本發(fā)明包括在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，并且涉及穩(wěn)定性較高的、可注射的褪黑素組合物。本發(fā)明還涉及將所述組合物用作藥品并且涉及其在各種病癥，比如敗血癥的治療中的用途。
背景技術(shù)：
：褪黑素(N-乙?；?5-甲氧基色胺)是由松果腺(松果體)通過生理作用產(chǎn)生的內(nèi)源性神經(jīng)激素。其分泌速率遵循與亮-暗周期有關(guān)聯(lián)的晝夜節(jié)律，并且其在誘導(dǎo)睡眠中起到基本作用。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)褪黑素在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中起到基本作用，因?yàn)槠溆米魅缦缕陂g產(chǎn)生的氧自由基的有效清除劑：例如，在敗血癥和全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的后續(xù)發(fā)展以及后續(xù)的多器官功能障礙綜合征(MODS，也稱為多器官功能衰竭)期間；在心肌梗塞期間；在線粒體損傷中；在腹部手術(shù)過程中；在肺水腫中；和在腎或肝衰竭中。已知除了其它功能以外，激活抗氧化酶途徑(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶)(Reiteretal.1995.JPinealRes18:1-11)能調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)(etal.2011.CurrTopMedChem11:221-240)，降低循環(huán)的多形核白細(xì)胞的總量和血清丙二醛的水平(Gittoetal.,2004.JPediatrSurg39:184)，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、NK和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以及抑制細(xì)胞凋亡(Mundigleretal.,2002.CritCareMed30:536-40；Carrillo-Vicoetal.2005.JPinealRes39:400-408)，并且能降低杜氏肌萎縮癥(Duchennemusculardystrophy)患者的促炎細(xì)胞因子水平和氧化損傷(Chahbounietal.2010,JPinealRes48:282-289)。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在敗血癥危重患者中褪黑素的晝夜節(jié)律被擾亂，而未患敗血癥的患者保持褪黑素的內(nèi)源性分泌。已經(jīng)在不同的病理學(xué)中證明了其治療用途(Sánchez-Barcelóetal.2010,CurrMedChem17:2070-2095)，其中一般規(guī)則顯示在給藥后缺乏毒性(etal.2014.CellMolLifeSciDOI:10.1007/s00018-014-1579-2)。因此，通常作為睡眠-覺醒周期的調(diào)節(jié)劑(MohanandBrunner,2005.ActaAnaesthesiolScand49:1397)，它已成功地用于治療癲癇(Molina-Carballoetal.,1997.JPinealRes23:97-105)，以及用于進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)病房的患者(MohanandBrunner,2005.ActaAnaesthesiolScand49:1397)。其在患有敗血癥的新生兒中的靜脈內(nèi)使用導(dǎo)致死亡率的顯著下降而沒有副作用(Gittoetal.,2004.JPediatrSurg39:184)。在這種情況下，使用乙醇：水組合物(1:50)通過靜脈內(nèi)施用褪黑素。還已經(jīng)證明在急性心肌梗塞后具有心臟保護(hù)作用(Kücükakinetal.,2008.JPinealRes44:426-31)。已經(jīng)證明了其降低手術(shù)期間由侵入性手術(shù)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的能力以及當(dāng)通過靜脈內(nèi)施用不同劑量時(shí)，其安全性、功效和副作用的缺乏(Kücükakinetal.,2009.JSurgRes152:338-347；Naguibetal.,2001.BritishJAnaesth90:504-507)。在最后的參考文獻(xiàn)中，服用褪黑素所用的載體是水、丙二醇(PPG)和1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的2:1:1混合物。然而，在這種情況下，廣泛使用的溶劑40NMP對于使水不溶性褪黑素溶解似乎是必需的。然而，現(xiàn)在，使用NMP作為藥物載體因其生殖毒性而引起問題。因此，考慮到褪黑素給藥的效果、功效和安全性的結(jié)果和科學(xué)證據(jù)，需要產(chǎn)生呈現(xiàn)長期穩(wěn)定性并因此允許儲存的改進(jìn)的褪黑素組合物。在這方面，國際專利申請WO2012/156565公開了包含10mg/ml丙二醇的“穩(wěn)定的”水性褪黑素組合物。