政府支持

本技術(shù)在由nationalinstitutesofhealth授予的資助r37-ag012279和f32-ag034809下由美國政府支持完成。美國政府在本技術(shù)中具有某些權(quán)利。

背景

由小鼠胚胎干細胞（esc）體外形成的卵泡樣結(jié)構(gòu)由單一卵母細胞樣細胞組成，其可以生長至直徑70μm大小，由一層或多層緊密附著的體細胞所環(huán)繞。與在卵巢內(nèi)正常卵泡形成過程中所觀察到的類似，esc來源的卵泡樣結(jié)構(gòu)內(nèi)的體細胞經(jīng)胞間橋與其封閉的生殖細胞連接，其可以用于促進正常卵泡發(fā)育所需的細胞與細胞的相互作用。

概述

在一方面，本技術(shù)提供促進個體中哺乳動物卵母細胞的生長和成熟的方法。所述方法包括：將哺乳動物多能細胞工程改造以包含顆粒細胞特異性報告分子，其中所述顆粒細胞特異性報告分子的表達指示作為顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的細胞，將哺乳動物多能細胞在適合于所述多能細胞分化為顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的條件下體外培養(yǎng)，基于顆粒細胞特異性報告分子的表達分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群，并將顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群與哺乳動物卵巢組織接觸，其中所述哺乳動物卵巢組織包含卵泡和/或不成熟卵母細胞，其中顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞促進卵泡和/或不成熟卵母細胞的生長和成熟。

在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的群和哺乳動物卵巢組織是自體的。

在一些實施方案中，哺乳動物卵巢組織是人的。

在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子包括在卵巢顆粒細胞特異性基因控制下的熒光報告分子。

在一些實施方案中，卵巢顆粒細胞特異性基因選自：叉頭框l2(foxl2)、無翼型mmtv整合位點家族成員4(wnt4)、nr5a1、dax-1、atp-結(jié)合盒亞家族9(abca9)、乙酰輔酶a?；D(zhuǎn)移酶2(線粒體3-氧代酰基-輔酶a硫解酶;acaa2)、肌動蛋白α2（平滑肌、主動脈）(acta2)、具有1型凝血酶基序的解整聯(lián)蛋白樣和金屬肽酶（reprolysin樣）17(adamts17)、adamts-樣2(adamtsl2)、af4/fmr2家族成員1(aff1)、表達序列ai314831(ai314831)、醛酮還原酶家族1成員c14(akr1c14)、醛酮還原酶家族1、notch2以及成員c樣(akr1cl)。

在一些實施方案中，熒光報告分子選自：dsred、綠色熒光蛋白(gfp)、黃色熒光蛋白(yfp)和橙色熒光蛋白(ofp)。

在一些實施方案中，將顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群與哺乳動物卵巢組織接觸先體外后體內(nèi)（exvivo）進行。在一些實施方案中，將顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群與哺乳動物卵巢組織接觸體內(nèi)（invivo）進行。

在一些實施方案中，哺乳動物多能細胞選自：胚胎干細胞（esc）、誘導(dǎo)多能干細胞（ipsc）、骨髓來源的細胞和外周血來源的細胞。

在另一方面，本技術(shù)提供在有需要的個體中提高一種或多種甾體激素水平的方法。所述方法包括：將多個哺乳動物多能細胞工程改造以包含顆粒細胞特異性報告分子，其中所述顆粒細胞特異性報告分子的表達指示作為顆粒細胞或顆粒細胞前體的細胞，將多個哺乳動物多能細胞在適合于所述哺乳動物多能細胞分化為顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的條件下體外培養(yǎng)，基于顆粒細胞特異性報告分子的表達分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群，并將有效量的顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群施用給個體，其中所述顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞分泌一種或多種甾體激素，且其中施用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群之后，所述個體相比于施用所述顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群之前的個體展示出一種或多種甾體激素的水平升高。

在一些實施方案中，所述方法還包括刺激顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞以分泌甾體激素。

在一些實施方案中，甾體激素選自：雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和黃體酮。

在一些實施方案中，通過卵泡刺激激素（fsh）、8-溴腺苷3′,5′-環(huán)單磷酸(8-br-camp)和黃體化激素（lh）刺激顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞以分泌甾體激素。

在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的群對于個體是自體的。

在一些實施方案中，個體是人。

在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子包括在卵巢顆粒細胞特異性基因控制下的熒光報告分子。

在一些實施方案中，卵巢顆粒細胞特異性基因選自：叉頭框l2(foxl2)、無翼型mmtv整合位點家族成員4(wnt4)、nr5a1、dax-1、atp-結(jié)合盒亞家族9(abca9)、乙酰輔酶a?；D(zhuǎn)移酶2(線粒體3-氧代?；?輔酶a硫解酶;acaa2)、肌動蛋白α2（平滑肌、主動脈）(acta2)、具有1型凝血酶基序的解整聯(lián)蛋白樣和金屬肽酶（reprolysin樣）17(adamts17)、adamts-樣2(adamtsl2)、af4/fmr2家族成員1(aff1)、表達序列ai314831(ai314831)、醛酮還原酶家族1成員c14(akr1c14)、醛酮還原酶家族1、notch2以及成員c樣(akr1cl)。

在一些實施方案中，熒光報告分子選自：dsred、綠色熒光蛋白(gfp)、黃色熒光蛋白(yfp)和橙色熒光蛋白(ofp)。

在一些實施方案中，在施用前刺激顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。在一些實施方案中，在施用后刺激顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。

在一些實施方案中，哺乳動物多能細胞選自：胚胎干細胞（esc）、誘導(dǎo)多能干細胞（ipsc）或其他重編程體細胞、骨髓來源的細胞和外周血來源的細胞。

在一些實施方案中，個體具有降低的甾體激素分泌或缺乏甾體激素分泌。在一些實施方案中，降低的甾體激素分泌或缺乏甾體激素分泌是由于選自以下的病況：絕經(jīng)、卵巢切除術(shù)、子宮切除術(shù)、卵巢早衰、原發(fā)性卵巢功能不全、化療誘發(fā)的卵巢衰竭、特納氏綜合征。

