相關(guān)申請本申請根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求于2014年6月17日提交的美國臨時申請no.62/013,121的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。本發(fā)明一般地涉及自體cd133+骨髓干細(xì)胞(bonemarrowstemcell，bmdsc)用于誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生和治療子宮內(nèi)膜病理狀況(例如子宮腔粘連綜合征(asherman’ssyndrome)和子宮內(nèi)膜萎縮)的用途。
背景技術(shù)：
：在育齡婦女中，可以區(qū)分兩層子宮內(nèi)膜：(i)鄰近子宮腔的功能層，和(ii)鄰近子宮肌層并在功能層下面的基底層。功能層在先前月經(jīng)周期的第一部分期間月經(jīng)結(jié)束之后建立。增生是由雌激素誘導(dǎo)的(月經(jīng)周期的卵泡期)，并且此層中的后來的變化由來自黃體的孕酮產(chǎn)生(黃體期)。其適于為胚胎的植入和生長提供最佳環(huán)境。該層在月經(jīng)期間完全脫落。相反，在月經(jīng)周期期間的任何時間，基底層不脫落。在每個月經(jīng)周期中，在全身性卵巢類固醇變化下人子宮內(nèi)膜的再生對于該器官的主要功能(即發(fā)生子宮內(nèi)膜植入窗口以接待植入的胚泡，從而允許發(fā)生妊娠)的準(zhǔn)備是必需的。因此，每個月經(jīng)周期補充子宮內(nèi)膜功能層的所有細(xì)胞區(qū)室對于正常生殖功能是必需的。子宮腔粘連綜合征(asherman’ssyndrome，as)是其中由重復(fù)或侵略性刮除術(shù)和/或子宮內(nèi)膜炎引起的子宮內(nèi)膜破壞的病癥。它在許多區(qū)域產(chǎn)生帶有子宮內(nèi)粘連的子宮腔閉塞和功能性子宮內(nèi)膜的缺失?；加羞@種疾病以及萎縮性子宮內(nèi)膜(＜4mm)的婦女通常與不孕、月經(jīng)不調(diào)(包括閉經(jīng)、月經(jīng)過少)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrentpregnancyloss)斗爭。目前沒有針對這些子宮內(nèi)膜病理狀況的特異性治療。因此，仍然需要開發(fā)安全且有效的治療來治療這些病理狀況。發(fā)明概述本公開內(nèi)容至少部分地涉及自體cd133+骨髓衍生干細(xì)胞(bonemarrowderivedstemcell，bmdsc)可使血管形成再生的研究結(jié)果，所述血管形成導(dǎo)致自體功能性子宮內(nèi)膜從頭產(chǎn)生。因此，本公開內(nèi)容的一些方面提供了誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生的方法。在一些實施方案中，所述方法包括向有此需要的對象的子宮動脈中施用有效量的自體cd133+骨髓衍生干細(xì)胞(bonemarrowderivedstemcell，bmdsc)以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生。在一些實施方案中，已知對象患有子宮腔粘連綜合征或子宮內(nèi)膜萎縮。在一些實施方案中，對象患有抵抗激素治療的子宮內(nèi)膜萎縮。在一些實施方案中，對象曾有過一次或更多次先前的胚胎植入失敗(priorembryoimplantationfailure)。在一些實施方案中，自體cd133+bmdsc通過以下來制備：向?qū)ο笫┯糜糜趯mdsc從骨髓動員到對象外周血中的藥劑；并從對象的外周血中分離cd133+bmdsc。在一些實施方案中，用于動員bmdsc的藥劑是粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，g-csf)。在一些實施方案中，自體cd133+bmdsc通過使用抗cd133抗體的單采血液成分術(shù)(apheresis)從對象的外周循環(huán)中分離。在一些實施方案中，cd133+bmdsc通過導(dǎo)管施用到子宮動脈中。在一些實施方案中，cd133+bmdsc施用到對象的子宮螺旋小動脈(uterinespiralarteriole)中。本公開內(nèi)容的一些方面提供了用于誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生的方法，所述方法包括從有此需要的對象中分離自體cd133+骨髓衍生干細(xì)胞(bmdsc)；和向所述對象的子宮動脈中施用有效量的所分離的cd133+bmdsc以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生。在一些實施方案中，在分離自體bmdsc之前向?qū)ο笫┯昧＜?xì)胞集落刺激因子(g-csf)。在一些實施方案中，自體cd133+bmdsc通過使用抗cd133抗體的單采血液成分術(shù)從對象的外周循環(huán)中分離。在一些實施方案中，將cd133+bmdsc通過導(dǎo)管施用到子宮動脈中。在一些實施方案中，將cd133+bmdsc施用到對象的子宮螺旋小動脈中。在一些實施方案中，已知對象患有子宮腔粘連綜合征或子宮內(nèi)膜萎縮。在一些實施方案中，對象患有抵抗激素治療的子宮內(nèi)膜萎縮。在一些實施方案中，對象曾有過一次或更多次先前的胚胎植入失敗。本發(fā)明的每個限制可涵蓋本發(fā)明的多個實施方案。因此，預(yù)期涉及任何一個要素或要素組合的本發(fā)明的每個限制可包括在本發(fā)明的每個方面中。本發(fā)明在其應(yīng)用中不限于在以下描述中闡述或在附圖中示出的構(gòu)造細(xì)節(jié)和部件布置。本發(fā)明能夠具有其他實施方案并且能夠以多種方式實踐或執(zhí)行。此外，本文中使用的措辭和術(shù)語是為了描述的目的，并且不應(yīng)被視為限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其變化形式意在包括其后列出的項目及其等同物以及另外的項目。