本發(fā)明涉及對(duì)腦癌的新治療方法，所述腦癌在過(guò)去對(duì)于治療特別有抗性，即星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤，腦癌(轉(zhuǎn)移性癌癥)和原發(fā)性CNS淋巴瘤。

發(fā)明背景

癌癥是最具有生命威脅的疾病之一。癌癥是其中身體一部分中的細(xì)胞經(jīng)歷失控生長(zhǎng)的病癥。根據(jù)來(lái)自美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的最新數(shù)據(jù)，估計(jì)在2014年美國(guó)有167萬(wàn)新增癌癥病例。癌癥是美國(guó)第二大死因(僅次于心臟病)并且估計(jì)在2014年奪去超過(guò)585,000條生命。實(shí)際上，預(yù)計(jì)生活在美國(guó)的所有男性中的50％和所有女性中的33％在他們的有生之年都將發(fā)展某種類型的癌癥。因此，癌癥構(gòu)成重大的公共健康負(fù)擔(dān)并且在美國(guó)導(dǎo)致了顯著成本。這些數(shù)字在其他地方在全球大多數(shù)國(guó)家中反映，盡管癌癥的類型和發(fā)展癌癥的群體的相對(duì)比例取決于許多不同因素(如包括遺傳和飲食)而變化。

世界衛(wèi)生組織(WHO)將原發(fā)性腦腫瘤分成四類。WHO I和II級(jí)是低級(jí)膠質(zhì)瘤，而間變性星形細(xì)胞瘤和間變性少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(WHOIII級(jí))以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBMs)(WHO IV級(jí))總稱為惡性膠質(zhì)瘤。大多數(shù)原發(fā)性和繼發(fā)性腦腫瘤的預(yù)后是極壞的，因?yàn)槿狈τ行У闹委焺?。它們是兒童中由于?shí)體瘤導(dǎo)致的死亡的首因并且是年齡在15-34歲的青少年和成人中癌癥導(dǎo)致的死亡的第三大原因(Jemal等，CA Cancer J Clin 59 2009 225-249)。

在惡性膠質(zhì)瘤中，GBM是最常見(jiàn)的和致命的腫瘤，代表所有膠質(zhì)瘤的約50％。GBM的預(yù)后令人沮喪，突出了對(duì)新治療策略的需要。外科手術(shù)接著是烷基化劑替莫唑胺(TMZ)和放療的組合療法是對(duì)于患有GBM的患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。TMZ的主要作用機(jī)制是通過(guò)DNA堿基的異常甲基化引發(fā)的，特別是DNA中的O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤(Verbeek等，Br Med Bul，85，2008，17-33)。然而，許多患者對(duì)TMZ具有抗性或者僅顯示弱反應(yīng)。這已經(jīng)顯示是由O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)介導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)(MMR)賦予的(參見(jiàn)Weller等，Nat Rev Neurol，6，2010，39-51)。具有該修復(fù)系統(tǒng)的患者具有‘MGMT陽(yáng)性GBM’。mTOR/DNAPKC途徑的激活也被認(rèn)為發(fā)揮作用。迄今還未開(kāi)發(fā)出針對(duì)MGMT陽(yáng)性GBM具有活性的化療劑。MGMT的活性在其他星形膠質(zhì)細(xì)胞的腦腫瘤(即彌漫性星形細(xì)胞瘤(WHO II級(jí))和間變性星形細(xì)胞瘤(WHOIII級(jí)))中也是重要的。這些至GBM的進(jìn)展主要通過(guò)MGMT的甲基化來(lái)介導(dǎo)。因此可以看出，針對(duì)MGMT陽(yáng)性星形細(xì)胞瘤具有活性的治療劑在防止這些彌漫性和間變性星形細(xì)胞瘤進(jìn)展為GBM方面將是理想的。

因此，關(guān)鍵的是急切開(kāi)發(fā)一種具有優(yōu)異抗腫瘤活性的新治療劑，其不僅針對(duì)MGMT陰性GBM還針對(duì)MGMT陽(yáng)性GBM(以及其他星形膠質(zhì)細(xì)胞的腦腫瘤)，顯示優(yōu)異的CNS穿透并且具有可耐受的毒性性質(zhì)。

轉(zhuǎn)移性腦腫瘤作為癌癥起始于身體別處并擴(kuò)散至腦。乳腺癌、肺癌、黑素瘤、結(jié)腸癌和腎癌通常轉(zhuǎn)移。經(jīng)常地，在原發(fā)性腫瘤之前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腦腫瘤。轉(zhuǎn)移性腦腫瘤是成人中所有腦腫瘤中最常見(jiàn)的。估計(jì)每年可能存在高達(dá)170,000例新病例。盡管比GBM稍微好點(diǎn)，但是轉(zhuǎn)移性腦癌的預(yù)后通常是差的。再次，采用外科手術(shù)、治療和化療的組合，這些選項(xiàng)之中的確切組合取決于轉(zhuǎn)移癌的本性和發(fā)展階段(以及患者的健康)。外科手術(shù)(當(dāng)可能時(shí))和放療是應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)治療。有時(shí)候使用化療。不幸的是，迄今還未有很大成功。這部分是由于需要化療劑顯示優(yōu)異的CNS穿透(當(dāng)然，還有優(yōu)異的抗腫瘤活性和可耐受的毒性性質(zhì))。許多現(xiàn)有的化療劑顯示對(duì)血腦屏障的差的穿透。急切需要解決這些問(wèn)題的新治療劑。

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤源自淋巴細(xì)胞，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是腦腫瘤，因?yàn)槠湮恢脙H在腦中并且治療挑戰(zhàn)類似于其他腦腫瘤的那些。具體地，藥物遞送被血腦屏障阻礙并且腦毒性限制當(dāng)前治療的使用。大多數(shù)原發(fā)性CNS淋巴瘤是彌漫性大B-細(xì)胞淋巴瘤(約90％)。盡管其相對(duì)稀少，但是其發(fā)病率和流行程度正在增加。當(dāng)前，使用現(xiàn)有治療方案的中值存活率為44個(gè)月。對(duì)于該病癥還未建立特別有效的治療方案。當(dāng)前優(yōu)選的化療劑是甲氨蝶呤。然而，其對(duì)血腦屏障的穿透并不令人滿意，并且不得不以極高的劑量施用。使用放療的組合療法可以改善結(jié)果，但是副作用可能是非常嚴(yán)重的。因此，需要一種改進(jìn)的化療劑，其具有更大的穿透血腦屏障的能力并且還顯示針對(duì)原發(fā)性CNS淋巴瘤的優(yōu)異的抗腫瘤活性。

在WO-A-2010/085377中，公開(kāi)了以下式I的化合物。它是首創(chuàng)一類(first-in-class)雙功能烷基化-HDACi融合分子，其有效地抑制HDAC途徑。

