共使用簇集蛋白抑制劑和egfr抑制劑以治療癌癥的制作方法
【專利摘要】表皮生長因子受體(EGFR)表達和磷酸化在用抗簇集蛋白抗體治療的癌細胞中增加。這類治療還伴隨癌細胞的上皮表型復(fù)現(xiàn)，如通過癌細胞表面處增加的E-鈣黏著蛋白表達所確定。簇集蛋白抑制劑可以因此引起上皮至間充質(zhì)表型的逆轉(zhuǎn)并回復(fù)癌細胞對EGFR抑制劑的敏感性。因此提供簇集蛋白抑制劑和EGFR的組合以及它們在治療癌癥中的用途。
【專利說明】共使用簇集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑以治療癌癥

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及簇集蛋白抑制劑與表皮生長因子受體（EGFR)抑制劑用于治療癌癥的 組合。更具體地，本發(fā)明涵蓋了簇集蛋白抑制劑如抗簇集蛋白抗體恢復(fù)癌細胞對EGFR抑制 劑的敏感性或增強EGFR抑制劑作用的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 化療抗性的形成和侵襲至其他繼發(fā)部位是實體瘤惡變的共同特征。眾所周知化療 藥耐藥性的形成由參與藥物和凋亡抗性的蛋白質(zhì)過量表達引起。還相當充分地記錄了侵襲 過程。腫瘤侵襲由增加的癌細胞運動性和造成胞外基質(zhì)中蛋白質(zhì)降解的基因表達引起。存 在以下日益增加的證據(jù)：化療抗性和腫瘤侵襲可能通過稱作上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT)的生 物學(xué)過程共享共同的起點。最近研究已經(jīng)展示，轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFi3)可能是EMT的關(guān) 鍵介體。盡管這些進展，很少治療途徑可用于抑制化療抗性形成和癌癥向其他器官的擴散。 最近文獻中也已經(jīng)出現(xiàn)，發(fā)生EMT的某些腫瘤細胞去分化并采取干細胞樣特性（癌干細胞 或CSC)。如同正常干細胞那樣，CSC內(nèi)在地抵抗化療和放療。因此，靶向EMT和CSC維持過 程的特定調(diào)節(jié)物代表了一種增加針對化療藥的反應(yīng)并防止癌癥復(fù)發(fā)的非常有前景的治療 策略。
[0003] 利用充分表征細胞系作為EMT的模型，鑒定了引起EMT后上調(diào)的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)這 些蛋白質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)（稱作簇集蛋白的分泌型蛋白質(zhì)（sCLU))在EMT期間受到刺激， 并且本身可以促進EMT過程（Lenferink等人，2009)。產(chǎn)生了與sCLU相互作用的幾種高親 和力抗體，其中，在基于細胞的測定法中對它們阻斷EMT的能力測試時，中和EMT的這些抗 體均與sCLU蛋白中的相同關(guān)鍵氨基酸序列結(jié)合。這個發(fā)現(xiàn)表明sCLU的特定區(qū)域負責(zé)介導(dǎo) 其促進EMT的活性。通過阻斷sCLU中的EMT-表位，抗體，尤其命名為16B5的抗體，可以阻 斷EMT，如通過與癌細胞孵育時維持上皮細胞標志物（E-鈣黏著蛋白）的膜表達示例。另 夕卜，使用前列腺癌和胰腺癌腫瘤的人異體移植物動物研究顯示，阻斷腫瘤相關(guān)性sCLU的活 性導(dǎo)致針對標準化療藥物如多西紫杉醇和吉西他濱的反應(yīng)增加，如通過腫瘤生長顯著減少 所測量?？傊?，這些結(jié)果顯示，用能夠與sCLU中特定區(qū)域相互作用的抗體阻斷EMT導(dǎo)致腫瘤 生長抑制和針對細胞毒藥物的反應(yīng)增加（見以編號W02007/030930公開的國際申請?zhí)朠CT/ CA 2006/001505 和以編號 TO2011/063523 公開的國際申請?zhí)?PCT/CA 2010/0001882,所述 文獻的完整內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合在此
[0004] 肺癌是最常見癌癥的之一和世界范圍內(nèi)死亡的主導(dǎo)原因，每年診斷超過1百萬病 例并且非小細胞肺癌（NSCLC)占多于80%的全部肺癌。盡管診斷方案和治療方案的最新改 善，大部分患者診斷患有其中中位數(shù)存活保持不良的晚期NSCLC(Adamo等人，2009)。
[0005] NSCLC中的最重要靶之一是表皮生長因子受體（EGFR)(受體酪氨酸激酶的ErbB 家族的一個成員，其中所述受體酪氨酸激酶是在癌細胞的增殖和存活中發(fā)揮重要作用的細 胞膜受體）。它是一種巨大的跨膜糖蛋白，充當EGF和幾種另外內(nèi)源性配體的受體。它具 有三個結(jié)構(gòu)域，由胞外區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK)結(jié)構(gòu)域組成。在功能上，配體 與EGFR結(jié)合誘導(dǎo)受體二聚化，導(dǎo)致促進自身磷酸化和胞內(nèi)TK結(jié)構(gòu)域激活的結(jié)構(gòu)變化。因 此，EGFR激活影響影響細胞增殖、侵襲性、運動性、存活和凋亡的多個下游信號傳導(dǎo)途徑， 包括Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶（MAPK)和磷脂酰肌醇-3'-激酶（PI3K)/Akt途徑 (Shigematsu 等人，2005)。
[0006] 雖然EGFR普遍表達，但是它經(jīng)常在腫瘤細胞中被修飾。這些修飾包括基因擴增、 配體和/或受體過量表達和激活性突變。EGFR或其原發(fā)性配體的過量表達或失調(diào)是許多 種人實體腫瘤（包括肺癌）的特征。在NSCLC中，43 %至83 %的腫瘤過量表達EGFR (Adamo 等人，2009)。針對EGFR如靶向胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的幾種試劑或小分子能夠抑制TK 活性。
[0007] EGFR在轉(zhuǎn)移性NSCLC中的狀態(tài)和針對化療的反應(yīng)是眾多爭論的主題。盡管大比例 的腫瘤存在增加的EGFR表達，但是一些臨床研究已經(jīng)顯示這是一線療法中反應(yīng)的低劣預(yù) 測物（Barr等人，2008)。另外，盡管與單獨化療相比，用順鉬、長春瑞濱和西妥昔單抗（EGFR 單克隆抗體）一線治療的患者中存在輕微但明顯的反應(yīng)，但是在西妥昔單抗和EGFR過量表 達之間不存在相關(guān)性（Mirshahidi和Hsueh，2010)?？傮w上，在NSCLC顯中采用EGRF抑制 劑的海量臨床結(jié)果表明，受體的狀態(tài)在一線療法中不重要，直至一份最近研究報道這樣的 結(jié)果，所述結(jié)果顯示與單獨化療相比，用西妥昔單抗和化療治療的存在高EGFR表達的患者 顯示總生存期增加（Pirker等人，2012)。從這些結(jié)果顯而易見，存在涉及腫瘤中EGFR的其 他機制，這些機制影響NSCLC患者對EGFR抑制劑的反應(yīng)。
[0008] EGFR的可能影響抑制劑反應(yīng)的另外特征是允許小分子與該受體的TK活性結(jié) 合的那些特征。一些小分子已經(jīng)被開發(fā)并批準用于癌癥適應(yīng)癥，包括吉非替尼和厄洛替 尼（模擬ATP與該區(qū)域結(jié)合，因此阻止胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的兩種小分子）。然而，發(fā)現(xiàn)這些抑 制劑在一線療法中均在NSCLC中無活性，但是在二線和三線環(huán)境下實現(xiàn)明顯的臨床反應(yīng) (Mirshahidi和Hsueh，2010)。有趣地，EGFR過量表達對患者反應(yīng)無影響，但是發(fā)現(xiàn)，EGFR 和某些其他基因中的激活性突變是關(guān)鍵的。例如，發(fā)現(xiàn)激活性突變導(dǎo)致用吉非替尼治療的 患者中無進展性生存期顯著增加（Costanzo等人，2011)。此外，用厄洛替尼治療的也在稱 作KRAS的基因中具有突變的NSCLC患者顯示不反應(yīng)（Herbst和Sandler，2008)。因此，患 者選擇對試圖理解他們是否將成為EGFR TK抑制劑的反應(yīng)個體至關(guān)重要。
[0009] 如上文描述，EMT可以對腫瘤細胞將對治療作出反應(yīng)的方式具有極大影響并且癌 細胞保持上皮狀的能力對這種反應(yīng)至關(guān)重要。在基于細胞的研究中，具有增加的上皮細胞 標志物E-鈣黏著蛋白表達的細胞對EGFR抑制劑更敏感（Barr等人，2008)。與這些觀察 結(jié)果一致，在E-鈣黏著蛋白表達和厄洛替尼敏感性之間存在相關(guān)性（Yauch等人，2005)。 在腫瘤水平，已經(jīng)顯示恢復(fù)E-鈣黏著蛋白表達增加對EGFR抑制劑的敏感性（Witta等人， 2006)。然而，迄今尚未在臨床試驗中清晰檢驗EMT和EGFR狀態(tài)之間的聯(lián)系。然而，鑒于在 EGFR過量表達和針對EGFR抑制劑的反應(yīng)之間缺少相關(guān)性和缺少激活性EGFR突變對其反應(yīng) 的影響，以下情況是可能的：另外的影響如EMT可能直接參與增加 NSCLC患者中EGFR抑制 劑的功效。
[0010] 本申請?zhí)峁┮环N采用抗體治療的方法，其中所述抗體通過抑制表達EGFR的腫瘤 中的sCLU阻斷EMT。這些腫瘤中的EGFR狀態(tài)可能包括EGFR基因擴增或EGFR配體的擴增。 另外，腫瘤細胞可能包括因 EGFR和EGFR蛋白質(zhì)配偶物而增加的自分泌信號傳導(dǎo)。EGFR狀 態(tài)可能還包括EGFR中造成受體顯示增加的活性的激活性突變。在另一個實施例中，腫瘤可 能對EGFR抑制劑敏感或抵抗，所述EGFR抑制劑包括針對EGFR的單克隆抗體或消除EGFR 活性的小分子抑制劑。另外，EGFR狀態(tài)可能還包括先前為EGFR表達陰性的已經(jīng)獲得EGFR 的腫瘤。