附圖簡述圖1是示出圖1a所示事件的研究設(shè)計(a)和時間線(b)的示意圖。圖2是示出探針從子宮動脈通過螺旋小動脈之路徑的血管造影，其中cd133+細(xì)胞通過非侵入性放射學(xué)進(jìn)行定位。圖3示出了在自體bmsc治療之前、3-6個月和9個月之后患有萎縮性子宮內(nèi)膜的一個患者的子宮腔的宮腔鏡檢查。圖4示出了在自體bmsc治療之前和3個月之后在本研究中包括的6例患有萎縮性子宮內(nèi)膜/子宮腔粘連綜合征的患者的子宮內(nèi)膜厚度。圖5示出了在自體bmsc治療之前和3個月之后的平均值+sd子宮內(nèi)膜厚度。圖6示出了顯示與預(yù)處理基礎(chǔ)狀態(tài)相比，自體bmsc治療后3個月獲得的子宮內(nèi)膜體積改善的3d超聲圖像。圖7a-7b示出了術(shù)前和術(shù)后宮腔鏡檢查圖像。在患有子宮腔粘連綜合征(圖7a)或子宮內(nèi)膜萎縮(圖7b)的患者中，在干細(xì)胞治療之前(第一次視檢(look))，和干細(xì)胞治療后2-3個月(第二次視檢)和4-6個月(第三次視檢)的宮腔鏡檢查的研究結(jié)果。子宮內(nèi)膜粘連的嚴(yán)重程度根據(jù)美國生育學(xué)會(americanfertilitysociety)分類進(jìn)行分級。圖8a-8i示出了組織分析。自體細(xì)胞治療之前(圖8a)、3個月后(圖8b)和6個月后(圖8c)來自患者7的子宮內(nèi)膜中的成熟血管檢測的免疫組織化學(xué)結(jié)果。以α-sma+、cd31+陽性細(xì)胞鑒定成熟血管(20×)。圖8d示出了用作α-sma染色的陽性對照的人子宮肌層和用作cd31的陽性對照的人扁桃體(圖8e)。圖8f示出了在不存在一抗情況下產(chǎn)生的陰性對照。圖8g示出了圖8c中鑒定的血管的詳細(xì)視圖(40×)。在圖8h中，呈現(xiàn)了在細(xì)胞治療之前以及在細(xì)胞治療后3個月和6個月的8個患者的成熟血管總數(shù)的動態(tài)分析，表明時間敏感的新生血管生成效應(yīng)。圖8i示出了治療前和治療后3個月和6個月的總成熟血管的平均值±sem的統(tǒng)計學(xué)分析。圖9示出了研究設(shè)計。在增生期由一名外科醫(yī)生進(jìn)行as或ea的宮腔鏡檢查重新確認(rèn)和分級。通過g-csf注射誘導(dǎo)bmdsc動員，五天后，并且通過單采血液成分術(shù)從外周血中分離cd133+細(xì)胞并通過介入性放射學(xué)立即灌輸?shù)铰菪用}中。進(jìn)行第二次和第三次視檢宮腔鏡檢查以評價干細(xì)胞治療后的子宮腔。然后邀請患者嘗試懷孕。發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分地基于使用自體干細(xì)胞治療來誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生的新治療方法的研究結(jié)果。特別地，本申請基于自體cd133+骨髓衍生干細(xì)胞(bmdsc)可使血管形成再生的研究結(jié)果，所述血管形成導(dǎo)致自體功能性子宮內(nèi)膜從頭產(chǎn)生。雖然已知bmdsc是不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞區(qū)室(基質(zhì)、腺上皮和腔上皮)中的非造血細(xì)胞的來源，但是不知道bmdsc的哪個亞群促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)。本申請?zhí)峁┝税踩矣行У幕诩?xì)胞的治療以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生并治療與子宮內(nèi)膜變性相關(guān)的病理狀況，例如子宮腔粘連綜合征和子宮內(nèi)膜萎縮。人子宮主要由子宮內(nèi)膜和稱為子宮肌層的外平滑肌層組成。人子宮內(nèi)膜的功能層是高度再生性組織，在婦女的生殖年齡期間經(jīng)歷生長、分化和脫落的按月的周期。循環(huán)雌激素和孕酮的波動水平協(xié)調(diào)人子宮內(nèi)膜的這種急劇的重塑。子宮內(nèi)膜再生也在分娩和子宮內(nèi)膜切除術(shù)后發(fā)生。從基底層的子宮內(nèi)膜再生有助于功能層的替換，隨后其在月經(jīng)和分娩期間脫落。然而，子宮內(nèi)膜可無法響應(yīng)于雌激素，并且在某些病理狀況(例如子宮腔粘連綜合征和子宮內(nèi)膜的萎縮)中不再生。這樣的對象可經(jīng)歷異常的子宮內(nèi)膜增生并變得不育。子宮腔粘連綜合征(as)(或弗里奇綜合征(fritschsyndrome))是以子宮內(nèi)膜粘連和/或纖維化為特征的病癥，其通常與子宮內(nèi)腔的擴張和刮除術(shù)有關(guān)。許多其他術(shù)語已用于描述所述病癥和相關(guān)病癥，包括：子宮內(nèi)粘連(intrauterineadhesion，iua)、子宮/宮頸閉鎖、創(chuàng)傷性子宮萎縮、硬化子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜硬化和子宮內(nèi)粘連(intrauterinesynechiae)。子宮內(nèi)膜基底層的創(chuàng)傷(例如，在流產(chǎn)或分娩或者用于藥物流產(chǎn)之后進(jìn)行的擴張和刮除術(shù)(dilationandcurettage，d&c)之后)可導(dǎo)致發(fā)生導(dǎo)致粘連的子宮內(nèi)瘢痕，這可不同程度地使子宮腔閉塞。在極端情況下，整個腔可有疤痕和閉塞。即使具有相對較少的瘢痕，子宮內(nèi)膜可無法響應(yīng)于雌激素，并且對象可經(jīng)歷次級月經(jīng)不調(diào)(例如閉經(jīng)、月經(jīng)過少或月經(jīng)稀發(fā)(oligomenorrhea))并且變得不育。as也可源自其他骨盆手術(shù)，包括剖宮產(chǎn)術(shù)、去除纖維瘤(子宮肌瘤切除術(shù))和其他原因，例如iud、盆腔輻照、血吸蟲病和生殖器結(jié)核。來自生殖器結(jié)核的慢性子宮內(nèi)膜炎是發(fā)展中國家嚴(yán)重子宮內(nèi)粘連(iua)的重要原因，經(jīng)常導(dǎo)致難以治療的子宮腔完全閉塞。