生物學(xué)測(cè)定顯示，式I的化合物有效地抑制1類和2類HDAC酶(例如HDAC1，IC₅₀為9nM)，并且已經(jīng)顯示具有針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的優(yōu)異的體外活性。此外，其通過(guò)顯著下調(diào)FANCD2，BRCA1，BRCA2，和TS(胸苷酸合成酶)抑制DNA修復(fù)，可能涉及HDAC6和HDAC8抑制。在NCI-60細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性測(cè)定已經(jīng)顯示其具有極強(qiáng)的抗癌活性，與苯達(dá)莫司汀(Bendamustine)的72μM相比，其IC₅₀中值為2.2μM。WO-A-2013/113838包括了顯示式I的化合物(在說(shuō)明書中稱為NL-101)針對(duì)許多細(xì)胞系的活性的數(shù)據(jù)，所述細(xì)胞系包括一些成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系。然而，考慮的細(xì)胞系中的每一種都是MGMT陰性GBM腫瘤細(xì)胞系。

發(fā)明概述

在本發(fā)明的第一方面，提供用于治療腦癌的式I的化合物或其藥用鹽：

所述腦癌選自MGMT陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤、轉(zhuǎn)移性腦癌和原發(fā)性CNS淋巴瘤。

在臨床前體外和體內(nèi)研究中，已經(jīng)顯示式I的化合物不僅針對(duì)MGMT陰性GBM腫瘤具有活性，而且對(duì)于MGMT陽(yáng)性GBM腫瘤具有活性。由此，還可以預(yù)期其對(duì)于其他MGMT陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤具有活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，式I的化合物能夠非常好地穿透血腦屏障，使得其不僅針對(duì)MGMT陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤而且針對(duì)其他腦腫瘤的治療應(yīng)用理想。特別是，已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其具有非常好的針對(duì)轉(zhuǎn)移性腦癌以及原發(fā)性CNS淋巴瘤的活性。

在本發(fā)明的第二方面，提供了式I的化合物或其藥用鹽在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療選自MGMT陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤、轉(zhuǎn)移性腦癌和原發(fā)性CNS淋巴瘤的腦癌。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種在需要其的患者中治療腦癌的方法，所述腦癌選自MGMT陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤、轉(zhuǎn)移性腦癌和原發(fā)性CNS淋巴瘤，所述方法包括將式I的化合物或其藥用鹽施用于所述患者。

附圖描述

圖1是在腦脊液和血液中EDO-S101濃度(μM)對(duì)時(shí)間的圖表；

圖2是在施用替莫唑胺之后，12種測(cè)試的GBM細(xì)胞系的IC₅₀的圖表；

圖3是在施用替莫唑胺和伏林司他(vorinostat)之后，12種測(cè)試的GBM細(xì)胞系的IC₅₀的圖表；

圖4是在施用苯達(dá)莫司汀之后，12種測(cè)試的GBM細(xì)胞系的IC₅₀的圖表；

圖5是在施用苯達(dá)莫司汀和伏林司他后，12種測(cè)試的GBM細(xì)胞系的IC₅₀的圖表；

圖6是對(duì)于12種測(cè)試的細(xì)胞系的每一種，細(xì)胞存活百分比針對(duì)EDO-S101(μM)濃度的圖表；

圖7a是作為注射后GBM12細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)量值的發(fā)光針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖7b是存活百分比針對(duì)時(shí)間的圖表，顯示了EDO-S101針對(duì)苯達(dá)莫司汀和對(duì)照的存活的延長(zhǎng)。

圖8是對(duì)于移植了用EDO-S101處理的U251腫瘤的小鼠，進(jìn)展時(shí)間(TTP)概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖9是對(duì)于移植了用EDO-S101處理的U87腫瘤的小鼠，進(jìn)展時(shí)間(TTP)概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖10是對(duì)于僅用放療處理、用放療和2.5μM EDO-S101(在圖中顯示為NL-101)和5μM EDO-S101EDO-S101處理的U251，U87和T98G細(xì)胞，存活分?jǐn)?shù)針對(duì)放療劑量(Gy)的圖表；

圖11是對(duì)于移植了用對(duì)照、放療和EDO-S101處理的U251腫瘤的小鼠，進(jìn)展時(shí)間(TTP)概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖12是對(duì)于移植了用對(duì)照、放療和替莫唑胺、EDO-S101以及放療和EDO-S101處理的U251腫瘤的小鼠，進(jìn)展時(shí)間(TTP)概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖13是對(duì)于移植了用對(duì)照、放療和EDO-S101處理的U87腫瘤的小鼠，進(jìn)展時(shí)間(TTP)概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖14是對(duì)于移植了用對(duì)照、放療和替莫唑胺、EDO-S101、以及放療和EDO-S101處理的U87腫瘤的小鼠，進(jìn)展時(shí)間(TTP)概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖15和16是在用對(duì)照載體、EDO-S101、替莫唑胺、以及放療和替莫唑胺處理后，原位熒光素酶-轉(zhuǎn)染的U251GBM小鼠的生物發(fā)光圖像；

圖17是在用對(duì)照載體、放療、EDO-S101、替莫唑胺、以及放療和替莫唑胺處理后，對(duì)于原位熒光素酶-轉(zhuǎn)染的U251GBM小鼠存活概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表；

圖18是對(duì)于移植了用對(duì)照、苯達(dá)莫司汀和EDO-S101處理的OCI-LY10CNS淋巴瘤的小鼠，存活百分比針對(duì)時(shí)間的圖表；和

圖19是對(duì)于在用MB-468乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后具有腦的三陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的小鼠，存活百分比針對(duì)時(shí)間的圖表，所述MB-468乳腺癌細(xì)胞用對(duì)照、苯達(dá)莫司汀和EDO-S101處理。

發(fā)明詳述

在本發(fā)明中，使用許多通用術(shù)語(yǔ)和措詞，其應(yīng)該如下解釋。

星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤是源自于腦內(nèi)星形的膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞)的腫瘤。它們分為低級(jí)(I和II)和高級(jí)(III和IV)。已知II級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤為彌漫性星形細(xì)胞瘤。盡管這些生長(zhǎng)較慢，但是它們可以發(fā)展成為惡性原發(fā)性腫瘤。已知III級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤為間變性星形細(xì)胞瘤。這些是惡性腫瘤；它們生長(zhǎng)更快并且傾向于侵入附近健康組織。已知IV級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤是多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)。這些是高度惡性的，生長(zhǎng)快速，容易擴(kuò)散到附近組織，并且非常難以用常規(guī)治療來(lái)治療。

目前的標(biāo)準(zhǔn)化療治療是使用替莫唑胺(TMZ)。然而，許多患者對(duì)于反應(yīng)具有抗性或者僅顯示弱反應(yīng)。已經(jīng)顯示這是通過(guò)O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)介導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)(MMR)賦予的(參見(jiàn)Weller等，Nat Rev Neurol，6，2010，39-51)。具有該修復(fù)系統(tǒng)的患者具有‘MGMT陽(yáng)性GBMs’。GBMs因此分成MGMT陰性GBMs和MGMT陽(yáng)性GBMs，這取決于它們是否表達(dá)MGMT基因。已經(jīng)顯示本發(fā)明式I的化合物或其藥用鹽不僅具有針對(duì)MGMT陰性的GBMs的活性，而且具有針對(duì)MGMT陽(yáng)性GBMs的活性。