附圖簡述

圖1a是顯示具有綠色熒光蛋白（gfp）的生殖細胞譜系表達的未分化的小鼠tgog2esc系的圖像。

圖1b是顯示分化后3天具有g(shù)fp的生殖細胞譜系表達的tgog2esc系的圖像。

圖1c是顯示分化后7天具有g(shù)fp的生殖細胞譜系表達的tgog2esc系的圖像。

圖1d是顯示分化后10天具有g(shù)fp的生殖細胞譜系表達的tgog2esc系的圖像。

圖1e是顯示分化后26天具有g(shù)fp的生殖細胞譜系表達的tgog2esc系的圖像。

圖2a是顯示在分化esc中但不在未分化細胞中（第0天）的foxl2表達的圖像。β-肌動蛋白，樣品上樣的陽性pcr對照基因；-rt，缺少逆轉(zhuǎn)錄酶的rna樣品。

圖2b是顯示人(h)foxl2和小鼠(m)foxl2基因啟動子的保守元件的圖。

圖2c是顯示用foxl2-dsred構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后，dsred在小鼠顆粒細胞中但不在293細胞中表達的圖像。

圖2d為顯示在共表達foxl2-dsred的tgog2escs的分化起始的第一天存在gfp表達且不存在dsred表達的圖像。

圖2e為顯示共表達foxl2-dsred的tgog2escs的分化起始導(dǎo)致gfp表達的逐漸喪失（第1-5天），且在分化起始后5天檢測到最低gfp，但在分化起始后5天觀察到dsred的圖像。

圖2f-2g為顯示分化起始后9天gfp信號重新出現(xiàn)且表達foxl2-dsred的細胞幾乎排他地與表達gfp的細胞簇共定位的圖像。

圖3a為顯示表達dsred的細胞在分化第5天是可檢測的且可以通過facs分離（陰性，缺少foxl2-dsred的tgog2ecs的平行排序）的圖像。

圖3b為顯示在分化的指示日時通過facs分離的表達foxl2-dsred的細胞中的早期顆粒細胞標(biāo)志物的表達（-rt，缺少逆轉(zhuǎn)錄酶的rna樣品；β-肌動蛋白，用于樣品上樣的陽性pcr對照基因）的圖像。

圖4a為顯示在16天時共表達foxl2-dsred的tgog2escs的培養(yǎng)物中形成的卵泡樣結(jié)構(gòu)的圖像。△pe-pou5f1-驅(qū)動的gfp表達在由多個表達foxl2-dsred的細胞所環(huán)繞的單一大細胞中可檢測到。

圖4b為顯示在40天時共表達foxl2-dsred的tgog2escs的培養(yǎng)物中形成的卵泡樣結(jié)構(gòu)的圖像?！鱬e-pou5f1-驅(qū)動的gfp表達在由多個表達foxl2-dsred的細胞所環(huán)繞的單一大細胞中可檢測到。

圖4c為顯示分化16天后用foxl2-dsred轉(zhuǎn)導(dǎo)的在由v6.5esc形成的卵泡樣結(jié)構(gòu)中可檢測到表達dsred的細胞的圖像。

圖5a為顯示分化起始后第10-16天之間從esc培養(yǎng)物中分離的foxl2-dsred陽性細胞表達分化顆粒細胞的標(biāo)志物(–rt,缺少逆轉(zhuǎn)錄酶的rna樣品；β-肌動蛋白，用于樣品上樣的陽性pcr對照基因)的圖像。

圖5b為顯示由培養(yǎng)物中維持的facs-純化的foxl2-dsred陽性細胞(2x103個細胞/孔)的雌二醇生產(chǎn)持續(xù)直至3天(fsh,100ng/ml;8-br-camp,1mm)的圖。數(shù)據(jù)為3次獨立培養(yǎng)物的平均值±sem(*,相對于媒介物對照p<0.05)。

圖5b為顯示由培養(yǎng)物中維持的facs-純化的foxl2-dsred陽性細胞(2x103個細胞/孔)的黃體酮生產(chǎn)持續(xù)直至3天(fsh,100ng/ml;8-br-camp,1mm)的圖。數(shù)據(jù)為3次獨立培養(yǎng)物的平均值±sem(*,相對于媒介物對照p<0.05)。

圖6a為顯示分化后12天從esc培養(yǎng)物分離的表達foxl2-dsred的細胞注射前的野生型新生卵巢的圖像。

圖6b為顯示分化后12天從esc培養(yǎng)物分離的表達foxl2-dsred的細胞注射后的野生型新生卵巢的圖像。

圖6c為顯示移植后8天時卵巢間質(zhì)內(nèi)存在表達dsred的細胞（左）；通過雙免疫熒光，這些細胞經(jīng)常伴隨不成熟卵母細胞，其通過卵母細胞標(biāo)志物dazl表達所鑒定（綠色；右圖）的圖像。

圖6d為顯示表達dsred的細胞僅在移植后14天時生長的卵泡的顆粒細胞層中發(fā)現(xiàn)的圖像。

詳細描述

上文引入的且在下文中更詳盡地討論的多個概念可以以眾多方式中的任何方式來實施，因為所述概念不限于實施的任何具體方式。具體實施和應(yīng)用的實例提供主要用于說明目的。

如本文所用，除非內(nèi)容明確另有說明，單數(shù)形式“一個（a）”、“一個（an）”和“所述（the）”包括復(fù)數(shù)指示物。例如，提及“細胞”包括兩個或多個細胞的組合，等等。

如本文所用，“約”將由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解且將取決于其所用的上下文而在一些程度內(nèi)變化。如果存在該術(shù)語的使用對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不清楚，根據(jù)其所使用的上下文，“約”將意指直至具體術(shù)語的加減10%。

如本文所用，向個體“施用”藥劑、藥物、化合物或細胞包括向個體引入或遞送藥劑、藥物、化合物或細胞以行使其旨在的功能的任何途徑。施用可以通過任何合適的途徑來進行，例如，局部注射（例如，導(dǎo)管施用或直接卵巢內(nèi)注射）、全身注射、靜脈內(nèi)注射、子宮內(nèi)注射、口服、鼻內(nèi)和腸胃外施用。施用包括自施用和由另一位施用。