宮腔鏡檢查是用于診斷as的金標(biāo)準(zhǔn)。通過宮腔聲學(xué)造影術(shù)(sonohysterography)或子宮輸卵管造影術(shù)(hysterosalpingography)成像顯示瘢痕形成的程度。根據(jù)嚴(yán)重程度，as可能導(dǎo)致不育、反復(fù)流產(chǎn)、被困血液引起的疼痛和未來的產(chǎn)科并發(fā)癥。如果不治療，在一些情況下，由粘連導(dǎo)致的月經(jīng)流的阻塞可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥。在子宮內(nèi)膜萎縮中，由于低雌激素水平，子宮內(nèi)膜變得太薄。要認(rèn)為是萎縮，則子宮內(nèi)膜厚度應(yīng)該在經(jīng)陰道超聲掃描上測量為小于4-5mm。子宮體與子宮頸比例也將趨于降低并可接近1∶1。mri還可證明類似于用超聲觀察到的子宮內(nèi)膜厚度的降低。可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜萎縮的因素包括長期口服避孕、低雌激素狀態(tài)(卵巢功能障礙)和使用他莫昔芬。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生的方法。所述方法包括向有此需要的對象的子宮動脈中施用有效量的自體cd133+骨髓衍生干細(xì)胞(bmdsc)以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生的方法。所述方法包括從有此需要的對象中分離自體cd133+骨髓衍生干細(xì)胞(bmdsc)；和向所述對象的子宮動脈中施用有效量的所分離的cd133+bmdsc以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生。本文中使用的“對象”包括所有哺乳動物，包括但不限于狗、貓、馬、綿羊、山羊、牛、豬、人和非人靈長類動物。在一些實施方案中，對象是婦女。需要子宮內(nèi)膜再生的對象是其子宮內(nèi)膜無法響應(yīng)于雌激素而再生并且具有薄的子宮內(nèi)膜襯里的對象。這樣的對象經(jīng)常經(jīng)歷異常的子宮內(nèi)膜增生并變得不育。子宮內(nèi)膜襯里的最佳厚度為10至15mm，在植入時在婦女月經(jīng)周期的約第21天達(dá)到其最大厚度。在一些實施方案中，需要治療的對象在植入時具有小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm或小于1mm的子宮內(nèi)膜厚度。在一些實施方案中，對象具有以出血的流量和持續(xù)時間減小為特征的月經(jīng)不調(diào)(閉經(jīng)、月經(jīng)過少或月經(jīng)稀發(fā))和/或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。在一些實施方案中，已知對象患有子宮腔粘連綜合征或子宮內(nèi)膜萎縮。在一些實施方案中，對象患有抵抗激素治療的子宮內(nèi)膜萎縮。在一些實施方案中，對象曾有過一次或更多次先前的胚胎植入失敗。骨髓衍生干細(xì)胞(bmdsc)已示出作為外源性來源有助于組織修復(fù)和不同器官和組織的再生。在人和鼠子宮內(nèi)膜中，bmdsc也是不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞區(qū)室(基質(zhì)、腺上皮和腔上皮)中的非造血細(xì)胞的來源。它們主要有助于子宮內(nèi)膜基質(zhì)區(qū)室細(xì)胞的形成，并且以小得多的程度有助于子宮內(nèi)膜腺上皮和腔上皮區(qū)室的形成。bmdsc包括造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcell，hsc)和間充質(zhì)千細(xì)胞(mesenchymalstemcell，msc)。然而，bmdsc的哪個(哪些)亞群促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)是未知的。本申請的發(fā)明人首次在人中示出了通過手術(shù)和導(dǎo)管遞送系統(tǒng)遞送到子宮動脈中的cd133+骨髓衍生干細(xì)胞誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生的能力。在先前的骨髓動員后分離自體循環(huán)的cd133+bmdsc，并將其重新植入到同一患者子宮的螺旋小動脈中。cd133+bmdsc使血管形成再生，其導(dǎo)致自體功能性子宮內(nèi)膜從頭產(chǎn)生。cd133是在人和嚙齒類動物中也已知為prominin1(prom1)的糖蛋白。它是五次跨膜的膽固醇結(jié)合蛋白，其定位于膜突起(protrusion)并且經(jīng)常在成體干細(xì)胞上表達(dá)，其中其被認(rèn)為通過抑制分化而在維持干細(xì)胞性質(zhì)中發(fā)揮作用。本發(fā)明的cd133+bmdsc可來自于原代干細(xì)胞或可來自于已建立的干細(xì)胞系。在一些實施方案中，干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、體干細(xì)胞(somaticstemcell)、骨髓干細(xì)胞或動員的骨髓干細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，干細(xì)胞是成體干細(xì)胞。在一些實施方案中，cd133+bmdsc通過以下來制備：向?qū)ο笫┯糜糜趯mdsc從骨髓動員到對象外周血中的藥劑；從對象的外周血中分離cd133+bmdsc。在一些實施方案中，干細(xì)胞動員劑選自粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophage-colonystimulatingfactor，gm-csf)和普樂沙福(plerixafor)(amd3100)。在一些實施方案中，干細(xì)胞動員劑是g-csf。