相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2014年8月14日提交的美國臨時專利申請62/037,143的優(yōu)先權(quán)，該申請通過引用全部納入本文以用于所有目的。關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明不適用。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及線粒體-靶向陽離子型藥物，具體涉及線粒體-二甲雙胍化合物，和使用線粒體-二甲雙胍化合物治療癌癥的方法。
背景技術(shù)：
：二甲雙胍，來自山羊豆(galegaofficinalis)的雙胍，是用于fda批準(zhǔn)治療糖尿病的藥物，其抑制肝糖異生。二甲雙胍在生理ph下以親水性陽離子存在并且靶向線粒體，盡管是相當(dāng)?shù)托У?。二甲雙胍已經(jīng)在臨床中使用超過50年并且具有非常好的安全性概況(糖尿病患者每天容許2-3克的劑量)。然而，其抗腫瘤作用機(jī)制知之甚少，并且其分子靶標(biāo)仍不清楚。盛行的觀點(diǎn)是二甲雙胍的抗腫瘤和抗糖尿病效果是由于其螯合至線粒體中并激活“ampk/mtor途徑”的能力，該途徑參與調(diào)控細(xì)胞代謝、能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生長。先前改善并增強(qiáng)二甲雙胍的功效的嘗試已經(jīng)包括通過接合烷基或芳基增加其疏水性(丁二胍，苯乙雙胍)。然而，這些先前的努力導(dǎo)致明顯的不良副作用，并且還未成功。因此，存在對有效抑制腫瘤形成(即，降低癌癥癥狀的嚴(yán)重性或減緩其進(jìn)展)的化合物的需求，其在較低劑量下有增加的功效同時也減輕對化療和放療的耐受性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括選自下組的修飾的二甲雙胍化合物：線粒體(mito)-二甲雙胍、線粒體-苯乙雙胍、線粒體-peg-二甲雙胍、線粒體-cy-二甲雙胍或吡雙胍(pyrformin)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍(mito-met)化合物：n＝1-線粒體-二甲雙胍-c25-線粒體-二甲雙胍-c69-線粒體-二甲雙胍-c1011-線粒體-二甲雙胍-c12在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體12-二甲雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體10-二甲雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體6-二甲雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體2-二甲雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體-苯乙2雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：吡雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體-苯乙雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體-peg2-二甲雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括以下結(jié)構(gòu)的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體-cy-二甲雙胍。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明也包括抑制對象中腫瘤形成的方法，包括向該對象給予治療有效量的包含至少一種上述線粒體-二甲雙胍化合物的組合物。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含至少一種上述線粒體-二甲雙胍化合物、藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑、和說明材料的試劑盒。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含至少一種上述線粒體-二甲雙胍化合物、藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑、和說明材料的試劑盒。根據(jù)以下詳細(xì)說明、權(quán)利要求和圖片之后，本發(fā)明的其他特征將顯而易見。附圖說明圖1a-b。線粒體-二甲雙胍-c10和二甲雙胍(對照)對pdac增殖的影響。用線粒體-二甲雙胍-c10(a)或二甲雙胍(mm)(b)處理miapaca2細(xì)胞并且使用incucyte酶標(biāo)儀連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第0天-第6天)。細(xì)胞匯合(confluence)的變化用作細(xì)胞增殖的替代標(biāo)志物。值是平均±sd(n＝6)。圖2a-b。僅用放射或用二甲雙胍(met)類似物處理的pdac細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)。在電離輻射(0-6gy)前24小時用1mmmet(a)或1μm線粒體-二甲雙胍(b)處理miapaca2細(xì)胞并且確定克隆源性細(xì)胞存活。集落允許在培養(yǎng)基中在連續(xù)14天沒有處理下形成。值是平均±sd。*，在相同輻射條件下，與對照相比，p≤0.05(n＝3-6獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。圖3。人胰腺癌細(xì)胞對二甲雙胍的細(xì)胞攝入。使用lc-ms/ms對具有不同碳鏈長度的mito-met類似物和雙胍苯乙雙胍的細(xì)胞攝入進(jìn)行定量。值是平均±sd，n＝3。圖4。線粒體-二甲雙胍-處理的pdac細(xì)胞中的ampk活化。miapaca2(頂部)和鼠fc1199(底部)細(xì)胞中磷酸化(p)和總ampk的免疫印跡。細(xì)胞未刺激(對照)或用1μm線粒體-二甲雙胍(mm)、1mmmet、或1μg/ml寡霉素(oligo)作為陽性對照處理30分鐘。數(shù)據(jù)表示3個生物重復(fù)。圖5a-b。測量用二甲雙胍和線粒體-二甲雙胍(c10)處理24小時后miapaca2細(xì)胞中的集落形成的克隆源性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，二甲雙胍和線粒體-二甲雙胍(c10)確定的ic50值是1.3mm和1.1μm，表明mito-met-c10在抑制miapaca-2細(xì)胞增殖上比二甲雙胍有效接近1000倍。圖6。測量用二甲雙胍和線粒體-二甲雙胍c10、c6、c2和苯乙雙胍處理24小時后miapaca2細(xì)胞中的集落形成的克隆源性試驗(yàn)。圖7。線粒體-二甲雙胍-c6和二甲雙胍(對照)對pdac增殖的影響。用線粒體-二甲雙胍-c6(μm)或二甲雙胍(mm)處理miapaca2細(xì)胞并且使用incucyte酶標(biāo)儀連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第0天-第6天)。細(xì)胞匯合的變化用作細(xì)胞增殖的替代標(biāo)志物。值是平均±sd(n＝6)。圖8。苯乙雙胍-c6和二甲雙胍(對照)對pdac增殖的影響。用苯乙雙胍(μm)或二甲雙胍(mm)處理miapaca2細(xì)胞并且使用incucyte酶標(biāo)儀連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第0天-第6天)。細(xì)胞匯合的變化用作細(xì)胞增殖的替代標(biāo)志物。值是平均±sd(n＝6)。圖9。線粒體-二甲雙胍-c2和二甲雙胍(對照)對pdac增殖的影響。用線粒體-二甲雙胍-c2(μm)或二甲雙胍(mm)處理miapaca2細(xì)胞并且使用incucyte酶標(biāo)儀連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第0天-第6天)。細(xì)胞匯合的變化用作細(xì)胞增殖的替代標(biāo)志物。值是平均±sd(n＝6)。圖10a-d。二甲雙胍和線粒體-二甲雙胍對pdac增殖的影響。(a)二甲雙胍和類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(b)mito-met10和二甲雙胍對pdac增殖的影響。用mito-met10(0-1μm)或二甲雙胍(0-2,000mm)處理miapaca2細(xì)胞并且使用incucyte酶標(biāo)儀連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第0天-第6天)。細(xì)胞匯合的變化用作細(xì)胞增殖的替代標(biāo)志物。met(左)或mito-met10(右)對細(xì)胞匯合的劑量響應(yīng)。剛好在治療前，年齡匹配的細(xì)胞在20％或≤1％氧中三次傳代培養(yǎng)。(c)線粒體-二甲雙胍和二甲雙胍對miapaca-2細(xì)胞中集落形成的影響。用mito-met10(0.1-10μm)或二甲雙胍(1μm-10mm)處理miapaca-2細(xì)胞并且對形成的集落進(jìn)行計數(shù)。(d)用mito-met10(0.1-10μm)或二甲雙胍(1μm-10mm)滴定miapaca-2細(xì)胞，并且在上述相同條件下計算的存活分?jǐn)?shù)針對濃度作圖。實(shí)線表示用于確定細(xì)胞存活的ic50值的擬合曲線。(a)中的數(shù)據(jù)代表6個獨(dú)立研究。值是平均±sd(n＝6)。圖11a-b。mito-met10和二甲雙胍對pdac球狀生長的影響。(a)每天用各種濃度的mito-met10或met個新鮮培養(yǎng)基處理miapaca-2細(xì)胞3d球體。值是平均±sd(n＝4)。***＝p≤0.001。(b)在第3、7和14天用0.5μmmito-met10或10mm二甲雙胍處理的miapaca-2的代表性圖像。也顯示了沒有處理的pdac球體(載劑)。比例尺：100μm。圖12a-d。二甲雙胍和mito-met10對胰腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞增殖的影響：人胰腺癌細(xì)胞對二甲雙胍的細(xì)胞攝入。(a)在與圖10b相同的條件下mito-met10(頂部)和二甲雙胍(底部)對增殖的影響。