MGMT活性在其他星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤中也是重要的，所述其他星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤即彌漫性星形細(xì)胞瘤(WHO II級(jí))和間變性星形細(xì)胞瘤(WHO III級(jí))。這些至GBMs的進(jìn)展主要是通過(guò)MGMT導(dǎo)致的甲基化介導(dǎo)的。因此可以看到，因?yàn)槭絀的化合物及其藥用鹽具有針對(duì)MGMT陽(yáng)性星形細(xì)胞瘤的活性，因此它也能夠預(yù)防這些彌漫性和間變性星形細(xì)胞瘤至GBMs的進(jìn)展。

轉(zhuǎn)移性腦腫瘤是作為身體內(nèi)其他地方的癌癥起始并且擴(kuò)散到腦的腦腫瘤。乳腺癌、肺癌、黑素瘤、系統(tǒng)性淋巴瘤、肉瘤、結(jié)腸癌、胃腸癌和腎癌通常轉(zhuǎn)移。

在本發(fā)明上下文中的原發(fā)性CNS淋巴瘤是源自腦內(nèi)的淋巴細(xì)胞、由所述淋巴細(xì)胞形成的惡性細(xì)胞的淋巴瘤。因此，認(rèn)為其為腦腫瘤，因?yàn)槠湮恢煤椭委熖魬?zhàn)類似于其他腦腫瘤的那些。

“藥用鹽”是指本發(fā)明化合物的鹽，其是藥學(xué)上可接受的，如上定義，并且具有所需的藥理學(xué)活性。這些鹽包括與無(wú)機(jī)酸或與有機(jī)酸形成的酸加成鹽。藥用鹽還包括堿加成鹽，其當(dāng)存在的酸性質(zhì)子能夠與無(wú)機(jī)或有機(jī)堿反應(yīng)時(shí)可以形成。通常，這樣的鹽例如通過(guò)將游離酸或堿形式的這些化合物與化學(xué)計(jì)算量的適當(dāng)?shù)膲A或酸在水中或在有機(jī)溶劑中或在這兩者的混合物中反應(yīng)來(lái)制備。通常，優(yōu)選非水性介質(zhì)如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。酸加成鹽的實(shí)例包括無(wú)機(jī)酸加成鹽，如例如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，氨基磺酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，和有機(jī)酸加成鹽，如例如乙酸鹽，三氟乙酸鹽，馬來(lái)酸鹽，富馬酸鹽，檸檬酸鹽，草酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，水楊酸鹽，甲苯磺酸鹽，乳酸鹽，萘磺酸鹽，蘋果酸鹽，扁桃酸鹽，甲磺酸鹽和對(duì)甲苯磺酸鹽。堿加成鹽的實(shí)例包括無(wú)機(jī)鹽，如例如，鈉、鉀、鈣和銨鹽，和有機(jī)堿鹽，如例如乙二胺、乙醇胺、N，N-二亞烷基乙醇胺、三乙醇胺和堿性氨基酸鹽。

在本發(fā)明中，式I的化合物的藥用鹽可以優(yōu)選為鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，氨基磺酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，檸檬酸鹽，甲磺酸鹽，三氟乙酸鹽，谷氨酸鹽，葡糖醛酸鹽，戊二酸鹽，蘋果酸鹽，馬來(lái)酸鹽，琥珀酸鹽，富馬酸鹽，酒石酸鹽，甲苯磺酸鹽，水楊酸鹽，乳酸鹽，萘磺酸鹽或乙酸鹽，并且更優(yōu)選乙酸鹽。

在本發(fā)明中，當(dāng)將式I的化合物或其藥用鹽用于治療MGMT陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤時(shí)，這優(yōu)選選自MGMT陽(yáng)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、彌漫性(WHO II級(jí))星形細(xì)胞瘤和間變性(WHOIII級(jí))星形細(xì)胞瘤，并且最優(yōu)選為MGMT陽(yáng)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。

在本發(fā)明中，當(dāng)將式I的化合物或其藥用鹽用于治療轉(zhuǎn)移性腦癌時(shí)，這優(yōu)選選自轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性系統(tǒng)性淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性肺癌、轉(zhuǎn)移性黑素瘤、轉(zhuǎn)移性肉瘤和轉(zhuǎn)移性胃腸癌，并且最優(yōu)選轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

根據(jù)本發(fā)明第一、第二和第三方面施用于患者的式I的化合物或其藥用鹽和包含其的藥物的治療有效量是以下量，所述量以適用于任何藥物治療的合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比賦予對(duì)所治療的受試者根據(jù)本發(fā)明的治療效果。治療效果可以是客觀的(即，通過(guò)某種測(cè)試或標(biāo)記可測(cè)量的)或主觀的(即，受試者給出效果指示或感覺(jué))。認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明的式I的化合物或其藥用鹽的有效量是這樣的量，其中以0.1至70mg/kg患者體重(例如，0.5至50mg/kg體重，如1，5，10，20，30，40or 50mg/kg體重)的劑量范圍包括式I的化合物或其藥用鹽。

對(duì)于任何具體患者的特定治療有效劑量水平將取決于各種因素，所述因素包括被治療的病癥和病癥嚴(yán)重性；使用的具體化合物的活性；使用的具體組合物；患者的年齡，體重，整體健康，性別和飲食；給藥時(shí)間，給藥途徑和使用的具體化合物的排泄率；治療持續(xù)時(shí)間；與使用的具體化合物組合或同時(shí)使用的藥物；和醫(yī)藥領(lǐng)域公知的類似因素。

根據(jù)本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽和包含它們的藥物的給藥形式的適當(dāng)實(shí)例非限制性地包括口服、局部、腸胃外、舌下、直腸、陰道、經(jīng)眼和鼻內(nèi)。腸胃外給藥包括皮下注射，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。優(yōu)選地，將式(I)的化合物或其藥用鹽和包含它們的藥物腸胃外施用，并且最優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。

優(yōu)選地，將式I的化合物或其藥用鹽以0.1mg/kg至70mg/kg患者體重的劑量水平靜脈內(nèi)施用于需要其的患者，并且最優(yōu)選以0.5mg/kg至50mg/kg患者體重的劑量水平靜脈內(nèi)施用于需要其的患者。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的第一、第二和第三方面中，可以優(yōu)選將式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物在治療周期的第1天、第8天和第15天、在治療周期的第1天和第8天或僅在治療周期的第1天施用于需要其的患者。

在本發(fā)明第一、第二和第三方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，出人意料地發(fā)現(xiàn)式I的化合物及其藥用鹽當(dāng)與放療聯(lián)合施用時(shí)顯著更有效，并且實(shí)際上在體內(nèi)和體外研究中似乎與放療都具有協(xié)同效應(yīng)。因此，在本發(fā)明第一、第二和第三方面中，可以將式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物用于治療需要其的患者，其中在用所述式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物治療之前或之后，還為需要其的患者提供放療。優(yōu)選地，在用所述式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物治療之前，為所述患者提供放療治療。可以以連續(xù)5天1至5Gy并且優(yōu)選以連續(xù)5天2Gy的劑量提供放療。

