(yù)防或治療肝纖維化或肝硬化的藥物組合物。

背景技術(shù)：

肝臟在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外物質(zhì)的代謝中具有重要的作用，并且是一種連續(xù)產(chǎn)生酶反應(yīng)以及能量代謝的生物器官。目前在韓國，肝炎、肝硬化以及伴隨著循環(huán)性疾病的肝癌在慢性疾病中占有較大的百分比，且它們也是因病致死的主要原因。具體地，與發(fā)達(dá)國家相比，韓國有著相對較高的飲酒人群百分比，且由于重度酗酒與肝損的高風(fēng)險相關(guān)，韓國人對肝臟相關(guān)疾病的嚴(yán)重性非常擔(dān)心。由于病毒感染或飲酒造成對肝組織的持續(xù)性損傷會導(dǎo)致肝纖維化或肝癌。因此，有必要開發(fā)一種預(yù)防或治療肝臟相關(guān)疾病的藥物組合物，其可以減少肝臟組織的損傷并基本上能夠?qū)ζ溥M(jìn)行治療。

具體地，肝纖維化是與慢性肝臟疾病(例如肝炎等)相伴隨的生理性適應(yīng)性反應(yīng)，其是指這樣一種狀態(tài)：損傷的肝臟組織轉(zhuǎn)化為纖維組織，如膠原，而不恢復(fù)為正常的肝臟細(xì)胞。盡管肝纖維化是一種在損傷組織修復(fù)過程中的生理性適應(yīng)性反應(yīng)，但由于肝臟組織被纖維組織替換，不能行使肝臟原有的所有功能(例如體內(nèi)物質(zhì)的代謝、膽汁酸的分泌等)，肝功能的退化在所難免。由于持續(xù)、重復(fù)的肝纖維化會導(dǎo)致肝硬化且可能導(dǎo)致死亡，因此在制藥學(xué)方面，開發(fā)合適的治療性藥物就成了一個重要的課題。然而，肝纖維化代謝本身還沒有被清晰地解讀，因此開發(fā)合適的治療性藥物仍然懸而未決。

最近據(jù)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β)，是一種由肝臟枯否巨噬細(xì)胞和星狀細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，是一種肝纖維化的重要介質(zhì)。此外，據(jù)先前報道，采用tgf-β抗體及其反義rna對tgf-β反應(yīng)進(jìn)行的阻斷、以及細(xì)胞tgf-β受體的修飾顯著抑制了肝纖維化的進(jìn)程。然而，這些研究僅簡單地在實驗水平進(jìn)行，尚未有臨床使用的藥物。

如上所述，開發(fā)一種對肝纖維化或肝硬化有效的治療劑是一個重大課題，已有開展相關(guān)的研究(韓國專利號10-0949417)，但進(jìn)展緩慢。

公開內(nèi)容

技術(shù)問題

因此，本發(fā)明牢記現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明的一個方面就是提供一種預(yù)防或治療肝纖維化或肝硬化的藥物組合物，其包含含金的藥劑作為活性成分。

然而，本發(fā)明所完成的目的不僅限于上述目的，而以上未提及的目的將通過以下說明為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。

技術(shù)方案

本發(fā)明的一個方面是提供一種預(yù)防或治療肝纖維化或肝硬化的藥物組合物，其包含含金的藥劑作為活性成分。

在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，所述含金的藥劑可以選自以下的至少一種：醋硫葡金(auranofin)、硫代蘋果酸金鈉(sodiumaurothiomalate)、葡糖硫金(aurothioglucose)、硫代硫酸金鈉(sodiumaurothiosulfate)以及硫代蘋果酸金二鈉。

在本發(fā)明的另一個示例性實施方案中，所述組合物可以促進(jìn)向m2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