用mito-met10或二甲雙胍處理miapaca-2、mcf-10a和hacat細(xì)胞并且使用incucyte連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束。(b)細(xì)胞匯合百分比(對照組達(dá)到90％匯合時)針對濃度作圖。虛線表示用于確定ic50值的擬合曲線。(c)用不同碳鏈長度的mito-met類似物(mito-met2、mito-met6和mito-met10)、二甲雙胍或苯乙雙胍處理miapaca-2細(xì)胞24小時并且對形成的集落進(jìn)行計數(shù)。計算的存活分?jǐn)?shù)針對濃度作圖。實(shí)線表示用于確定ic50值的擬合曲線。顯示的數(shù)據(jù)表示平均±sd(n＝6)。(d)使用lc-ms/ms對具有不同碳鏈長度的mito-met類似物(mito-met2，mito-met6，andmito-met10)和雙胍苯乙雙胍的細(xì)胞攝入進(jìn)行定量。數(shù)值為均值±sem；n＝3。圖13a-b。在miapaca-2細(xì)胞中處理后即刻和24小時后觀察到的met、mito-met和苯乙雙胍對線粒體生物能量學(xué)的影響。(a)在添加met、mito-met類似物(mito-met10、mito-met6、mito-met2)和苯乙雙胍后即刻測量的氧消耗速率(ocr)，和(b)與(a)相同條件下24小時后測量的ocr。圖14a-d。僅用輻射或用二甲雙胍(met)類似物處理的miapaca-2細(xì)胞或正常mcf-10a細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)和線粒體-二甲雙胍-處理的pdac細(xì)胞中的ampk活化。(a)在電離輻射(0-6gy)前24小時用1,000μmmet(左)或1μmmito-met10(中和右)處理細(xì)胞并確定克隆源性存活分?jǐn)?shù)。集落允許在培養(yǎng)基中在連續(xù)14天沒有處理下形成。值是平均±sd。*，與輻射劑量相比，對照相比，p≤0.05(n＝6獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。(b)miapaca-2(頂部)和鼠fc1199(底部)細(xì)胞中磷酸化(p)和總ampk的免疫印跡。細(xì)胞未刺激(對照)或用1μm線粒體-二甲雙胍(mm)、1mmmet、或1μg/ml寡霉素(oligo)作為陽性對照處理30分鐘。數(shù)據(jù)表示3個生物重復(fù)。(c)腫瘤和正常細(xì)胞中mito-met10的胞內(nèi)保留。(d)提出的模型顯示mito-met10如何通過降低的復(fù)合物i活性抑制pdac增殖。圖15a-g。mito-met和二甲雙胍抑制丙酮酸鹽/酯-驅(qū)動的，而非琥珀酸鹽/酯-驅(qū)動的呼吸，并且mito-met10強(qiáng)效抑制體內(nèi)腫瘤生長和進(jìn)展。(a)和(b)提供mas緩沖液中10mm丙酮酸鹽/酯和1.5mm蘋果酸鹽/酯的透化的miapaca-2細(xì)胞的代表性實(shí)驗(yàn)?？焖偌尤媵~藤酮、丙二酸鹽/酯或mito-met10、mito-met6、mito-met2、和二甲雙胍并且立即測量ocr。(c)在該試驗(yàn)之前用二甲雙胍或mito-met10預(yù)處理細(xì)胞24小時。(d)將線粒體復(fù)合物i氧消耗(琥珀酸鹽/酯注射前的最后ocr讀取)針對濃度作圖。虛線表示用于確定ic50值的擬合曲線。琥珀酸鹽/酯(10mm)和抗霉素a(20μm)都如所示那樣注射。顯示的數(shù)據(jù)為平均±sd，n＝4。(e)全血生物發(fā)光成像顯示相對于met(1mg/kg)處理的小鼠，在mito-met10(1mg/kg)處理的小鼠中腫瘤生長降低。(f)單個fc1242-luc自體移植物的總生物發(fā)光值(輻射發(fā)光單位，rlu)。虛線表示單個小鼠。實(shí)線是載劑(黑線)、met10(紅線)或mito-met(藍(lán)線)處理的動物的二次回歸擬合曲線。(g)使用卡鉗測量的切下的原發(fā)fc1242腫瘤的腫瘤體積。數(shù)據(jù)是值±sd。圖16a-d。(a)線粒體-二甲雙胍-c2的合成。0.1g部分的溴化(2-氨基乙基)三苯基膦(0.26mmol)溶解在ch2cl2(3ml)中并且混合物冷卻至0℃。逐滴加入336μl部分的二乙醚(0.33mmol)中的hcl的1.0m溶液。在室溫下90分鐘后，真空去除溶劑。加入buoh(3ml)中的二氰胺鈉(0.026g，0.31mmol)。混合物過夜加熱回流，之后蒸發(fā)溶劑并且通過hplc純化殘留物以得到線粒體-二甲雙胍21(0.030g，25％)。31pnmr，(600.13)：δ21.61.1hnmr，(600.13mhz)：δ7.93-7.73(15h，m)，3.80-3.76(2h，m)，3.38-3.34(2h，m).13cnmr(75.47mhz)λ158.3(s)，158.1(s)，135.1(s)，133.7(s)，133.6(s)，130.3(s)，131.2(s)，117.6(d，j＝85)，35.1(s)，20.6(d，j＝47).hrms針對c22h25n5p[c22h25n5p]+計算為390.1842，實(shí)際為390.1842。(b)線粒體-二甲雙胍-c6。0.1g部分的溴化(6-氨基己基)三苯基膦(0.23mmol)溶解在ch2cl2(3ml)中并且混合物冷卻至0℃。逐滴加入453μl部分的二乙醚(0.45mmol)中的hcl的1.0m溶液。在室溫下90分鐘后，真空去除溶劑。加入buoh(3ml)中的二氰胺鈉(0.028g，0.33mmol)?；旌衔镞^夜加熱回流，之后蒸發(fā)溶劑并且通過hplc純化殘留物以得到線粒體-二甲雙胍6(0.020g，17％)。31pnmr，(600.13)：δ24.6.1hnmr，(600.13mhz)：δ7.93-7.88(3h，m)，7.81-7.77(12h，m)，3.60-3.46(2h，m)，3.05-3.00(2h，m)，1.55-1.48(2h，m)，1.48-1.42(2h，m)，1.41-1.35(2h，m)，1.31-1.24(2h，m).13cnmr(75.47mhz)δ158.2(s)，157.9(s)，134.9(s)，133.6(s)，133.5(s)，130.3(s)，130.2(s)，118.2(d，j＝86)，40.0(s)，30.0(s)，29.5(s)，25.9(s)，22.2(d，j＝3)，20.5(d，j＝49).hrms針對c26h33n5p[c26h33n5p]+計算為446.2468，實(shí)際為446.2467。(c)線粒體-二甲雙胍-c10。0.2g部分的溴化(10-氨基癸基)三苯基膦2(0.4mmol)溶解在ch2cl2(3ml)中并且混合物冷卻至0℃。逐滴加入500μl部分的二乙醚(0.5mmol)中的hcl的1.0m溶液。在室溫下1小時后，真空去除溶劑并且加入buoh(2ml)中的雙氰胺(0.034g，0.4mmol)?；旌衔镞^夜加熱回流，之后蒸發(fā)溶劑并且通過hplc純化殘留物以得到線粒體-二甲雙胍103(0.060g，30％)。31pnmr，(400.13)：δ23.77.1hnmr，(400.13mhz)：δ7.91-7.73(15h，m)，3.42-3.33(2h，m)，3.25-3.20(2h，m)，1.69-1.51(6h，m)，1.40-1.21(10h，m).hrms針對c30h41n5p[c30h41n5p]+計算為502.3094，實(shí)際為502.3094。圖17a-c。mito-met10、二甲雙胍和其他mta對miapaca-2細(xì)胞中胞內(nèi)atp水平和細(xì)胞死亡的影響。miapaca2細(xì)胞如所示那樣處理。(a)在24小時后胞內(nèi)atp水平針對濃度作圖。(b，c)通過sytoxgreen染色實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞死亡并且實(shí)時細(xì)胞死亡曲線被作圖。顯示的數(shù)據(jù)為平均±sd，n＝4。圖18a-b。線粒體-二甲雙胍-c2和二甲雙胍(對照)對pdac增殖的影響。(a)用線粒體-二甲雙胍-c2(μm)或二甲雙胍(mm)處理miapaca2細(xì)胞并且使用incucyte酶標(biāo)儀連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第0天-第6天)。細(xì)胞匯合的變化用作細(xì)胞增殖的替代標(biāo)志物。值是平均±sd(n＝6)。(b)線粒體-二甲雙胍-c6和二甲雙胍(對照)對pdac增殖的影響。用線粒體-二甲雙胍-c6(μm)或二甲雙胍(mm)處理miapaca2細(xì)胞并且使用incucyte酶標(biāo)儀連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第0天-第6天)。細(xì)胞匯合的變化用作細(xì)胞增殖的替代標(biāo)志物。值是平均±sd(n＝6)。圖19。fc1242-luc原位移植小鼠模型中mito-met的體內(nèi)組織累積。每天用mito-met10(1mg/kg)處理fc1242-luc原位移植小鼠持續(xù)2周。在最后處理后3天進(jìn)行組織收獲和提取。在標(biāo)準(zhǔn)化至組織濕重后mito-met濃度的定量數(shù)據(jù)表示為平均±sd，n＝5。圖20a-c。mito-met和二甲雙胍抑制丙酮酸鹽/酯-驅(qū)動的，而不是琥珀酸鹽/酯-驅(qū)動的呼吸。提供mas緩沖液中10mm丙酮酸鹽/酯和1.5mm蘋果酸鹽/酯的透化的miapaca-2細(xì)胞的代表性實(shí)驗(yàn)。mito-met10(a)或二甲雙胍(b)驟然加入并且立即測量ocr。(c)來自a和b的線粒體復(fù)合物i氧消耗(琥珀酸鹽/酯注射前的最后ocr讀取)針對濃度作圖。虛線表示用于確定ic50值的擬合曲線。琥珀酸鹽/酯(10mm)和抗霉素a(20μm)都如所示那樣注射。顯示的數(shù)據(jù)為平均±sd，n＝4。圖21。mito-met和二甲雙胍，但不是對照化合物(h-tpp+)抑制丙酮酸鹽/酯-驅(qū)動的呼吸。在復(fù)合物i活性試驗(yàn)之前，二甲雙胍、mito-met10或?qū)φ栈衔?h-tpp+)預(yù)處理24小時(與圖15d相同的實(shí)驗(yàn)條件)。線粒體復(fù)合物i氧消耗(琥珀酸鹽/酯注射前的最后ocr讀取)針對濃度作圖。虛線表示用于確定ic50值的擬合曲線。顯示的數(shù)據(jù)為平均±sd，n＝4。圖22。二甲雙胍和mito-met10對小鼠胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。在與圖10b相同的條件下mito-met10(左)和二甲雙胍(右)對增殖的影響。用mito-met10或二甲雙胍處理小鼠胰腺癌細(xì)胞fc1242并且使用incucyte連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞生長直至各實(shí)驗(yàn)結(jié)束。