[0011] 當表達sCLU的NSCLC細胞系暴露于抗簇集蛋白抗體時，EGFR的表達和活化均增 力口。同時，依靠用抗簇集蛋白抗體抑制EMT，NSCLC細胞系還顯示增加的E-鈣黏著蛋白表達。 總之，用與EGFR抑制劑組合的簇集蛋白抑制劑治療的NSCLC患者可以顯示針對EGFR抑制 劑的反應(yīng)增加。
[0012] 發(fā)明簡述
[0013] 本發(fā)明總體上涉及用于癌癥治療簇集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑的組合。
[0014] 本發(fā)明的方法涵蓋向有需要的個體施用能夠抑制上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT)的簇 集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑。EGFR抑制劑也可以與簇集蛋白抑制劑分開、同時或依次施 用。
[0015] 特別當觀察到、檢測到或疑似存在EGFR抗性時，可以施用簇集蛋白抑制劑。
[0016] 本發(fā)明的方法還包括施用簇集蛋白抑制劑以便阻止EGFR抗性或以便使癌細胞對 EGFR抑制劑敏化。
[0017] 附圖簡述
[0018] 圖1.肺癌細胞系表達族集蛋白。該圖顯不源自NSCLC的幾個細胞系中族集蛋白 mRNA表達的RT-PCR分析（上半圖）。作為對照，還擴增來自肌動蛋白的mRNA (下半圖）以 確保每個反應(yīng)中等量的起始物質(zhì)。
[0019] 圖2.肺癌細胞系表達簇集蛋白（sCLU)。該圖顯示對肺癌細胞系分泌的sCLU的定 量。這些量用sCLU-特異性ELISA測量并以ng/ml表述。
[0020] 圖3. hl6B5增加肺癌細胞系中的E-鈣黏著蛋白表達。該圖顯示與sCLU抑制劑 (hl6B5)孵育時A549NSCLC細胞的上皮特征增加。左圖顯示與對照IgG孵育48小時的細 胞，而右圖顯示相同條件下與hl6B5孵育的細胞。
[0021] 圖4.用hl6B5處理NSCLC細胞導(dǎo)致增加的EGFR表達。在對照溶媒或hl6B5存 在的情況下，在從A549或H226細胞制備的完整細胞裂解物中使用EGFR-特異性抗體測量 EGFR表達。
[0022] 圖5.用hl6B5處理NSCLC細胞導(dǎo)致增加的EGFR磷酸化。在對照溶媒或hl6B5存 在的情況下，在從A549或H226細胞制備的完整細胞裂解物中使用磷酸酪氨酸特異性抗體 測量EGFR磷酸化。
[0023] 圖6.用hl6B5處理NSCLC細胞導(dǎo)致增加的EGFR磷酸化。在對照溶媒、hl6B5或 對照IgG存在的情況下，在從A549或H226細胞制備的完整細胞裂解物中使用磷酸酪氨酸 特異性抗體測量EGFR磷酸化。
[0024] 圖7. hl6B5與厄洛替尼的組合導(dǎo)致增強的抗腫瘤作用。在hl6B5與厄洛替尼的組 合存在的情況下，在重組簇集蛋白存在或不存在時確定H1299癌細胞和H460癌細胞的存 活。
[0025] 發(fā)明詳述
[0026] 上皮的生長因子受體（EGFR)在幾種類型的上皮癌中過量表達。EGFR遺傳變異的 存在可以造成腫瘤對EGFR抑制劑更敏感。然而，對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI)具有初 始反應(yīng)的患者在平均一年內(nèi)復(fù)發(fā)。雖然已經(jīng)顯示EGFR外顯子9中的缺失或L858R突變導(dǎo) 致有利的臨床轉(zhuǎn)歸，但是繼發(fā)性分子事件如突變Τ790Μ、L747S和/或D761Y與耐藥性和腫 瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。也已經(jīng)顯示二者均獨立于EGFR而激活ΡΙ3/ΑΚΤ途徑的MET受體擴增和IGFR 信號傳導(dǎo)激活驅(qū)動繼發(fā)耐藥性。
[0027] 申請人:已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在用簇集蛋白抑制劑處理的癌細胞中EGFR表達和 磷酸化增加。用簇集蛋白抑制劑處理癌細胞還伴隨癌細胞的上皮表型復(fù)現(xiàn)，如通過細胞表 面處增加的E-鈣黏著蛋白表達所顯示。
[0028] 因而，簇集蛋白抑制劑不僅可以引起EMT表型的逆轉(zhuǎn)，它們還可以恢復(fù)癌細胞對 EGFR抑制劑的敏感性。
[0029] 本發(fā)明總體上涉及用于癌癥治療族集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑的組合。
[0030] 該藥物組合可以特別地包含與藥物可接受載體結(jié)合的簇集蛋白抑制劑和與藥物 可接受載體結(jié)合的EGFR抑制劑。
[0031] 本發(fā)明的方法涵蓋向有需要的個體施用簇集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑。EGFR抑 制劑可以與簇集蛋白抑制劑分開、同時或依次施用。
[0032] 特別當觀察到、檢測到或疑似存在EGFR抗性時，可以施用簇集蛋白抑制劑。
[0033] 本發(fā)明的方法還包括施用簇集蛋白抑制劑以便阻止EGFR抗性或以便使癌細胞對 EGFR抑制劑敏化。
[0034] 在本發(fā)明的個方面，族集蛋白抑制劑可以在EGFR抑制劑之如施用。例如，族集 蛋白抑制劑可以在施用EGFR抑制劑之前數(shù)小時至幾日或幾個月施用。在本發(fā)明的另一個 方面，簇集蛋白抑制劑也可以在每次用EGFR抑制劑治療的相同時間（例如，相同日）或在 每次用EGFR抑制劑治療之間施用。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，簇集蛋白抑制劑可以在施用EGFR抑制劑之前以多個劑量例如，每 日、每隔1日，一周1次、一周2次等施用。
[0036] 該方法也可以包含在施用EGFR抑制劑之前檢驗癌細胞的上皮至間充質(zhì)表型逆 轉(zhuǎn)。EMT狀態(tài)可以例如通過測量選自E-鈣黏著蛋白、RAB25、整聯(lián)蛋白β 6、波形纖維蛋白、 ΖΕΒ1和SIP1的一種或多種基因/蛋白質(zhì)的表達水平確定。
[0037] 簇集蛋白抑制劑可以通過它們損害簇集蛋白表達、分泌或簇集蛋白活性的能力來 鑒定。
[0038] 簇集蛋白抑制劑的示例性實施例包括例如因其干擾分泌型簇集蛋白（sCLU)或 TGF-β的EMT促進作用的能力而鑒定的那些。例如，可以在TGF-β或sCLU存在的情況下 用推定性簇集蛋白抑制劑處理癌細胞（例如，4T1 :乳腺癌細胞，DU145 :前列腺癌細胞等） 并且可以如下文描述那樣評估EMT的標志物?？梢詫⒛軌蛟黾由掀酥疚锉磉_和/或減少 間充質(zhì)標志物表達的推定性化合物鑒定為合適的簇集蛋白抑制劑。
[0039] 可替代地，可以在推定性簇集蛋白抑制劑存在的情況下評估癌細胞的運動性。例 如，可以在TGF-β或sCLU存在的情況下用推定性簇集蛋白抑制劑處理癌細胞并且可以如 在PCT/CA 2006/001505例如中所述那樣實施傷口愈合測定法或黑墨運動性測定法?？梢?將能夠在這些類型的測定法中抑制或減少癌細胞運動性的推定性化合物鑒定為合適的簇 集蛋白抑制劑。應(yīng)當理解其他技術(shù)可以用來鑒定合適的簇集蛋白抑制劑。
[0040] 簇集蛋白抑制劑特別由本發(fā)明涵蓋，例如包括，抗簇集蛋白抗體或其抗原結(jié)合片 段。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明，簇集蛋白抑制劑包括能夠抑制EMT的抗簇集蛋白抗體或抗原結(jié)合片 段（例如，在癌細胞中）。
[0042] 常使用的EMT的分子標志物例如包括，減少的E-鈣黏著蛋白、細胞角蛋白和 β-聯(lián)蛋白（膜中）表達和/或增加的Snail、Slug、TWiSt、ZEBl、ZEB2、N-鈣黏著蛋白、波 形纖維蛋白、a-平滑肌肌動蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等表達（見例如，Kalluri和Weinberg, The Journal of Clinical Investigation, 119(6)，第 1420-1428 頁；2009 ;Fassina 等人， Modern Pathology，25 ;第 86-99 頁；2012 ;Lee 等人，JCB ; 172 ;第 973-981 頁；2006)。EMT 表型也可以通過增加的移行、侵入能力或失巢凋亡/凋亡抵抗性區(qū)分。可以因此通過上皮 標志物的減少和間充質(zhì)標志物或EMT表型的出現(xiàn)檢出正在發(fā)生上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的細胞。
[0043] 標志物的表達可以總體上通過比較它們在一個狀態(tài)下與另一個狀態(tài)相比的細胞 表達水平（在基因水平或在蛋白質(zhì)水平（例如，包括細胞表面表達）來確定。例如，可以與 非癌細胞相比確定癌細胞中一種或多種特異性標志物的表達水平?？蛇x地，可以與對EGFR 抑制劑敏感的癌細胞相比，確定抵抗EGFR抑制劑的癌細胞中一種或多種特異性標志物的 表達水平。另外，可以評價一種或多種特異性標志物的表達水平高于統(tǒng)計上代表對照的值。
[0044] 將從這種治療獲益的個體包括患有癌（即，上皮癌）的那些，所述癌包括前列腺 癌、乳腺癌（例如，三陰性或基底樣乳腺癌）、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、肝細胞癌、結(jié)直腸癌、頭 頸癌（例如，頭頸鱗狀細胞癌）、肺癌（例如，非小細胞肺癌）、胰腺癌、腎細胞癌等（包括這 些癌癥的晚期形式或轉(zhuǎn)移形式）。