在本發(fā)明的另一個示例性實施方案中，所述組合物可以增加在骨髓細(xì)胞2上表達(dá)的觸發(fā)受體(trem-2)的表達(dá)。

另外，本發(fā)明提供用于預(yù)防或改善肝纖維化或肝硬化的保健功能性食品組合物，其包含含金藥劑作為活性成分。

在本發(fā)明的示例性實施方案中，所述含金的藥劑可以選自以下的至少一種：醋硫葡金、硫代蘋果酸金鈉、葡糖硫金、硫代硫酸金鈉以及硫代蘋果酸金二鈉。

此外，本發(fā)明提供了治療肝纖維化或肝硬化的方法，其包括向一對象施用含金藥劑。

另外，本發(fā)明提供含金藥劑在制備用于預(yù)防或治療肝纖維化或肝硬化的藥物中的用途。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的藥物組合物通過包含含金藥劑作為活性成分，不僅促進(jìn)巨噬細(xì)胞的m2型轉(zhuǎn)化，而且由于trem-2表達(dá)的增加而抑制星狀細(xì)胞的活化，因此，預(yù)期有效地用作用于預(yù)防，治療或改善肝纖維化或肝硬化的藥物組合物，食品組合物等。

另外，含金藥劑如醋硫葡金、硫代蘋果酸金鈉以及葡糖硫金長期以來用于治療不同的疾病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，因此它們的優(yōu)點在于不太可能引起不良作用。此外，預(yù)計含金藥劑能有效治療由纖維化(如腎纖維化)引起的其它疾病。

附圖簡要說明

圖1顯示了說明巨噬細(xì)胞的m1/m2轉(zhuǎn)化特征以及由其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的示意圖。

圖2顯示了多種含金藥劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖3a顯示了從人肝纖維化患者以及四氯化碳(ccl4)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中分離的肝組織中，作為m2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的trem-2表達(dá)增加/減少的確認(rèn)結(jié)果。

圖3b顯示了用trem-2過表達(dá)的巨噬細(xì)胞來源的培養(yǎng)基處理mef細(xì)胞后，α-sma和膠原蛋白la1表達(dá)增加/減少的確認(rèn)結(jié)果。

圖4顯示了在raw264.7細(xì)胞經(jīng)lps/ifn-γ處理后轉(zhuǎn)化為m1型巨噬細(xì)胞的情況下，用醋硫葡金處理后raw264.7細(xì)胞后inos和trem-2表達(dá)增加/減少的確認(rèn)結(jié)果。

圖5顯示了在用醋硫葡金處理raw264.7細(xì)胞后，通過用培養(yǎng)基處理mef細(xì)胞后α-sma表達(dá)的增加/減少的確認(rèn)結(jié)果。

圖6顯示了醋硫葡金處理四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型之后進(jìn)行h&e染色的肝組織纖維化評分的評價結(jié)果；以及一些肝組織粉碎后的α-sma和膠原-1a1的定量結(jié)果。

圖7a顯示了在通過用lps/ifn-γ處理后raw264.7細(xì)胞分化成m1型巨噬細(xì)胞的情況下，分別用硫代蘋果酸金鈉和葡糖硫金處理raw264.7細(xì)胞后，inos表達(dá)的增加/減少的確認(rèn)結(jié)果。

圖7b示出了在通過用il-4處理后raw264.7細(xì)胞分化為m2型巨噬細(xì)胞的情況下，分別用硫代蘋果酸金鈉和葡糖硫金處理raw264.7細(xì)胞后，精氨酸酶-1的表達(dá)增加/減少的確認(rèn)結(jié)果。

最佳實施方式

關(guān)于肝纖維化的過程，是肝細(xì)胞的破壞和星狀細(xì)胞通過膠原形成來修復(fù)被破壞的肝細(xì)胞的作用，已引起許多研究者的注意。然而，本發(fā)明集中于在肝細(xì)胞中具有巨噬細(xì)胞功能的枯否細(xì)胞(kupffercell)和透入血流中的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的作用。