(底部)細(xì)胞匯合百分比(對照組達(dá)到90％匯合時)針對濃度作圖。虛線表示用于確定ic50值的擬合曲線。顯示的數(shù)據(jù)表示平均±sd(n＝4)。圖23a-b。mito-met和二甲雙胍抑制n27細(xì)胞中丙酮酸鹽/酯-驅(qū)動的，而不是琥珀酸鹽/酯-驅(qū)動的呼吸。(a)提供mas緩沖液中10mm丙酮酸鹽/酯和1.5mm蘋果酸鹽/酯的透化的n27細(xì)胞的代表性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)條件與圖15a-g中所示的相同。(b)在該試驗(yàn)之前用二甲雙胍或mito-met10預(yù)處理24小時。線粒體復(fù)合物i氧消耗(琥珀酸鹽/酯注射前的最后ocr讀取)針對濃度作圖。虛線表示用于確定ic50值的擬合曲線。顯示的數(shù)據(jù)為平均±sd，n＝4。發(fā)明詳述綜述。描述本發(fā)明材料和方法之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述具體方法、方案、材料和試劑，這些可發(fā)生變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅是描述具體實(shí)施方式，不應(yīng)用來限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。必須注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文另有明確說明。同樣，術(shù)語“一個”(或“一種”)、“一個或多個”和“至少一個”在本文中可互換使用。還應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語“包括”、“包含”、和“具有”可以互換使用。除非另外定義，否則，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。雖然可采用與本文所述類似或等同的任何方法和材料實(shí)施或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。本文具體提及的所有出版物和專利都通過引用全文納入本文用于所有目的，包括描述和公開在出版物中報道的可與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞系、載體、動物、工具、統(tǒng)計分析和方法。本說明書引用的所有參考文獻(xiàn)都應(yīng)看作對本領(lǐng)域技術(shù)水平的指示。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能憑借在先發(fā)明而先于這些公開內(nèi)容。本發(fā)明。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾以選擇性并協(xié)同性抑制癌癥增殖和進(jìn)展的新線粒體-二甲雙胍(mito-met)化合物。具體地，發(fā)明人已經(jīng)顯示，與常規(guī)處理相比，將帶正電基團(tuán)接合至二甲雙胍在非常低的劑量上極大地增強(qiáng)了化合物的抗腫瘤功效。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包含經(jīng)修飾以包括烷基陽離子部分的二甲雙胍。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包含選自苯乙雙胍、peg、cy-二甲雙胍或吡雙胍的二甲雙胍化合物。具體地，發(fā)明人已經(jīng)顯示線粒體-靶向的二甲雙胍類似物(mito-met)在抑制胰腺癌細(xì)胞增殖上比二甲雙胍更強(qiáng)效。二甲雙胍(met)是fda-批準(zhǔn)的抗糖尿病藥物，其目前正被賦予有前景的抗腫瘤藥物的新用途。met靶向線粒體時，雖然不是非常有效，我們推測通過接合帶正電親脂取代基增加其線粒體靶向潛力將產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗腫瘤潛力的更強(qiáng)效mito-met。為此，合成并表征偶聯(lián)至變化的烷基鏈長度的含有三苯基膦陽離子(tpp+)的mito-met類似物。結(jié)果顯示，通過10-碳脂肪側(cè)鏈將tpp+接合至met合成的mito-met類似物(例如，mito-met10)在抑制胰腺導(dǎo)管腺瘤細(xì)胞(pdac)增殖上比met有效接近1000倍。mito-met10在抑制miapaca-2細(xì)胞中的線粒體復(fù)合物i-介導(dǎo)的氧消耗上比met有效2000倍(mito-met10的ic50≈0.43μm并且met的ic50≈1,088μm)。mito-met10(1mg/kg)在消除體內(nèi)腫瘤生長上比met明顯更強(qiáng)效。結(jié)果也顯示用比met低1000倍濃度的mito-met預(yù)處理pdac增強(qiáng)輻射敏化，如克隆源性試驗(yàn)所測量。增強(qiáng)的met的線粒體靶向與增強(qiáng)的輻射敏化功效的組合可在治療胰腺癌上更有益，胰腺癌是侵略性人類癌癥，對于改善存活的化療和放療選項(xiàng)有限。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物如下：n＝1-線粒體-二甲雙胍-c25-線粒體-二甲雙胍-c69-線粒體-二甲雙胍-c1011-線粒體-二甲雙胍-c12在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體12-二甲雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體10-二甲雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體6-二甲雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體2-二甲雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：吡雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體-cy-二甲雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體-peg2-二甲雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體-苯乙雙胍。在一個具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包括以下結(jié)構(gòu)：線粒體-苯乙2雙胍。合成方法。通過在100-180℃下將相應(yīng)的溴化氨基烷基三苯基膦與雙氰胺反應(yīng)來制備本發(fā)明的mito-met化合物。隨后，產(chǎn)物通過快速色譜或在hplc上純化。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物包含糖酵解、谷氨酰胺、和/或線粒體代謝抑制物的組合，其與標(biāo)準(zhǔn)治療一起治療癌癥。使用方法。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療對象中癌癥的方法，包括向該對象給予治療有效量的包含至少一種本發(fā)明的mito-met化合物的組合物。在一個實(shí)施方式中，該組合物包含本發(fā)明的mito-met化合物，但在替代實(shí)施方式中，可給予多種本發(fā)明的mito-met化合物。使用中，本發(fā)明的mito-met化合物對于癌細(xì)胞比非癌細(xì)胞更有細(xì)胞毒性。發(fā)明人已經(jīng)證明本發(fā)明的線粒體-二甲雙胍化合物通過選擇性抑制腫瘤而非正常細(xì)胞強(qiáng)效抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。另外，本發(fā)明的mito-met化合物在比使用二甲雙胍的常規(guī)治療所需的劑量低得多的劑量下更有效。具體地，本發(fā)明的mito-met化合物在抑制胰腺癌細(xì)胞增殖上比二甲雙胍有效接近1000倍(圖5)。另外，本發(fā)明的mito-met化合物在比二甲雙胍低1000倍的濃度下協(xié)同增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞殺傷(圖2)。在一個實(shí)施方式中，mito-met10(圖10a)在抑制pdac增殖上比met有效接近1000倍，并且在消除pdac腫瘤生長上比met有效至少100倍。在其他實(shí)施方式中，mito-met10在抑制miapaca-2細(xì)胞中的線粒體復(fù)合物i-介導(dǎo)的氧消耗上比met有效2000倍(mito-met10的ic50≈0.43μm并且met的ic50≈1,088μm)。mito-met10(1mg/kg)在消除體內(nèi)腫瘤生長上比met明顯更強(qiáng)效。我們顯示mito-met10產(chǎn)生與met(1mm)相同程度的放射敏感性增強(qiáng)，但在低1000倍的濃度(1μm)下。這證明相對無毒的線粒體-靶向的二甲雙胍類似物單獨(dú)或與放療組合可消除胰腺癌細(xì)胞增殖。另外，本發(fā)明的mito-met化合物比苯乙雙胍有效至少20倍(圖6)。本發(fā)明還提供治療性組合物，其包含至少一種本發(fā)明的mito-met化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑或運(yùn)載體。該治療性組合物可優(yōu)選在生理上可接受的ph下溶于水性溶液中。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物提供治療癌癥的有效方法。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物強(qiáng)效抑制腫瘤形成。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物可與電離輻射組合以抑制腫瘤細(xì)胞形成。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的mito-met化合物在與常規(guī)治療方案組合時可增加常規(guī)癌癥治療的效果。“腫瘤”表示組織的任何異常增殖，包括實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤。例如，本發(fā)明的組合物和方法可用于治療癌癥，其表現(xiàn)為實(shí)體瘤如胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、皮膚癌等。