在本發(fā)明第一、第二和第三方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療進(jìn)一步包括向需要其的患者施用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑，并且所述式I的化合物或其藥用鹽和所述血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑可以同時(shí)、順序或分開(kāi)施用，并且優(yōu)選同時(shí)施用。優(yōu)選地，所述血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑是貝伐珠單抗。

在本發(fā)明第一、第二和第三個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療還包括向需要其的患者施用聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑，并且所述式I的化合物或其藥用鹽和所述聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑可以同時(shí)、順序或分開(kāi)施用，并且優(yōu)選同時(shí)施用。優(yōu)選地，所述聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑選自rucaparib、奧拉帕利(olaparib)和veliparib。

在本發(fā)明第一、第二和第三個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療還包括向需要其的患者施用PD-1/PDL-1(免疫檢查點(diǎn))抑制劑，并且所述式I的化合物或其藥用鹽和所述PD-1/PDL-1(免疫檢查點(diǎn))抑制劑可以同時(shí)、順序或分開(kāi)施用，并且優(yōu)選同時(shí)施用。優(yōu)選地，所述PD-1/PDL-1(免疫檢查點(diǎn))抑制劑是伊匹木單抗。

當(dāng)意欲用于口服給藥時(shí)，本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以是固體或液體形式，其中半固體、半液體、混懸液和凝膠形式被包括在本文中考慮為固體或液體的形式內(nèi)。

本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以使用藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法制備用于給藥。適當(dāng)?shù)乃幬镏苿┖洼d體的實(shí)例描述在E.W.Martin的"Remington′s Pharmaceutical Sciences"中。

作為用于口服給藥的固體組合物，本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以配制成粉末、顆粒、壓縮片劑、藥丸、膠囊、口香糖、糯米紙囊劑(wafer)等形式。該固體組合物典型地含有一種或多種惰性稀釋劑，作為包含所有活性劑的單一片劑或作為各自包含本發(fā)明的組合的單一活性劑的多個(gè)分開(kāi)的固體組合物(在試劑盒的情形中)。另外，可以存在以下中的一種或多種：粘合劑如羧甲基纖維素，乙基纖維素，微晶纖維素，或明膠；賦形劑，如淀粉，乳糖或糊精，崩解劑，如海藻酸，海藻酸鈉，玉米淀粉等；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂；助流劑，如膠體二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；調(diào)味劑如薄荷油，水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑；和著色劑。

當(dāng)本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物是膠囊形式(例如，明膠膠囊)時(shí)，除了上述類型的材料以外，它還可以含有液體載體，如聚乙二醇，環(huán)糊精或脂肪油。

本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以是液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液劑、乳劑或混懸劑。該液體可以用于口服給藥或者用于通過(guò)注射遞送。當(dāng)意欲用于口服給藥時(shí)，本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以包含甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和增香劑中的一種或多種。在用于通過(guò)注射給藥的本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物中，還可以包括表面活性劑、防腐劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和等張劑中的一種或多種。

優(yōu)選的給藥途徑是腸胃外給藥，包括但不限于，皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，硬膜外，鼻內(nèi)，腦內(nèi)，心室內(nèi)，鞘內(nèi)，陰道內(nèi)或透皮。優(yōu)選的給藥方式留待執(zhí)業(yè)醫(yī)生判斷，并且將部分取決于醫(yī)學(xué)病癥的部位(如癌癥部位)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)施用本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物。

本發(fā)明第一、第二和第三方面的液體的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物，無(wú)論它們是溶液、混懸液或其他類似形式，還可以包括以下中的一種或多種：無(wú)菌稀釋劑，如注射用水，鹽水溶液，優(yōu)選生理鹽水，林格氏溶液，等張氯化鈉，固定油，如合成甘油單酯或二酯，聚乙二醇，甘油，或其他溶劑；抗細(xì)菌劑，如苯甲醇，或?qū)αu基苯甲酸甲酯；和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或右旋糖。腸胃外組合或組合物可以被包封在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓿管、一次性注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的輔劑。

可以通過(guò)任何便利的途徑，例如通過(guò)輸注或推注，通過(guò)上皮或皮膚黏膜襯里吸收，并且優(yōu)選通過(guò)推注，施用本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物。

實(shí)施例

在以下實(shí)施例中，將具有下式I的化合物稱為EDO-S101。

如WO-A-2010/085377的實(shí)施例6所述，制備EDO-S101。將EDO-S101溶解在DMSO(100X母液)中并保存在4℃，之后在使用日懸浮在介質(zhì)中。

實(shí)施例1在Sprague-Dawley大鼠中EDO-S101的CNS藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析

在以40mg/kg尾靜脈注射EDO-S101后在大鼠中確定CNS藥物代謝動(dòng)力學(xué)。通過(guò)微透析探針以18時(shí)間間隔從血液和腦室中收集微透析液樣品。用UV檢測(cè)(CE-UV)，通過(guò)毛細(xì)管電泳，確定這些樣品中的藥物濃度，接著計(jì)算各種藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

使用氣態(tài)異氟烷(在20％氧和80％氮?dú)獾幕旌衔镏械?％異氟烷)將六只大鼠麻醉，并且固定在立體定位的框架(KOPF Instruments，Tujunga，CA)中。在整個(gè)程序中保持麻醉。將每個(gè)引導(dǎo)套管(CMAMicrodialysis Inc.，Acton，MA)立體定位地植入側(cè)腦室(AP-0.9，L 1.6，V 3.4，相對(duì)于前囟和頭骨)，然后通過(guò)螺釘和牙科粘合劑固定頭骨。在外科手術(shù)后，將每只大鼠單獨(dú)收容，隨意提供食物和水3天，以從插管手術(shù)中恢復(fù)。在清醒的自由移動(dòng)的大鼠上進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，將引導(dǎo)套管中的管心針用微透析探針(CMA/11，具有4mm膜，CMA Microdialysis Inc.，Acton，MA)替換，并且將血管微透析探針(CMA/20，具有4mm膜，CMA Microdialysis Inc.，Acton，MA))植入頸靜脈。所述探針具有進(jìn)口管，所述進(jìn)口管與注射器連接以遞送人工腦脊髓液(146mM NaCl，1.2mM CaCl₂，3mM KCl，1mM MgCl₂，1.9mM Na₂HPO₄，0.1mM NaH₂PO₄，pH 7.4)到腦室中并且將Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS)遞送到血液中，流速為0.5μl/min。出口管與微級(jí)分收集器連接，以在4℃收集微透析液。在劑量給藥之前，允許大鼠恢復(fù)至少24小時(shí)。在(靜脈內(nèi))注射EDO-S101之后，在3小時(shí)內(nèi)收集十八個(gè)樣品。將所有樣品加樣至毛細(xì)管電泳，用UV檢測(cè)(CE-UV)以確定腦脊髓液(CSF)和血液中的EDO-S101的濃度。在實(shí)驗(yàn)后用CO₂吸入將大鼠處死。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)通過(guò)目檢證實(shí)探針的位置。