如本文所用，“分化”指譜系定型(lineagecommitment)的發(fā)育過程?！白V系”指細胞發(fā)育的途徑，其中前體或“祖先”細胞經(jīng)歷漸進的生理變化以成為具有特征性功能的特定細胞類型（例如，神經(jīng)細胞、肌肉細胞或顆粒細胞）。分化在多個階段發(fā)生，其中細胞逐漸變得更為特定直至它們變得完全成熟，這也稱為“終末分化”?！敖K末分化的細胞”是已經(jīng)變?yōu)樘囟ㄗV系且已經(jīng)達到分化的末期的細胞（即已經(jīng)完全成熟的細胞）。卵母細胞是終末分化細胞類型的實例。

如本文所用，術(shù)語“富集的群”指顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的純化的或半純化的群。在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的特定群通過從分化的多能細胞的群中分選顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞來富集，例如，這通過熒光激活細胞分選術(shù)（facs）、磁力輔助的細胞分選（macs）、或本領(lǐng)域中已知的用于從細胞的一般群體中分離特定的細胞群的其他細胞純化策略。例如但不限于，在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群是已經(jīng)通過facs從分化的多能細胞中分離的顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的純化或半純化的群。

如本文所用，術(shù)語“有效量”或“治療有效量”指足以實現(xiàn)期望的作用的量，例如，將在有需要的個體中升高甾體激素水平的顆粒細胞的量。例如但不限于，在一些實施方案中，治療有效量的顆粒細胞是相比于正常個體的甾體激素水平升高個體的甾體激素水平所需的顆粒細胞的量。在激素治療應(yīng)用的上下文中，在一些實施方案中，施用于個體的顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的量將取決于個體的病況或疾病狀態(tài)，例如，更年期個體或已經(jīng)進行子宮切除的個體，并取決于個體的特征，諸如一般健康、年齡、性別、體重和對藥物的耐受。技術(shù)人員將能夠根據(jù)這些和其他因素確定合適的劑量。

如本文所用，“卵泡”指由被體（不具有或具有膜-間質(zhì)的粒層細胞）細胞所環(huán)繞的單一卵母細胞組成的卵巢結(jié)構(gòu)。生殖腺的體細胞包圍各個卵母細胞以形成卵泡。每一完全形成的卵泡包圍在完整的基膜中。盡管這些新形成的卵泡中的一些幾乎立即開始生長，但它們中的大多數(shù)保持靜止?fàn)顟B(tài)直至它們退化或一些信號活化它們進入生長期。

如本文所用，術(shù)語“未成熟的卵母細胞”指停止在前期i的初級卵母細胞。

如本文所用，術(shù)語“成熟的卵泡”指具有環(huán)繞發(fā)育中的卵母細胞的活躍增殖的顆粒細胞的卵泡，所述發(fā)育中的卵母細胞響應(yīng)于外源激素。例如但不限于，成熟或正在成熟的卵泡大小增加，這是由于顆粒細胞的增殖、減數(shù)分裂恢復(fù)后卵母細胞的膨大以及由于充滿流體的腔的發(fā)育。

如本文所用，術(shù)語“成熟卵母細胞”指精子穿入或通過添加鈣離子載體激活單性生殖后停滯在減數(shù)分裂的中期ii的能夠受精的卵母細胞。

如本文所用，術(shù)語“刺激劑”指刺激顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞以分泌甾體激素例如雌二醇或黃體酮的任何化合物、激素、鈦、藥物或其他試劑。例如但不限于，在一些實施方案中，刺激劑包括但不限于卵泡刺激激素（fsh）和8-溴腺苷3′,5′-環(huán)單磷酸(8-br-camp)。

一般背景

已經(jīng)從起始衍生自小鼠esc或誘導(dǎo)的多能干細胞（ipsc）的卵母細胞生成了完全功能化的卵細胞。hayashi等人,science,338:971-975(2012)。來自分化中的小鼠esc或ipsc的原始生殖細胞（pgc）樣細胞（pgclc）的特化體外遵循精確的時間框架。pgclc在3-6天之間形成并分化為esc或ipsc，其非常類似于胎齡12.5（e12.5）小鼠卵巢中存在的內(nèi)源pgc。在一項研究中，將具有分散e12.5卵巢組織的esc分化起始后3、4和6天特化的體外來源的pgclc作為聚集體在成年雌性小鼠的卵巢囊（ovarianbursalsacs）下移植。hayashi等人,science,338:971-975(2012)。pgclc隨后發(fā)育為胚泡階段的卵母細胞。收獲和體外成熟后，卵母細胞經(jīng)歷體外受精。胚胎發(fā)生后，將胚移植入受體雌性且它們發(fā)育為活的后代。其他研究已成功使用從成人卵巢純化的女性生殖細胞或卵原細胞干細胞來產(chǎn)生有受精能力的卵細胞。zou等人,natcellbiol.,11:631-636(2009),zhang等人,jmolcellbiol.,3:132-141(2011),和white等人,natmed.,18:413-421(2012)。

這些研究證實小鼠esc和ipsc可以實際上分化（盡管以低頻率）為能夠受精和胚胎發(fā)生的卵母細胞。這些研究還證實pgclc（其在胎兒性腺中類似于內(nèi)源pgc）需要與發(fā)育匹配的胚胎卵巢體細胞相互作用以實現(xiàn)其全部體內(nèi)效力。為了提供卵發(fā)生、卵泡形成和最終從pgclc形成卵細胞所需的微環(huán)境因素(cues)，需要發(fā)育匹配的卵巢體細胞來源。