本發(fā)明的組合物和方法也可用于治療非實(shí)體瘤癌癥，如非霍奇金淋巴瘤、白血病等?！皩ο蟆北硎静溉閯游锖头遣溉閯游??！安溉閯游铩敝傅氖侨我獾牟溉閯游锞V成員，包括但不限于人類、非人靈長類，例如大猩猩和其他猿類和猴類；農(nóng)場動物，例如牛、馬、山羊、綿羊和豬；家養(yǎng)動物，例如兔、狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動物，包含嚙齒動物，例如大鼠、小鼠和豚鼠；等等。非哺乳動物的示例包括但不限于鳥、魚等。術(shù)語“對象”不表示特定年齡或性別?！爸委煛北硎咎幱趯辜膊?、病癥或紊亂的目的管理和護(hù)理對象。所述術(shù)語包括預(yù)防性治療(即預(yù)防)和緩解性治療。治療包括給予本發(fā)明的化合物以防止、減輕和/或改善所述癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作、緩解所述癥狀或并發(fā)癥、或消除所述疾病、病癥、或紊亂?！皽p輕”、“緩解”、“改善”等表示可檢測的改善或符合對象中或至少少數(shù)對象中出現(xiàn)的改善的可檢測變化，例如，至少約2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、100％或這些值中任意兩個之間的范圍。與不用本發(fā)明的mito-met化合物治療的對象相比，治療的對象中可觀察到這種改善或變化，其中未治療的對象具有相同或相似疾病、病癥、癥狀等，或者是發(fā)展相同或相似疾病、病癥、癥狀等的對象?？芍饔^或客觀確定疾病、病癥、癥狀或試驗(yàn)參數(shù)的緩解，例如，對象自我評價，通過臨床醫(yī)師評價或通過進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)或測量，包括，例如，生物質(zhì)量評價，疾病或病癥的緩慢進(jìn)展，疾病或病癥的降低的嚴(yán)重性，或生物分子、細(xì)胞的活性或水平的合適試驗(yàn)，或通過檢測對象內(nèi)的細(xì)胞遷移。緩解可以是暫時的、延長的或永久的，或者其可在本發(fā)明的mito-met化合物給予對象或用于本文或參考文獻(xiàn)所述的其他方法或試驗(yàn)中期間或之后的相關(guān)時間上可變，例如，在給予或使用本發(fā)明的mito-met化合物的約1小時內(nèi)至對象已接受本發(fā)明的mito-met化合物后的約3、6、9個月或更久?！罢{(diào)節(jié)”，例如，癥狀，分子的生物活性或水平，病原體復(fù)制、細(xì)胞響應(yīng)、細(xì)胞活性等表示可檢測地增加或降低細(xì)胞水平或活性。與不用本發(fā)明的mito-met化合物治療的對象相比，治療的對象中可觀察到這種增加或減少，其中未治療的對象具有相同或相似疾病、病癥、癥狀等，或者是發(fā)展相同或相似疾病、病癥、癥狀等的對象。這種增加或減少可以是至少約2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、1000％或更多或約這些值中任意兩個之間的任意范圍內(nèi)。可主觀或客觀確定調(diào)節(jié)，例如，通過對象自我評價，通過臨床醫(yī)師的評價或通過進(jìn)行適當(dāng)試驗(yàn)或測量，包括，例如，生活質(zhì)量評價或針對分子、細(xì)胞的活性或水平或?qū)ο髢?nèi)細(xì)胞遷移的合適試驗(yàn)。調(diào)節(jié)可以是暫時的、延長的或永久的，或者其可在本發(fā)明的mito-met化合物給予對象或用于本文或參考文獻(xiàn)所述的其他方法或試驗(yàn)中期間或之后的相關(guān)時間上可變，例如，在給予或使用本發(fā)明的mito-met化合物的約1小時內(nèi)至對象已接受本發(fā)明的mito-met化合物后的約3、6、9個月或更久?！敖o予”表示向體內(nèi)導(dǎo)入本發(fā)明的mito-met化合物的任何手段，優(yōu)選導(dǎo)入全身循環(huán)。示例包括但不限于口服、口頰、舌下、經(jīng)肺、透皮、經(jīng)粘膜，以及皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、和肌內(nèi)注射?！爸委熡行Я俊北硎驹谒鑴┝亢统掷m(xù)所需時間有效實(shí)現(xiàn)所需治療結(jié)果(如減少或逆轉(zhuǎn)癌癥中的血管形成，或減少或抑制自身免疫疾病中的t-細(xì)胞)的量。在一個實(shí)施方式中，治療有效量的范圍是約5-50mg/kg。本發(fā)明的mito-met化合物的治療有效量可根據(jù)以下因素變化，如疾病狀態(tài)、年齡、性別、和對象體重，以及mito-met化合物在對象中引發(fā)所需響應(yīng)的能力?？烧{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療響應(yīng)。治療有效量也是其中本發(fā)明的mito-met化合物的治療有益效應(yīng)勝過任何毒性或有害效應(yīng)的量?！邦A(yù)防有效量”是指在所需劑量并持續(xù)所需時間有效實(shí)現(xiàn)所需預(yù)防結(jié)果，如防止或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移率的量?？扇缟鲜鲠槍χ委熡行Я克龃_定預(yù)防有效量。一般而言，由于預(yù)防劑量在疾病的早期或之前用于對象，預(yù)防有效量將小于治療有效量。試劑盒。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含藥物組合物和說明材料的試劑盒，該藥物組合物包含本發(fā)明的mito-met化合物?！罢f明材料”表示發(fā)表物、記錄、圖表、或任何其他表達(dá)媒介，其用于向人傳遞針對本文所述目的之一的本發(fā)明藥物組合物的實(shí)用性。說明材料也能描述例如本發(fā)明藥物組合物的合適的劑量。例如，可將試劑盒的指導(dǎo)材料粘附至含有本發(fā)明的藥物組合物的容器中，或與含有藥物組合物的容器一起運(yùn)輸?；蛘?，所述說明材料能與本發(fā)明的容器分開運(yùn)送，從而所述說明材料和所述藥物組合物能由接收者配合使用。實(shí)施例當(dāng)然，提供以下實(shí)施例僅用于說明目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，根據(jù)前述說明和后述實(shí)施例，本發(fā)明所示和描述以外的各種變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，所述變化也包括在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1.吡雙胍化合物的合成按照以下反應(yīng)合成本發(fā)明的吡雙胍化合物：方案試劑和條件：i，etoh，回流；ii，二氰胺鈉，純，180℃。實(shí)施例2.線粒體-cy-二甲雙胍化合物的合成。按照以下反應(yīng)合成本發(fā)明的線粒體-cy-二甲雙胍化合物：線粒體-cy-二甲雙胍方案試劑和條件：i，pph3，acn，回流；ii，nh2-nh2，etoh，回流；iii，hcl，二氰胺鈉，純，180℃。實(shí)施例3.線粒體-peg-二甲雙胍化合物的合成。按照以下反應(yīng)合成本發(fā)明的線粒體-peg-二甲雙胍化合物：線粒體-peg2-二甲雙胍(n＝1)線粒體-peg3-二甲雙胍(n＝2)方案試劑和條件：i，pbr3；ii，鄰苯二甲酰亞胺鉀，dmf；iii，pph3，acn，回流；iv，nh2-nh2，etoh，回流；v，hcl，二氰胺鈉，純，180℃。實(shí)施例4.線粒體-苯乙雙胍化合物的合成。按照以下反應(yīng)合成本發(fā)明的線粒體-苯乙雙胍化合物：線粒體-苯乙雙胍(n＝1)線粒體-苯乙2雙胍(n＝2)試劑和條件：i，鄰苯二甲酰亞胺鉀，dmf；ii，pph3，acn，回流；iii，nh2-nh2，etoh，回流；iv，hcl，二氰胺鈉，純，180℃。實(shí)施例5.線粒體-二甲雙胍化合物的合成。按照以下反應(yīng)合成本發(fā)明的線粒體-二甲雙胍化合物：線粒體2-二甲雙胍(n＝1)線粒體6-二甲雙胍(n＝5)線粒體10-二甲雙胍(n＝10)線粒體12-二甲雙胍(n＝11)方案試劑和條件：i，pph3，can，回流；ii，nh2-nh2，etoh，回流；iii，hcl，二氰胺鈉，純，180℃。實(shí)施例6：線粒體2-二甲雙胍1的合成線粒體2-二甲雙胍10.1g部分的溴化(2-氨基乙基)三苯基膦(0.26mmol)溶解在ch2cl2(3ml)中并且混合物冷卻至0℃。逐滴加入336μl部分的二乙醚(0.33mmol)中的hcl的1.0m溶液。在室溫下1小時30分鐘后，真空去除溶劑。加入buoh(3ml)中的二氰胺鈉(0.026g，0.31mmol)?；旌衔镞^夜加熱回流，之后蒸發(fā)溶劑并且通過hplc純化殘留物以得到線粒體2-二甲雙胍1(0.030g，25％)。31pnmr，(600.13)：δ21.61.1hnmr，(600.13mhz)：δ7.93-7.73(15h，m)，3.80-3.76(2h，m)，3.38-3.34(2h，m).13cnmr(75.47mhz)λ158.3(s)，158.1(s)，135.1(s)，133.7(s)，133.6(s)，130.3(s)，131.2(s)，117.6(d，j＝85)，35.1(s)，20.6(d，j＝47).hrms針對c22h25n5p[c22h25n5p]+計算為390.1842，實(shí)際為390.1842。實(shí)施例7.線粒體6-二甲雙胍4的合成：溴化(6-苯鄰二甲酰亞胺基)三苯基膦2。含有乙腈(60ml)中溴鄰苯二甲酰亞胺(5g，0.016mol)和三苯基膦(4.2g，0.019mol)的混合物回流15小時。減壓蒸餾溶劑。通過在硅膠(ch2cl2/etoh80：20)上的快速色譜純化粗產(chǎn)物得到白色固體2(5.7g，62％)。31pnmr，(400.13)：δ24.38.1hnmr，(400.13mhz)：δ7.90-7.66(15h，m)，3.90-3.75(2h，m)，3.65-3.55(2h，m)，1.72-1.55(6h，m)，1.40-1.28(2h，m).13cnmr(75.47mhz)δ168.1(s)，134.84(s)，134.80(s)，133.7(s)，133.4(s)，133.3(s)，131.7(s)，130.4(s)，130.2(s)，122.8(s)，118.5(s)，118.4(s)，37.4(s)，29.2(d，j＝16.5)，26.0(s)，22.2(d，j＝4.4)，18.2(s).溴化(6-氨基己基)三苯基膦3。向etoh(70ml)中2(5.2g，0.009mol)的溶液添加10ml的thf中的1m肼。