[0045] 可以用來實施本發(fā)明的抗簇集蛋白抗體的示例性實施例包括能夠與人簇集蛋白 -亞基的C末端部分的氨基酸421和443結(jié)合的那些。由本發(fā)明涵蓋的抗體或抗原結(jié)合片 段的更具體實施例包括在以編號W0 2007/030930公開的國際申請?zhí)朠CT/CA 2006/001505 和以編號W02011/063523公開的國際申請?zhí)朠CT/CA 2010/0001882中描述的那些。
[0046] 本發(fā)明特別地涵蓋具有至少一個與鑒定為16B5、21B12、20E11、16C11和11E2的 抗體的互補性決定區(qū)相同的互補性決定區(qū)（⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2和/或 ⑶RL3)的抗體和抗原結(jié)合片段。更具體地，本發(fā)明特別地涵蓋抗體和抗原結(jié)合片段，所述抗 體和抗原結(jié)合片段具有與鑒定為16B5、21B12、20E11、16C11和11E2的那些（還見PCT/CA 2006/001505)相同或者與鑒定為人源化16B5 (hl6B5)、人源化21B12 (h21B12)、hl6B5VL共 有序列1、hl6B5VL共有序列2、hl6B5VL共有序列3、hl6B5VH共有序列1、hl6B5VH共有序 列2、hl6B5VH共有序列3、h21B12VL共有序列l(wèi)、h21B12VL共有序列2、h21B12VL共有序列 3、112川12￥!1共有序列1、1121812￥!1共有序列2或1121812￥!1共有序列3的那些（還見？(：1'/ CA 2010/0001882)相同的輕鏈和/或重鏈。
[0047] 鑒定為20E11U6C11和11E2的抗體的輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的氨基酸序 列在SEQ ID NOs. :62-67中提出，其中預(yù)測的互補決定區(qū)以粗體顯示。
[0048] 抗體和抗原結(jié)合片段的其他示例性實施例包括可以與本文中所鑒定的抗體競爭 的那些
[0049] 本發(fā)明涵蓋具有本文所述特征的單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體 和人抗體（分離株）以及抗原結(jié)合片段。再次還涵蓋了包含單克隆抗體、嵌合抗體、人源化 抗體或人抗體之間的輕鏈和/或重鏈排列的抗體或抗原結(jié)合片段。
[0050] 本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段因此可以包含人恒定區(qū)的氨基酸和/或人抗體的 框架氨基酸。
[0051] 術(shù)語"抗體"指完整抗體、單克隆抗體或多克隆抗體。術(shù)語"抗體"還涵蓋多特異 性抗體如雙特異性抗體。人抗體通常由各自包含可變區(qū)和恒定區(qū)的兩條輕鏈和兩條重鏈構(gòu) 成。輕鏈可變區(qū)包含3個⑶R，它們在本文中被鑒定為旁側(cè)分布有框架區(qū)的⑶RL1、⑶RL2 和⑶RL3。重鏈可變區(qū)包含3個⑶R，它們在本文中被鑒定為旁側(cè)分布有框架區(qū)的⑶RH1、 CDRH2 和 CDRH3。
[0052] 如本文所用，術(shù)語"抗原結(jié)合片段"，指抗體的一個或多個片段，所述片段保留與抗 原結(jié)合的能力（例如，KAAG1、分泌形式的KAAG1或其變體）。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功 能可以由完整抗體的片段執(zhí)行。涵蓋于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"內(nèi)部的結(jié)合片段的例 子包括（i)Fab片段，一種由\、V H、（^和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，一 種包含由二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個Fab片段的雙價片段；（iii)由V H和CH1結(jié)構(gòu)域組成 的Fd片段；（iv)由抗體單臂的 '和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb 片段（Ward等人，（1989)Nature341:544-546);和（vi)分離的互補性決定區(qū)（Q)R)，例如 VH OTR3。另外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域'和νΗ?獨立基因編碼，但是使用重組方法，可 以將它們通過能夠使這兩個結(jié)構(gòu)域作為單條蛋白鏈產(chǎn)生的合成性接頭連接，在所述單條多 肽鏈中\(zhòng)區(qū)和V H區(qū)配對以形成單價分子（稱作單鏈Fv(scFv);見例如Bird等人（1988) Science242:423-426 ;和 Huston 等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883)。 這種單鏈抗體也意在涵蓋于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"范圍內(nèi)。另外，抗原結(jié)合片段包 括結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，其包括：（i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié) 構(gòu)域多肽（如重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、或經(jīng)接頭肽與輕鏈可變區(qū)融合的重鏈可變區(qū)）、 (ii)與鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)、和（iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球 蛋白重鏈CH3恒定區(qū)?？梢酝ㄟ^用絲氨酸殘基替換一個或多個半胱氨酸殘基修飾鉸鏈區(qū)， 從而防止二聚化。這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白進一步在US 2003/0118592和US 2003/0133939中公開。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，獲得這些抗體片段，并且按照 與完整抗體相同的方式篩選所述片段的有用性。
[0053] 典型的抗原結(jié)合位點由可變區(qū)組成，所述可變區(qū)由輕鏈免疫球蛋白和重鏈免疫球 蛋白的配對形成。抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)是非常一致的并且顯示非常相似的結(jié)構(gòu)。這些可變區(qū) 一般由相對同源的以稱作互補決定區(qū)（CDR)的3個高變區(qū)間插的框架區(qū)（FR)組成?？乖?結(jié)合片段的總體結(jié)合活性經(jīng)常由CDR的序列決定。FR經(jīng)常在CDR的三個維度的正確定位和 對齊方面發(fā)揮作用以便最佳抗原結(jié)合。
[0054] 本發(fā)明的抗體和/或抗原結(jié)合片段可以源自例如小鼠、大鼠或任何其他哺乳動物 或源自其他來源，如通過重組DNA技術(shù)。
[0055] 其他簇集蛋白抑制劑可以包括例如并且不限于siRNA(例如，靶向簇集蛋白的 RNA)和反義RNA (例如，靶向簇集蛋白的RNA)。
[0056] 反義RNA的示例性實施例例如包括在美國專利號7, 569, 551 (所述文獻的完整內(nèi) 容通過引用的方式結(jié)合在此）中描述的那些并且特別地包括0GX-011 (又稱作，custirsen 鈉、OncoGenex，還見 SEQ ID NO. :61)。
[0057] EGFR抑制劑的示例性實施例包括酪氨酸激酶抑制劑，例如，吉非替尼、厄洛替尼、 伊馬替尼、拉帕替尼或神馬替尼（semazinib)。EGFR抑制劑的其他示例性實施例例如包括 單克隆抗體，如西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗或莫蘇珠單抗（metuzumab)。
[0058] 將從用本發(fā)明藥物組合治療獲益的其他個體包括患有抵抗一種或多種EGFR抑制 劑的腫瘤的那些個體?？梢栽谑┯盟幬锝M合之前選擇這類個體。
[0059] 可以通過評價臨床參數(shù)如腫瘤復(fù)發(fā)或通過測量抵抗性的分子標志物（例如，EGFR 中或EGFR途徑（RAS/MAPK、磷脂酶C、磷脂酰肌醇3-激酶/AKT、SRC/FAK途徑等）和/或 EMT標志物中的突變、擴增），確定EGFR抑制劑抵抗性。
[0060] 檢驗EGFR抑制劑抵抗性因此可以包括確定EGFR中突變（例如，酪氨酸激酶結(jié)構(gòu) 域中的突變、截短突變、插入）的存在，確定EGFR擴增。
[0061] 如本文所用"藥物可接受載體"或"藥用載體"是本領(lǐng)域已知的并且包括但不限于 0. 01-0. 1M或0. 05M磷酸鹽緩沖液或0. 8%鹽水。另外，這類藥物可接受載體可以是水溶液 或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射 用有機酯如油酸乙酯。含水載體包括水、醇/水溶液、乳劑或懸液，包括鹽水和緩沖的介質(zhì)。 腸胃外溶媒包括氯化鈉溶液、Ringer右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸化Ringer液或不揮發(fā) 性油。靜脈內(nèi)溶媒可以包括流體和營養(yǎng)補充物、電解質(zhì)補充物，如基于Ringer右旋糖的那 些等。防腐劑和其他添加物也可以存在，如，例如抗微生物藥、抗氧化劑、絡(luò)合劑、惰性氣體 等。