該水性組合物在制備后3個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的，但是在制備后6個(gè)月，觀察到以下特性：-高壓滅菌的和未高壓滅菌的處于室溫的制劑都具有淺黃色外觀，這可能是褪黑素氧化的結(jié)果。-高壓滅菌的和未高壓滅菌的處于4℃的制劑都結(jié)晶，并且在室溫下不完全重懸。-高壓滅菌的和未高壓滅菌的處于-20℃的制劑都是混濁的，并且當(dāng)將制劑置于室溫時(shí)，沒有成功地消除該混濁。因此，鑒于專利申請WO2012/156565中描述的在所有儲存條件下缺乏長期穩(wěn)定性，這種制劑不允許超過3個(gè)月的儲存期。為此，仍然需要生產(chǎn)呈現(xiàn)長期穩(wěn)定性并因此允許儲存超過3個(gè)月的改進(jìn)的褪黑素組合物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種呈現(xiàn)驚人的長期穩(wěn)定性并允許高濃度的所述水不溶性活性成分的水性褪黑素組合物。所述組合物的性質(zhì)使其可用作注射劑，例如用于靜脈內(nèi)給藥。因此，本發(fā)明的第一方面涉及包含丙二醇、聚乙二醇、和褪黑素或其衍生物、鹽、前藥或溶劑化物的組合物，聚乙二醇也稱為聚(氧-1,2-乙炔二基)、α-氫-ω-羥基、PEG、碳蠟(Carbowax)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚氧化乙烯、聚環(huán)氧乙烷或聚乙二醇(Macrogol)。這類組合物適于制備可用于例如靜脈內(nèi)給藥的可注射的褪黑素組合物。在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實(shí)施例中，這類組合物被凍干。可以使用適于可通過肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)注射的制劑的任何聚乙二醇(下文中稱為PEG)實(shí)施本發(fā)明。PEG的分子量優(yōu)選為200至600原子質(zhì)量單位(amu)，并且更優(yōu)選400amu(PEG400)。PEG(聚乙二醇)是工業(yè)上廣泛使用的聚醚，并且用以下通式表示：HO-(CH2-CH2-O-)n-H.其也被稱為“Macrogol”，因此PEG400也可以被描述為Macrogol400，并且在制藥工業(yè)中作為滴劑、可注射溶液、人造淚液、明膠膠囊等的組分。不同類型的PEG之間的分子量差異意味著除了給該聚乙二醇類型提供“姓”之外，它們對水具有不同的表現(xiàn)和親和力。例如，PEG400是吸濕性接近PG的高吸濕性的無色粘性液體，而PEG6000是具有蠟質(zhì)外觀和低吸濕性的固體物質(zhì)。它們都具有低毒性，例如PEG400LD50為約30g/Kg(對大鼠口服給藥)。如果將結(jié)果外推，對于體重為70kg的人，毒性劑量為2100g。這些特性使得PEG或聚乙二醇可理想地用作本發(fā)明的溶液的基礎(chǔ)材料。本發(fā)明的第二方面涉及包含水或鹽水溶液、丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、鹽、前藥或溶劑化物的組合物。本發(fā)明的第三方面涉及本發(fā)明的第一或第二方面中任一方面所述的組合物在藥品的制備中的用途。本發(fā)明的第四方面涉及本發(fā)明的第一或第二方面中任一方面描述的組合物用作藥品或用于治療。本發(fā)明的第五方面涉及本發(fā)明的第一或第二方面中任一方面所述的組合物在藥品的制備中的用途，所述藥品用于人類受試者的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的治療、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的治療、多器官功能障礙綜合征(MODS)的治療、新生兒和兒童敗血癥的治療、成人敗血癥的治療、心肌梗塞的治療、線粒體損傷的治療、肺水腫的治療、腎或肝衰竭的治療、或手術(shù)期間，特別是腹部手術(shù)期間產(chǎn)生的氧化應(yīng)激狀態(tài)的治療。關(guān)于本發(fā)明第五方面的可替換方面涉及本發(fā)明的第一或第二方面中任一方面描述的組合物人類受試者的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的治療、多器官功能障礙綜合征(MODS)的治療、新生兒和兒童敗血癥的治療、成人敗血癥的治療、心肌梗塞的治療、線粒體損傷的治療、肺水腫的治療、腎或肝衰竭的治療、或手術(shù)期間，特別是腹部手術(shù)期間產(chǎn)生的氧化應(yīng)激狀態(tài)的治療。在本發(fā)明背景下，成年人被認(rèn)為是18歲或更大的患者。新生兒通常被認(rèn)為是0至27天齡的患者，嬰兒被認(rèn)為是28天至23個(gè)月大的患者，兒童被認(rèn)為是24個(gè)月至11歲的患者，青少年被認(rèn)為是12至17歲的患者。雖然重量和劑量之間存在相關(guān)性，但所述相關(guān)性不總是線性的和必須針對每組患者進(jìn)行識別。本發(fā)明的組合物(參見本發(fā)明的第一或第二方面的組合物)使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如在西班牙和美國藥典和類似參考文獻(xiàn)中描述或提及的那些。第六方面涉及本發(fā)明組合物的制備，其包括混合水、丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、鹽、前藥或溶劑化物、它們的鹽、前藥、衍生物或溶劑化物。