混合物回流18小時。通過在硅膠(ch2cl2/etoh80：20)上的快速色譜純化產(chǎn)物得到黃色固體3(3g，75％)。31pnmr，(400.13)：δ23.73.1hnmr，(400.13mhz)：δ7.90-7.66(15h，m)，3.46-3.39(2h，m)，2.91(2h，t，j＝7.5)，1.72-1.55(6h，m)，1.40-1.28(2h，m).13cnmr(75.47mhz)δ136.4(s)，136.3(s)，134.9(s)，134.8(s)，133.0(s)，131.7(s)，131.6(s)，130.9(s)，127.0(s)，120.4(s)，119.6(s)，40.8(s)，31.2(d，j＝16.1)，29.0(s)，26.9(s)，23.5(d，j＝4.4)，23.0(s)，22.5(s).線粒體6-二甲雙胍40.1g部分的溴化(6-氨基己基)三苯基膦(0.23mmol)溶解在ch2cl2(3ml)中并且混合物冷卻至0℃。逐滴加入453μl部分的二乙醚(0.45mmol)中的hcl的1.0m溶液。在室溫下1小時30分鐘后，真空去除溶劑。加入buoh(3ml)中的二氰胺鈉(0.028g，0.33mmol)?；旌衔镞^夜加熱回流，之后蒸發(fā)溶劑并且通過hplc純化殘留物以得到線粒體6-二甲雙胍4(0.020g，17％)。31pnmr，(600.13)：δ24.6.1hnmr，(600.13mhz)：δ7.93-7.88(3h，m)，7.81-7.77(12h，m)，3.60-3.46(2h，m)，3.05-3.00(2h，m)，1.55-1.48(2h，m)，1.48-1.42(2h，m)，1.41-1.35(2h，m)，1.31-1.24(2h，m).13cnmr(75.47mhz)δ158.2(s)，157.9(s)，134.9(s)，133.6(s)，133.5(s)，130.3(s)，130.2(s)，118.2(d，j＝86)，40.0(s)，30.0(s)，29.5(s)，25.9(s)，22.2(d，j＝3)，20.5(d，j＝49).hrms針對c26h33n5p[c26h33n5p]+計算為446.2468，實(shí)際為446.2467。實(shí)施例8.線粒體10-二甲雙胍7的合成：溴化(10-苯鄰二甲酰亞胺基)三苯基膦5。含有乙腈(60ml)中溴鄰苯二甲酰亞胺(7g，0.019mol)和三苯基膦(5g，0.019mol)的混合物回流15小時。減壓蒸餾溶劑。通過在硅膠(ch2cl2/etoh80：20)上的快速色譜純化粗產(chǎn)物得到白色固體5(9g，73％)。ms針對[c36h39no2p]+，br-；[c36h39no2p]+計算為548.3，實(shí)際為548.3。溴化(10-氨基癸基)三苯基膦6。向etoh(70ml)中5(7g，0.0108mol)的溶液添加肼(0.54ml，0.0108mol)?；旌衔锘亓?5小時。蒸餾溶劑并且使用混合物et2o/etoh(100ml+45ml)使雜質(zhì)結(jié)晶。通過在硅膠(ch2cl2/etoh80：20)上的快速色譜純化產(chǎn)物得到黃色固體6(4g，73％)。31pnmr(121.49mhz)δ24.61.1hnmr(300.13mhz)δ7.95-7.73(15h，m)，3.70-3.55(2h，m)，2.80-2.70(2h，m)，1.60-1.40(6h，m)，1.35-1.10(10h，m).ms針對[c28h37np]+，br-；[c28h37np]+計算為418.2，實(shí)際為418.2。線粒體10-二甲雙胍7。0.2g部分的溴化(10-氨基癸基)三苯基膦2(0.4mmol)溶解在ch2cl2(3ml)中并且混合物冷卻至0℃。逐滴加入500μl部分的二乙醚(0.5mmol)中的hcl的1.0m溶液。在室溫下1小時后，真空去除溶劑并且加入buoh(2ml)中的雙氰胺(0.034g，0.4mmol)。混合物過夜加熱回流，之后蒸發(fā)溶劑并且通過hplc純化殘留物以得到線粒體10-二甲雙胍3(0.060g，30％)。31pnmr，(400.13)：δ23.77.1hnmr，(400.13mhz)：δ7.91-7.73(15h，m)，3.42-3.33(2h，m)，3.25-3.20(2h，m)，1.69-1.51(6h，m)，1.40-1.21(10h，m).hrms針對c30h41n5p[c30h41n5p]+計算為502.3094，實(shí)際為502.3094。實(shí)施例9.線粒體-二甲雙胍(mito-met)是腫瘤形成的強(qiáng)效抑制物。在該實(shí)施例中，發(fā)明人顯示本發(fā)明的mito-met化合物的抗增殖效力。采用incucytetm活細(xì)胞成像分析儀(埃森生物科學(xué)公司(essenbioscience))使用無標(biāo)記物的非侵入性細(xì)胞匯合試驗(yàn)來測量細(xì)胞增殖。該系統(tǒng)基于高分辨相襯圖像的劃分提供實(shí)時細(xì)胞匯合數(shù)據(jù)。miapaca2(1,000個細(xì)胞/孔)過夜接種在96孔板上，置于保持在37℃下的xl-3孵育箱中，并且每2小時通過incucyte軟件對細(xì)胞進(jìn)行成像并計算匯合。用met(1和2mm)或mito-met-c10(1-2μm)處理miapaca2細(xì)胞。顯示了由記錄的細(xì)胞匯合動力學(xué)和代表性相襯圖像測量的細(xì)胞增殖曲線(圖1)。本發(fā)明的其他mito-met化合物也是有效的(參見圖6、7和9)。實(shí)施例10.mito-met抑制腫瘤形成。在該實(shí)施例中，發(fā)明人已經(jīng)顯示用一定濃度范圍的本發(fā)明的mito-met化合物處理的miapaca2細(xì)胞的生長被有效抑制(圖1-3)。初步數(shù)據(jù)顯示，一種通過接合含tpp+部分的十碳側(cè)鏈形成的met的合成衍生物mito-met-c10強(qiáng)效抑制pdac增殖和線粒體呼吸。顯示了本發(fā)明的mito-met化合物對能量代謝腫瘤細(xì)胞增殖和遷移、以及體外腫瘤生長和代謝的影響。實(shí)施例11.mito-met化合物的細(xì)胞攝入增加。在該實(shí)施例中，發(fā)明人顯示miapaca2細(xì)胞中通過lc-ms測量的各種mito-met化合物的相對胞內(nèi)攝入。隨著碳-碳側(cè)鏈增加，mito-met細(xì)胞攝入顯著增加。具體地，mito-met-c10攝入是苯乙雙胍(一種met類似物)的接近100倍(圖3)。另外，來自兩個獨(dú)立細(xì)胞生長試驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明的mito-met化合物在抑制pdac細(xì)胞增殖比僅二甲雙胍有效接近1000倍。實(shí)施例12.mito-met化合物的增加的功效。在該實(shí)施例中，發(fā)明人顯示本發(fā)明的mito-met化合物在增強(qiáng)pdac輻射敏感性上比僅二甲雙胍更強(qiáng)效。miapaca2細(xì)胞(1000個細(xì)胞/孔)在96孔板中一式四份過夜培養(yǎng)，并改到新鮮培養(yǎng)基中。對照細(xì)胞和用1mm二甲雙胍處理24小時的細(xì)胞都經(jīng)受增加劑量的x-輻射。在使用克隆源性試驗(yàn)測量時(圖2)，二甲雙胍預(yù)處理增加了輻射敏化，在輻射后miapaca2細(xì)胞生長降低。實(shí)施例13.癌細(xì)胞中增加的ampk活化。在該實(shí)施例中，發(fā)明人已經(jīng)顯示本發(fā)明的mito-met化合物在癌細(xì)胞中導(dǎo)致增加的ampk活化。在初步實(shí)驗(yàn)中(圖4)，用1μmmito-met(mm)、1mmmet、或寡霉素陽性對照處理30分鐘的人miapaca2和鼠fc1199pdac細(xì)胞裂解，并且在sds-page上尺寸分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到pvdf，并且用針對磷酸化ampkthr-172的抗體探測。活性蛋白質(zhì)的水平測量為活性磷酸化蛋白質(zhì)相對于總蛋白質(zhì)的比率，顯示出mito-met化合物在比僅二甲雙胍低1000倍的濃度下在人和鼠pdac細(xì)胞中都誘發(fā)活性ampk的1.5-2.5倍增加。實(shí)施例14.有效抑制物。二甲雙胍(met)，一種天然產(chǎn)生的化合物山羊豆堿的合成類似物，是fda-批準(zhǔn)的抗糖尿病藥物，其抑制肝糖異生并且在具有胰腺癌的糖尿病患者中顯示抗癌效果。met在生理ph下以親水性陽離子(圖10a)存在并且弱靶向線粒體。流行的觀點(diǎn)是met通過使細(xì)胞amp/atp比率提高并活化5-amp-活化的激酶(ampk)/mtor途徑和/或通過降低循環(huán)胰島素水平(和血糖水平)來發(fā)揮抗腫瘤效果。met也抑制線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈中的復(fù)合物i，導(dǎo)致抑制腫瘤線粒體呼吸。更近期，顯示二甲雙胍通過抑制線粒體甘油磷酸脫氫酶來阻遏糖異生(gluroneogenesis)。有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(oct)負(fù)責(zé)將met攝入腫瘤細(xì)胞，而其他親脂met類似物(例如，苯乙雙胍)通過其他機(jī)制被攝入細(xì)胞。苯乙雙胍顯示在抑制胰腺腫瘤細(xì)胞增殖上比met更強(qiáng)效。苯乙雙胍的顯著缺陷在于，由于在抗糖尿病治療中報道的增加的酸中毒發(fā)生率，其退出美國市場。然而，最近的研究推薦其他臨床研究將苯乙雙胍重新賦予強(qiáng)效抗腫瘤藥物的用途。之前的報道表明，線粒體靶向的陽離子型試劑在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)抗增殖和細(xì)胞毒性效果，而沒有明顯影響正常細(xì)胞。例如，通過脂肪側(cè)鏈將氮氧化物、醌、色滿醇(chromanol)或維生素e偶聯(lián)至三苯基膦(tpp+)基團(tuán)增加了其在腫瘤細(xì)胞中的抗增殖效果。與正常細(xì)胞相比對腫瘤細(xì)胞的選擇性毒性歸因于腫瘤細(xì)胞線粒體中增強(qiáng)的含tpp+化合物的攝入和停留。met已經(jīng)在臨床中使用超過50年并且具有非常好的安全性概況(糖尿病患者每天容許2-3克的劑量)。改善并增強(qiáng)met功效的努力包括通過接合烷基或芳基來修飾結(jié)構(gòu)(例如，丁二胍，苯乙雙胍)(圖10a)。我們現(xiàn)在顯示通過接合帶正電的親脂取代基改善對met的線粒體靶向?qū)a(chǎn)生具有顯著增加的抗腫瘤潛力的新線粒體靶向藥物類別。