[0062] 本文所述的實驗用16B5的人源化形式（hl6B5)實施。 實施例
[0063] 實例 1
[0064] NSCLC細胞系表達sCLU
[0065] 我們希望確定簇集蛋白是否在源自NSCLC腫瘤的細胞系中表達。作為第一步驟， 從每個細胞系制備總RNA并用作模板以采用隨機引發(fā)的寡核苷酸制備cDNA。使用本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的方法，用人簇集蛋白基因特異性寡核苷酸實施RT-PCR。5' -引物（ogsl788) 由SEQ ID N0:57中所示的序列編碼并且3' -弓丨物（ogsl721)由SEQ ID N0:58中所示的 序列編碼。PCR產(chǎn)物是1412bp長度。作為每個反應(yīng)中總RNA量的對照，采用對人持家基因 肌動蛋白特異的寡核苷酸進行平行RT-PCR反應(yīng)。5'-引物（ogs387)由SEQ ID N0:59中 所示的序列編碼并且3'-引物（ogs965)由SEQ ID N0:60中所示的序列編碼。PCR產(chǎn)物是 746bp長度。如圖1中所示，除一個細胞系之外，分析的全部NSCLC細胞系均含有編碼簇集 蛋白的mRNA，所述mRNA以不同的水平檢測到。如預(yù)期，肌動蛋白存在于全部RNA樣品中， 這表明在每個RT-PCR反應(yīng)中存在大約等量的起始總RNA。這項分析中使用的細胞系是：泳 道 1，A549 ;泳道 2, EKVX ;泳道 3, H0P-62 ;泳道 4, H0P-92 ;泳道 5, H322M ;泳道 6, H226 ;泳 道 7, H23 ;泳道 8, H460 ;和泳道 9, H522。
[0066] 平行地，我們確定sCLU是否由NSCLC細胞系分泌。A549、H226、H292、H46(^PH1299 細胞從ATCC(馬納薩斯，VA)購買并根據(jù)制造商的說明書培養(yǎng)。在在培養(yǎng)下幾日后并且當 細胞達到匯合時，收集來自每個細胞系的條件培養(yǎng)基用于分析。獲得設(shè)計成測量人簇集蛋 白的商業(yè)ELISA試劑盒（BioVendor LLC，Candler,NC)并且根據(jù)制造商的說明書實施分析。 如圖2的表中所顯示，全部5種培養(yǎng)基樣品均含有范圍從13. 6ng/mL至大于lOOng/mL水平 的sCLU，例外是具有低于10ng/mL水平的H226細胞系。
[0067] 總之，這些結(jié)果顯示，源自NSCLC患者的癌細胞系大量分泌sCLU并且具有響應(yīng)于 抗體（如hl6B5)的潛力，其中所述抗體抑制sCLU的EMT誘導(dǎo)活性。
[0068] 實施例2
[0069] NSCLC細胞與hl6B5的孵育導(dǎo)致上皮細胞標志物E-鈣黏著蛋白的表達增加
[0070] 我們還通過使用免疫熒光法監(jiān)測A549細胞表面上的E-鈣黏著蛋白表達，檢查 E-鈣黏著蛋白的表達。簡而言之，將細胞接種在蓋玻片上并且與10g/ml的對照IgG或 hl6B5孵育48小時。在這個孵育后，將細胞用多聚甲醛固定并且與小鼠抗人E-鈣黏著蛋 白抗體（制造商）孵育1小時。在洗滌后，將E-鈣黏著蛋白染色的細胞與綴合至羅丹明 紅-X的第二抗體孵育。將蓋玻片封裝并且通過熒光顯微術(shù)可視化特異性E-鈣黏著蛋白染 色。如圖3中所示，A549細胞在它們的細胞表面上具有E-鈣黏著蛋白的低表達并且與非 特異性IgG孵育48小時不增加這種蛋白質(zhì)的水平（見左圖）。相反，細胞與hl6B5孵育造 成A549細胞表面上E-鈣黏著蛋白染色的強度明顯增加（見右圖）。這表示細胞的上皮特 征是極高的。
[0071] 實施例3
[0072] 用hl6B5抑制sCLU引起NSCLC細胞中EGFR表達和磷酸化的增加
[0073] 在這個實例中，我們檢驗了使用hl6B5抑制EMT是否導(dǎo)致對NSCLC細胞系中EGFR 的狀態(tài)的任何影響。為了解決這個問題，將條件優(yōu)化以測量這些細胞中受體的表達和磷酸 化。已知EGFR在暴露于其配體（包括EGF)后非常迅速地磷酸化。與這種磷酸化平行相伴， 受體內(nèi)化并再循環(huán)以及其從細胞表面喪失存在。選擇分泌相對高水平sCLU的兩個細胞系 A549和H226用于這項分析。將細胞接種在多孔板中并用10 μ g/ml hl6B5、10 μ g/ml對照 IgG或溶媒PBS處理48小時。在這種孵育后，將細胞用EGF (10ng/mL)處理并將細胞在不同 時間收獲并轉(zhuǎn)化成裂解物。這些裂解物由SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至尼龍膜并且用于 蛋白質(zhì)印跡中以檢驗EGFR的表達或磷酸化。為了測量EGFR的表達，使用一種命名為克隆 1005的商業(yè)抗體（Santa Cruz, Biotech, Santa Cruz, CA)，而用命名為克隆4G10的抗磷酸 酪氨酸抗體Millipore, Etobicoke, 0N)監(jiān)測EGFR的磷酸化。如圖4中所示，如預(yù)期，用溶媒 對照處理48小時、隨后用EGFR處理的A549細胞顯示EGFR表達下降，所述EGFR表達在10 分鐘后迅速恢復(fù)（上半圖：比較泳道1與泳道2)。相反，用hl6B5抗sCLU抗體處理的A549 細胞保護細胞免于EGF誘導(dǎo)的受體降解（上半圖：比較泳道5與泳道6)。為了控制每條泳 道中蛋白質(zhì)的量，將膜用抗肌動蛋白抗體（克隆AC-15, Sigma, Oakville, 0N)再印跡，其中 所述肌動蛋白在凝膠上分離的不同樣品之間等量表達。使用相同方案檢驗另一個NSCLC細 胞系H226(下半圖）和并且觀察到的結(jié)果與采用A549細胞時觀察到的那些結(jié)果相似。在 這種情況下，當細胞用對照處理48小時時，EGF誘導(dǎo)的EGFR降解甚至更明顯（下半圖，泳道 1 4)。在細胞用hl6B5處理的情況下，未見EGFR減少（下半圖，泳道5 8)。這再次顯示 用抗體抑制sCLU導(dǎo)致EGFR表達的維持。因此，這些研究結(jié)果表明，細胞將顯示增加的EGFR 抑制劑敏感性。
[0074] 還檢驗了這些細胞中EGFR的激活。在這個實例中，膜用僅與酪氨酸磷酸化形式的 受體相互作用的抗體印跡。在A549細胞中，如預(yù)期，在EGF不存在的情況下未見EGFR的磷 酸化（見圖5,上半圖，泳道1和泳道5)。然而，當細胞用EGF處理時，檢測到磷酸化酪氨酸 殘基的出現(xiàn)，甚至在2分鐘后也是如此（上半圖，泳道2和泳道6)。與未處理的細胞相比， 用hl6B5處理48小時的細胞顯示EGFR上更高量的磷酸化酪氨酸殘基。EGFR磷酸化的這 種差異重現(xiàn)于H226細胞中（見圖5,下半圖，比較泳道2 4與泳道6 8)。作為另外的對 照，A549細胞在暴露于EGF之前還用對照抗體處理48小時（圖6)。再次，EGFR磷酸化的 量的變化僅見于用hl6B5處理的細胞中（比較泳道2、3 (對照）和泳道8、9 (IgG)與泳道5、 6(hl6B5))。
[0075] 總之，我們的結(jié)果顯示肺癌細胞中阻斷EMT影響這些細胞中的EGFR狀態(tài)。具體而 言，用單克隆抗體如hl6B5抑制sCLU誘導(dǎo)EMT的活性是借以改變這些癌細胞中EGFR狀態(tài) 的機制之一。我們顯示，用hl6B5處理的肺癌細胞具有增加的E-鈣黏著蛋白表達并且因此 更有上皮性質(zhì)。預(yù)期EGFR敏感性增加與通過用抗體阻斷sCLU而抑制EMT的組合增加 EGFR 抑制劑的功效。最后，預(yù)期表達EGFR并發(fā)生EMT的任何癌細胞均以類似于肺癌細胞的方式 響應(yīng)于sCLU的抑制劑，如單克隆抗體。
[0076] 實施例4
[0077] 用于在hl6B5存在的情況下增加癌細胞對EGFR抑制劑的敏感性的方法
[0078] 通過用抗簇集蛋白抗體阻斷sCLU而抑制癌細胞中的EMT，導(dǎo)致細胞表面上增加的 EGFR表達或增加的EGFR磷酸化或這兩種情況。因此期望EGFR的抑制劑在其中用簇集蛋白 抑制劑抑制EMT的條件下具有增加的功效。
[0079] 例如，將癌細胞系接種在多孔平板中并且當接近于匯合時，將細胞用抗簇集蛋白 抗體（例如，hl6B5)處理以抑制EMT。它可以有用于先驗地以已知誘導(dǎo)物如sCLU、TGF3、 EGFR的配體（如EGF)或其他相似分子誘導(dǎo)EMT。
[0080] 還將EGFR抑制劑（例如，阻斷配體與受體結(jié)合或阻止EGFR二聚化的單克隆抗體、 TK抑制劑等）與抗簇集蛋白抗體一起或稍后（例如，數(shù)小時后）添加至各孔。在某種情況 下，可以將EGFR抑制劑在抗簇集蛋白抗體之前添加至各孔。
[0081] EGFR抑制劑可以按范圍從lfmol/L至100毫摩爾/L的不同濃度添加。為了確定 用hl6B5抑制sCLU時EGFR抑制劑的細胞毒性是否增加，使用標準方案如增殖測定法、侵襲 測定法、凋亡測定法或遷移測定法確定剩余細胞的數(shù)目。適用于這種測定法的癌細胞包括 抗EGFR抑制劑的癌細胞或表達野生型EGFR、含有激活性突變的EGFR、EGFR基因擴增和其 中可能改變EGFR狀態(tài)的其他情況的癌細胞。