具體實(shí)施方式發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在不補(bǔ)充使用共溶劑(許多共溶劑是潛在有毒的，例如乙醇或NMP)的情況下，單獨(dú)的丙二醇(PPG)在溶解褪黑素方面是有效的；然而，單獨(dú)的PPG不能產(chǎn)生呈現(xiàn)長期穩(wěn)定性的褪黑素組合物。在這個(gè)意義上，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充有聚乙二醇的PPG多么驚人地不僅溶解褪黑素而且產(chǎn)生呈現(xiàn)長期穩(wěn)定性的組合物。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種組合物，其適合與水或鹽水溶液組合并用于制備包含丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、鹽、前藥或溶劑化物的可注射的褪黑素組合物。在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明第一方面的組合物的每種組分的濃度必須能夠獲得本發(fā)明第二方面中限定的任何可注射組合物。在本發(fā)明第一方面的另一優(yōu)選實(shí)施例中，組合物被凍干并且包含適當(dāng)比例的下列各組分：丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、鹽、前藥或溶劑化物，以便一旦再水化，能夠獲得本發(fā)明的第二方面中限定的任何可注射組合物。本發(fā)明的第二方面涉及藥學(xué)上可接受的可注射溶液形式的組合物，所述組合物包含水或鹽水溶液、丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、鹽、前藥或溶劑化物。根據(jù)本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實(shí)施例，所述可注射組合物或溶液包含：-每100ml總?cè)芤?～50克(w/v)，優(yōu)選每100ml總?cè)芤?0～30克(w/v)，更優(yōu)選每100ml總?cè)芤杭s20克丙二醇(w/v)；-每100ml總?cè)芤?至50克(w/v)，優(yōu)選每100ml總?cè)芤?0～40克(w/v)，更優(yōu)選每100ml總?cè)芤杭s30克聚乙二醇(w/v)；-每100ml總?cè)芤?.1～30克(w/v)，優(yōu)選每100ml總?cè)芤?.3～30克(w/v)，更優(yōu)選每100ml總?cè)芤?.3～20克(w/v)，更優(yōu)選每100毫升總?cè)芤?.3～10克(w/v)，更優(yōu)選每100毫升總?cè)芤?.3～2克(w/v)，更優(yōu)選每100ml總?cè)芤?.3～1g(w/v)，更優(yōu)選每100ml總?cè)芤?.3～0.8g(w/v)，甚至更優(yōu)選每100ml總?cè)芤杭s0.6g褪黑素；以及-足量的水或鹽水溶液。因此，本發(fā)明第二方面中所述的組合物驚人地允許高負(fù)荷的且同時(shí)穩(wěn)定的褪黑素，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中使用相對低濃度的丙二醇(PPG)，褪黑素明顯溶解，從而降低了可表現(xiàn)為施用高濃度PPG的副作用的刺激或疼痛的風(fēng)險(xiǎn)。因此，可以施用高劑量的褪黑素，而不同時(shí)施用大量的丙二醇(在非常高的劑量下可以具有毒性作用)，并且在任何情況下降低副作用的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的第一或第二方面中任一方面的組合物還可以包含其它藥學(xué)上可接受的賦形劑。根據(jù)EMEA的定義，賦形劑被認(rèn)為是組合物中除活性成分之外的任何組分?？捎糜诮M合物的可注射組合物中的賦形劑的例子包括抗菌性防腐劑，例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如焦亞硫酸鈉、沒食子酸丙酯；穩(wěn)定劑和懸浮劑，例如改性的可溶或可溶脹纖維素，例如，羧甲基纖維素鈉(Aquasorb,Blanose,Nymcel)；張力劑，例如氯化鈉；或增溶劑，例如丙二醇或聚乙二醇。這些賦形劑必須在本發(fā)明定義的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，“藥學(xué)上可接受的”組合物或其組分表明它們是生理上可耐受的，并且當(dāng)對人進(jìn)行給藥時(shí)，其給藥導(dǎo)致過敏、副作用、不良事件或其他類似反應(yīng)例如胃病，頭暈等的風(fēng)險(xiǎn)低。優(yōu)選地，如本文所使用的表述“藥學(xué)上可接受的”是指其已經(jīng)被州或聯(lián)邦政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，或者其列舉在美國藥典或其他公認(rèn)的藥典中，用于動物，以及更具體地用于人類中。因此，本發(fā)明的組合物是無熱原的。本發(fā)明的組合物包括褪黑素，以及其衍生物、鹽、前藥或溶劑化物。例如，通過常規(guī)化學(xué)方法，通常通過使褪黑素與合適的酸在水中或在有機(jī)溶劑中或在兩者的混合物中反應(yīng)，從而由褪黑素合成藥學(xué)上可接受的鹽。通常優(yōu)選非水性介質(zhì)如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。