為此，我們合成并表征與含有tpp+部分的烷基取代基偶聯(lián)的幾種met類似物(例如，mito-met2，mito-met4，mito-met10)(圖16a-d)，并且本發(fā)明的結(jié)果顯示mito-met類似物(例如，mito-met10)(圖10a)在抑制pdac增殖上比met有效接近1000倍，并且在消除pdac腫瘤生長上有效至少100倍。報道表明met(1mm)預(yù)處理后的輻射增加了輻射敏化，導(dǎo)致增強(qiáng)的癌細(xì)胞殺傷。在該實(shí)施例中，我們顯示mito-met10產(chǎn)生與met(1mm)相同程度的放射敏感性增強(qiáng)，但在低1000倍的濃度(1μm)下。該研究的顯著性是證明相對無毒的線粒體-靶向的二甲雙胍類似物單獨(dú)或與放療組合可消除胰腺癌細(xì)胞增殖。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)。miapaca-2和mcf-10a細(xì)胞系獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國弗吉尼亞州瑪納薩斯(manassas，va，usa))，它們在那里經(jīng)定期驗(yàn)證。hacat和n27細(xì)胞系儲存在液氮中并在凍融后6個月內(nèi)使用。fc-1242細(xì)胞系衍生自c57bl/6(b6)kpc轉(zhuǎn)基因小鼠，其自發(fā)發(fā)展胰腺腫瘤。這些細(xì)胞系經(jīng)工程改造以表達(dá)熒光素酶(kpc-1242-luc)，其使得能夠進(jìn)行腫瘤生長監(jiān)測。之前報道了細(xì)胞培養(yǎng)的詳細(xì)內(nèi)容。完整和透化細(xì)胞中的呼吸酶活性。使用seahorsexf96胞外通量分析儀(海馬生物科學(xué)公司(seahorsebioscience)，美國馬薩諸塞州比爾里卡(northbillerica，ma，usa))測量完整和透化胰腺癌細(xì)胞中的線粒體功能。除非另有說明，如之前所述進(jìn)行完整細(xì)胞中的試驗(yàn)。按照生產(chǎn)商的說明(海馬生物科學(xué)公司)在透化的細(xì)胞中進(jìn)行對線粒體呼吸復(fù)合物的測量。簡言之，在剛好通過xf96的氧消耗率(ocr)測量之前使用1nm質(zhì)膜透化劑(pmp，海馬生物科學(xué)公司)來透化完整細(xì)胞。通過向線粒體提供不同底物來測量衍生自線粒體復(fù)合物i或復(fù)合物ii活性的氧消耗，例如，針對復(fù)合物1是丙酮酸鹽/酯/蘋果酸鹽/酯，并且針對復(fù)合物ii活性是琥珀酸鹽/酯。魚藤酮、丙二酸鹽/酯和抗霉素a被分別用作線粒體復(fù)合物i、ii和iii活性的特定抑制物?？寺≡葱栽囼?yàn)。細(xì)胞如所述接種在6孔板中并用mito-met10或二甲雙胍處理24小時。板保持在孵育器中并且每3-4天更換培養(yǎng)基直至對照細(xì)胞形成足夠大的克隆。如前所述計算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。incucyte分析儀-實(shí)時測量細(xì)胞增殖。通過incucyte活細(xì)胞成像系統(tǒng)(埃森生物科學(xué)公司，美國密歇根州安娜堡(annarbor，mi，usa)；incucyteflr)使用無標(biāo)記非侵入性細(xì)胞匯合試驗(yàn)來測量細(xì)胞增殖。該系統(tǒng)使得能夠在幾天內(nèi)在2小時間隔上收集活細(xì)胞圖像。incucyte分析儀基于高分辨相襯圖像的劃分提供實(shí)時細(xì)胞匯合數(shù)據(jù)。細(xì)胞增殖表示為細(xì)胞匯合百分比增加。pdac的三維球狀細(xì)胞培養(yǎng)。miapaca-2細(xì)胞(5000)接種在含有用作支架的基質(zhì)膠(康寧公司(corning))的96孔板中。這種典型的3d-細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)使得球體在基質(zhì)內(nèi)形成。板在含5％co2的潮濕氣氛中在37℃下孵育，并且培養(yǎng)基每兩天用不同濃度處理(0-1000μmmitomet10或0-10,000μm二甲雙胍)替換。在第3、7和14天，通過亮場顯微術(shù)觀察孔，并且在nikoneclipseti倒置顯微鏡(美國紐約州的尼康儀器公司(nikoninstrumentinc.，ny，usa))上獲取圖像。使用nikonnis元素成像軟件(尼康)對球體形成細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。數(shù)據(jù)表示為球體數(shù)量的平均和sd。細(xì)胞毒性試驗(yàn)。為了確定mito-met類似物和與長鏈脂肪烴偶聯(lián)的其他tpp+的細(xì)胞毒性，我們?nèi)缜八鍪褂胹ytox試驗(yàn)。miapaca-2細(xì)胞處理24小時，并且在200nmsytoxgreen(英杰公司)存在下監(jiān)測死細(xì)胞。sytox方法標(biāo)記死細(xì)胞的核產(chǎn)生綠色熒光。用裝配設(shè)為37℃和5％co2：95％空氣的氣氛控制器的酶標(biāo)儀(bmg實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司)使用485nm(激發(fā))和535nm(發(fā)射)的熒光檢測在4小時后每15分鐘實(shí)時獲取96孔板中死細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。為了測量總細(xì)胞數(shù)，在sytoxgreen存在下，通過添加曲通x100(0.065％)對各處理組中的所有樣品進(jìn)行透化3小時，并且最大熒光強(qiáng)度取為100％。在標(biāo)準(zhǔn)化至各組的總細(xì)胞數(shù)之后，數(shù)據(jù)表示為死細(xì)胞百分比。免疫印跡。miapaca-2pdac細(xì)胞(1x106)在60mm盤中接種至80％匯合，然后血清饑餓5小時。在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行用二甲雙胍或mito-met10的刺激。用寡霉素刺激細(xì)胞作為陽性對照。在刺激后，細(xì)胞在冷pbs中洗滌2次并且使用改性的ripa緩沖液裂解。裂解物針對蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化，使用還原sds-page進(jìn)行尺寸分離，電轉(zhuǎn)至pvdf膜(密理博公司(millipore))并且然后使用一抗和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗探測。針對總或磷酸化5′amp-活化的蛋白激酶(ampk)的抗體購自細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(cellsignalingtechnology)(馬薩諸塞州丹佛(danvers，ma))并且按照生產(chǎn)商推薦的稀釋使用。蛋白質(zhì)通過用自曝光的化學(xué)發(fā)光可視化并且通過使用來自細(xì)胞生物科學(xué)公司(加利福尼亞州圣克拉拉(santaclara，ca))的fluorchemhd2的密度計量分析定量。通過lc-ms/ms對胞內(nèi)mito-met類似物的定量。細(xì)胞在10cm盤上生長并且在完全培養(yǎng)基中用化合物處理24小時。從細(xì)胞中提取mito-met類似物的方案與之前針對使用二氯甲烷∶甲醇(2∶1)混合物的mito-維生素e所述相同，但不添加丁基羥基甲苯(bht)，一種親脂鏈-斷裂抗氧化劑。使用由含0.1％甲酸的水：乙腈混合物(4∶1)平衡的kinetexphenyl-hexyl柱(50mm×2.1mm，1.7μm，菲羅門公司(phenomenex))進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析。通過在4分鐘內(nèi)將乙腈含量從20％增加至100％來洗脫化合物，并使用mrm模塊檢測。輻射實(shí)驗(yàn)。以5×105接種在6-cm盤的miapaca-2和mcf-10a細(xì)胞用mito-met10或二甲雙胍處理24小時。然后用0、2、4和6gy的x-輻射處理細(xì)胞。在合適的情況下用相同濃度的載劑(0.1％dmso)處理對照細(xì)胞。放射后，細(xì)胞懸浮并以各種密度(100-8,000個細(xì)胞/孔)接種到6孔板中用于如上所述的克隆源性試驗(yàn)。板保持在孵育器內(nèi)并且每3-4天更換培養(yǎng)基持續(xù)2周。選擇具有10-50個足夠大的克隆的孔來計算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。體內(nèi)研究和生物發(fā)光成像。使用原位同源移植模型來評價用二甲雙胍或線粒體-二甲雙胍-c10處理后的轉(zhuǎn)移尋靶和腫瘤進(jìn)展。用異氟烷麻醉6-8周齡的c57bl/6小鼠并且接種1x106個表達(dá)熒光素酶的fc1242細(xì)胞。為了生成表達(dá)熒光素酶的fc1242細(xì)胞，螢火蟲熒光素酶基因被克隆到哺乳動物表達(dá)載體pcdna3.1/使用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(生命技術(shù)公司(lifetechnologies))轉(zhuǎn)染hygro(-)細(xì)胞。通過在補(bǔ)充500ug/ml潮霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行有限稀釋克隆來生成穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞系。擴(kuò)增名為fc1242-luc的穩(wěn)定克隆以生成凍存母液。細(xì)胞用met(1000μm)或mito-met10(0.5μm)預(yù)處理48小時，然后原位移植到胰腺，如之前定義針對人胰腺癌細(xì)胞。從植入當(dāng)天開始，每天用通過腹膜內(nèi)注射給予的200μl體積的1mg/kgmet或mito-met10處理小鼠。在第1、7和13天使用生物發(fā)光成像(luminaivis100，加利福尼亞州阿拉米達(dá)的帕金埃爾默公司(perkinelmer，alameda，ca))來監(jiān)測腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在13天后，處死小鼠，并且使用卡鉗測量原發(fā)腫瘤生長。使用生物發(fā)光成像離體評價向肝、腸系膜淋巴結(jié)、脾和肺的轉(zhuǎn)移。統(tǒng)計學(xué)分析。所有統(tǒng)計學(xué)分析使用graphpadprism4(加利福尼亞州圣迭戈(sandiego，ca))進(jìn)行。