由小鼠esc體外形成的卵泡樣結(jié)構(gòu)由單一卵母細胞樣細胞組成，其可以生長至直徑70μm大小，由一層或多層緊密附著的體細胞所環(huán)繞。與在卵巢內(nèi)正常卵泡形成過程中所觀察到的類似，esc來源的卵泡樣結(jié)構(gòu)內(nèi)的體細胞經(jīng)胞間橋與其封閉的生殖細胞連接，其可以用于促進正常卵泡發(fā)育所需的細胞與細胞的相互作用。此外，甾體產(chǎn)生途徑基因的表達增加伴隨雌激素分泌至培養(yǎng)基中，與從esc體外形成卵泡樣結(jié)構(gòu)一起發(fā)生。盡管這些觀察結(jié)果共同地支持這一論斷，即體外來源的卵泡樣結(jié)構(gòu)的體細胞具有與內(nèi)源顆粒細胞在超結(jié)構(gòu)和功能上相似的特征，但從分化中的esc分離并表征這些細胞尚很困難。

總體上，本技術(shù)涉及施用來源于多能細胞的經(jīng)富集的分離的顆粒細胞促進卵腺體的形成和生長和/或促進卵母細胞成熟的方法。另外，本技術(shù)還涉及通過施用來源于多能細胞的經(jīng)富集的分離的顆粒細胞用于增加個體中甾體激素水平的方法。

用于從多能細胞分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的方法

在一些實施方案中，本技術(shù)涉及從多能細胞鑒定和分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。

在一些實施方案中，多能細胞被工程改造以包含至少一種顆粒細胞特異性基因報告分子，其中所述顆粒細胞特異性基因報告分子的表達指示作為顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的細胞。

多能細胞包括但不限于胚胎干細胞（esc）、多能干細胞、誘導(dǎo)的多能干細胞（ipsc）或其他重編程的體細胞、骨髓來源的細胞、外周血來源的細胞。

多能細胞可以是任何哺乳動物多能細胞。多能細胞可以來源于的哺乳動物包括例如家畜，諸如綿羊、豬、牛和馬；寵物動物，諸如犬和貓；實驗室動物，諸如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中，哺乳動物是人。

在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子包括在卵巢顆粒細胞特異性基因的調(diào)節(jié)控制下的熒光報告分子。卵巢顆粒細胞特異性基因包括但不限于：叉頭框l2(foxl2)、無翼型mmtv整合位點家族成員4(wnt4)、nr5a1、dax-1、atp-結(jié)合盒亞家族9(abca9)、乙酰輔酶a酰基轉(zhuǎn)移酶2(線粒體3-氧代?；?輔酶a硫解酶;acaa2)、肌動蛋白α2（平滑肌、主動脈）(acta2)、具有1型凝血酶基序的解整聯(lián)蛋白樣和金屬肽酶（reprolysin樣）17(adamts17)、adamts-樣2(adamtsl2)、af4/fmr2家族成員1(aff1)、表達序列ai314831(ai314831)、醛酮還原酶家族1成員c14(akr1c14)、醛酮還原酶家族1、notch2、和成員c樣(akr1cl)。熒光報告分子包括但不限于：?？N(discosomasp.)紅（dsred）、綠色熒光蛋白（gfp）、黃色熒光蛋白（yfp）和橙色熒光蛋白（ofp）。

在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子是在卵巢顆粒細胞特異性基因的調(diào)節(jié)控制下的非熒光報告分子。非熒光報告分子包括但不限于螢光素酶和β半乳糖苷酶。

顆粒細胞特異性報告分子可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來工程改造。例如但不限于，在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子通過如下工程改造：鑒定顆粒細胞特異性基因啟動子，確定基因啟動子的保守區(qū)，使用pcr從基因組dna分離保守區(qū)并將保守區(qū)克隆入含有熒光標(biāo)志物的載體。

將多能細胞功能化以包含顆粒細胞特異性基因報告分子可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來完成。例如但不限于，在一些實施方案中，將顆粒細胞特異性基因報告分子通過施用電穿孔插入多能細胞中。其他插入顆粒細胞特異性基因報告分子的方法包括但不限于病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、基于多組分脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣、deae-葡聚糖和直接遞送。

包含顆粒細胞特異性基因報告分子的多能細胞可以通過本領(lǐng)域已知的任何選擇方法來選擇。用于細胞選擇的方法的實例包括但不限于熒光激活細胞分選術(shù)（facs）、差速貼壁、選擇前體細胞或祖先細胞用于克隆擴增和選擇抗生素抗性。

將包含顆粒細胞特異性基因報告分子的多能細胞群在適合于哺乳動物多能細胞分化為顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的條件下進行培養(yǎng)。可以通過本領(lǐng)域中常用的任何方法誘導(dǎo)多能細胞。例如但不限于，在有絲分裂無活性的小鼠胚胎成纖維細胞（mef）飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的包含顆粒細胞特異性基因報告分子的未分化的esc如下來誘導(dǎo)分化：通過差速貼壁從mef中分離esc并將esc用15%fbs在不存在lif的情況下在明膠包被的板上以單層進行培養(yǎng)。分化的其他方法包括但不限于通過在懸滴中擬胚體形成的誘導(dǎo)。

在一些實施方案中，顆粒細胞特化的信號傳導(dǎo)途徑的生長因子或激活物被用于指導(dǎo)多能細胞分化為顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。顆粒細胞特化的信號傳導(dǎo)途徑的生長因子或激活物包括但不限于bfgf或notch信號傳導(dǎo)途徑的激活物例如jagged1或jagged2。

誘導(dǎo)多能細胞群的分化后，鑒定并分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。在一些實施方案中，通過在顆粒細胞特異性基因的控制下表達熒光來鑒定顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。在一些實施方案中，通過facs、基于抗體的免疫磁力分選（例如，磁力輔助的細胞分選(macs)）、差速貼壁、克隆選擇和擴增、或抗生素抗性將顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞分離入顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的經(jīng)富集的群中。

在一些實施方案中，使用對于顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞選擇性的或特異性的細胞表面標(biāo)志物來分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。對于顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞選擇性的或特異性的細胞表面標(biāo)志物包括但不限于抗mullarian激素受體和notch受體(notch2)。

卵巢組織中卵泡和不成熟卵母細胞的生長和成熟的方法

在一些實施方案中，使用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群來促進卵巢組織中卵泡、卵泡樣結(jié)構(gòu)和/或未成熟卵母細胞的生長和成熟。