酸加成鹽的例子包括礦物酸加成鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽；和有機(jī)酸加成鹽，例如乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、扁桃酸鹽、甲烷磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽。在本申請中使用的術(shù)語“前藥”在本文中定義為意指經(jīng)歷化學(xué)衍生化的化學(xué)化合物(例如在給藥至受試者之后，提供活性化合物自身的活性化合物的酯、醚或酰胺衍生物)，化學(xué)衍生化為例如取代或添加另外的化學(xué)基團(tuán)以改變(用于藥物用途)其任何物理化學(xué)性質(zhì)，例如溶解度或生物利用度。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于制備給定活性化合物的前藥的公知方法的例子，并且所述方法可見于例如Krogsgaard-Larsenetal.,TextbookofDrugDesignandDiscovery,Taylor&Francis(2002年4月)。特別優(yōu)選的前藥是當(dāng)將化合物給藥至患者時(shí)，增加本發(fā)明化合物的生物利用度(例如，允許口服給藥的化合物更容易被吸收到血液中)，或相對于原物種改進(jìn)原化合物向生物隔室(例如，腦或淋巴系統(tǒng))的遞送的那些化合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“溶劑化物”必須理解為是指具有通過非共價(jià)鍵結(jié)合的另一分子(最可能是極性溶劑)的任何形式的根據(jù)本發(fā)明的褪黑素。這種溶劑化物的例子包括水合物和醇化物，例如甲醇化物。鹽、溶劑化物和前藥的制備可以通過本領(lǐng)域已知的方法實(shí)施。必須注意，非藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因?yàn)樗鼈兛捎糜谥苽渌帉W(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥。本領(lǐng)域已知同樣包括在本發(fā)明中的各種褪黑素衍生物。根據(jù)具體實(shí)施例，根據(jù)式(I)定義褪黑素衍生物、其鹽、前藥或溶劑化物其中，n是選自1、2、3和4的整數(shù)；R1和R3獨(dú)立地選自直鏈或支鏈C1-C4烷基；以及R2選自氫、直鏈或支鏈C1-C4烷基、-C(＝O)O-Ra和-C(＝O)-N(H)-Ra，其中Ra是直鏈或支鏈C1-C4烷基。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物可通過靜脈內(nèi)注射。一個(gè)具體方面包括在本發(fā)明的組合物中存在第二藥品。所述第二藥品可以是組合物的一部分或者可以作為單獨(dú)的組合物提供，用于在相同時(shí)間或在不同時(shí)間給藥。通常，本發(fā)明的組合物，以及褪黑素的“治療有效量”將取決于各種因素，諸如所治療的病癥的嚴(yán)重性、患者的性別、年齡或體重，以及其他因素。例如，本發(fā)明的組合物可在每天一次或多次以標(biāo)準(zhǔn)總?cè)談┝?.1～1000mg/kg/天的范圍內(nèi)服用。本發(fā)明涉及褪黑素、其鹽、前藥、衍生物或溶劑化物在藥品的制備中的用途，該藥品用于在人或動物諸如敗血癥的治療過程、用于全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的治療或用于多器官功能障礙綜合征(MODS)的治療、心肌梗塞的治療、線粒體損傷的治療、肺水腫的治療、腎或肝衰竭的治療或手術(shù)誘發(fā)的氧化應(yīng)激狀態(tài)的治療。在具體的實(shí)施例中，所述用途包括每24小時(shí)施用5～1,000mg，5～700mg，5～600mg或5～300mg的褪黑素。在另一具體實(shí)施例中，對患者施用的褪黑素的量為每4小時(shí)30～90mg，優(yōu)選40～70mg。在具體實(shí)施例中，每24小時(shí)患者施用55～75mg褪黑素。一般地，根據(jù)人等效劑量計(jì)算(Reagan-Shawetal.2007.FasebJ22:659-661)，褪黑素的最小劑量的范圍在50～500mg/天之間(Venegasetal.2012.JPinealRes52:217-227)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述用途涉及每24小時(shí)施用至少300mg，優(yōu)選至少400mg，甚至更優(yōu)選至少500mg褪黑素。在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方案中，所述用途優(yōu)選是指敗血癥的治療。在具體實(shí)施方案中，通過灌注進(jìn)行給藥。在另一實(shí)施方案中，褪黑素、其鹽、前藥、衍生物或溶劑化物每天給藥1、2、3、4、5或6次或更多次，直到達(dá)到所需的總?cè)談┝?。治療期可以根?jù)患者的進(jìn)展而變化，并且通常持續(xù)1～30天。在具體實(shí)施例中，所述成人敗血癥是嚴(yán)重的敗血癥。SIRS是一系列嚴(yán)重臨床損傷的一般性炎癥反應(yīng)。根據(jù)美國胸科醫(yī)師學(xué)會/重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)學(xué)會商定的定義，通過兩種或多種以下癥狀(i)至(iv)的存在而在臨床上識別該綜合征：(i)溫度>38℃或<36℃。