巨噬細(xì)胞可以根據(jù)其分化過程大致分為兩種表型。m1型巨噬細(xì)胞主要通過脂多糖(lps，一種來源于細(xì)菌的內(nèi)毒素)和干擾素-γ(ifn-γ)刺激產(chǎn)生。已知m1型巨噬細(xì)胞通過誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(tnf-α)，白細(xì)胞介素-6(il-6)和誘生型一氧化氮合酶(inos)，參與細(xì)胞吞噬作用并伴有炎癥反應(yīng)的放大，這是巨噬細(xì)胞的特征性功能；而通過白細(xì)胞介素-4(il-4)、tgf-β等分泌產(chǎn)生的m2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)抗細(xì)胞因子如il-10和精氨酸酶，已知它們參與諸如組織修復(fù)等反應(yīng)(參見圖1)。

最近的一個報道顯示，m1/m2的轉(zhuǎn)化影響著纖維化信號傳導(dǎo)。根據(jù)其它報道，m1巨噬細(xì)胞造成的炎癥進(jìn)展的惡化導(dǎo)致了纖維化的惡化，而m2巨噬細(xì)胞通過表達(dá)精氨酸酶-1抑制了th2炎癥反應(yīng)以及腎纖維化。因此，為了預(yù)防和治療肝纖維化和肝硬化，可以使用能夠適當(dāng)?shù)乜刂苖1/m2轉(zhuǎn)化的藥物。

在這種情況下，本發(fā)明人進(jìn)行了許多努力以開發(fā)可適當(dāng)控制m1/m2轉(zhuǎn)化的藥物。結(jié)果，他們首次發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)用于不同用途的含金藥劑可以通過將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為m2型并增加在骨髓細(xì)胞2(trem-2)上表達(dá)的觸發(fā)受體的表達(dá)來抑制肝纖維化，從而完成了本發(fā)明。

在下文中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療肝纖維化或肝硬化的藥物組合物，其包含含金藥劑作為活性成分。

如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”是指通過施用本發(fā)明藥物組合物來抑制或延遲肝纖維化或肝硬化發(fā)生的所有活性。

如本文所用，術(shù)語“治療”是指通過施用本發(fā)明藥物組合物來改善或有利地改變肝纖維化或肝硬化癥狀的所有活性。

如本文所用，術(shù)語“含金藥劑”是指其中包含預(yù)定比例的金和其它元素(組分)的化合物，即金化合物，并且其可以包括金(i)化合物和金(iii)化合物。用于本發(fā)明的含金藥劑的實例可包括醋硫葡金(2,3,4,6-四-o-乙?；?1-硫代-β-d-吡喃葡萄糖基-s-[三乙基膦]金)、硫代蘋果酸金鈉、葡糖硫金、硫代硫酸金鈉、硫代蘋果酸金二鈉等，但不限于此(見圖2)，且優(yōu)選采用醋硫葡金、硫代蘋果酸金鈉或葡糖硫金，且最優(yōu)選為醋硫葡金。

本發(fā)明藥物組合物，其包含了含金藥劑作為活性成分，不僅可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的m2型轉(zhuǎn)化，還因trem2表達(dá)增加而抑制星狀細(xì)胞的激活，從而能夠預(yù)防、治療或改善肝纖維化或肝硬化。

在本發(fā)明的一個示例性實施例中，測試了含金藥劑是否能夠?qū)⒕奘杉?xì)胞轉(zhuǎn)化為m2型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含金藥劑的處理抑制了sma和inos的表達(dá)，并增加了trem-2和精氨酸酶-1的表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞向m2型轉(zhuǎn)化，并同時阻止其向m1型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(見實施例3、4和6)。

在本發(fā)明的另一個示例性實施例中，測試了通過給予含金藥劑對肝纖維化的抑制作用，結(jié)果確認(rèn)，采用含金藥劑的處理顯著降低了α-sma以及膠原蛋白la1的表達(dá)，這些是星狀細(xì)胞的激活指標(biāo)，并且在10mg/kg時顯著地降低了肝纖維化的評分(見實施例5)。