[0082] 也可以在充分建立的癌癥模型體內(nèi)測試簇集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑組合。例 如，將表達EGFR的人癌細胞系注射在免疫受損的小鼠中并允許其生長直至植入腫瘤異體 移植物。動物用與（同時或依次施用的）EGFR抑制劑組合的抗簇集蛋白抗體（例如，16B5、 hl6B5或其他抗體）治療以阻斷EMT。通過各種方法監(jiān)測腫瘤的生長，所述方法包括用儀器 如卡鉗直接測量尺寸。在腫瘤細胞經(jīng)基因修飾以表達熒光分子或生物發(fā)光分子的情況下， 用來測量腫瘤生長的其他方法可能包括熒光法或生物發(fā)光法。在另一種情況下，可以使用 正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)（PET)或計算機斷層成像（CT)掃描方法監(jiān)測腫瘤生長。在這些測定 法中，簇集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑可以通過不同途徑反復(fù)施用，所述途徑包括靜脈內(nèi)、 皮下、肌內(nèi)腫瘤內(nèi)或經(jīng)口途徑。常見劑量將從1微克/kg至100mg/kg。
[0083] 基于這種方法的應(yīng)用，將可能顯示，采用與EGFR抑制劑組合的阻斷EMT的藥物 (如16B5、hl6B5或其他）的治療將導(dǎo)致與單獨使用任一種治藥劑相比，增強的抗腫瘤作用。
[0084] 在這個例子中，我們顯示與sCLU的抑制劑（如hl6B5)組合施用時，可以增加 對癌細胞對EGFR抑制劑的反應(yīng)。已知表達野生型EGFR的兩個NCSLC細胞系Η1299和 H460(Akashi等人，2008)用sCLU(0. 25g/ml)、TGF0 (2ηΜ)或這兩種蛋白質(zhì)的組合處理 48小時以刺激ΕΜΤ。在這種誘導(dǎo)后，將細胞用厄洛替尼（20 μ Μ)處理96小時并且使用 Cel lTiter-Gl〇?.發(fā)光細胞生存力測定法（Promega，Madison，WI)，確定細胞的數(shù)目。 作為對照，不用sCLU或TGF0誘導(dǎo)另外的細胞。如圖7A中所示，H1299細胞比H460細胞 對厄洛替尼更敏感。厄洛替尼與hl6B5的組合導(dǎo)致細胞數(shù)目進一步減少（分別是10. 2% 和13. 8%更少的H1299和H460細胞），表明阻斷內(nèi)源表達的sCLU的活性（見圖2)增強厄 洛替尼殺死EGFR陽性肺癌細胞的能力。我們還在受sCLU或TGFi3誘導(dǎo)以發(fā)生EMT的細胞 中比較對厄洛替尼的反應(yīng)。如圖7B中所示，刺激EMT不改變細胞對厄洛替尼的反應(yīng)性。然 而，在這些條件下，與不發(fā)生EMT的細胞相比，細胞數(shù)目的減少在hl6B5存在的情況下更大 (對于H1299細胞和H460細胞，分別是16. 1%和24. 0% )。這表示當抑制EMT時，細胞中 厄洛替尼-反應(yīng)的增加更大。值得注意的是，觀察到厄洛替尼反應(yīng)性的增加在更抵抗這種 EGFR抑制劑的H460細胞中更大。最后這個結(jié)果顯示了用hl6B5抑制sCLU作為治療抵抗 EGFR抑制劑的肺癌患者的策略的潛力。
[0085] 實施例5
[0086] 藥物組合用于在其他癌癥適應(yīng)癥中使用
[0087] 已知為三陰性（即，缺少雌激素受體和孕酮受體表達并且不存在HER2-表達）的 乳腺癌細胞系MDA-MB-231或基底樣乳腺癌細胞系用與吉非替尼組合的抗簇集蛋白抗體或 用單獨的吉非替尼處理。通過標準測定法在幾日時間范圍內(nèi)測量細胞生長。
[0088] 這個實驗顯示抗簇集蛋白抗體與吉非替尼的組合比單獨的吉非替尼更有效抑制 腫瘤細胞生長（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0089] 可以使用與實例1-5中描述的那些技術(shù)相似的技術(shù)測試其他簇集蛋白抑制劑和/ 或EGFR抑制劑組合。
[0090] 序列表
[0091] SEQ ID NO. : 1
[0092] 16B5 CDRH1:GFNIKDIYMH
[0093] SEQ ID NO. :2
[0094] 16B5 CDRH2:RIDPAYGNTKYDPKFQG
[0095] SEQ ID NO. :3
[0096] 16B5 CDRH3:RYDTAMDY
[0097] SEQ ID NO. :4
[0098] 16B5 CDRL1:KSSQSLLNSRTRKNYLA
[0099] SEQ ID NO. :5
[0100] 16B5 CDRL2:WASTRES
[0101] SEQ ID NO. :6
[0102] 16B5 CDRL3:KQSYNLWT
[0103] SEQ ID NO. :7
[0104] hl6B5人源化重鏈可變區(qū)
[0105] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDIYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAYGNTKYDPKFQGRVT ITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYDTAMDYWGQGTLVTVSS
[0106] SEQ ID NO. :8
[0107] hl6B5人源化輕鏈可變區(qū)
[0108] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLWTFGQGTKLEIK
[0109] SEQ ID NO. :9
[0110] hl6B5的完整重鏈免疫球蛋白序列
[0111] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDIYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAYGNTKYDPKFQGRVT ITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCArRYDTAMDYwgqgtlvtvsSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVEC PPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVS VLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0112] SEQ ID NO. : 10
[0113] hl6B5的完整輕鏈免疫球蛋白序列
[0114] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLWTFGQGTKLEIKVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0115] SEQ ID NO. :11
[0116] 21B12 CDRH1:GYTFTNYGMH
[0117] SEQ ID NO. : 12
[0118] 21B12 CDRH2:WINTYTGEPTYADDFKG
[0119] SEQ ID NO. : 13
[0120] 21B12 CDRH3:DGFLYFFDY
[0121] SEQ ID NO. : 14
[0122] 21B12 CDRL1:KSSQSLLYSSNQKNYLA
[0123] SEQ ID NO. : 15
[0124] 21B12 CDRL2:WASTRES
[0125] SEQ ID NO. : 16
[0126] 21B12 CDRL3:QQYYIYPRT
[0127] SEQ ID NO. : 17
[0128] h21B12人源化重鏈可變區(qū)
[0129] QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFV FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDGFLYFFDYWGQGTLVTVSS
[0130] SEQ ID NO. : 18
[0131] h21B12人源化輕鏈可變區(qū)
[0132] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYIYPRTFGQGTKLEIK
[0133] SEQ ID NO. : 19
[0134] h21B12的完整重鏈免疫球蛋白序列
[0135] QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMHWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFV FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARdGFLYFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVE CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVV SVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0136] SEQ ID NO. :20
[0137] h21B12的完整輕鏈免疫球蛋白序列
[0138] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYIYPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0139] SEQ ID NO. :21
[0140] hl6B5的重鏈的完整核苷酸序列