(ii)心率>90次/分鐘。(iii)呼吸率>20次呼吸/分鐘或PaCO2<32mmHg。(iv)白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12,000個(gè)細(xì)胞/mm3，<4,000個(gè)細(xì)胞/mm3或>10％的未成熟(條帶)形式。敗血癥相當(dāng)于因感染明顯集中引起的SIRS。其診斷需要兩種或更多種SIRS標(biāo)準(zhǔn)和清楚的臨床感染圖片或微生物研究(在正常無菌流體中存在病原微生物，在尿中或在支氣管分泌物的定量培養(yǎng)物中超過100,000CFU/ml)的存在。此外，當(dāng)與器官功能障礙，低灌注或低血壓(<90mmHg收縮壓)相關(guān)時(shí)，敗血癥被認(rèn)為是嚴(yán)重的。低灌注的表現(xiàn)可以包括但不限于乳酸酸中毒(乳酸>3mmol/l)，少尿(利尿50<30ml/h持續(xù)3小時(shí)或24小時(shí)內(nèi)700ml)，凝血病(凝血酶原時(shí)間的延長或血小板減少癥小于100,000/ml)，或精神狀態(tài)的急劇變化(激動、神志不清)。在本文件的上下文中，術(shù)語“治療”是指服用根據(jù)本發(fā)明的化合物或配劑，以預(yù)防、改善或根除疾病或與所述疾病相關(guān)的一種或多種癥狀?！爸委煛边€涵蓋預(yù)防、改善或根除疾病的生理后遺癥。在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“包括”及其變體不旨在排除其它技術(shù)特征、補(bǔ)充、組分或步驟。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以從說明書以及從本發(fā)明的實(shí)施過程中部分地推導(dǎo)出。以下實(shí)施例和附圖以舉例說明的方式提供，并且不旨在限制本發(fā)明。實(shí)施例本發(fā)明將通過發(fā)明人進(jìn)行的檢驗(yàn)進(jìn)行下面的說明，檢驗(yàn)清楚地顯示本發(fā)明組合物的穩(wěn)定性和有效性。實(shí)施例1本發(fā)明的組合物的制備在約20％的丙二醇和約30％的聚乙二醇中以足量的無熱原水(API)制備濃度為6mg/ml的用于可注射溶液的褪黑素。表1檢驗(yàn)的組合物的定性和定量組成組分組成(每ml)功能褪黑素6.0mg活性成分丙二醇200.0mg賦形劑聚乙二醇(macrogol)300.0mg賦形劑用于注射劑的水足量1ml溶劑用于封裝表1中所述的組合物的材料是預(yù)先在烘箱中滅菌的I型玻璃安瓿(EP)。實(shí)施例2穩(wěn)定性檢驗(yàn)2.1一般原則本研究是表1中指定的產(chǎn)品在制備后和6個(gè)月時(shí)間的穩(wěn)定性研究。為此目的，使用三個(gè)工業(yè)規(guī)模的浴，每個(gè)包含1000安瓿的表1中指定的產(chǎn)品。2.2穩(wěn)定性測試結(jié)果表2：表1描述的含6mg/ml褪黑素的溶液的長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)從所示的長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)可以推斷儲存6個(gè)月后，包括含6mg/ml注射用褪黑素的溶液的所述安瓿符合具有這些特征的產(chǎn)品所需的技術(shù)規(guī)范。實(shí)施例3：敗血癥患者的臨床研究本發(fā)明的組合物，將實(shí)施例1所述的安瓿中含6mg/ml注射用褪黑素的溶液(以下稱為“褪黑素可注射劑”)用于臨床研究，將14名敗血癥患者在腹部手術(shù)后隨機(jī)分配成2個(gè)研究組(A和B)。組A對應(yīng)于除了標(biāo)準(zhǔn)治療之外，以60mg/天的劑量接受褪黑素注射劑5天的患者，每天采集血液樣品以進(jìn)行連續(xù)的分析測定。治療組B接受標(biāo)準(zhǔn)治療和安慰劑，后者是具有相同賦形劑但不含褪黑素活性成分的相同的小瓶；也從該組的每個(gè)患者獲得每日血液樣品以進(jìn)行連續(xù)地分析測定。血液樣品稱為T0、T1、T2、T3、T4和T5。對每個(gè)參與患者，從這些樣品分析以下血液參數(shù)：白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、嗜中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比和血小板數(shù)。在參與研究的每個(gè)患者中測定的生化參數(shù)為：轉(zhuǎn)氨酶(GOT和GPT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、肌酸酐、尿素，堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)。進(jìn)行的測定的正當(dāng)性包括白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)的血液參數(shù)以及血小板數(shù)是指示敗血癥狀態(tài)的參數(shù)。在這方面，已知敗血癥導(dǎo)致淋巴細(xì)胞百分比下降。測定的生化參數(shù)與肝功能相關(guān)，例如：-谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT/AST)：屬于轉(zhuǎn)氨酶群的酶，其通過轉(zhuǎn)移氨基，催化氨基酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的α-酮酸，反之亦然。