同時，本發(fā)明藥物組合物還可以含有至少一種已知的活性成分，其與含金藥劑一起對治療肝纖維化或肝硬化有效。

本發(fā)明所述組合物還可以含有合適的載體、賦形劑、稀釋劑，其常規(guī)用于藥物組合物的制備。此外，本發(fā)明組合物可以制成口服制劑，例如粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑、糖漿、氣霧劑等，外用制劑、栓劑和無菌注射劑，且可以根據(jù)常規(guī)方法制成適用于口服施用的單元劑型。

本發(fā)明組合物中所含有的載體、賦形劑以及稀釋劑可以包含：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。對于組合物的制劑，常用的稀釋劑或賦形劑如填充劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等。

用于口服施用的固體制劑可包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑等。固體制劑可通過加入至少一種賦形劑例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖、明膠等制備。另外，除了簡單的賦形劑之外，可采用潤滑劑例如硬脂酸鎂，滑石等。用于口服施用的液體制劑的實例可以包括懸浮劑、內(nèi)部使用的制劑，乳劑、糖漿等，并且除了簡單的稀釋劑(例如水和液體石蠟)之外，可以使用各種賦形劑，例如濕潤劑、甜味劑、芳香劑、防腐劑等。用于胃腸外施用的制劑可以包括無菌水溶液、非水溶劑、懸浮劑、乳劑、凍干制劑和栓劑。對于非水溶劑和懸浮劑，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射的酯如油酸乙酯。栓劑基質(zhì)的實例可包括witepsol，聚乙二醇(macrogol)、吐溫61(tween61)、可可脂、月桂油、甘油明膠等。

本發(fā)明組合物以藥學(xué)上有效量施用。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上的有效量”是指足以以適用于醫(yī)學(xué)治療的合理利益/風(fēng)險比治療疾病的量，并且有效劑量的水平可以取決于包括對象的疾病種類、疾病的嚴(yán)重程度、藥物活性、藥物敏感性、施用時間、施用途徑和排泄速率、治療時長、包括同時使用的藥物在內(nèi)的因素以及其它在醫(yī)療領(lǐng)域公知的因素。本發(fā)明組合物可以作為單獨的治療劑、與其它治療劑組合、或者與常規(guī)治療劑序貫或同時施用，并且可以施用一次或多次?？紤]到上述因素，施用一定量以獲得最大效果且沒有副作用的最小量是重要的，并且該量可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。

具體地，本發(fā)明藥物組合物的藥學(xué)上的有效量可以根據(jù)年齡、性別、健康狀況、患者體重、活性成分體內(nèi)的吸收率、失活率以及排泄率、疾病種類以及聯(lián)合施用的藥物而不同，通常的量約為0.01mg/kg/天-100mg/kg/天，優(yōu)選的量為0.1mg/kg/天-30mg/kg/天，且可以每天施用一次或分幾次施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過多種途徑向?qū)ο笫┯??？梢灶A(yù)期所有的施用模式，例如，本發(fā)明藥物組合物可以通過口服、直腸或靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、子宮內(nèi)、硬膜外、或腦血管內(nèi)注射施用。本發(fā)明藥物組合物可以根據(jù)藥物(活性成分)與例如所需治療的疾病、施用途徑、年齡、性別、患者體重、疾病嚴(yán)重程度等多種因素而確定。

在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療肝纖維化或肝硬化的方法，其包括向一對象施用所述藥物組合物。如本文所用，術(shù)語“對象”指的是需要治療疾病的目標(biāo)，更具體地，為哺乳動物，如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、牛等。

此外，在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或改善肝纖維化或肝硬化的保健功能性食品組合物，其包含含金藥劑作為有效成分。

如本文所用，術(shù)語“改善”是指所有與治療中的病癥例如癥狀相關(guān)的參數(shù)至少有減輕的所有作用。特別地，在疾病發(fā)生之前或之后，所述功能性食品組合物可以用于預(yù)防或改善肝纖維化或肝硬化，與同時用于治療的藥物聯(lián)合或分開用于治療。