在一些實施方案中，通過使用抗cd133抗體的稱為單采血液成分術(shù)的方法，從對象的外周循環(huán)中分離自體cd133+bmdsc(見例如，sovalath，scrofanim，eidenschenka，pasquets，rimelenv，，hénonp.identificationandisolationfromeitheradulthumanbonemarroworg-csf-mobilizedperipheralbloodofcd34(+)/cd133(+)/cxcr4(+)/lin(-)cd45(-)cells，featuringmorphological，molecular，andphenotypiccharacteristicsofverysmallembryonic-like(vsel)stemcells.exphematol.2011apr；39(4)：495-505，其全部內(nèi)容整體并入本文)。單采血液成分術(shù)是本領(lǐng)域中公知的方法，是指從供體對象抽取血液并分離成其組分(其中一些組分保留)，例如干細(xì)胞群體；并且其余部分通過輸血返回給供體對象的方法或操作。單采血液成分術(shù)需要比全血捐贈更長的時間。全血捐贈需要約10-20分鐘來收集血液，而單采血液成分術(shù)捐獻(xiàn)可需要約1-2小時。單采血液成分術(shù)產(chǎn)物是指由單采血液成分術(shù)方法收集的異質(zhì)細(xì)胞群。在一些實施方案中，使用抗cd133抗體從所分離的bmdsc中分離cd133+bmdsc。在一些實施方案中，使用抗cd133抗體選擇cd133+bmdsc，直到cd133+bmdsc為至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或100％純的。在一些實施方案中，cd133+bmdsc為至少95％、98％、99％、99.9％或100％純的。例如通過移植、植入(例如，細(xì)胞本身或作為基質(zhì)-細(xì)胞組合的一部分的細(xì)胞)、注射(例如，直接到子宮動脈中)、輸注、通過導(dǎo)管遞送或本領(lǐng)域中已知的用于提供細(xì)胞治療的任何其他方式，可以實現(xiàn)向有此需要的對象施用cd133+bmdsc或包含這樣的細(xì)胞的治療組合物。在一個實施方案中，通過動脈內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)遞送細(xì)胞。子宮動脈導(dǎo)管插入術(shù)操作已被廣泛描述并用于子宮肌瘤的栓塞(ravinajh，herbreteaud，ciraru-vigneronn，etal.arterialembolisationtotreatuterinemyomata.lancet1995；346(8976)：671-2，其全部內(nèi)容整體并入本文)。cd133+bmdsc可施用到對象的子宮動脈中。這些動脈向子宮提供血液。在一些實施方案中，cd133+bmdsc施用到對象的子宮螺旋小動脈中。螺旋動脈是在月經(jīng)周期的黃體期期間暫時向子宮內(nèi)膜供應(yīng)血液的小動脈。這些動脈對雌激素和孕酮高度敏感，穿透子宮內(nèi)膜功能層，在其內(nèi)生長并發(fā)出分枝，并顯示出非常不同且獨特的模式。cd133+bmdsc以有效量施用?！坝行Я俊笔侵缸阋砸鹌谕纳飳W(xué)應(yīng)答(即誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜再生)的量。有效量包括減緩、降低、抑制、改善或逆轉(zhuǎn)與as或子宮內(nèi)膜萎縮相關(guān)的一種或更多種癥狀所需的量。在一些實施例中，這樣的術(shù)語指：·cd133+bmsc干細(xì)胞治療后的月經(jīng)重新開始；·子宮內(nèi)膜厚度增大；子宮內(nèi)膜厚度測量為子宮內(nèi)膜腔基底部中從子宮肌層以上到子宮肌層以下限度的長度。例如，所述增大可以是以激素替代治療(hormonereplacementtherapy，hrt)獲得并通過在子宮底的陰道超聲縱軸測量的最大厚度增大50％(vgr為4至6mm)；·子宮內(nèi)膜從頭形成的宮腔鏡檢查證據(jù)和組織學(xué)證據(jù)；和/或·在這些患者的胚胎放置后的活出生率(live-birthrate)、妊娠和植入率方面而言的重建的子宮內(nèi)膜的功能。在一些實施方案中，將至少4千5百萬個cd133+bmdsc輸注到對象中。在一些實施方案中，將至少5千萬、5千5百萬、6千萬、6千5百萬個cd133+bmdsc輸注到對象中。有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法確定。在一些實施方案中，有效量是導(dǎo)致所治療的病癥的任何改善的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可例如基于體外和/或體內(nèi)測試和/或化合物劑量的其他知識來確定所使用的治療劑的合適劑量和范圍。當(dāng)施用于對象時，治療劑的有效量當(dāng)然將取決于所治療的具體疾?。患膊〉膰?yán)重程度；個體患者參數(shù)，包括年齡、身體狀況、身材和體重、同時進(jìn)行的治療、治療頻率和給藥方式。這些因素是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且可以僅通過常規(guī)實驗來解決。在一些實施方案中，使用最大劑量，即根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。通過以下實施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，這些實施例決不應(yīng)解釋為進(jìn)一步限制。本申請通篇引用的所有參考文獻(xiàn)(包括參考文獻(xiàn)、授權(quán)的專利、公布的專利申請和共同未決專利申請)的全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文。實施例實施例1材料和方法設(shè)計以下是西班牙衛(wèi)生部資助的由西班牙巴倫西亞醫(yī)院(hospitalclinicodevalencia)的irb批準(zhǔn)的對16名難治性as患者進(jìn)行的實驗性非對照研究(refec11-299)。