通過(guò)CE-UV(Agilent 3D CE)測(cè)量微透析液中的EDO-S101。簡(jiǎn)而言之，用1M氫氧化鈉將毛細(xì)管預(yù)先處理2分鐘，用水預(yù)先處理2分鐘和用運(yùn)行緩沖液[100mmol/l乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)節(jié)至pH 3.1)-乙腈(50∶50，v/v)]預(yù)先處理3分鐘。將樣品以0.7psi的壓力注射5s并且注射體積約為5nl。在注射后，將EDO-S101在50μm I.D.和50/65cm長(zhǎng)度(有效長(zhǎng)度/總長(zhǎng)度)的熔融二氧化硅毛細(xì)管中在15kv和25℃下分離。以UV在300nM檢測(cè)來(lái)自EDO-S101的吸光度。在光電倍增管(PMT)上收集發(fā)射。

為了對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用雙向重復(fù)測(cè)量ANOVA，接著是Tukey’s檢驗(yàn)。認(rèn)為P＜0.05是顯著的。作為CSF和血液曲線下面積(AUC)的比率，確定CNS穿透。

在分析結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)EDO-S101以16.5％的CNS穿透，很好地穿過(guò)血腦屏障(參見(jiàn)圖1)。其可以以11.2μM的C_max獲得高CNS濃度。因此，EDO-S101對(duì)于腦腫瘤的治療應(yīng)用是理想的。還顯示其具有非常短的在血液中約6分鐘和在腦中約9分鐘的半衰期。由于藥物濃度是基于EDO-S101在300nM的UV波長(zhǎng)下的吸光度確定的，所以所有測(cè)量值是關(guān)于未代謝化的EDO-S101的。結(jié)果總結(jié)在以下表1中。

表1

實(shí)施例2 EDO-S101和已知化合物對(duì)于各種MGMT陽(yáng)性和陰性細(xì)胞系的體外活性測(cè)試

設(shè)計(jì)體外實(shí)驗(yàn)，其中使用一系列代表MGMT陰性和MGMT陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的GBM細(xì)胞系。

化合物：1-100μM EDO-S101，1-50μM替莫唑胺(TMZ)，1-50μM替莫唑胺+500nM伏林司他，1-40μM苯達(dá)莫司汀，1-40μM苯達(dá)莫司汀和500nM伏林司他。

細(xì)胞系：A172，LN229，SNB19，SW1783，U251，U373和U87：MGMT陰性細(xì)胞系；LN18，Mz54，T98G，U138，U118：MGMT陽(yáng)性細(xì)胞系

使用了十二種代表III級(jí)和IV神經(jīng)膠質(zhì)瘤并且具有不同MGMT表達(dá)、藥物和放療敏感性的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系和五種患者來(lái)源的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞(參見(jiàn)以上)。將四種來(lái)源于患者的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞(由Hotchkiss Brain Institute，醫(yī)學(xué)系，University of Calgary，Calgary，Alberta，加拿大的J.Gregory Cairncross，和Samuel Weiss友情提供)和一種來(lái)自米蘭University la Bicocca的Angelo Vescovi教授的轉(zhuǎn)染熒光素酶的PTC#8在成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中和以非貼壁球體培養(yǎng)的方式培養(yǎng)。將細(xì)胞重懸浮于無(wú)血清的補(bǔ)充有20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(Sigma-Aldrich)，20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Sigma-Aldrich)，B-27補(bǔ)充劑1X(Gibco，Life Technologies)和抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。在將3×10³個(gè)細(xì)胞鋪平板于具有干細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔平板中之后，直接加入EDO-S101處理。在倒置顯微鏡下以×4放大率，在處理后5天對(duì)球體計(jì)數(shù)。如果球體具有至少15個(gè)細(xì)胞，將球體計(jì)數(shù)。

將細(xì)胞以2x 10⁴個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到24孔平板中。將細(xì)胞留下貼壁并在5％FCS DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)。此刻之后，將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下維持。每天用倒置相差顯微照相機(jī)(Nikon Diaphot，東京，日本)進(jìn)行形態(tài)學(xué)控制，之后將細(xì)胞用胰蛋白酶處理并計(jì)數(shù)。將用胰蛋白酶處理并重懸浮在1.0ml鹽水中的細(xì)胞用NucleoCounterTM NC-100(自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)，Chemotec，Cydevang，DK)計(jì)數(shù)，以便評(píng)估細(xì)胞生存力。所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。通過(guò)GraFit方法(Erithacus Software Limited，Staines，UK)計(jì)算IC₅₀值。使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT；Sigma-Aldrich)測(cè)定測(cè)量細(xì)胞生存力。

還如上所述測(cè)定所有十二種細(xì)胞系針對(duì)苯達(dá)莫司汀和伏林司他的IC₅₀和IC₂₀值。接下來(lái)，進(jìn)行使用固定劑量的伏林司他(IC₂₀值)和改變劑量的苯達(dá)莫司汀的組合測(cè)定。計(jì)算苯達(dá)莫司汀當(dāng)與伏林司他組合時(shí)的新IC₅₀值。

如從圖2可以看出的，U251，U373，SW1783，A172和U87 GBM細(xì)胞系對(duì)于TMZ高度敏感，而LN229，SNB19和U138中等敏感。然而，MGMT陽(yáng)性GBM細(xì)胞系LN18，Mz54，T98G和U118對(duì)于TMZ具有抗性。

在分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中，將TMZ與500nM伏林司他組合使用。已知伏林司他與TMZ在GBM細(xì)胞系中具有協(xié)同作用。如從圖3張可以看出，盡管MGMT陽(yáng)性GBM細(xì)胞系LN18和U118對(duì)于該組合時(shí)敏感的，但是T98G和Mz54仍然是極具抗性的。T98G的IC₅₀被降低，但是其并非在人中可以實(shí)現(xiàn)的劑量范圍。

圖4顯示GBM細(xì)胞系中沒(méi)有一種對(duì)于苯達(dá)莫司汀高度敏感，但是LN18，LN229，SNB19，U138，U251，U373，SW1783和U87 GBM細(xì)胞系對(duì)于苯達(dá)莫司汀中度敏感，而A172，Mz54，T98G和U118對(duì)苯達(dá)莫司汀具有抗性。如從圖5中可以看出，當(dāng)苯達(dá)莫司汀與500nM伏林司他組合時(shí)，獲得了與TMZ和伏林司他非常類似的結(jié)果，即所有細(xì)胞系(除了Mz54和T98G以外)是高度敏感的，而T98G的IC₅₀降低，它不是人中可實(shí)現(xiàn)的劑量范圍。

與其他單一化合物和組合比較，圖6張十二種測(cè)試的細(xì)胞系的IC₅₀曲線顯示了所有十二種細(xì)胞系，包括所有MGMT陽(yáng)性細(xì)胞系，對(duì)于EDO-S101是高度敏感的。這顯示EDO-S101是針對(duì)MGMT陰性和MGMT陽(yáng)性GBMs二者的高度有希望的治療劑。