食品的種類沒有特別限制?？商砑踊钚猿煞值氖称返睦涌砂嬃稀⑷?、香腸、面包、餅干、米餅、巧克力、糖果、小吃、餅干、比薩、拉面、其它面條、口香糖、乳制品包括冰激凌、各種湯、飲料、酒精飲料、維生素復(fù)合物、牛奶制品、經(jīng)加工的乳制品等，并且從常規(guī)的觀點來說，可以包括各種健康功能食品。

在本發(fā)明的保健功能性食品組合物中，活性成分可以直接添加到食品中，可以與其他食品或食品成分一起使用，也可以根據(jù)常規(guī)方法適當(dāng)使用?；钚猿煞值幕旌狭靠梢愿鶕?jù)預(yù)期用途(預(yù)防或改善)適當(dāng)確定。通常，在食品或飲料的制備中，本發(fā)明的組合物可以以15wt％以下、優(yōu)選以10wt％以下的量添加。然而，在為了健康和衛(wèi)生或用于健康控制的長期攝入食物的情況下，組合物的量可以小于上述范圍。

對于本發(fā)明的保健功能性食品組合物，除了含有上述活性成分作為必要成分之外，對其它成分沒有特別限制，可以含有各種調(diào)味劑或天然碳水化合物等作為常規(guī)飲料中的附加成分。天然碳水化合物的實例可以包括常規(guī)的糖類，例如單糖(如葡萄糖、果糖等)，雙糖(如麥芽糖、蔗糖等)和多糖(如葡聚糖、環(huán)糊精等)，以及糖醇(如木糖醇、山梨醇、赤蘚糖醇等)。除了上述以外，可以使用天然調(diào)味劑(甜蛋白、甜葉菊提取物(例如萊鮑迪苷a，甘草甜素等))和合成調(diào)味劑(糖精，阿斯巴甜，等)作為調(diào)味劑。天然碳水化合物的百分比可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定。

另外，本發(fā)明的保健功能性食品組合物可包括各種營養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)(電解質(zhì))、合成和/或天然調(diào)味劑、著色劑和填充劑(干酪、巧克力等)，果膠酸或其鹽、藻酸或其鹽、有機酸、保護(hù)性膠體增稠劑、ph調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、碳酸飲料中使用的碳酸化劑等。這些成分可以單獨使用或組合使用。這些添加劑的百分比也可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)選擇。

本發(fā)明詳述

在下文中，將參考以下實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實施例僅用于說明的目的，并且本發(fā)明不受這些實施例的限制。

實施例

實施例1：實驗制備及方法

1.1實驗制備

a.從人肝纖維化患者制備肝組織

獲得朝鮮大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科的臨床實驗批準(zhǔn)(chosun2013-04-005)后，采用分離自36例病例肝癌組織的肝臟組織，包括正常組織和肝纖維化組織。

b.制備四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型

通過對c57bl/6j小鼠重復(fù)施用0.5ml/kg四氯化碳，每周兩次，持續(xù)三周，制備具有四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠模型。

1-2.實驗方法

a.蛋白質(zhì)印跡

使用凝膠電泳裝置(mightysmallse250，霍弗科學(xué)儀器，美國，舊金山-hoeferscientificinstruments，sanfrancisco，usa)，根據(jù)laemmli方案進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)。將細(xì)胞的溶解部分在樣品稀釋緩沖液[63mmtris(ph6.8)、10％甘油、2％sds、0.0013％溴酚藍(lán)、5％β-巰基乙醇)中稀釋并使用8％和10％凝膠在電極緩沖液(在1l溶液中含有tris(15g)、甘油(72g)和sds(5g))中進(jìn)行電泳。凝膠電泳完成后，將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmtris、192mm甘油、20％v/v甲醇(ph8.3))中以40mamps轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，3小時。將作為一抗的抗trem-2、抗精氨酸酶-1、抗inos、抗α-sma和抗膠原-1a1各自分別在硝酸纖維素膜上反應(yīng)，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔igg和辣根過氧化物酶耦合的山羊抗小鼠igg作為二抗在其上反應(yīng)1小時，使用ecl檢測系統(tǒng)(ecl化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(amersham，蓋瑟斯堡，馬薩諸塞州))顯色硝酸纖維素膜。使用抗β-肌動蛋白抗體和抗核纖層蛋白a/c對樣品中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行鑒定。對于蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，使用光密度測定法誘導(dǎo)顯色強度，并使用圖像掃描與分析系統(tǒng)(imagescan&analysissystem，alpha-innotechco.美國)進(jìn)行光密度測定掃描。在每個泳道中，使用alphaease^tm版本5.5軟件通過減去背景強度計算強度。