使用粒細(xì)胞-csf(g-csf)(5mg/kg/12小時，皮下(sc)，經(jīng)4天)進(jìn)行bmdsc動員。7天后，以外周血單采血液成分術(shù)進(jìn)行cd133+細(xì)胞的分離。然后，使用2.5f微導(dǎo)管通過子宮動脈的非侵入性放射學(xué)干預(yù)將自體cd133+細(xì)胞遞送到螺旋小動脈中。通過宮腔鏡檢查、陰道超聲和組織學(xué)在干細(xì)胞干預(yù)(stemcellintervention)前、以及干細(xì)胞干預(yù)3、6和9個月后對子宮內(nèi)膜腔狀態(tài)進(jìn)行評估?；颊吆头椒{入標(biāo)準(zhǔn)該研究中包括16名先前用手術(shù)治療至少7次且診斷為患有難治性子宮腔粘連綜合征，或患有抵抗激素治療的子宮內(nèi)膜萎縮(＜4mm)且患有復(fù)發(fā)性植入失敗的患者。所有患者由世界各地的各自的醫(yī)生轉(zhuǎn)移進(jìn)入由西班牙衛(wèi)生部支持的臨床實驗研究?；颊吣挲g為20-45歲，并且均具有正常的肝、心、腎功能。證實在自然周期中或在激素替代治療(hrt)后沒有月經(jīng)出血。也證實了不存在精神病理狀況、hiv、乙型或丙型肝炎和梅毒并且證實了參與研究的意愿。排除標(biāo)準(zhǔn)如果沒有進(jìn)入外周靜脈或者如果他們患有脾腫大，則將患者從研究中排除。方法學(xué)1.骨髓干細(xì)胞(bmsc)動員為了開始動員過程，滿足以下條件：·患者被告知程序，并在動員前至少24小時給予知情同意書。·進(jìn)行相應(yīng)的醫(yī)學(xué)評估，以及相關(guān)的補充探索，并由負(fù)責(zé)bmsc回收的醫(yī)生進(jìn)行驗證?！ぬ峁┫嚓P(guān)血清學(xué)檢測結(jié)果(hiv、hbcag、hbsag、hcv、梅毒)?！ぴu價靜脈以確定其對于該過程的適宜性。然后，通過g-csf(5mcg/kg皮下(sc)，每12小時)誘導(dǎo)bmsc向外周血動員，持續(xù)4天。2.bmsc回收bmsc通過使用外周靜脈的常規(guī)單采血液成分術(shù)過程進(jìn)行回收。根據(jù)clínicouniversitario醫(yī)院批準(zhǔn)的po-7610-02方案進(jìn)行cd133+細(xì)胞的陽性選擇，其中應(yīng)用三次洗滌并隨后選擇cd133+細(xì)胞。首先，洗滌細(xì)胞并與單克隆抗體孵育，然后將它們再洗滌兩次，最后進(jìn)行cd133+選擇。選擇過程進(jìn)行最多3小時或直到收集至少5千萬個cd133+細(xì)胞。3.將cd133+細(xì)胞通過動脈內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)移植到子宮螺旋小動脈中在將它們分離后24小時，將自體cd133+細(xì)胞在15-30cc鹽水溶液中稀釋，然后輸注到螺旋動脈中。通過無菌注射器將細(xì)胞收集到容器中，并在其輸注前送至放射科。輸注至少4千5百萬個細(xì)胞。子宮動脈的導(dǎo)管插入術(shù)被廣泛描述并用于子宮肌瘤的栓塞。該方法所需的放射設(shè)備是放射外科手術(shù)c-臂或具有超聲掃描的血管造影室。簡而言之，在使用seldinger技術(shù)進(jìn)入普通股動脈后，將4f導(dǎo)管置于動脈中并將其用于使用血管造影導(dǎo)管對兩個腹下動脈進(jìn)行導(dǎo)管插入，其中所述血管造影導(dǎo)管帶有cobra彎曲件2(cobracurve2)和terumo引導(dǎo)件(0.035英寸)。將微導(dǎo)管2.5f與引導(dǎo)件(0.014英寸)通過cobra導(dǎo)管放置，并對子宮動脈插入導(dǎo)管，直到上升曲線或直到微導(dǎo)管達(dá)到其最遠(yuǎn)端水平。一旦導(dǎo)管穩(wěn)定并且已經(jīng)檢查其位置，則將cd133+bmsc在鹽水溶液懸浮液中進(jìn)行輸注。用于細(xì)胞注射的導(dǎo)管的直徑為500-600微米，并灌注15cc。干預(yù)后，患者在醫(yī)院過夜，第二天出院，無并發(fā)癥。響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)該技術(shù)旨在使用cd133+bmsc重新填充患有子宮腔粘連綜合征或子宮內(nèi)膜萎縮之患者中子宮內(nèi)膜血管小環(huán)境(endometrialvascularniche)，以便在由于子宮內(nèi)膜的復(fù)發(fā)性植入失敗而經(jīng)歷art的患者中重建功能性子宮內(nèi)膜，使得能夠允許胚胎植入。因此，以下指標(biāo)被認(rèn)為是成功治療的指標(biāo)：·月經(jīng)結(jié)果，月經(jīng)必須在cd133+bmsc治療后重新開始。·子宮內(nèi)膜厚度的增大。最小為通過陰道超聲縱軸在子宮底測量的hrt獲得的最大厚度的50％(vgr為4至6mm)·從頭子宮內(nèi)膜形成的宮腔鏡檢查證據(jù)和組織學(xué)證據(jù)·在這些患者中重建的子宮內(nèi)膜在胚胎移植(embryoreplacement)后的活出生率、妊娠和植入率方面的功能結(jié)果表1.cd133+干細(xì)胞治療后的臨床結(jié)局表2：cd133+bmdcc自體移植后的周期長度、以及月經(jīng)量和持續(xù)時間(以天為單位)月經(jīng)規(guī)律(天)量(保護(hù)次數(shù)/天)持續(xù)時間(天)治療后第二個月26.52.63.8治療后第四個月25.41.63.1治療后第六個月26.11.42.1這是使用這種血管內(nèi)應(yīng)用于as的特異性干細(xì)胞治療的第一個病例系列研究。不育婦女之中，as的發(fā)病率在2-22％之間變化。g-csf是在自體和同種異體供體中均用于bmsc動員的最常用的細(xì)胞因子。該產(chǎn)品一般耐受性良好。然而，施用高于5mcg/kg/天的劑量已經(jīng)顯示在超過50％的病例中引起骨骼肌疼痛。如果發(fā)生這種情況，應(yīng)當(dāng)施用對乙酰氨基酚作為鎮(zhèn)痛劑(500mg/8小時)，同時保持g-csf的施用。