使用斯氏t-檢驗(yàn)來計算配對分析。使用單項(xiàng)anova和圖基事后(tukeypost-hoc)分析來分析多重比較以鑒定不同實(shí)驗(yàn)組之間的配對差異。統(tǒng)計學(xué)顯著性定義為p≤0.05。結(jié)果-不同側(cè)鏈長度的線粒體-靶向的二甲雙胍類似物的合成和表征。通過nmr和hr-ms分析來合成和表征線粒體-二甲雙胍類似物(圖16a-d)。通過在180℃下用氨基烷基膦衍生物的相應(yīng)鹽酸鹽與純二氰胺反應(yīng)來獲得mito-met(n＝2，6，10，和12)。通過反相制備型-hplc來純化mito-met。試劑和條件是：i)pph3，acn，回流；ii)nh2-nh2，etoh，回流；iii)et2o中1mhcl，二氰胺鈉，純，180℃(圖16d)。mito-met抑制pdac細(xì)胞和pdac球體生長比met更強(qiáng)效。采用incucytetm活細(xì)胞成像分析儀使用無標(biāo)記物的非侵入性細(xì)胞匯合試驗(yàn)來測量細(xì)胞增殖。用met(100-2,000μm)或mito-met10(0.1-1μm)處理miapaca-2細(xì)胞。由記錄的細(xì)胞匯合動力學(xué)和代表性相襯圖像測量的細(xì)胞增殖曲線(圖10b)。對照細(xì)胞在5-6天內(nèi)達(dá)到100％匯合。mito-met10處理(0.2和1μm)分別抑制細(xì)胞生長70％和超過90％(圖10b)。相反，二甲雙胍在高1000倍的濃度(1,000μm)下抑制細(xì)胞生長80％(圖10b)。在20％和1％氧中觀察到相似趨勢(圖10b)。我們也監(jiān)測相似條件下用met或mito-met10處理24小時后在miapaca-2細(xì)胞中的集落形成。用所示濃度范圍處理miapaca-2細(xì)胞(圖10c)，并且對形成的集落數(shù)量進(jìn)行計數(shù)。在用3μm的mito-met10和3mm的met處理的細(xì)胞中幾乎沒有檢測到集落形成(圖10c)。存活分?jǐn)?shù)分析(圖10d)顯示met和mito-met10確定的ic50值分別是1.3mm和1.1μm。因此，來自兩個獨(dú)立細(xì)胞生長試驗(yàn)的結(jié)果顯示，mito-met10在抑制miapaca-2細(xì)胞增殖上比met有效接近1000倍。通過sytoxgreen染色檢測細(xì)胞死亡誘導(dǎo)，如之前所示。miapaca-2細(xì)胞用mito-met10(100μm)、mito-cp(100μm)、或met(30mm)和其他對照處理24小時并且實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞死亡。如圖17所示，甚至在高10到100倍濃度(100μm)的用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的mito-met10存在下沒有可檢測的細(xì)胞死亡(圖10b)。然而，其他線粒體-靶向抗增殖劑(包括，例如，且不限于，mito-cp、mito-q、mito-cp-ac、mito-4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶(tempol)、和mito-色滿醇)在這些條件下明顯更有毒性。在這些條件下測量的胞內(nèi)atp水平(圖17b)。我們測試了mito-met和met在多細(xì)胞球體模型中的抗增殖效果(圖11a)。miapaca-2細(xì)胞在基質(zhì)膠中培養(yǎng)14天并用mito-met10和met處理。如圖11b所示，與met(10,000μm)相比，mito-met(0.5μm)強(qiáng)效抑制ppac球體生長。2d和3d細(xì)胞生長試驗(yàn)都表明mito-met在抑制pdac增殖上比met有效接近1000至10000倍。mito-met類似物在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的效果：微調(diào)烷基側(cè)鏈長度和效力。我們比較了其他mito-met類似物(mito-met2，和mito-met6)與mito-met10、苯乙雙胍、和二甲雙胍在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的相對抗增殖效力。圖12a顯示mito-met10和二甲雙胍在miapaca-2和非惡性對照細(xì)胞，mcf-10a，和hacat中的實(shí)時細(xì)胞匯合數(shù)據(jù)。與miapaca-2或fc1242胰腺癌細(xì)胞相反，非惡性乳腺上皮細(xì)胞(mcf-10a)或角質(zhì)形成細(xì)胞(hacat)并沒有響應(yīng)mito-met10和二甲雙胍治療而受到顯著影響(圖12a，頂部和底部軌跡)。與正常細(xì)胞(hacat和n27)相比，mito-met10和二甲雙胍在miapaca-2細(xì)胞中更強(qiáng)效抑制細(xì)胞匯合(圖12b)。圖12c顯示了mito-met類似物(mito-met2、mito-met6、和mito-met10、苯乙雙胍、和二甲雙胍)在抑制miapaca-2細(xì)胞存活上的相對效力。mito-met10的ic50值是0.84μm并且二甲雙胍的ic50值是1.1mm(圖12b)。接著，我們研究了不同mito-met類似物(mito-met2、mito-met6、和mito-met10)和苯乙雙胍在miapaca-2細(xì)胞中的相對攝入(圖12d)。用相應(yīng)mito-met類似物(1μm)處理細(xì)胞1小時。細(xì)胞在洗滌后裂解并且通過lc-ms分析mito-met類似物。如圖12d所示，隨著碳-碳側(cè)鏈長度增加，mito-met細(xì)胞攝入顯著增加。如圖12d所示，mito-met10攝入比苯乙雙胍高接近100倍。在這些處理?xiàng)l件下，二甲雙胍攝入明顯低于苯乙雙胍。met和mito-met類似物對miapaca-2細(xì)胞中線粒體生物能量的影響。使用seahorsebiosciencexf96胞外通量分析儀，氧消耗率(ocr)和胞外酸化率(ecar)測量為線粒體功能和糖酵解的讀數(shù)。我們比較了響應(yīng)不同濃度的met、mito-met2、mito-met6、mito-met10、和苯乙雙胍的中間ocr變化(例如，由克隆源性試驗(yàn)確定的ic50或更高值)(圖13a)。二甲雙胍在較高濃度(≈1-10mm)下劑量依賴性地降低氧消耗。相反，親脂苯乙雙胍在低10倍的濃度下相同程度地(與met相同)抑制ocr(圖13a)。在亞微摩爾濃度下最強(qiáng)效抑制增殖的mito-met10在1μm濃度下不抑制ocr，雖然在較高濃度(≈10μm)mito-met10下處理miapaca-2細(xì)胞時有輕微抑制。用mito-met6和mito-met2觀察到類似結(jié)果(圖13a)。接著，我們監(jiān)測用met、mito-met類似物和苯乙雙胍處理24小時，之后洗去處理并回到新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基后的miapaca-2細(xì)胞中的線粒體ocr變化。與圖13a中所示結(jié)果相反，在用這些試劑處理24小時后的細(xì)胞中觀察到ocr的明顯降低(圖13b)。在24小時處理后，mito-met10(1μm)而非二甲雙胍和甲基-tpp+最強(qiáng)效抑制ocr(未顯示)。在這些條件下(圖13b)，ecar保持幾乎不變，雖然在ecar中響應(yīng)這些試劑有初始的增加，盡管是輕微的(未顯示)。這些結(jié)果證明ocr抑制依賴于鏈長度并且mito-met10在1μm濃度下抑制ocr與mito-met2在25μm下的抑制相當(dāng)(圖13b)。mito-met類似物抑制ocr的程度隨著烷基接頭的長度增加而增加(mito-met10＞mitomet6＞mito-met2)。mito-met和met對pdac輻射敏感性的影響。在x-放射之前，對照細(xì)胞和細(xì)胞都用1mmmet或mito-met(1μm)預(yù)處理24小時。通過克隆源性試驗(yàn)來測量細(xì)胞存活。如圖14a所示，met預(yù)處理增加了輻射敏化，miapaca-2細(xì)胞生長在放射后減少。這些結(jié)果驗(yàn)證了之前報道的用met和放射增強(qiáng)pdac細(xì)胞殺傷的發(fā)現(xiàn)。結(jié)果顯示1μmmito-met在誘導(dǎo)pdac輻射敏感性上與1mmmet一樣有效(圖14a)，而在用mito-met10預(yù)處理的正常細(xì)胞(mcf-10a)中沒有觀察到輻射敏感性(圖14a)。lc-ms數(shù)據(jù)顯示miapaca-2和mcf-10a細(xì)胞中mito-met的胞內(nèi)攝入和停留存在4倍差異(圖14c)。mito-met和met-處理的pdac細(xì)胞中的ampk活化。已經(jīng)報道了線粒體-靶向的陽離子藥物活化生物能量應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們研究了mito-met10和met活化ampk-mtor能量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的相對能力。用mito-met10(1μm)或met(1mm)處理30分鐘的人miapaca-2和鼠fc199pdac細(xì)胞經(jīng)裂解、在sds-page上蛋白質(zhì)尺寸分離，轉(zhuǎn)移至pvdf，并用針對磷酸化的ampk蘇氨酸-172的抗體探測。測量為活性磷酸化蛋白質(zhì)相對于總蛋白質(zhì)的比率的活性蛋白質(zhì)的水平顯示，mito-met10在比met低接近1000倍的濃度下在人和鼠pdac細(xì)胞中都誘發(fā)活性ampk的1.5-2.5倍增加(圖14b)。mito-met類似物和二甲雙胍對復(fù)合物i活性的影響。使用在補(bǔ)充丙酮酸的mas緩沖液中透化的miapaca-2細(xì)胞測量氧消耗率。使用透化的細(xì)胞避免了化合物細(xì)胞攝入上的差異。圖15a顯示了在對照透化的細(xì)胞和在魚藤酮或丙二酸鹽/酯處理的細(xì)胞中的ocr變化。魚藤酮(復(fù)合物i抑制物)極大地消除了ocr，其由添加的琥珀酸鹽/酯恢復(fù)。然而，在丙二酸鹽/酯(復(fù)合物ii抑制物)存在下，添加琥珀酸鹽/酯并不刺激ocr(圖15a)?？姑顾豠降低了琥珀酸鹽/酯-誘導(dǎo)ocr。這些研究建立了透化的miapaca-2細(xì)胞在生物能量功能試驗(yàn)中的用途。接著，我們使用該模型來探測二甲雙胍和線粒體-二甲雙胍類似物。mito-met10在比met低得多的濃度下抑制ocr(10μm對比3000μm)(圖15b和圖20a-c)。met和mito-met10的ic50值分別確定為792和2μm(圖20c)。