在肝組織的情況下，將一定量的肝組織與液氮和細(xì)胞裂解緩沖液一起在研缽中勻漿，轉(zhuǎn)移到新管中，并渦旋。將所得物在14,000rpm和4℃下離心20分鐘，并從其中收集中間層，并通過bradford測定法對蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量。在sds-page對30μg蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳后，通過蛋白質(zhì)印跡分析測量α-sma蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。

b.纖維化評分的評估

病理學(xué)專業(yè)住院醫(yī)師通過雙盲檢驗，采用顯微鏡檢查對各組織樣本的至少10個重量份進(jìn)行纖維評分評估。標(biāo)準(zhǔn)指南如下：階段0：無；階段1：纖維化匯管區(qū)擴大；階段2：門靜脈周圍或門脈間隔，結(jié)構(gòu)完整；階段3：纖維化伴隨結(jié)構(gòu)變形，但無明顯的硬化；階段4：可能或確定性肝硬化。

實施例2：通過trem-2(巨噬細(xì)胞m2標(biāo)記物)對肝纖維化的抑制進(jìn)行確認(rèn)

2-1.在肝纖維化組織中確認(rèn)trem-2表達(dá)的增加/減少

通過蛋白印跡分析，在實施例1-1中從肝纖維化患者和四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠分離的組織中證實了trem-2(即巨噬細(xì)胞m2標(biāo)記物)表達(dá)的增加/減少，結(jié)果如圖3a所示。

如圖3a所示，證實了在從肝纖維化患者和具有四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化的小鼠中分離的組織中，trem-2(即巨噬細(xì)胞m2標(biāo)記物)的表達(dá)顯著上升。

2-2.通過trem-2確認(rèn)肝纖維化的抑制

膠原(肝纖維化的致病物質(zhì))、轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β(纖維化的核心因子)等)的釋放有助于肝星狀細(xì)胞的活化。

在這方面，具有類似于活性星狀細(xì)胞特征的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)用從巨噬細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基處理，其中trem-2過表達(dá)，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析證實α-平滑肌肌動蛋白(α-sma，分化為成纖維細(xì)胞型的星狀細(xì)胞的特異性蛋白質(zhì)，是作為星狀細(xì)胞的活化標(biāo)志物而廣泛使用的標(biāo)記蛋白質(zhì))和膠原-1a1(代表性的纖維狀膠原)表達(dá)的增加/降低行。結(jié)果如圖3b所示。

如圖3b所示，證實用從trem-2過表達(dá)的巨噬細(xì)胞中獲得的培養(yǎng)基的處理抑制了α-sma和膠原-1a1的表達(dá)。上述結(jié)果證實了作為m2標(biāo)志物的trem-2受體可以有效地抑制肝纖維化。

實施例3：確認(rèn)含金藥劑的處理增加了巨噬細(xì)胞m2抗纖維化因子trem-2的表達(dá)

為了確認(rèn)含金藥劑是否可以誘導(dǎo)向m2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，用脂多糖(lps)/干擾素-γ(ifn-γ)處理小鼠巨噬細(xì)胞系raw264.7細(xì)胞，然后在分化成m1型巨噬細(xì)胞的條件下用醋硫葡金處理，通過蛋白印跡分析證實inos和trem-2表達(dá)的增加/減少。結(jié)果如圖4所示。