在一些實施方案中，將卵巢組織與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群接觸，其中顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞促進卵巢組織中卵泡、卵泡樣結(jié)構(gòu)和/或未成熟卵母細胞的生長和成熟。在一些實施方案中，與卵巢組織接觸后，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞遷移至卵巢組織中的卵泡、卵泡樣結(jié)構(gòu)和/或未成熟卵母細胞或卵母細胞前體細胞以產(chǎn)生或富集誘導(dǎo)卵泡和未成熟卵母細胞成熟的卵巢體細胞環(huán)境。

在一些實施方案中，將卵巢組織與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群體內(nèi)接觸。在一些實施方案中，體內(nèi)施用包括但不限于局部注射（例如導(dǎo)管施用或直接卵巢內(nèi)注射）、全身注射、靜脈內(nèi)注射、子宮內(nèi)注射和腸胃外施用。

在一些實施方案中，將卵巢組織與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群先體外后體內(nèi)接觸。在一些實施方案中，先體外后體內(nèi)接觸包括但不限于卵巢組織的直接注射、與完整或離解的卵巢組織的聚集、和與卵巢組織共培養(yǎng)。在一些實施方案中，將先體外后體內(nèi)接觸的卵巢組織進行培養(yǎng)并且隨后移植或植入個體的卵巢或周圍組織中。用于移植或植入的方法包括但不限于移植到卵巢上、卵巢切開后注射或移植組織至卵巢內(nèi)、和移植到輸卵管內(nèi)。

在一些實施方案中，將先體外后體內(nèi)接觸的卵巢組織進行培養(yǎng)隨后在卵泡和/或卵母細胞生長和成熟后冷凍并儲存。

卵巢組織可以是任何哺乳動物卵巢組織。卵巢組織可以來源于的哺乳動物包括例如家畜，諸如綿羊、豬、牛和馬；寵物動物，諸如犬和貓；實驗室動物，諸如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中，哺乳動物是人。

在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群和卵巢組織是自體的。在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群和卵巢組織是異源同種異體的。

在一些實施方案中，通過顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞在卵巢組織中促進卵泡、卵泡樣結(jié)構(gòu)和/或未成熟卵母細胞或卵母細胞前體細胞的生長和成熟通過以下來測量：卵泡直徑的增加、顆粒細胞數(shù)目的增加、甾體激素產(chǎn)生的增加、卵母細胞直徑的增加或其組合。

成熟卵泡或卵母細胞的直徑在物種之間有所不同且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員所鑒定，因為特定物種的成熟卵泡大小是本領(lǐng)域眾所周知的。例如但不限于，在一些實施方案中，指示成熟或成熟中的卵泡的人卵泡的卵泡直徑為大于約30μm的直徑。可選地，或另外地，指示成熟或成熟中的卵泡的人卵泡的卵泡直徑為這樣的直徑：約30μm-10,000μm、約50μm-5000μm、約100μm-2000μm、約200μm-1000μm、約300μm-900μm、約400μm-800μm或約500μm-700μm。

例如但不限于，在一些實施方案中，指示成熟或成熟中的卵母細胞的人卵母細胞的卵母細胞直徑為大于約10μm的直徑。可選地，或另外地，指示成熟或成熟中的卵母細胞的人卵泡的卵泡直徑為這樣的直徑：約10μm-200μm、或約20μm-175μm、或約30μm-150μm、或約40μm-125μm、或約50μm-100μm、或約60μm-75μm。

在一些實施方案中，卵巢組織中顆粒細胞數(shù)目的增加通過將與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸之前卵巢組織中顆粒細胞的數(shù)目和與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸后卵巢組織中顆粒細胞的數(shù)目進行比較來測量。可選地或另外地，卵巢組織中顆粒細胞數(shù)目的增加通過將與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸之后卵巢組織中顆粒細胞的數(shù)目和未與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸的年齡匹配的卵巢組織進行比較來測量。

在一些實施方案中，將與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸的卵巢組織中顆粒細胞數(shù)目的增加測量為約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或者這些值的任意兩個與例如與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸前的卵巢組織或未與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸的年齡匹配的卵巢組織比較時的百分比增加。

通過將顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞與卵巢組織接觸產(chǎn)生的甾體激素包括但不限于雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和黃體酮。在一些實施方案中，將與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸的卵巢組織中產(chǎn)生的甾體激素的增加測量為約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或者這些值的任意兩個與例如與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸前的卵巢組織或未與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸的年齡匹配的卵巢組織比較時的百分比增加。

用于增加個體中甾體激素的方法

在一些實施方案中，向個體施用有效量的顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群以增加甾體激素。

在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞分泌甾體激素?？蛇x地或另外地，在一些實施方案中，通過刺激劑對顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞進行刺激以分泌甾體激素。

由顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞分泌的甾體激素包括但不限于雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和黃體酮。

刺激劑包括但不限于：卵泡刺激激素（fsh）、8-溴腺苷3′,5′-環(huán)單磷酸(8-br-camp)和黃體化激素（lh）。

在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞在施用于個體前進行刺激，即顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞先體外后體內(nèi)刺激以分泌甾體激素。在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞在施用于個體后進行刺激，即顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞體內(nèi)刺激以分泌甾體激素。

在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群對于個體是自體的。在一些實施方案中，顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群對于個體是異源的。

在一些實施方案中，個體具有降低的甾體激素分泌或缺乏甾體激素分泌。在一些實施方案中，降低的甾體激素分泌或缺乏甾體激素分泌是由于絕經(jīng)、卵巢切除術(shù)、子宮切除術(shù)、卵巢早衰、原發(fā)性卵巢功能不全、化療誘發(fā)的卵巢衰竭、特納氏綜合征。

在一些實施方案中，有需要的個體中甾體激素的增加是基于施用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞前個體中的甾體激素水平與施用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞后個體中的甾體激素水平之間的比較。

在一些實施方案匯總，個體中甾體激素的增加是基于施用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞后個體中的甾體激素水平相比于與被治療的個體性別和年齡匹配且未施用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的個體中的甾體激素水平。