它見于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。它對肝病是高度特異的。-谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT/ALT)：也是屬于轉(zhuǎn)氨酶群的酶，其通過轉(zhuǎn)移氨基，催化氨基酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的α-酮酸，反之亦然。其最高的活性水平見于肝臟。-γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)：有助于肝-膽汁疾病的診斷和控制。GGT的酶活性通常是這類疾病增加的唯一參數(shù)，并且它是高度敏感的。-堿性磷酸酶(ALP/FA)：在人血清中，存在四種結(jié)構(gòu)的基因型：肝-骨-腎型、腸型、胎盤型和干細(xì)胞變體。該酶見于成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎、脾、胎盤、前列腺、白細(xì)胞和小腸中。肝-骨-腎型特別重要。關(guān)于腎功能，已經(jīng)測定了以下參數(shù)：-肌酸酐是由肌肉代謝產(chǎn)生的廢物分子。肌酸酐來自肌酸，是肌肉中產(chǎn)生能量的非常重要的分子。每天約2％的身體肌酸轉(zhuǎn)化為肌酸酐。肌酸酐通過血液從肌肉運(yùn)輸?shù)侥I。腎過濾大部分肌酸酐，并在尿液中排除。血清肌酸酐的測定是相當(dāng)可靠準(zhǔn)確地表明腎臟功能狀態(tài)的檢驗(yàn)。-尿素，其測定是最廣泛使用的以評價(jià)腎臟功能的測試。尿素是蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的最終產(chǎn)物。在蛋白質(zhì)降解中，蛋白質(zhì)分解成氨基酸并脫去氨基。隨著氨的形成，在肝臟中合成尿素。這是人體中過量氮降解的最重要途徑。為了檢測組織(比如，肝)中的損傷，已經(jīng)測定了在人體幾乎所有組織中發(fā)現(xiàn)的酶乳酸脫氫酶(也稱為“乳酸脫氫酶”(LDH))。它在細(xì)胞呼吸(其中來自食物的葡萄糖轉(zhuǎn)變成能被細(xì)胞使用的能量的過程)中起重要作用。即使LDH在組織細(xì)胞中充裕，血液水平通常較低。然而，當(dāng)組織由于損傷或疾病而受損時(shí)，它們將更多的LDH釋放到血流中。通常引起血流中LDH量增加的病癥如下：肝病、心臟病發(fā)作、貧血、肌肉創(chuàng)傷、骨折、癌癥、感染如腦膜炎、腦炎或HIV。結(jié)果與討論獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)學(xué)家對來自研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并獲得以下結(jié)果：·白細(xì)胞：結(jié)果顯示組A和組B的白細(xì)胞水平均下降；雖然兩組的白細(xì)胞平均值都下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著?！ぜt細(xì)胞：盡管兩組的紅細(xì)胞平均值都下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著?！ぱt蛋白：盡管兩組的血紅蛋白平均值都下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著?！ぱ?xì)胞比容：雖然兩組的血細(xì)胞比容平均值都下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。·血小板：盡管兩組的血小板平均值都增加，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著?！ち馨图?xì)胞：組之間存在顯著差異(p＝0.015)，即，不管在什么時(shí)間(差異在所有測量時(shí)刻相同)，組A(用褪黑素注射劑處理)的淋巴細(xì)胞平均值大于組B(安慰劑)的淋巴細(xì)胞平均值。此外，時(shí)間的影響在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＝0.005，因?yàn)椴蛔裱蛐味?，這意味著淋巴細(xì)胞水平的增加在不同的測量時(shí)刻是不同的。具體地，差異是由于相對于初始時(shí)間的時(shí)間4和5。·嗜中性粒細(xì)胞：像在淋巴細(xì)胞的情況下，研究組之間存在顯著差異(p＝0.007)，即，不管在什么時(shí)間(在所有測量時(shí)刻差異相同)，組B(安慰劑)的嗜中性粒細(xì)胞平均值大于組A(褪黑素)的嗜中性粒細(xì)胞平均值。時(shí)間上的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＝0.042，因?yàn)椴蛔裱蛐味?。幾乎可以說，在時(shí)刻3之后，組A(褪黑素)中的下降開始是顯著的?！OT：盡管接受治療的患者(組A)的初始GOT水平較高，但平均值的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著(p＝0.633)。不同時(shí)刻的變化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也不顯著，即GOT水平幾乎保持相同。·GPT：GPT水平的變化在不同的測量時(shí)刻并不顯著。