如圖4所示，證實了醋硫葡金的處理抑制了inos的表達(dá)，同時增加了trem-2的表達(dá)。這些結(jié)果證實，含金藥劑，特別是醋硫葡金可以促進(jìn)向m2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，同時抑制向m1型的轉(zhuǎn)化。

實施例4：通過在用含金藥劑預(yù)處理的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中暴露星狀細(xì)胞來證實對星狀細(xì)胞活化的抑制

用醋硫葡金處理小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系raw264.7細(xì)胞，然后在具有與活性星狀細(xì)胞特征相似的mef細(xì)胞上處理培養(yǎng)基，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析證實測定α-sma表達(dá)的增加/減少，其是星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物。結(jié)果如圖5所示。

如圖5所示，證實了醋硫葡金的處理抑制了α-sma的表達(dá)。從上述結(jié)果，證實了含金藥劑，特別是醋硫葡金通過促進(jìn)向m2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并增加trem-2的表達(dá)可以抑制星狀細(xì)胞的活化。

實施例5：通過施用含金藥劑證實肝纖維化的抑制

在實施例1-1中制備的四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，醋硫葡金按1、3和10mg/kg口服給藥，其是已知對治療關(guān)節(jié)炎有效的劑量，一周五次，共3周。給藥結(jié)束后，對肝組織進(jìn)行h&e染色評價纖維化評分，將一些肝組織粉碎，對α-sma(星狀細(xì)胞的活化指數(shù))和膠原-1a1(膠原蛋白聚集的指數(shù))進(jìn)行定量。結(jié)果示于圖6。

如圖6所示，證實醋硫葡金的處理明顯減少了作為星狀細(xì)胞活化指標(biāo)的α-sma和膠原-1a1的表達(dá)，并且在10mg/kg還顯著降低了實際肝纖維化評分。

實施例6.確認(rèn)含金藥劑的處理抑制了巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為m1型并促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為m2型的作用

另外確認(rèn)了用除醋硫葡金外的含金藥劑的處理抑制了巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為m1型并促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為m2型。

首先，在脂多糖(lps)/干擾素γ(ifn-γ)處理將細(xì)胞分化成m1型巨噬細(xì)胞的條件下，分別用類似于醋硫葡金的硫代蘋果酸金鈉和葡糖硫金處理小鼠巨噬細(xì)胞系raw264.7細(xì)胞，并且通過蛋白質(zhì)印跡分析證實inos的表達(dá)的增加/減少。

結(jié)果如圖7a所示，證實硫代蘋果酸金鈉和葡糖硫金的處理抑制了inos的表達(dá)。

此外，在用il-4處理將細(xì)胞分化為m2型巨噬細(xì)胞的條件下，分別用與醋硫葡金類似的硫代蘋果酸金鈉和葡糖硫金處理小鼠巨噬細(xì)胞系raw264.7細(xì)胞，并通過蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)精氨酸酶-1表達(dá)的增加/減少。

結(jié)果如圖7b所示，證實硫代蘋果酸鈉和葡糖硫金的處理增加了精氨酸酶-1的表達(dá)。

上述結(jié)果證實，含金藥劑可以抑制巨噬細(xì)胞向m1型的轉(zhuǎn)化，同時促進(jìn)巨噬細(xì)胞向m2型的轉(zhuǎn)化。

提供前述說明用于說明目的，并且本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明可以以其它具體形式實施，而不改變本發(fā)明的技術(shù)概念或本質(zhì)特征。在這點上，本文公開的示例性實施例僅用于說明性目的，并且不應(yīng)被解釋對本發(fā)明范圍的限制。

工業(yè)實用性

本發(fā)明組合物不僅可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為m2型，而且由于trem-2的增加，抑制了星狀細(xì)胞的激活。因此，本發(fā)明組合物能夠有效地用作用于預(yù)防、治療或改善肝纖維化或肝硬化的藥物組合物、食品組合物等。