在一些實施方案中，將施用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的個體中產(chǎn)生的甾體激素的增加測量為約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或者這些值的任意兩個與例如與顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞接觸前的個體或未施用顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的性別和年齡匹配的個體比較時的百分比增加。

有效量的顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞可以在臨床前試驗和臨床試驗過程中通過醫(yī)師和臨床醫(yī)師熟知的方法來測定?？捎糜诒痉椒ㄖ械念w粒細胞或顆粒細胞前體細胞的有效量可以通過眾多熟知的用于施用細胞的方法中的任何方法施用于有需要的個體。劑量和/或劑量方案將取決于被治療的病況的特征，例如個體處于絕經(jīng)或個體具有子宮切除、個體以及個體的歷史。

本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于施用細胞作為治療的任何方法都可以采用。在一些實施方案中，將顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞施用于個體，例如局部注射（例如導(dǎo)管施用或直接卵巢內(nèi)注射）、全身注射、靜脈內(nèi)注射、子宮內(nèi)注射和腸胃外施用。例如但不限于，在一些實施方案中，將顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞直接注射入卵巢組織或卵巢中。

在一些實施方案中，個體是人。哺乳動物個體包括但不限于家畜，諸如綿羊、豬、牛和馬；寵物動物，諸如犬和貓；實驗室動物，諸如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中，哺乳動物是人。

試劑盒

在一些實施方案中，本技術(shù)涉及用于產(chǎn)生顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括至少一種顆粒細胞特異性報告分子。

在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子包括在卵巢顆粒細胞特異性基因的調(diào)節(jié)控制下的熒光報告分子。熒光報告分子包括但不限于：海葵種(discosomasp.)紅（dsred）、綠色熒光蛋白（gfp）、黃色熒光蛋白（yfp）和橙色熒光蛋白（ofp）。

在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子是在卵巢顆粒細胞特異性基因的調(diào)節(jié)控制下的非熒光報告分子。非熒光報告分子包括但不限于螢光素酶和β半乳糖苷酶。

卵巢顆粒細胞特異性基因包括但不限于：叉頭框l2(foxl2)、無翼型mmtv整合位點家族成員4(wnt4)、nr5a1、dax-1、atp-結(jié)合盒亞家族9(abca9)、乙酰輔酶a酰基轉(zhuǎn)移酶2(線粒體3-氧代?；?輔酶a硫解酶;acaa2)、肌動蛋白α2（平滑肌、主動脈）(acta2)、具有1型凝血酶基序的解整聯(lián)蛋白樣和金屬肽酶（reprolysin樣）17(adamts17)、adamts-樣2(adamtsl2)、af4/fmr2家族成員1(aff1)、表達序列ai314831(ai314831)、醛酮還原酶家族1成員c14(akr1c14)、醛酮還原酶家族1、notch2、和成員c樣(akr1cl)。

在一些實施方案中，顆粒細胞特異性報告分子在遞送載體中。遞送載體包括但不限于質(zhì)粒和病毒載體。

在一些實施方案中，試劑盒包括多個多能細胞。多能細胞包括但不限于胚胎干細胞（esc）、多能干細胞、誘導(dǎo)的多能干細胞（ipsc）或其他重編程的體細胞、骨髓來源的細胞、外周血來源的細胞。

多能細胞可以是任何哺乳動物多能細胞。多能細胞可以來源于的哺乳動物包括例如家畜，諸如綿羊、豬、牛和馬；寵物動物，諸如犬和貓；實驗室動物，諸如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中，哺乳動物是人。

在一些實施方案中，試劑盒還包括將顆粒細胞特異性報告分子插入多能細胞中的試劑。在一些實施方案中，試劑盒還包括用于培養(yǎng)多能細胞的試劑。

在一些實施方案中，試劑盒還包括如何使用試劑盒組分以產(chǎn)生顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞經(jīng)富集的群的說明書。例如但不限于，在一些實施方案中，說明書將公開如何將顆粒細胞特異性報告分子插入至多能細胞中，如何誘導(dǎo)多能細胞分化以及如何分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。

實施例

本實施例為使用本技術(shù)的非限制性實施。

實施例1.分化中esc培養(yǎng)物中的卵泡樣結(jié)構(gòu)形成

該實施例顯示esc分化導(dǎo)致卵泡樣結(jié)構(gòu)的形成。

材料和方法

使用基本上描述于hübner等人,science,300:1251-56(2003)中的標(biāo)準(zhǔn)方法從tgog2(△pe-pou5f1-gfp)轉(zhuǎn)基因雌性小鼠中生成具有綠色熒光蛋白（gfp）的生殖細胞譜系表達的未分化的小鼠xxesc系。

將未分化的tgog2esc維持于補充有15%熱失活的esc-級胎牛血清(fbs;invitrogen,carlsbad,ca)、1%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、1%青霉素-鏈霉素(invitrogen)、103u/ml白血病抑制因子(lif;millipore,billerica,ma)和0.1mmβ-巰基乙醇(sigma-aldrich,st.louis,mo)的dmem中有絲分裂無活性的小鼠胚胎成纖維細胞（mef）飼養(yǎng)層上。對于分化，將esc通過差速貼壁從mef中分離，并用15%fbs在lif不存在的情況下在明膠包被的板上以單層進行培養(yǎng)，如描述于hübner等人,science,300:1251-56(2003)中。

使用nikoneclipsete2000-s倒置熒光顯微鏡和spot成像軟件(diagnosticinstruments,sterlingheights,mi)進行活細胞成像。

結(jié)果

在未分化的tgog2esc集落中檢測到gfp表達（圖1a），而通過去除mef和lif起始分化導(dǎo)致在接下來3-7天上廣泛分布的gfp表達的逐漸消失（圖1b）。由gfp陽性細胞構(gòu)成的不同集落的形成發(fā)生在起始分化后第7-26天（圖1c-1d）。在分化的第16-40天檢測到由體細胞環(huán)繞的單一大的gfp陽性卵母細胞樣細胞組成的卵泡樣結(jié)構(gòu)（圖1e）。