平均值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也不顯著。·GGT：GGT水平的變化在不同的測量時(shí)刻并不顯著。平均值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也不顯著?！LP(堿性磷酸酶)：在不同的測量時(shí)刻，堿性磷酸酶的變化并不顯著。平均值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也不顯著?！つ蛩兀耗蛩厮皆跁r(shí)間上沒有顯著差異；它們在兩組中幾乎保持相同(Friedman檢驗(yàn)，對于組A，p＝0.205，并且對于組B，p＝0.959)。如果在每個(gè)測量時(shí)刻比較兩組之間的尿素水平，可以看出在所有測量時(shí)刻(除了最后一個(gè)測量時(shí)刻)，組B(安慰劑)中的尿素水平較高。差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的?！ぜ∷狒杭∷狒皆跁r(shí)間上沒有顯著差異；它們在兩組中保持相同(Friedman檢驗(yàn)，對于組A，p＝0.122，對于組B，p＝0.831)。如果在每個(gè)測量時(shí)刻比較兩組之間的肌酸酐水平，可以看出組A和組B之間的肌酸酐水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異?！DH：LDH水平在時(shí)間上沒有顯著差異；它們在兩組中幾乎保持相同(Friedman檢驗(yàn)，對于組A，p＝0.355，對于組B，p＝0.921)。如果在每個(gè)測量時(shí)刻比較兩組之間的LDH水平，可以看出，在所有測量時(shí)間，組A(褪黑素)的LDH水平較高，盡管差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。非參數(shù)檢驗(yàn)的分析盡管樣本量很小，盡管遵守所有變量的正態(tài)性假設(shè)，但是使用非參數(shù)檢驗(yàn)，因?yàn)樗鼈冊跇颖救绱诵r(shí)更加穩(wěn)健和合適?？紤]到這一點(diǎn)，一方面，對獨(dú)立樣品使用Friedman檢驗(yàn)，分別比較每組中不同參數(shù)隨時(shí)間的進(jìn)展。對于隨時(shí)間的進(jìn)展，在以下參數(shù)中獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p<0.10)：·在不同時(shí)間觀察到的組A的血紅蛋白水平(p＝0.069)?！ぴ诓煌瑫r(shí)間觀察到的組A(p＝0.056)和組B(p＝0.069)的血小板水平?！ぴ诓煌瑫r(shí)間觀察到的組A(p＝0.030)和組B(p＝0.085)的淋巴細(xì)胞水平?！ぴ诓煌瑫r(shí)間觀察到的組A的嗜中性粒細(xì)胞水平(p＝0.070)?！ぴ诓煌瑫r(shí)間觀察到的組A(p＝0.013)和組B(p＝0.077)的GOT水平?！ぴ诓煌瑫r(shí)間觀察到的組B的GPT水平(p＝0.004)?！ぴ诓煌瑫r(shí)間觀察到的組A的GGT水平(p＝0.079)。此外，對獨(dú)立樣品，獨(dú)立地使用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較在每個(gè)時(shí)刻組A和組B之間的直接差異，得到以下結(jié)果：·在時(shí)刻T2，組A和組B之間在紅細(xì)胞(p＝0.026)，血紅蛋白(p＝0.038)和血細(xì)胞比容(p＝0.053)水平上存在差異?！ぴ谒袝r(shí)間淋巴細(xì)胞水平都存在差異?！ぴ赥2(p＝0.007)和T3(p＝0.011)，組A和組B之間在嗜中性粒細(xì)胞水平上存在差異。·在T5，組A和組B之間在GPT水平上存在差異(p＝0.038)。結(jié)論在接受注射劑的組A的敗血癥患者中用褪黑素注射劑治療顯示淋巴細(xì)胞百分比逐漸增加。這種增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。這些患者還顯示嗜中性粒細(xì)胞百分比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著下降。淋巴細(xì)胞的增加和嗜中性粒細(xì)胞的減少都發(fā)生在研究的所有時(shí)間，在研究期結(jié)束時(shí)達(dá)到接近健康個(gè)體的正常值的水平。這種情況使得接受褪黑素注射劑治療的患者的免疫恢復(fù)，因?yàn)樵诮邮茏⑸鋭┲委煹幕颊咧袑?shí)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞之間的平衡。此外，在接受注射劑治療的患者中，用褪黑素注射劑治療不涉及任何肝或腎損傷。統(tǒng)計(jì)分析詳情下面提供對在研究的所有時(shí)刻(T0，...，T5)測量的參數(shù)上進(jìn)行的分析的詳情。白細(xì)胞雖然兩組的白細(xì)胞平均值下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。紅細(xì)胞雖然兩組的紅細(xì)胞平均值下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。血紅蛋白雖然兩組的血紅蛋白平均值下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。血細(xì)胞比容雖然兩組的血細(xì)胞比容平均值下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。