其他不太經(jīng)常觀察到的并發(fā)癥是：惡心和嘔吐、偏頭痛和失眠。在每種情況下，應(yīng)施用對癥治療。一般而言，在停止施用g-csf后3-4天內(nèi)癥狀消失，盡管乏力的感覺可以持續(xù)到最后給藥后的2周。最后，健康供體的脾破裂與g-scf的施用相關(guān)。由于該事實，應(yīng)該在所有表現(xiàn)出左側(cè)季肋部(hypochondrium)疼痛的患者中進(jìn)行腹部掃描。在這些病例中檢測到脾腫大之后應(yīng)立即暫停g-csf。通常檢測到高水平的堿性磷酸酶和ldh而沒有任何相關(guān)癥狀。白細(xì)胞增多癥是相當(dāng)普遍的，且值通常小于70×109/l。實施例2研究參與者邀請了基于美國生育學(xué)會分類診斷為難治性子宮腔粘連綜合征(as)(n＝11)或子宮內(nèi)膜萎縮(n＝5)的16位患者(年齡為30-45歲)參與研究。證實了嚴(yán)重子宮腔粘連綜合征或子宮內(nèi)膜萎縮的早期診斷，并且在增生期進(jìn)行宮腔鏡檢查。診斷為as的患者根據(jù)子宮粘連的afs分類進(jìn)行分類，并獲得了子宮內(nèi)膜活檢。所有患者在其自然周期或激素替代治療(hrt)后經(jīng)歷很少或無月經(jīng)出血。參與研究的要求包括以下：正常的肝、心和腎功能，不存在hiv、乙型或丙型肝炎、梅毒和精神病理狀況，以及愿意完成研究。排除了沒有外周靜脈進(jìn)入或脾腫大的病例中的患者。bmdsc的動員和分離通過粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)的藥理學(xué)施用(在第-4，-3，-2和-1天，10μg/kg/天)誘導(dǎo)bmdsc的動員。g-csf是在自體和同種異體供體中均廣泛用于該目的的細(xì)胞因子。注射后5天，cd133+細(xì)胞的分離使用cobespectra分離器(terumobct，lakewood，co)通過外周靜脈通過單采血液成分術(shù)進(jìn)行分離。為每個患者處理兩到三個樣品，并且使用系統(tǒng)(miltenyibiotecgmbh，bergischgladbach，德國)根據(jù)建立的方案獲得cd133+細(xì)胞的陽性選擇。在收集的三小時內(nèi)進(jìn)行選擇，直到獲得5千萬個細(xì)胞。將所分離的cd133+細(xì)胞稀釋到15至30cc的鹽水溶液中，并在無菌注射器中運送至放射科以遞送到螺旋小動脈中。bmdsc的遞送在成功分離cd133+后，患者被轉(zhuǎn)送到hcu的放射科，在其中進(jìn)行動脈內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)以使用用于栓塞纖維瘤的技術(shù)將細(xì)胞遞送至子宮內(nèi)膜干細(xì)胞小環(huán)境(stemcellniche)。使用seldinger技術(shù)接近股總動脈，其中4f導(dǎo)引器允許用血管造影導(dǎo)管彎曲件和引導(dǎo)件terumo(0.035英寸)對兩個腹下動脈進(jìn)行導(dǎo)管插入術(shù)。通過后一導(dǎo)管，引入具有引導(dǎo)件(0.014英寸)的2.5f微導(dǎo)管以將子宮動脈導(dǎo)管插入微導(dǎo)管可到達(dá)的最遠(yuǎn)端的螺旋小動脈(圖9)。一旦導(dǎo)管位置穩(wěn)定并確認(rèn)，則通過每個子宮動脈將15cc所選cd133+細(xì)胞(含有42至200×106個細(xì)胞，平均值123.56×106±57.64)的鹽水懸浮液注射到螺旋小動脈中。隨訪所有患者接受細(xì)胞治療后均被給予激素替代治療(progylutontm，bayer，berlin，德國)。通過診斷性宮腔鏡檢查、陰道超聲和組織學(xué)評估子宮內(nèi)膜腔狀態(tài)，以確定在細(xì)胞治療之前、細(xì)胞治療之后2、3和6個月時子宮內(nèi)膜厚度和子宮內(nèi)膜粘連的存在與否。然后，患者被邀請進(jìn)行art以嘗試懷孕(圖9)。子宮內(nèi)膜免疫組織化學(xué)使用抗人cd31(dako，glostrup，丹麥)以及二抗alexa山羊抗小鼠488和小鼠抗人α-sma-cy3(sigma-aldrich，mo，eeuu)通過石蠟切片中的cd31和α-sma-cy3免疫組織化學(xué)評估血管形成。將載玻片用dapi(invitrogen，ca，eeuu)復(fù)染色。陽性對照包括針對cd31的人扁桃體和針對α-sma的子宮肌層。在熒光nikoneclipse80i顯微鏡下檢查載玻片。將三個獨立的20×視野用于通過imagej軟件分析每個區(qū)域的總血管形成。數(shù)據(jù)以每個患者在細(xì)胞治療前、細(xì)胞治療后3個月和6個月的具體值表示。統(tǒng)計學(xué)分析使用spss17.0軟件(ibm，md，美國)進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用配對樣本t檢驗來分析在總成熟血管計數(shù)中觀察到的差異。在雙尾檢驗中獲得的p值≤0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。結(jié)果由于在一個病例中cd133+細(xì)胞的動員不足(＜4千萬)，而另一個病例中缺乏到達(dá)外周靜脈的路徑，這兩位患者開始時被排除在研究之外。共有16位患者完成了方案。沒有報道主要的并發(fā)癥。診斷為難治性as的患者(n＝11)被轉(zhuǎn)移至本研究中(表3)?；颊叩脑陆?jīng)病史顯示兩例患者出現(xiàn)閉經(jīng)，9例發(fā)現(xiàn)月經(jīng)不足。as的原因是創(chuàng)傷性擴張和刮除術(shù)(d&c)(n＝9)、子宮肌瘤切除術(shù)(n＝1)和不明原因(n＝1)。先前嘗試的修復(fù)性手術(shù)性宮腔鏡檢查的平均數(shù)為2。盡管手術(shù)治療，但沒有患者報道子宮內(nèi)膜狀態(tài)的顯著改善。3位患者被分類為asiii級，4位患者被評分為ii級+ea，2位患者被分類為ii級，1位患者被分類為asi級(圖7a)。在細(xì)胞治療之前進(jìn)行高劑量hrt所實現(xiàn)的最大子宮內(nèi)膜厚度為4.3mm±0.74(范圍為2.7-5mm)(表3)。