對(duì)于不同細(xì)胞系的IC₅₀值的總結(jié)顯示在以下表2中。

表2

實(shí)施例3 EDO-S101在小鼠模型中對(duì)于多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的體內(nèi)評(píng)估

基于通過(guò)生物發(fā)光成像確定的腫瘤生長(zhǎng)和通過(guò)Kaplan-Meier分析確定的存活分析，在鼠腦腫瘤模型中確定EDO-S101針對(duì)GBM的治療活性。

使用立體定位平臺(tái)，在麻醉下在無(wú)胸腺小鼠中通過(guò)腦內(nèi)注射3X10⁵個(gè)轉(zhuǎn)染熒光素酶的GBM12細(xì)胞，產(chǎn)生鼠腦腫瘤模型。GBM12是MGMT陰性腫瘤細(xì)胞系。在外科手術(shù)之前，將十八周齡的無(wú)胸腺小鼠進(jìn)行最少7天適應(yīng)/隔離。在無(wú)菌條件下在層流凈化罩中進(jìn)行外科手術(shù)。給予Tylenol 300mg/kg PO，以用于在外科手術(shù)前鎮(zhèn)痛24小時(shí)，手術(shù)后持續(xù)48小時(shí)。通過(guò)吸入1-2％異氟烷實(shí)現(xiàn)麻醉。在小鼠變得完全被麻醉后，將其置于Kopf立體定位儀器中。將少量BNP抗生素軟膏(桿菌肽，新霉素和多粘菌素的混合物)涂抹在其眼睛上以防止手術(shù)期間的感染和角膜損傷。將一條軟織物放在小鼠身體和尾巴上以防止手術(shù)期間過(guò)度熱損失。頭皮區(qū)域用2％聚維酮碘(Betadine)清潔并用棉尖涂藥器干燥。在頭皮中進(jìn)行中線矢狀切割。

根據(jù)通過(guò)參考Franklin和Paxinos的小鼠腦地圖測(cè)定的坐標(biāo)(AP：0.5mm，LM：2.5mm)，在左頭骨上用外科鉆頭(Kopf)或Dremel鉆頭鉆一個(gè)小的鉆孔。將硬腦脊膜外科暴露，并將具有26S-號(hào)傾斜針頭的10μl-Hamilton注射器放低到左腦半球中直至3mm的深度，并緩慢輸入(0.5μl/min)5μl的3X10⁵個(gè)轉(zhuǎn)染了熒光素酶的GBM12細(xì)胞腫瘤細(xì)胞。將針頭放置原位達(dá)5分鐘以防止回流，然后緩慢取出。用傷口夾密封皮膚。在外科手術(shù)后，將小鼠在溫暖環(huán)境中康復(fù)并且當(dāng)運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)時(shí)返回至它們的籠子中。將籠子放在加熱墊頂部以最小化康復(fù)期間的身體熱損失。在手術(shù)后監(jiān)視小鼠，至少一天兩次，共5天，或直至康復(fù)完成。在腦內(nèi)腫瘤細(xì)胞移植后+4天開(kāi)始，然后隨后在第+11天和第+18天，通過(guò)尾靜脈施用EDO-S101(60mg/kg體重)或苯達(dá)莫司汀(50mg/kg體重)。將肢體麻痹作為存活分析的終點(diǎn)。

在腦內(nèi)注射GBM細(xì)胞后，將所有小鼠進(jìn)行生物發(fā)光成像(BLI)，從腦內(nèi)注射后第4天開(kāi)始，一周兩次，以監(jiān)視實(shí)時(shí)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。使用Xenogen Lumina光學(xué)成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)進(jìn)行BLI。用異氟烷將小鼠麻醉，之后以150mg/kg的劑量進(jìn)行熒光素的腹膜內(nèi)注射，提供熒光素酶的飽和底物濃度。在熒光素注射后10分鐘記錄到峰值發(fā)光信號(hào)。使用Living Image軟件(Xenogen，Alameda，CA)限定涵蓋顱內(nèi)信號(hào)區(qū)域的目標(biāo)區(qū)域，并且記錄總光子/s/立體弧度/cm2。

使用ANOVA來(lái)確定每個(gè)時(shí)刻實(shí)驗(yàn)組之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。使用Prism4軟件(GraphPad Software，LaJolla CA)產(chǎn)生Kaplan-Meier存活曲線，以對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)得出曲線之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。認(rèn)為P＜0.05是顯著的。

在GBM(GBM12)的該患者衍生的異種移植物模型中，將EDO-S101以IV 60mg/kg每周一次在腦內(nèi)移植腫瘤細(xì)胞后+4，+11，+18天施用(MTD劑量)。將苯達(dá)莫司汀以IV 50mg/kg在+4，+11，+18天給予(MTD劑量)。發(fā)現(xiàn)EDO-S101具有顯著的治療活性，抑制腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)存活，中值存活為66天，相比之下，苯達(dá)莫司汀為58天，并且在非處理對(duì)照中為52天(參見(jiàn)圖7a和7b)。EDO-S101具有優(yōu)異的針對(duì)該MGMT陰性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療活性。

使用細(xì)胞系U87G和U251G，以類似的方式采用上述步驟。再次，通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)施用EDO-S101(60mg/kg)，但是在這些實(shí)驗(yàn)中，將其在第1，8和15天施用。替代苯達(dá)莫司汀，施用TMZ作為比較，16mg/kg，連續(xù)5天，po。在28天之后處死小鼠。

對(duì)于已經(jīng)植入U(xiǎn)251腫瘤的小鼠，在圖8中進(jìn)展時(shí)間(TTP)概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表顯示，對(duì)于用EDO-S101處理的小鼠的TTP顯著長(zhǎng)于對(duì)于對(duì)照小鼠和用TMZ處理的那些觀察到的。對(duì)于移植了U87腫瘤的小鼠觀察到了類似的TTP的顯著增加，EDO-S101的TTP顯著長(zhǎng)于對(duì)照和TMZ兩者(參見(jiàn)圖9)。

實(shí)施例4在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的鼠模型中對(duì)于放療和替莫唑胺(單獨(dú)或組合)EDO-S101(單獨(dú)或與放療組合)的體內(nèi)評(píng)估

在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將U251，U87和T98G細(xì)胞系用單獨(dú)放療或用放療和EDO-S101處理。