[0141] ATGGACTGGACCTGGCGGATCCTGTTCCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACCCACGCCCAGGTGCAGCTG GTGCAGTCTGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCACCGTCAAGATCAGCTGCAAGGTGTCCGGCTTCAACATCAA GGACATCTACATGCACTGGGTGCAGCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGCCGGATCGACCCTGCCTACG GCAACACCAAGTACGACCCTAAGTTCCAGGGCCGGGTGACCATCACCGCCGACACCTCCACCGACACCGCCTACATG GAACTGTCCTCCCTGCGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGAGATACGACACCGCCATGGATTACTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCA GGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA
[0142] SEQ ID NO. :22
[0143] h21B12的重鏈的完整核苷酸序列
[0144] ATGGACTGGACCTGGCGGATCCTGTTTCTGGTGGCCGCTGCTACCGGCACACACGCCCAGGTGCAGCTG GTGCAGTCCGGCTCCGAGCTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCAC CAACTACGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCTGGATCAACACCTACACCG GCGAGCCTACCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGATTCGTGTTCTCCCTGGACACCTCCGTGTCCACCGCCTACCTG CAGATCTCCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGGCTTCCTGTACTTCTTCGACTA CTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCT CCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCC TGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTC CTCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACA CCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCT AGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGT GGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCA AGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAAC GGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGG CCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCGCGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCT GTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAG ACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCA GCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGT CTCCTGGCAAGTGA
[0145] SEQ ID NO. :23
[0146] H16B5的輕鏈的完整核苷酸序列
[0147] ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCCTACGGCGACATCGTG ATGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGTCCCT GCTGAACTCCCGGACCCGGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCT ACTGGGCCTCCACCCGGGAGTCCGGCGTGCCTGACCGGTTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACC ATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCAAGCAGTCCTACAACCTGTGGACCTTCGGCCAGGG CACCAAGCTGGAGATCAAGCGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAAC GCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
[0148] SEQ ID NO. :24
[0149] h21B12的輕鏈的完整核苷酸序列
[0150] ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTACGGCGACATCGTG ATGACCCAGTCCCCCGACTCTCTGGCTGTGTCCCTGGGCGAGCGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGTCCCT GCTGTACTCCTCCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCT ACTGGGCCTCCACCCGGGAATCTGGCGTGCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACC ATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACATCTACCCTCGGACCTTCGGCCA GGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGA AGTCCGGCACCGCCTCTGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGAC AACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTC CACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCT CTCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
[0151] SEQ ID NO. :25(鼠 16B5VL)
[0152] DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFT GSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEFK
[0153] SEQ ID NO. :26(hl6B5VL 共有 1)
[0154] DIVMXQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQXPKLLIYWASTRESGVPDRFX GSGSGTDFTLTISSXQAEDXAVYYCKQSYNLffTFGXGTKLEXK ；
[0155] 與SEQ ID NO. :25中所述多肽中的相應(yīng)氨基酸相比，X是一個氨基酸置換。
[0156] SEQ ID NO. :27(hl6B5VL 共有 2)
[0157] DIVMXalQSPXa2SLAVSXa3GEX a4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQX a8PKLLIYWASTR ESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXal0QAEDX allAVYYCKQSYNL-WTFGXal2GTKLEXal3K
[0158] Xal是中性親水氨基酸，例如，T或S;
[0159] 父&是0 或 S;
[0160] Xa3是疏水性氨基酸，例如，L或A ;
[0161] Xa4是堿性氨基酸，例如，R或K ;
[0162] Xa5是疏水性氨基酸，例如，A或V ;
[0163] Xa6是疏水性氨基酸，例如I或Μ ;
[0164] Xa7是N或S;
[0165] 父泌是？或S;
[0166] Xa9是中性親水氨基酸，例如，S或Τ ;
[0167] XalQ是疏水性氨基酸，例如，L或V ;
[0168] Xall是疏水性氨基酸，例如，V或L ;
[0169] Xal2 是 Q 或 G 并且；
[0170] Xal3 是 I 或 F。
[0171] SEQ ID NO. :28(hl6B5VL 共有 3)
[0172] DIVMXalQSPXa2SLAVSXa3GEX a4Xa5TXa6Xa7CKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQX a8PKLLIYWASTR ESGVPDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXal0QAEDX allAVYYCKQSYNL-WTFGXal2GTKLEXal3K
[0173] Xal 是 T 或 S ;Xa2 是 D 或 S ;Xa3 是 L 或 A ;Xa4 是 R 或 K ;Xa5 是 A 或 V ;Xa6 是 I 或 M ;Xa7 是N或S ;Xa8是P或S ;Xa9是S或T ;Xal(l是L或V ;Xall是V或L ;Xal2是Q或G并且；Xal3是 I或F。