表3：子宮腔粘連綜合征患者的特征和結(jié)局注意：pt＝患者；mh＝月經(jīng)史；et＝子宮內(nèi)膜厚度；d&c＝擴張/刮除術(shù)；pof＝卵巢早衰；h/s＝宮腔鏡檢查；hm＝子宮肌瘤切除術(shù)；lm＝腹腔鏡肌瘤切除術(shù)；as＝子宮腔粘連綜合征(通過美國生育學(xué)會分類的子宮內(nèi)膜粘連分類，1998)；ea＝子宮內(nèi)膜萎縮；bp＝生化妊娠；ep＝異位妊娠；sp＝自然妊娠；art＝輔助生殖治療；lng＝左炔諾孕酮；hrt＝激素替代治療本研究中入選的患有ea和植入失敗的患者(n＝5)(表4)具有先前的閉經(jīng)(n＝3)或稀少(n＝2)的月經(jīng)史。病因是先前的d&c(n＝1)、不明原因(n＝1)、使用左炔諾孕酮iud(n＝1)、卵巢早衰(n＝1)和先前的子宮肌瘤切除術(shù)(n＝1)。先前嘗試的修復(fù)性手術(shù)性宮腔鏡檢查的平均次數(shù)為兩次。在所有情況下觀察到嚴(yán)重的子宮內(nèi)膜萎縮(圖7b)。在細(xì)胞治療之前以高劑量hrt達(dá)到的最大子宮內(nèi)膜厚度為4.2mm±0.8(范圍為2.7-5mm)(表4)。表4：子宮內(nèi)膜萎縮患者的特征和結(jié)果注意：pt＝患者；mh＝月經(jīng)史；et＝子宮內(nèi)膜厚度；d&c＝擴張/刮除術(shù)；pof＝卵巢早衰；h/s＝宮腔鏡檢查；hm＝子宮肌瘤切除術(shù)；lm＝腹腔鏡肌瘤切除術(shù)；as＝子宮腔粘連綜合征(根據(jù)美國生育學(xué)會分類的子宮內(nèi)膜粘連分類，1998)；ea＝子宮內(nèi)膜萎縮；bp＝生化妊娠；ep＝異位妊娠；sp＝自然妊娠；art＝輔助生殖治療；lng＝左炔諾孕酮；hrt＝激素替代治療干細(xì)胞治療后的子宮內(nèi)膜重建自體cd133+bmdsc治療后，所有伴隨hrt的16例患者恢復(fù)月經(jīng)周期，除了一例患有ea以外。然而，月經(jīng)的持續(xù)時間和強度(通過使用的墊的數(shù)量評估)從第一個月的平均5.06天(范圍3-7天)逐漸降低到細(xì)胞治療后第六個月的2.12天(范圍，1-3天)(補充圖1a)。月經(jīng)量也從平均2.68(范圍，1-5)墊/天降至第6個月的1.5(范圍，1-4)墊/天。在細(xì)胞治療后2、3和6個月進(jìn)行的子宮觀察顯示子宮內(nèi)膜和子宮腔的改善(表3和4；圖7)。具體地，診斷為iii期as的所有患者改善至i期，而ii期受影響的兩位患者中的一位顯示完全正常化的子宮內(nèi)膜腔，而另一位改善至i期。其余患者最初診斷為i期，其相對于合格分?jǐn)?shù)得到了改善，如表3中所示。所獲得的術(shù)后最大子宮內(nèi)膜厚度為6.7mm(范圍，3.1-12mm)(表3，圖7a)。在ea組中，在五位患者中的四位中觀察到細(xì)胞治療后的正常子宮內(nèi)膜(表4；圖7b)。細(xì)胞治療后獲得的最大子宮內(nèi)膜厚度為5.7mm(范圍，5-12mm)(表4)。通過在細(xì)胞治療之前以及在細(xì)胞治療之后3和6個月進(jìn)行的cd31和a-sma的共定位，在8位患者中評估了所形成的成熟血管的總數(shù)(圖8)。在治療3個月后(患者4、5、7、12和13)觀察到血管形成的遞增提高，而在其他患者中發(fā)現(xiàn)一致數(shù)量的成熟血管(患者6、9和10)(圖8h)。為了比較實驗起始點(稱為對照)和用cd133+細(xì)胞特異性治療后3個月的結(jié)果，檢查了數(shù)據(jù)的相應(yīng)平均值和sem。在治療三個月后，觀察到患者中總成熟血管(cd31+/a-sma+)的數(shù)量增多(p＝0.021)。這些結(jié)果表明在as和ea患者中自體注射cd133+細(xì)胞后的特征性新血管生成，其在6個月后逐漸降低(圖8i)。通過在自體cd133+bmdsc治療后希望懷孕的患者的生殖結(jié)果來評估重建的子宮內(nèi)膜的功能(表3和4)。兩個患者分別在細(xì)胞治療后兩個月和四個月自然妊娠，導(dǎo)致持續(xù)妊娠(患者15)，和由于膜的過早破裂(患者7)在第17周期間流產(chǎn)。在13次胚胎移植后獲得6個陽性妊娠，導(dǎo)致3次生化妊娠、由于在流產(chǎn)后評估為染色體異常胚胎而在第9周的一次流產(chǎn)、1次異位妊娠、以及1次持續(xù)妊娠(患者12)。在一個病例中，由于所有胚胎中的染色體異常而取消了胚胎轉(zhuǎn)移(患者8)，而在另一個案例中，由于細(xì)胞治療的失敗，未進(jìn)行轉(zhuǎn)移(患者14)。討論從組織學(xué)的角度來看，as對應(yīng)于以纖維組織替代子宮內(nèi)膜基質(zhì)來影響子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，并因此影響組織功能。腺通常由無活性的立方柱狀上皮細(xì)胞代替，其一般對激素刺激無應(yīng)答，并導(dǎo)致子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的完全消失，以影響子宮內(nèi)膜干細(xì)胞小環(huán)境，并因此影響組織功能。在發(fā)現(xiàn)as后的頭50至60年間，研究人員集中于病癥的流行、病因和病理狀況。隨著內(nèi)窺鏡檢查的出現(xiàn)，開發(fā)了用于診斷和治療病癥的新方法；然而，盡管技術(shù)進(jìn)步，目前仍有約50％的as病例沒有得到全面治愈。在這里，描述了特異性靶向子宮內(nèi)膜干細(xì)胞小環(huán)境的干細(xì)胞治療的第一實例。在穩(wěn)態(tài)條件下，循環(huán)epc(circulatingepc，cep)僅占循環(huán)中細(xì)胞的0.01％。因此，計劃在受影響的器官中進(jìn)行與直接輸注相結(jié)合的cep動員。在用g-csf動員后分離自體cd133+bmdsc，然后使用非侵入性放射學(xué)方法將其重新引入到患者子宮的螺旋小動脈中。cd133+bmdsc使血管生成再生并誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜增生，導(dǎo)致自體重建的子宮內(nèi)膜的創(chuàng)建。