對(duì)于克隆存活，將指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞(70％匯合)在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用適當(dāng)濃度的EDO-S101或載體(0.1％的DMSO終濃度)處理24小時(shí)。使用6MV線性加速器Elekta Synergy，使用臨床上校準(zhǔn)的30×30cm的輻射面積進(jìn)行腫瘤細(xì)胞輻射。在完全裝填培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶之上和之下放置兩cm厚的有機(jī)玻璃板以補(bǔ)償積累效應(yīng)(build-up effect)。除了輻射暴露以外，以與輻射的細(xì)胞一樣處理非輻射對(duì)照。在處理之后，將細(xì)胞以適當(dāng)濃度(1,000個(gè)細(xì)胞)稀釋并且再接種在新的100mm組織培養(yǎng)皿中(一式三份)并溫育14天。在第14天，去除培養(yǎng)基，并將克隆用甲醇：乙酸(10∶1，v/v)固定，并用結(jié)晶紫染色。計(jì)數(shù)含有超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的克隆。計(jì)算平板效率(PE)為觀察到的克隆數(shù)/鋪平板的細(xì)胞數(shù)。計(jì)算存活分?jǐn)?shù)為與對(duì)照中形成的數(shù)目相比在處理的平皿中形成的克隆數(shù)。根據(jù)線性-二次公式：S(D)/S(O)＝exp-(aD+bD2)，通過(guò)加權(quán)的、分層的線性回歸擬合數(shù)據(jù)，使用SPSS(Chicago，IL)統(tǒng)計(jì)軟件分析存活曲線。

對(duì)于MGMT陰性U251MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，測(cè)量的IC₅₀對(duì)于EDO-S101為6.60μM(相比之下，對(duì)于苯達(dá)莫司汀為30μM，并且對(duì)于替莫唑胺為20μM)。

對(duì)于MGMT陰性U87G成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，測(cè)量的IC₅₀對(duì)于EDO-S101為1.36μM(相比之下，對(duì)于苯達(dá)莫司汀為50μM，并且對(duì)于替莫唑胺為20μM)。

對(duì)于MGMT陽(yáng)性T98G成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，測(cè)量的IC₅₀對(duì)于EDO-S101為7.70μM(相比之下，對(duì)于苯達(dá)莫司汀為52μM，并且對(duì)于替莫唑胺為＞100μM)。

如從圖10可以看出，在所有3種GBM細(xì)胞系中，與單獨(dú)放療相比，當(dāng)放療與一個(gè)劑量的EDO-S101(2.5μM或5μM)聯(lián)用時(shí)，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的％存活率顯著降低。

接下來(lái)，采用實(shí)施例3的步驟，使用GBM細(xì)胞系U251和U87，在小鼠中制備GBMs皮下(s.c.)異種移植物模型。

將如上制備的U251小鼠進(jìn)行放療(2Gy，連續(xù)5天)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或僅對(duì)照處理。在任何輻射之前，小鼠用氯胺酮(25mg/ml)/甲苯噻嗪(5mg/ml)的混合物麻醉。麻醉的攜帶腫瘤的小鼠以2Gy的劑量接收病灶輻射，連續(xù)5天。使用X-射線線性加速器以200cGy/min的劑量速率在室溫遞送輻射。將所有小鼠用特別設(shè)計(jì)的鉛裝置屏蔽，以允許輻射到右后肢。將小鼠保持在這些條件下直至所有輻射完成。

根據(jù)實(shí)施例3的步驟進(jìn)行GBM的進(jìn)展研究。進(jìn)展時(shí)間概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表顯示在圖11中。從這很明顯，用EDO-S101處理的小鼠的進(jìn)展時(shí)間要顯著長(zhǎng)于對(duì)于放療處理的腫瘤所觀察到的。

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將以相同方式制備的U251小鼠進(jìn)行以下處理：當(dāng)前的放療和替莫唑胺的金標(biāo)準(zhǔn)處理(2Gy，連續(xù)5天，和16mg/kg，連續(xù)5天，po)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)處理，用EDO-S101和放療(2Gy，連續(xù)5天，和60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或?qū)φ仗幚怼Ｔ趫D12中顯示了進(jìn)展時(shí)間概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表。從這很明顯，用EDO-S101和放療處理的小鼠的進(jìn)展時(shí)間要顯著長(zhǎng)于用單獨(dú)EDO-S101處理的腫瘤所觀察到的。此外，對(duì)于放療和EDO-S101的組合的進(jìn)展時(shí)間要顯著長(zhǎng)于對(duì)于用放療和替莫唑胺(當(dāng)前的金標(biāo)準(zhǔn)處理)處理的腫瘤所觀察到的。

遵照相同的實(shí)驗(yàn)順序，但是這次是使用GBM細(xì)胞系U87在小鼠中制備的GBM的皮下異種移植物模型。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將如上制備的U87小鼠進(jìn)行以下處理：放療(2Gy，連續(xù)5天)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或僅對(duì)照處理。進(jìn)行GBM進(jìn)展的研究。圖13中顯示了進(jìn)展時(shí)間概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表。從這很明顯，用EDO-S101(在圖13中稱為NL101)處理的小鼠的進(jìn)展時(shí)間要顯著長(zhǎng)于對(duì)于放療處理的腫瘤所觀察到的。

在與關(guān)于U251小鼠所用類似的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將以相同方式制備的U87小鼠進(jìn)行以下處理：當(dāng)前的的金標(biāo)準(zhǔn)處理-放療和替莫唑胺(2Gy，連續(xù)5天，和16mg/kg，連續(xù)5天，po)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)處理，用EDO-S101和放療(2Gy，連續(xù)5天，和60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或?qū)φ仗幚怼D14中顯示了進(jìn)展時(shí)間概率(％)針對(duì)時(shí)間的圖表。從這很明顯，用EDO-S101和放療處理的小鼠的進(jìn)展時(shí)間要顯著長(zhǎng)于對(duì)于用單獨(dú)EDO-S101處理的腫瘤所觀察到的。此外，對(duì)于放療和EDO-S101的組合的進(jìn)展時(shí)間要顯著長(zhǎng)于對(duì)于放療和替莫唑胺(當(dāng)前的金標(biāo)準(zhǔn)處理)所觀察到的。還應(yīng)當(dāng)注意，對(duì)于用單獨(dú)EDO-S101處理的U87小鼠觀察到的進(jìn)展時(shí)間確實(shí)要大于用組合的放療和替莫唑胺處理所取得的進(jìn)展時(shí)間。

腫瘤的進(jìn)展時(shí)間從對(duì)于U251G小鼠異種移植物模型的對(duì)照的約17-18天增加至對(duì)于放療和替莫唑胺的組合的42天，到對(duì)于單獨(dú)的EDO-S101的超過(guò)50天(顯著性P＝0.924)，到對(duì)于EDO-S101和放療的組合的顯著超過(guò)50天(顯著性P＝0.0359)。

發(fā)現(xiàn)腫瘤的進(jìn)展時(shí)間從對(duì)于U87G小鼠異種移植物模型的對(duì)照的約15天增加至對(duì)于放療和替莫唑胺的組合的35天，到對(duì)于單獨(dú)的EDO-S101的40天(顯著性P＝2372)，到對(duì)于EDO-S101和放療的組合的顯著超過(guò)50天(顯著性P＝0.0001)。

實(shí)施例5腫瘤的組織學(xué)評(píng)估：U251-轉(zhuǎn)染熒光素酶的細(xì)胞的原位移植模型

將按照實(shí)施例3的步驟用U251-熒光素酶同位素地(isotopically)轉(zhuǎn)染的小鼠用以下處理：放療(2Gy，連續(xù)5天)，替莫唑胺(16mg/kg，連續(xù)5天，po)，放療和替莫唑胺(2Gy，連續(xù)5天和16mg/kg，連續(xù)5天，po)，EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或?qū)φ蛰d體。