血小板雖然兩組的血小板平均值下降，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。淋巴細(xì)胞受試者內(nèi)的效果檢驗(yàn)變換變量：平均值組之間存在顯著差異(p＝0.015)，即，不管在什么時(shí)間(在所有測量時(shí)刻，差異相同)，組A的淋巴細(xì)胞平均值大于組B的淋巴細(xì)胞平均值。此外，時(shí)間的影響在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＝0.005，因?yàn)椴蛔裱蛐味?，這意味著淋巴細(xì)胞水平的增加在不同的測量時(shí)刻是不同的。具體來說，差異是由于時(shí)間4和5相對于初始時(shí)間產(chǎn)生：受試者內(nèi)的效果檢驗(yàn)受試者內(nèi)的對比檢驗(yàn)嗜中性白細(xì)胞與前面的情況一樣，組之間存在顯著差異(p＝0.007)，即，不管在什么時(shí)間(在所有測量時(shí)刻，差異相同)，組B的嗜中性粒細(xì)胞平均值大于組A的嗜中性粒細(xì)胞平均值。受試者內(nèi)的效果檢驗(yàn)變換變量：平均值時(shí)間上的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＝0.042，因?yàn)椴蛔裱蛐味?。幾乎可以說在時(shí)刻3之后，下降開始是顯著的。受試者內(nèi)的效果檢驗(yàn)受試者內(nèi)的對比檢驗(yàn)GOT即使治療組A中的患者的初始GOT水平較高，平均值的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著(p＝0.633)。在不同時(shí)刻的變化也并不顯著，即GOT水平幾乎保持相同。受試者內(nèi)的效果檢驗(yàn)變換變量：平均值GPT在不同的測量時(shí)刻GPT水平的變化并不顯著。平均值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也并不顯著。GGT在不同的測量時(shí)刻GGT水平的變化并不顯著。平均值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也并不顯著。堿性磷酸酶在不同的測量時(shí)刻，堿性磷酸酶的變化并不顯著。平均值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也并不顯著。非參數(shù)檢驗(yàn)分析：一方面，分別比較每組中不同參數(shù)隨時(shí)間的進(jìn)展(對獨(dú)立樣品使用Friedman檢驗(yàn))，在以下方面獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p<0.10)：在不同時(shí)間觀察到的組A的血紅蛋白水平(p＝0.069)：在不同時(shí)間觀察到的組A(p＝0.056)和組B(p＝0.069)的血小板水平：在不同時(shí)間觀察到的組A(p＝0.030)和B(p＝0.085)的淋巴細(xì)胞水平：在不同時(shí)間觀察到的組A的嗜中性粒細(xì)胞水平(p＝0.070)：在不同時(shí)間觀察到的組A(p＝0.013)和組B(p＝0.077)的GOT水平：在不同時(shí)間觀察到的組B的GPT水平(p＝0.004)：在不同時(shí)間觀察到的組A的GGT水平(p＝0.079)：·如果在每個(gè)時(shí)刻獨(dú)立比較組A和組B之間的直接差異(對獨(dú)立樣本進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn))，則在時(shí)刻T2，組A和組B之間在紅細(xì)胞(p＝0.026)、血紅蛋白p＝0.038)和血細(xì)胞比容(p＝0.053)水平上存在差異。淋巴細(xì)胞水平在所有時(shí)間都存在差異：·在T2(p＝0.007)和T3(p＝0.011)，組A和組B之間在嗜中性粒細(xì)胞水平上存在差異。·在T5，組A和組B之間在GPT水平上存在差異(p＝0.038)?！つ蛩厮皆跁r(shí)間上沒有顯著差異；它們在兩組中幾乎保持相同(Friedman檢驗(yàn)，對于組A，p＝0.205，對于組B，p＝0.959)：尿素·然而，如果在每個(gè)測量時(shí)刻比較兩組之間的尿素水平，則在除了最后一個(gè)測量時(shí)刻之外的所有測量時(shí)刻，組B的尿素水平較高。差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的：此外，每組中以下參數(shù)隨時(shí)間的進(jìn)展分別沒有表現(xiàn)出顯著差異：肌酸酐·肌酸酐水平在時(shí)間上沒有顯著差異；它們在兩組中保持相同(Friedman檢驗(yàn)，對于組A，p＝0.122，對于組B，p＝0.831)：·如果在每個(gè)測量時(shí)刻比較兩組之間的肌酸酐水平，可以看出組A和組B之間的肌酸酐水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異：LDH·LDH水平在時(shí)間上沒有顯著差異；它們在兩組中幾乎保持相同(Friedman試驗(yàn)，對于組A，p＝0.355，對于組B，p＝0.921)：·如果在每個(gè)測量時(shí)刻比較兩組之間的LDH水平，則在所有測量時(shí)間，組A的LDH水平較高，但差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著：當(dāng)前第1頁1 2 3