結(jié)果顯示esc可以自發(fā)地分化為卵泡樣結(jié)構(gòu)。

實施例2.顆粒細胞特化和分離

本實施例顯示用于追蹤和鑒定從esc分化的顆粒細胞的方法。

材料和方法

為了鑒定并追蹤分化中的esc培養(yǎng)物中的卵巢體細胞，在分化中的esc培養(yǎng)物中對早期顆粒細胞標(biāo)志物foxl2的表達進行定位。定位揭示在第5天foxl2基因的激活（圖2a）。使用genomevista鑒定出foxl2基因啟動子的739bp區(qū)域。將該區(qū)域從小鼠基因組dna中分離并克隆入pdsred2-1載體(clontech,mountainview,ca,)或含有dsred完整可讀框的plenti6慢病毒構(gòu)建體(gatewaylentiviralsystem;invitrogen)，因此產(chǎn)生在foxl2基因啟動子控制下的dsred表達載體（圖2b）。

使用小鼠顆粒細胞作為陽性對照和293細胞(invitrogen)作為陰性對照驗證啟動子活性和特異性（圖2c）。為了驗證foxl2基因啟動子驅(qū)動的dsred表達，用foxl2-pdsred2-1構(gòu)建體經(jīng)電穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染未分化的tgog2esc，隨后進行克隆選擇和擴展?？蛇x地，分化起始后使用由轉(zhuǎn)染有foxl2-dsred慢病毒構(gòu)建體(plenti6-foxl2-dsred)的293細胞產(chǎn)生的病毒上清液來病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)esc。通過熒光顯微鏡分析細胞的dsred表達并且通過熒光激活細胞分選術(shù)（facs）來分離。

對于facs，通過0.25%胰蛋白酶-edta（分化第10天前）或手工刮取將分化中的esc從板上移除。隨后將細胞與800u/ml的iv型膠原酶(worthington,lakewood,nj)保持輕柔分散(gentledispersion)溫育15分鐘，隨后與0.25%胰蛋白酶-edta溫育10分鐘以獲得單細胞懸浮液（分化第10天后）。通過重懸浮在含有0.1%fbs的1x濃度的磷酸緩沖鹽水（pbs）并過濾(35-μm孔徑)制備用于facs的細胞。使用facsaria流式細胞儀(bdbiosciences,sanjose,ca)分析并分選細胞。

測量來自facs純化的foxl2-dsred陽性細胞的培養(yǎng)基中的雌二醇和黃體酮濃度，所述foxl2-dsred陽性細胞已經(jīng)重新鋪板并且在存在pbs(媒介物)、100ng/ml卵泡刺激激素(fsh;niddk,nih,bethesda,md)或1mm8-溴腺苷3′,5′-環(huán)單磷酸(8-br-camp)(8-br-camp;sigma-aldrich)的情況下培養(yǎng)24、48或72小時。通過在所有培養(yǎng)物中提供熱失活的15%fbs（其含有0.92pg/ml雄激素（測試的fbs的56個批次的平均值））而提供芳香化為雌激素所需的雄激素底物。雌二醇elisa來自alpco(salem,nh)，且黃體酮elisa來自drginternational(mountainside,nj)。所有測定根據(jù)制造商指南進行。

結(jié)果

通過去除mef和lif將具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的foxl2-dsred載體的未分化的tgog2esc誘導(dǎo)以分化。dsred表達陽性的細胞在第1天不存在（圖2d），但最早至分化第5天被觀察到（圖2e）。到第9天，發(fā)現(xiàn)表達dsred的細胞緊密伴隨表達gfp的集落（圖2f-2g）。顯著地，表達dsred的細胞幾乎排他地與表達gfp的細胞簇在此時共定位（圖2f-2g）。

在分化第5天時通過facs分離dsred陽性細胞的基因表達分析（圖3a）揭示與存在早期卵巢顆粒細胞一致的不同的體細胞基因表達（圖3b）。檢測到的mrna為foxl2、無翼相關(guān)的mmtv整合位點4(wnt4)、卵泡抑素(fst)和kit配體(kitl;也稱為干細胞因子或scf，或steel因子)。核受體亞家族5組a成員1(nr5a1；也稱為甾體生成因子-1或sf-1)的表達在第7天變得可檢測到（圖3b）。

在分化的第16天，且持續(xù)直至第40天，多維卵泡樣結(jié)構(gòu)（其每一個由被表達dsred的細胞環(huán)繞的單一大(25–50μm)的gfp陽性細胞組成）通過直接熒光而觀察到（圖4a-4b）。為了確保這些觀察結(jié)果并非特異于tgog2esc系，用foxl2-dsred轉(zhuǎn)導(dǎo)的v6.5esc在誘導(dǎo)分化至少16天后也形成相同的卵泡樣結(jié)構(gòu)，所述卵泡樣結(jié)構(gòu)由被表達dsred的體細胞環(huán)繞的位于中心的卵母細胞樣細胞構(gòu)成（圖4c）。

在分化第10天通過facs分離的表達dsred細胞的基因表達分析揭示存在與分化中的顆粒細胞通常相關(guān)聯(lián)的多種標(biāo)志物，包括卵泡刺激激素受體（fshr）、抗müllerian激素(amh;也稱為müllerian抑制物或mis)、細胞色素p450家族19亞家族多肽1(cyp19a1;也稱為芳香化酶)和甾體生成急性調(diào)節(jié)蛋白(star)（圖5a）。分化第12天分離的dsred陽性細胞的亞培養(yǎng)后甾體生成的評估揭示培養(yǎng)基中存在雌二醇或黃體酮（圖5b-5c）。另外，用fsh或8-br-camp處理導(dǎo)致雌二醇產(chǎn)量的顯著增加，其證實這些細胞中存在功能性fsh受體和與甾體生成相關(guān)的camp介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。然而，僅8-br-camp能夠顯著增強黃體酮產(chǎn)生（圖5c）。

這些結(jié)果顯示多能細胞能夠分化為顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞。另外，結(jié)果顯示來源于多能細胞的顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞能夠通過顆粒細胞特異性基因報告分子進行追蹤和鑒定，所述報告分子還可以用于分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞，例如通過facs。因此，包含顆粒細胞特異性基因報告分子的多能細胞可用于追蹤和分離顆粒細胞或顆粒細胞前體細胞的群。