使用Hamamatsu成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA)監(jiān)視顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。將小鼠用2％至4％異氟烷(Baxter，Deerfield，IL，USA)麻醉，接著腹膜內(nèi)注射150mg/kg d-熒光素(In Vivo Imaging Solutions)。同時(shí)測(cè)量五只動(dòng)物，并且將發(fā)光照相機(jī)設(shè)置為1分鐘曝光，中等合并(medium binning)，1f/光圈(stop)，封閉激發(fā)濾鏡，和開(kāi)啟發(fā)射濾鏡。將照相機(jī)設(shè)置為2s曝光，中等合并，和8f/光圈。將視野設(shè)定為22cm以一次捕獲五只小鼠。使用相同的設(shè)定，以一周一次的基礎(chǔ)獲取系列圖像。使用Living Image軟件(Caliper Life Sciences)定量生物發(fā)光強(qiáng)度。

在任何輻射之前，將小鼠用氯胺酮(25mg/ml)/甲苯噻嗪(5mg/ml)的混合物麻醉。麻醉的攜帶腫瘤的小鼠以2Gy的劑量接收病灶輻射，連續(xù)5天。使用X-射線線性加速器以200cGy/min的劑量速率在室溫遞送輻射。將所有小鼠用特別設(shè)計(jì)的鉛裝置屏蔽，以允許輻射到右后肢。將小鼠保持在這些條件下直至所有輻射完成。

使用下列順序獲得橫平面的所有圖像：橫向T2-加權(quán)渦輪自旋回波(turbo spin-echo，TSE)順序(重復(fù)時(shí)間[TR]微秒/回波時(shí)間[TE]微秒)6766/120，獲得信號(hào)數(shù)量4，192x 192矩陣)，應(yīng)用的切片厚度0.9mm，交叉間隙(intersection gap)0.0mm，和傾倒角160°。視野為36x 60mm²，其整體包括在腫瘤中，獲得的三維像素尺寸為0.3x 0.3x 1.0mm³。

連續(xù)變量總結(jié)為平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)或中值和中值的95％CI。對(duì)于非正態(tài)分布的連續(xù)變量，通過(guò)進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)建立對(duì)照和處理組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。對(duì)于正態(tài)分布的連續(xù)變量，通過(guò)對(duì)未成對(duì)數(shù)據(jù)(對(duì)于兩個(gè)比較)進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)或進(jìn)行Student t檢驗(yàn)，建立對(duì)照和處理組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

在開(kāi)始不同治療方案后50天，處死小鼠并在用對(duì)照、EDO-S101、替莫唑胺、以及放療和替莫唑胺進(jìn)行處理的小鼠中，將最終顱內(nèi)損傷可視化。結(jié)果顯示在圖15和16中。使用EDO-S101和替莫唑胺研究獲得類似的結(jié)果，兩者都顯示13只小鼠中5只(38.5％)具有某個(gè)級(jí)別的腫瘤，與此對(duì)比，在對(duì)照中11只小鼠中8只(72.7％)具有某個(gè)級(jí)別的腫瘤。然而，EDO-S101處理的13只小鼠中僅有1只顯示大的損傷，而13只替莫唑胺處理的小鼠中有2只顯示大的損傷。在放療和替莫唑胺研究中，11只小鼠中僅2只(18.2％)在研究結(jié)束時(shí)顯示損傷，盡管這些兩者都是大損傷。從這可以得出結(jié)論，EDO-S101在預(yù)防GBMs擴(kuò)散方面高度有效。

EDO-S101在預(yù)防GBMs擴(kuò)散方面的功效進(jìn)一步在圖17中強(qiáng)調(diào)，該圖顯示了存活概率(％)針對(duì)時(shí)間(天)的圖表。用EDO-S101處理的小鼠的存活概率顯著大于關(guān)于用放療或替莫唑胺處理的那些的存活概率。僅用放療和替莫唑胺的組合處理的小鼠顯示了與單獨(dú)EDO-S101相比更高的總存活概率。

實(shí)施例6 EDO-S101在原發(fā)性CNS淋巴瘤鼠模型中的體內(nèi)評(píng)估

重復(fù)實(shí)施例3的步驟，除了用1x 10⁵個(gè)轉(zhuǎn)染了熒光素酶的OCI-LY10B淋巴瘤細(xì)胞建立鼠模型，產(chǎn)生原發(fā)性CNS淋巴瘤模型。在腦內(nèi)移植OCI-LY10B淋巴瘤細(xì)胞后第+4，+11和+18天，將EDO-S101(60mg/kg體重)，苯達(dá)莫司汀(50mg/kg體重)和對(duì)照通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)施用于分開(kāi)的測(cè)試小鼠組。EDO-S101和苯達(dá)莫司汀兩者都顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)并且延長(zhǎng)存活，中值存活分別為62天和54天，與此對(duì)比，非處理對(duì)照為48天(參見(jiàn)圖18a和18b)。因此，EDO-S101似乎是原發(fā)性CNS淋巴瘤的有希望的治療。

實(shí)施例7 EDO-S101在腦的三陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌(Triple Metastatic Breast Cancer)的小鼠模型中的體內(nèi)評(píng)估

重復(fù)實(shí)施例3的步驟，除了用1x 10⁵個(gè)轉(zhuǎn)染了熒光素酶的MB-468乳腺癌細(xì)胞建立小鼠模型，產(chǎn)生原發(fā)性CNS淋巴瘤模型。在腦內(nèi)移植MB-468乳腺癌細(xì)胞后第+4天，將EDO-S101(60mg/kg體重)，苯達(dá)莫司汀(50mg/kg體重)和對(duì)照通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)施用于分開(kāi)的測(cè)試小鼠組。EDO-S101顯示了顯著的治療活性，抑制腫瘤生長(zhǎng)并且延長(zhǎng)存活，中值存活為71天，與此對(duì)比，苯達(dá)莫司汀為62天，并且非處理對(duì)照為55天(參見(jiàn)圖19a和19b)。因此，EDO-S101似乎是轉(zhuǎn)移性腦癌的特別有希望的治療。

總之，實(shí)驗(yàn)顯示了EDO-S101穿過(guò)血腦屏障的能力是非常好的。這使得它成為治療腦癌的有希望的候選物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，其不僅具有針對(duì)MGMT陰性GBMs的活性，而且具有針對(duì)MGMT陽(yáng)性GBMs的活性，使得其高度有希望作為治療MGMT陽(yáng)性GBMs和其他MGMT陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腦腫瘤的治療劑，因?yàn)閷?duì)于這些還未開(kāi)發(fā)出療法。還顯示了它在原發(fā)性CNS淋巴瘤和轉(zhuǎn)移性腦癌中都顯著延長(zhǎng)中值存活，再次使得它是兩種病癥的非常有希望的候選治療劑。數(shù)據(jù)還顯示，當(dāng)將EDO-S101與放療組合施用時(shí)，則它在GBM的治療中顯示了與單獨(dú)EDO-S101相比顯著改善的活性。