cd133+bmdsc最近在非血液學(xué)應(yīng)用中的再生醫(yī)學(xué)的臨床試驗中得到了探索。主要目標(biāo)是重建子宮內(nèi)膜，其首先通過恢復(fù)月經(jīng)來評估，這在我們的16例患者中出現(xiàn)了15例。雖然月經(jīng)的持續(xù)時間和強度在細(xì)胞治療后6個月逐漸下降，但干細(xì)胞治療會使子宮內(nèi)膜形態(tài)發(fā)生即時差異。子宮腔的宮腔鏡可視化檢查、通過陰道超聲測量的子宮內(nèi)膜厚度和通過免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)的新血管生成與子宮內(nèi)膜的有效、盡管短暫的重建是一致的。次要目標(biāo)是通過嘗試懷孕來測試重建的子宮內(nèi)膜的功能。幾個伴隨使用art的自然妊娠在細(xì)胞治療后得以實現(xiàn)，并且在本研究中觀察到的兩個流產(chǎn)與子宮內(nèi)膜功能無關(guān)。細(xì)胞植入是主要關(guān)注的問題，因為irb將不允許用超順磁性鐵氧化物納米顆粒(superparamagneticiron-oxidenanoparticle，spio)標(biāo)記cd133+bmdsc以追蹤被注射的細(xì)胞。相反，用于子宮腔粘連綜合征的鼠免疫缺陷實驗?zāi)Ｐ捅挥糜诖四康摹碜詤⑴c研究的患者的1百萬個cd133+bmdsc的等分試樣用于進(jìn)一步表征并測定lgr5+細(xì)胞和醛脫氫酶1(aldehydedehydrogenase1，aldh1)活性，產(chǎn)生75.72±8％lgr5+細(xì)胞和77.45±7.81％aldh1活性，分別鑒定了干細(xì)胞和祖細(xì)胞的狀態(tài)。將另1百萬個細(xì)胞等分試樣與50μg/mlmoldayion羅丹明b孵育18小時，產(chǎn)生在所有實驗中大于97％的標(biāo)記效率。然后，通過尾靜脈或子宮內(nèi)注射將spio標(biāo)記的細(xì)胞注射到子宮腔粘連綜合征的免疫缺陷小鼠模型中。細(xì)胞植入為通過使用普魯士藍(lán)染色鑒定細(xì)胞內(nèi)鐵沉積來檢測，揭示cd133+bmdsc主要圍繞創(chuàng)傷子宮內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜血管發(fā)生植入。先前的病例報道示出了以從骨髓經(jīng)自體干細(xì)胞分離cd9、cd40和cd90細(xì)胞并將它們置入子宮內(nèi)膜腔來治療as的陽性結(jié)果；而另一個病例報道描述了用針頭將非表征的單核干細(xì)胞直接置入子宮內(nèi)膜下區(qū)域。兩份病例報道在遞送的細(xì)胞類型和靶向的干細(xì)胞小環(huán)境方面不同。本研究表明cd133+bmdsc自體細(xì)胞治療可用于治療患有難治性as和ea并希望懷孕的患者。參考文獻(xiàn)1.chaj，vilellaf，deyskandsimónc.“molecularinterplayinsuccessfulimplantation”intencriticaltopicsinreproductivemedicine，s.sanders.science/aaas，washington，dc，2013，pp.44-48.2.cervelloi，gil-sanchisc，masa，delgado-rosasf，martmez-conejeroja，galana，martlnez-romeroa，martlnezs，navarroi，ferroj，horcajadasja，estebanfj，etal.humanendometrialsidepopulationcellsexhibitgenotypic，phenotypicandfunctionalfeaturesofsomaticstemcells.plosone2010；5：e10964.3.cervelloi，masa，gil-sanchisc，perisl，fausa，saunderspt，critchleyho，simonc.reconstructionofendometriumfromhumanendometrialsidepopulationcelllines.plosone2011；6：e21221.4.masudah，matsuzakiy，hiratsue，onom，nagashimat，etal.(2010)stemcell-likepropertiesoftheendometrialsidepopulation：implicationinendometrialregeneration.plosone.5(4)：e10387.5.pittengermf，mackayam，becksc，jaiswalrk，douglasr，etal.(1999)multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.science284(5411)：143-7.6.taylorhs.(2004)endometrialcellsderivedfromdonorstemcellsinbonemarrowtransplantrecipients.jama.292(1)：81-5.7.duh，taylorhs.(2007)contributionofbonemarrow-derivedstemcellstoendometriumandendometriosis.stemcells25(8)：2082-6.8.mintsm，janssonm，sadeghib，westgtenm，uzunelm，etal.(2008)endometrialendotheli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，除了本文中所示和所述的那些之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，并且落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)點和目的不一定包括在本發(fā)明的每個實施方案中。當(dāng)前第1頁12