實施例3.顆粒細胞的卵巢內(nèi)移植

該實施例顯示來源于多能細胞的顆粒細胞遷移至新生卵巢中的不成熟卵母細胞和發(fā)育中的卵泡。

材料和方法

在以下實驗中使用了野生型c57bl/6雌性小鼠(charlesriverlaboratories,wilmington,ma,usa)。

表達foxl2-dsred的esc分化12天后，使用facs來分離dsred陽性細胞。對于每一實驗，將200-500dsred陽性細胞使用pneumaticpicopump(worldprecisioninstruments,sarasota,fl)微注射入單個新生的（產(chǎn)后第2-4天）野生型小鼠卵巢中（圖6a-6b）。隨后將經(jīng)注射的卵巢移植入6周齡的切除卵巢的野生型雌性小鼠的腎被膜下。在移植后8天和2周，移除經(jīng)移植的卵巢并固定在4%低聚甲醛（pfa）中用于分析。

將固定的卵巢包埋在石蠟中，連續(xù)切片，封固在載玻片上并在二甲苯中脫蠟，隨后在梯度乙醇系列中水化。抗原修復(fù)通過如下進行：將載玻片在檸檬酸鈉（ph6.0）中煮沸5min，隨后在tnk緩沖液(0.1mtris、0.55mnacl、0.1mmkcl、1%山羊血清、0.5%牛血清白蛋白和0.1%triton-x于pbs中)中封閉，與所需一級抗體（1：100稀釋）在4°c溫育過夜，并與綴合熒光團(fluor-conjugated)的二級抗體（1:250稀釋，alexafluor-488或-568;invitrogen）在20°c下溫育1小時。所用的一級抗體為來自serotec(mca2336;raleigh,nc)的小鼠抗dazl抗體和來自abcam(ab62341;cambridge,ma)的兔抗rfp抗體（用于檢測dsred）。使用nikoneclipsete2000-s倒置熒光顯微鏡和spot成像軟件(diagnosticinstruments)進行熒光圖像分析。

結(jié)果

注射從分化后12天的esc培養(yǎng)物中分離的表達foxl2-dsred的細胞之前，野生型新生卵巢沒有顯示dsred（圖6a）。注射從分化后12天的esc培養(yǎng)物中分離的表達foxl2-dsred的細胞之后，野生型新生卵巢顯示dsred（圖6b）。

在移植后8天，發(fā)現(xiàn)表達dsred的細胞分布在整個經(jīng)注射的卵巢的基質(zhì)。觀察到這些細胞中的許多細胞緊密接近未成熟卵母細胞，如由對dsred和卵母細胞標(biāo)志物dazl（精子缺乏樣中刪除的(deletedinazoospermia-like)）的雙免疫熒光染色所指示的（圖6c）。在移植后14天，表達dsred的細胞不再在基質(zhì)中觀察到但排他地在生長中的卵泡的顆粒細胞層內(nèi)檢測到（圖6d）。

這些結(jié)果顯示顆粒細胞和顆粒細胞前體細胞天然遷移至發(fā)育中的卵泡或未成熟卵母細胞。因此，多個和一個顆粒細胞可用于促進卵泡、卵泡樣結(jié)構(gòu)和未成熟卵母細胞的生長和成熟。

實施例4.促進卵泡或卵泡樣結(jié)構(gòu)的生長和成熟的方法

該實施例將顯示顆粒細胞促進卵泡和未成熟卵母細胞的生長和成熟。

材料和方法

將年齡和性別匹配的人個體分為兩組。一組通過直接向卵巢中注射來施用顆粒細胞，其中所述顆粒細胞如上所述從來自每名個體的多能細胞工程改造，使得顆粒細胞對于每名個體是自體的。第二組（對照）不施用顆粒細胞。

使用本領(lǐng)域已知的方法，移除來自每名個體的卵巢組織樣品并通過本領(lǐng)域已知的方法分析以測量卵泡直徑和卵母細胞直徑。

結(jié)果

預(yù)期來自用自體顆粒細胞處理的個體的卵巢將具有直徑大于30μm的卵泡和/或直徑大于10μm的卵母細胞。

這些結(jié)果將表明顆粒細胞和/或顆粒細胞前體細胞可用于促進卵泡和未成熟卵母細胞的生長和成熟。

實施例5.增加甾體激素的方法

該實施例將顯示向有需要的個體施用顆粒細胞將提高個體中甾體激素的水平。

材料和方法

將年齡和性別匹配的患有化療誘導(dǎo)的卵巢衰竭的人個體分為兩組。一組通過直接向卵巢中注射來施用顆粒細胞，其中所述顆粒細胞如上所述從來自每名個體的多能細胞工程改造，使得顆粒細胞對于每名個體是自體的。第二組（對照）不施用顆粒細胞。

使用本領(lǐng)域已知的方法，將測量每名個體中的雌二醇和黃體酮的水平。

結(jié)果

預(yù)期施用有自體顆粒細胞的個體將相比于未處理的個體具有升高水平的雌二醇和黃體酮。

這些結(jié)果將表明顆粒細胞和/或顆粒細胞前體細胞可用于提高有需要的個體中的甾體激素水平。

等同方案

本技術(shù)將不限于本申請中所描述的具體實施方案，所述實施方案旨在作為本技術(shù)的各個方面的單個說明?？梢赃M行本技術(shù)的許多改變和變化而不背離其精神和范圍，如同對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。除了列舉的那些外，本文本技術(shù)范圍內(nèi)的功能等同的方法和設(shè)備對于本領(lǐng)域技術(shù)人員從前述內(nèi)容中也將是顯而易見的。此類改變和變化旨在落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本技術(shù)將不僅僅限于所附的權(quán)利要求，連同此類權(quán)利要求所賦予的等同方案的全部范圍。應(yīng)理解本技術(shù)不限于具體的方法、試劑、化合物組合物或生物系統(tǒng)，這些當(dāng)然是可以進行改變的。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，并不旨在是限制性的。