我們測試了使用透化的模型用mito-met10或met預(yù)處理細(xì)胞的效果。miapaca-2細(xì)胞用met和mito-met10處理24小時并且在透化后在這些細(xì)胞中進(jìn)行氧消耗研究。與圖15b中所示的結(jié)果相反，在用對于抑制復(fù)合物i低得多的濃度(0.75μm)下的mito-met10處理24小時后在透化的細(xì)胞中觀察到ocr的顯著減少(圖15c-d)。在透化的細(xì)胞模型中確定的met和mito-met10的ic50值分別是1.1mm和0.4μm。mito-met10增加的抑制復(fù)合物i活性的效力與mito-met10相比met增強(qiáng)超過1000倍的抗增殖效果相一致。mito-met抑制體內(nèi)kpc自體抑制物的腫瘤生長。體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示線粒體-二甲雙胍在臨床前小鼠模型中強(qiáng)效停止腫瘤生長(圖15e-g)。在初步概念證明實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)螢火蟲熒光素酶(fc1242-luc)的同源kpc細(xì)胞被原位植入c57bl/6小鼠的胰腺并且使用生物發(fā)光成像來監(jiān)測腫瘤生長(圖15f)。用fc1242-luc細(xì)胞原位自體移植的小鼠每天用1mg/kg或150mg/kgmet、或1mg/kgmito-met處理。與細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)相一致，mito-met在消除pdac生長上比met明顯更有效(圖10b)并且在實(shí)驗(yàn)完成時導(dǎo)致明顯更小的原發(fā)腫瘤(圖6e-f)。收集來自這些動物的血清，并且分別使用標(biāo)準(zhǔn)ast、alt、ap、和bun試驗(yàn)來測試肝和腎毒性。如從細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)預(yù)測的那樣(圖10a-d)，met或線粒體-靶向類似物mito-met都沒有引發(fā)體內(nèi)毒性(表1)。表1.毒性。肝肝腎ast[iu/l]alt[iu/l]bun[mg/kg]對照85±1517±222±3met[1mg/kg]189±11735±1530±7mito-met[1mg/kg]89±1626±1027±4met[150mg/kg]127±2419±322±2在fc1242-luc原位小鼠中給予mito-met10持續(xù)2周后，我們檢測到這種化合物在肝、腎、脾和腫瘤中增加的積累(圖19)?？傮w來說，來自這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明mito-met的治療指數(shù)比met大接近1000倍，具有可忽略的脫靶毒性。討論。人胰腺導(dǎo)管腺癌(pdac)是胰腺癌的最嚴(yán)重和最有侵襲性的形式，其改善存活的化療和放療選項(xiàng)有限。目前的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理化療提供有有限的存活益處。對在胰腺癌中減輕治療耐受性機(jī)制并最大化多峰治療方法的新治療方法存在嚴(yán)重未滿足的需求。在該研究中，我們已經(jīng)開發(fā)了新的線粒體-靶向的二甲雙胍類似物，其單獨(dú)或與放療組合與二甲雙胍相比顯著抑制pdac增殖。這些線粒體-靶向的二甲雙胍類似物可在pdac治療中有顯著的臨床和轉(zhuǎn)化潛力。線粒體-二甲雙胍在胰腺癌細(xì)胞中的抗增殖效果。電子移位親脂性陽離子(dlc)通過在線粒體內(nèi)積累和抑制線粒體呼吸來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。已經(jīng)顯示腫瘤線粒體膜電勢遠(yuǎn)高于正常(非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞(內(nèi)部更負(fù))。我們之前報道了連接到烷基鏈的陽離子化合物優(yōu)先在腫瘤線粒體中積累，取決于烷基側(cè)鏈長度。與芳族和雜環(huán)偶聯(lián)的tpp+-連接的試劑(mito-色滿醇，mito-cp)也在各種腫瘤細(xì)胞中顯示出選擇性細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞毒性效果。該研究的目的是將親水性陽離子型二甲雙胍修飾成親脂性二甲陽離子類似物。二甲雙胍通過改變細(xì)胞生物能量而自身不經(jīng)過任何可檢測到的代謝來發(fā)揮生物活性。癌細(xì)胞線粒體生物能量的選擇性靶向是新興的化療策略。雖然幾種二甲雙胍的親脂性變體經(jīng)合成并顯示發(fā)揮增加的抗腫瘤效力，這些修飾都沒有增強(qiáng)線粒體靶向陽離子功能。在該研究中，我們首次顯示并表征通過接合連接至不同烷基鏈長度的tpp+基團(tuán)對二甲雙胍的微調(diào)是合成上可行的，并且這些修飾的二甲雙胍愈加靶向腫瘤線粒體。與增強(qiáng)的胞內(nèi)攝入相一致，線粒體-二甲雙胍類似物抑制胰腺腫瘤細(xì)胞增殖的能力比二甲雙胍更強(qiáng)效。mito-met類似物的抗增殖功效隨著烷基接頭的長度增加而增加(mito-met10＞mito-met8＞mito-met2)(圖12c和18a-b)。腫瘤細(xì)胞中mito-met類似物的選擇性抗增殖效果的主要原因是由于與非轉(zhuǎn)化(正常)細(xì)胞相比，其在腫瘤細(xì)胞中優(yōu)先積累。提出的pdac中增強(qiáng)的抗增殖和輻射敏化效果的機(jī)制?，F(xiàn)在，導(dǎo)致mito-met在癌細(xì)胞中增強(qiáng)的抗增殖和輻射敏化效果的機(jī)制還未知。線粒體-靶向的二甲雙胍類似物可能通過靶向能量傳感生物能量途徑在pdac中發(fā)揮抗增殖作用。在miapaca-2細(xì)胞中，mito-met10活化amp-活化的蛋白激酶(ampk)比二甲雙胍強(qiáng)效接近1000倍(圖14a-c)。ampk，一種細(xì)胞能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)物，一般由增強(qiáng)的胞內(nèi)amp活化。在其中胞內(nèi)atp水平降低伴隨著amp同時增加的條件下(增強(qiáng)的amp-至-atp比率)，ampk通過其蘇氨酸-172殘基的磷酸化活化。之前的研究已經(jīng)顯示ampk通過抑制akt/foxo3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)阻遏forkheadboxm1(foxm1)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，導(dǎo)致阻遏宮頸癌細(xì)胞生長。因此，設(shè)想mito-met10和相關(guān)類似物作用于akt/foxo3/foxm1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。線粒體-靶向的二甲雙胍類似物的增強(qiáng)的輻射敏感性可歸因于由mito-met誘導(dǎo)的增加的腫瘤氧化(即，減少缺氧)。腫瘤缺氧(po2＜10mmhg)，包括胰腺癌的多種實(shí)體瘤的固有性質(zhì)，來自氧輸送和氧消耗之間的失衡。研究表明用藥物降低氧消耗是增加腫瘤氧化并進(jìn)而增加輻射敏感性的更有效途徑。最近的報道表明二甲雙胍(1-10mm)改善了腫瘤氧化并增強(qiáng)腫瘤輻射敏感性。本發(fā)明的結(jié)果顯示在24小時后mito-met10降低miapaca-2細(xì)胞中的線粒體呼吸(圖13b)。mito-met10在微摩爾水平抑制腫瘤呼吸，而二甲雙胍在毫摩爾水平以相似程度抑制呼吸。mito-met10可能在比二甲雙胍低1000倍的濃度下刺激腫瘤氧化。mito-met10降低線粒體呼吸的合理機(jī)制是由于mito-met10在線粒體中增強(qiáng)的積累，導(dǎo)致對線粒體電子傳遞鏈中復(fù)合物i的增強(qiáng)的抑制。在輻射和mito-met10類似物存在下，可能有2種或更多種機(jī)制運(yùn)作。ampk-活化藥物增強(qiáng)腫瘤輻射敏感性。輻射本身活化ampk能量傳感通路。然而，對ampk誘導(dǎo)腫瘤氧化和輻射敏感性的程度仍然知之甚少。最近，報道了雖然二甲雙胍抑制雷帕霉素(mtor)途徑的哺乳動物靶標(biāo)和膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞生長，但發(fā)現(xiàn)效果與ampk無關(guān)。另外，相同的研究表明ampk可潛在發(fā)揮腫瘤生長支持物的功能。二甲雙胍-修飾的mtor抑制和膠質(zhì)瘤增殖的阻遏歸因于增強(qiáng)的pras40與raptor的結(jié)合。顯而易見，met和mito-met的抗增殖作用機(jī)制可能并不簡單地與ampk活化和其他機(jī)制(即，也應(yīng)該考慮pras40/raptor結(jié)合的活化)相關(guān)。pdacs的增強(qiáng)的輻射敏化。二甲雙胍對比線粒體-二甲雙胍。如之前所報道，我們發(fā)現(xiàn)用met預(yù)處理增加了輻射敏化并降低miapaca-2細(xì)胞增殖(圖21、22和23a-b)。本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明mito-met在刺激pdac輻射敏感性上比met更有效(圖14a-d)。流行的觀點(diǎn)表明met的抗增殖效果由ampk途徑的活化和/或改善的腫瘤氧化(即，減少缺氧)介導(dǎo)，由于抑制線粒體，導(dǎo)致在經(jīng)輻射的腫瘤中降低的腫瘤細(xì)胞呼吸。腫瘤缺氧(po2＜10mmhg)由氧輸送和氧消耗之間的失衡導(dǎo)致。研究表明用降低氧消耗是增加腫瘤氧化并進(jìn)而增加輻射敏感性的更有效途徑。ampk-活化藥物已經(jīng)顯示增強(qiáng)腫瘤放射敏感性。mito-met在比二甲雙胍低1000倍的濃度下抑制線粒體呼吸并活化ampk(圖14b)。顯而易見，這是令人激動的發(fā)現(xiàn)，其具有明顯的臨床轉(zhuǎn)化潛力并且需要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分光光度研究的其他機(jī)制研究。更近期，顯示在二甲雙胍的常規(guī)抗糖尿病劑量下，在晚期胰腺癌患者中沒有明顯的治療效果。研究者表示更強(qiáng)效的雙胍應(yīng)用于癌癥的代謝治療，由于通常在用二甲雙胍治療的糖尿病癌癥患者中檢測到的大大降低的血漿濃度。mito-met10顯示出比二甲雙胍高1000倍的效力，因此在癌癥患者中實(shí)現(xiàn)治療有效的血漿濃度。當(dāng)前第1頁12