[0174] SEQ ID NO. :29(鼠 16B5VH)
[0175] EVQLQQSGAELVKPGASVRLSCTTSGFNIKDIYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAYGNTKYDPKFQGKAT ITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARRYDTAMDYWGQGTSVTVSS
[0176] SEQ ID NO. :30(hl6B5VH 共有 1)
[0177] XVQLXQSGAEXXKPGAXVXXSCXXSGFNIKDIYMHWVXQXPXXGLEWXGRIDPAYGNTKYDPKFQGXXT ITADTSXXTAYXXLSSLXSEDTAVYYCArRYDTAMDYWGQGTXVTVSS ；
[0178] 與SEQ ID NO. :29中所述多肽中的相應(yīng)氨基酸相比，X是一個氨基酸置換。
[0179] SEQ ID NO. :31(hl6B5VH 共有 2)
[0180] XblVQLXb2QSGAEXb3X b4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8X b9SGFNIKDIYMHWVXbl0QXbllPXbl 2X bl3GLEWXbl4GRIDPAYGNTKYDPKFQGXbl5Xbl6TITADTSX bl7Xbl8TAYXbl9Xb20LSSLXb21SEDT-AVYYCARRYDTAMDYWGQGTX b22VTVSS ；
[0181] Xbl是Q或E;
[0182] 父)32是￥或〇;
[0183] Xb3是疏水性氨基酸，例如，V或L ;
[0184] 父)34是1(或 V;
[0185] Xb5是中性親水氨基酸，例如，T或S;
[0186] Xb6是堿性氨基酸，例如K或R ;
[0187] Xb7是疏水性氨基酸，例如I或L ;
[0188] 父^是仄或T;
[0189] 父)39是￥或1';
[0190] Xbl(l是堿性氨基酸，例如Q或K ;
[0191] Xbll 是 A 或 R;
[0192] Xbl2 是 G 或 E;
[0193] Xbl3是堿性氨基酸，例如K或Q ;
[0194] Xbl4是疏水性氨基酸，例如Μ或I ;
[0195] Xbl5是堿性氨基酸，例如R或Κ ;
[0196] Xbl6是疏水性氨基酸，例如V或A ;
[0197] Xbl7是中性氨基酸，例如T或S;
[0198] Xbl8 是例如 D 或 N;
[0199] Xbl9是疏水性氨基酸，例如Μ或L ;
[0200] Xb2Q 是 Ε 或 Q ;
[0201] Xb21 是 R 或 T 并且；
[0202] 父1^2是1^或5。
[0203] SEQ ID NO. :32(hl6B5VH 共有 3)
[0204] XblVQLXb2QSGAEXb3X b4KPGAXb5VXb6Xb7SCXb8X b9SGFNIKDIYMHWVXbl0QXbllPXbl 2X bl3GLEWXbl4GRIDPAYGNTKYDPKFQGXbl5Xbl6TITADTSX bl7Xbl8TAYXbl9Xb20LSSLXb21SEDT-AVYYCARRYDTAMDYWGQGTX b22VTVSS ；
[0205] Xbl 是 Q 或 E ;Xb2 是 V 或 Q ;Xb3 是 V 或 L ;Xb4 是 K 或 V ;Xb5 是 T 或 S ;Xb6 是 K 或 R ;Xb7 是I或L ;Xb8是K或T ;Xb9是V或T ;Xbl(l是Q或K ;Xbll是A或R ;Xbl2是G或E ;Xbl3是K或 Q ;Xbl4 是 M 或 I ;Xbl5 是 R 或 K ;Xbl6 是 V 或 A ;Xbl7 是 T 或 S ;Xbl8 是 D 或 N ;Xbl9 是 M 或 L ;Xb2Q 是E或Q ;Xb21是R或T并且；Xb22是L或S。
[0206] SEQ ID NO. :33(鼠 21B12VL)
[0207] DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFT GSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYIYPRTFGGGTKLEIK
[0208] seq id no. :34(h21B12VL 共有 1)
[0209] DIVMXcQSPXSLAVSXGEXXTXXCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQXPGQXPKLLIYWASTRESGVPDRF XGSGSGTDFTLTISSXXAEDXAVYYCQQYYIYPRTFGXGTKLEIK
[0210] 與SEQ ID NO. :33中所述多肽中的相應(yīng)氨基酸相比，X是一個氨基酸置換。
[0211] seq id no. :35(h21B12VL 共有 2)
[0212] DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEX c4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQX c8PGQXc9PKLLIYWAS TRESGVPDRFXc10GSGSGTDFTLTISSX c11Xc12AEDXc13AVYYCQQYYIYPRTFGXc14GTKLEIK ；
[0213] Xcl是中性氨基酸，例如T或S ;
[0214] 父。2是0 或 S;
[0215] Xe3是疏水性氨基酸，例如L或V ;
[0216] Xc4是堿性氨基酸，例如R或K ;
[0217] Xe5是疏水性氨基酸，例如A或V ;
[0218] Xe6是疏水性氨基酸，例如I或Μ ;
[0219] Xc7是N或S;
[0220] Xe8是堿性氨基酸，例如Κ或R ;
[0221] Xe9 是 P 或 S;
[0222] XclQ是中性氨基酸，例如S或T ;
[0223] Xcll是疏水性氨基酸，例如L或V ;
[0224] Xel2是堿性氨基酸，例如Q或K ;
[0225] Xel3是疏水性氨基酸，例如V或L并且；
[0226] Xcl4 是 Q 或 G。
[0227] seq id no. :36(h21B12VL 共有 3)
[0228] DIVMXc1QSPXc2SLAVSXc3GEX c4Xc5TXc6Xc7CKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQX c8PGQXc9PKLLIYWAS TRESGVPDRFXc10GSGSGTDFTLTISSX c11Xc12AEDXc13AVYYCQQYYIYPRTFGXc14GTKLEIK ；
[0229] Xcl 是 T 或 S ;Xc2 是 D 或 S ;Xc3 是 L 或 V ;Xc4 是 R 或 K ;Xc5 是 A 或 V ;Xc6 是 I 或 M ;Xc7 是N或S ;Xe8是K或R ;Xe9是P或S ;Χε1(ι是S或T ;Χε11是L或V ;Xel2是Q或Κ ;Χε13是V或 L并且；\14是〇或G。
[0230] SEQ ID NO. :37(鼠 21B12VH)
[0231] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMHWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFA FSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARDGFLYFFDYWGQGTTLTVSS
[0232] seq id no. :38(h21B12VH 共有 1)
[0233] QXQLVQSGXELKKPGXXVKXSCKASGYTFTNYGMHWVXQAPGXGLXWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFX FSLXTSXSTAYLQIXXLKXEDTAXYXCARdGFLYFFDYWGQGTXXTVSS
[0234] 與SEQ ID NO. :37中所述多肽中的相應(yīng)氨基酸相比，X是一個氨基酸置換。
[0235] seq id no. :39(h21B12VH 共有 2)
[0236] QXdlQLVQSGXd2ELKKPGXd3X d4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6QAPGXd7GLX d8WMGWINTYTGEPTY ADDFKGRFXd9FSLXdl0TSX dllSTAYLQIXdl2Xdl3LKXdl4EDTAX dl5YXdl6CARDGFLYFFDYWGQGTXdl7Xdl8TVSS ；
[0237] Xdl是疏水性氨基酸，例如V或I ;
[0238] Xd2 是 S 或 P ;
[0239] Xd3 是 A 或 E ;
[0240] Xd4是中性氨基酸，例如S或T ;
[0241] Xd5是疏水性氨基酸，例如V或I ;
[0242] Xd6是堿性氨基酸，例如R或K ;
[0243] Xd7是堿性氨基酸，例如Q或Κ ;
[0244] Xd8 是 Ε 或 Κ ;
[0245] Xd9是疏水性氨基酸，例如V或A ;
[0246] XdlQ是酸性氨基酸，例如D或E ;
[0247] Xdll是疏水性氨基酸，例如V或A ;
[0248] Xdl2 是 S 或 N ;
[0249] Xdl3 是 S 或 N ;
[0250] Xdl4 是 A 或 N ;
[0251] Xdl5 是 V 或 T;
[0252] Xdl6是芳族氨基酸，例如Y或F ;
[0253] Xdl7 是 L 或 T 并且；
[0254] Xdl8是疏水性氨基酸，例如V或L。
[0255] seq id no. :40(h21B12VH 共有 3)
[0256] QXdlQLVQSGXd2ELKKPGXd3X d4VKXd5SCKASGYTFTNYGMHWVXd6QAPGXd7GLX d8WMGWINTYTGEPTY ADDFKGRFXd9FSLXdl0TSX dllSTAYLQIXdl2Xdl3LKXdl4EDTAX dl5YXdl6CARDGFLYFFDYWGQGTXdl7Xdl8TVSS ；
[0257] Xdl 是 V 或 I ;Xd2 是 S 或 P ;Xd3 是 A 或 E ;Xd4 是 S 或 T ;Xd5 是 V 或 I ;Xd6 是 R 或 K ;Xd7 是Q或K ;Xd8是E或K ;Xd9是V或A ;Xdl。是D或E ;Xdll是V或A ;Xdl2是S或N ;Xdl3是S或 N ;Xdl4 是 A 或 N ;Xdl5 是 V 或 T ;Xdl6 是 Y 或 F ;Xdl7 是 L 或 T 并且；Xdl8 是 V 或 L。
[0258] SEQ ID NO. :41 (16B5VL 的人模式）
[0259] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNSKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPYSFGQGTKLEIK
[0260] SEQ ID NO. :42(16B5VH 的人模式）
[0261] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVT ITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIPLFGRDHWGQGTLVTVSR
[0262] SEQ ID NO. :43(21B12VL 的人模式）
[0263] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNSKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPYS FGQGTKLEIK
[0264] SEQ ID NO. :44(21B12VH 的人模式）
[0265] QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFV FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDWGQGTLVTVSSVATIDENWFDP
[0266] SEQ ID NO. :45
[0267] 16B5 CDRH1 (較短形式）：GFNIHHY
[0268] SEQ ID NO. :46
[0269] 16B5 CDRH2(較短形式）：IDPAYGNT
[0270] SEQ ID NO. :47
[0271] 16B5 CDRH3 :ARRYDTAMDY
[0272] SEQ ID NO. :48
[0273] 1部5 CDRL1 (較短形式）：QSLLNSRTRKNY
[0274] SEQ ID NO. :49
[0275] 16B5 CDRL2 (較短形式）：WAS
[0276] SEQ ID NO. :50
[0277] 16B5 CDRL3:KQSYNLWT
[0278] SEQ ID NO. :51
[0279] 21B12 CDRH1:GYTFTNYG
[0280] SEQ ID NO. :52
[0281] 21B12 CDRH2:INTYTGEP
[0282] SEQ ID NO. :53
[0283] 21B12 CDRH3:X3X4DGFLYFFDY
[0284] X3 是 A ;
[0285] X4 是 R ;
[0286] 或X3和X4在CDRH3外部
[0287] SEQ ID NO. :54
[0288] 21B12 CDRL1:QSLLYSSNQKNY
[0289] SEQ ID NO. :55
[0290] 21B12 CDRL2:WAS
[0291] SEQ ID NO. :56
[0292] 21B12 CDRL3:QQYYIYPRT
[0293] SEQ ID NO :57
[0294] GAGCAGAGCGCTATAAATACG
[0295] SEQ ID NO :58
[0296] CACGGTCTCCATAAATTTAGG
[0297] SEQ ID NO :59
[0298] TTGCGGCCGCAATACAATGAGCTGCGTGTGGC
[0299] SEQ ID NO :60
[0300] GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG
[0301] SEQ ID NO. :61
[0302] 簇集蛋白反義：5' -CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT-3'
[0303] SEQ ID NO. :62(2〇Ell 可變輕鏈）
[0304] DIVLTLSPASLAVSLGQRATISCRASQSVNSSNYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGS GSGTHFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLEIK
[0305] SEQ ID NO. :63(2〇Ell 可變輕鏈）
[0306] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFA FSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARTGSSGYFDCWGQGTTLTVSS
[0307] SEQ ID NO. :64(11E2 可變輕鏈 Grl)
[0308] ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNS YSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPFTFGSGTKLEIK
[0309] SEQ ID NO. :65(11E2 可變輕鏈 GR2)
[0310] DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGR DYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLLRTFGGGTKLEIK
[0311] SEQ ID NO. :66(11E2 可變重鏈）
[0312] EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQNNGKSLEWIGNIDPYYGTPNYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCALNSLLRLNAMDYWGQGTSVTVSS
[0313] SEQ ID NO. :67(16C11 可變重鏈）
[0314] EVQLQQSGPELGKPGASVKISCKASGYSFTGYNMYWVKQSHRKSLEWIGYIDPYNGDTSYNQKSKGKAT LTADRSSSTAYMHLNSLTSEDSGIYYCARGAYGSSYAYWGQGTLVAVSA
[0315] 參考文獻
[0316] Lenferink，Α· Ε·，C. Cantin 等人（2009) · "Transcriptome prof iling of a TGF-beta-induced epithelial_t〇-mesenchymal transition reveals extracellular clusterin as a target for therapeutic antibodies (TGF-β 誘導(dǎo)的上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)變 的轉(zhuǎn)錄組剖析揭示胞外簇集蛋白作為治療性抗體的祀）." 0ncogene29:831。
[0317] Adamo, V.，T. Franchina 等人（2009) "Gefitinib in lung cancer therapy (肺癌 療法中的吉非替尼）."Cancer Biol Ther8:206。
[0318] Shigematsu Η·，L· Lin L 等人，（2005) "Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancer^與肺癌表皮生長因子受體基因突變相關(guān)的臨床特征和生物特征）."J Natl Cancer Inst97:339。
[0319] Barr，S.，S. Thomson 等人，（2008) "Bypassing cellular EGF receptor dependence through epithelial-to-mesenchymal-like transitions (借助上皮至間充 質(zhì)轉(zhuǎn)變的旁路細胞EGF受體依賴性）."Clin Exp Metastasis25:685。
[0320] Mirshahidi，Η· R.，C. Τ·，Hsueh (2010) "Updates in non-small cell lung cancer-insights from the2009 45th annual meeting of the American Society of Clinical 0ncology(非小細胞肺癌新進展-來自2009年美國臨床腫瘤學(xué)會第45屆年會的 深入認識）· "J Hemat&0ncol3:18。
[0321] Pirker，R.，J. R.，Peirera 等人，（2012) "EGFR expression as a predictor of survival for first-line chemotherapy plus cetuximab in patients with advanced non-small-cell lung cancer:analysis of data from the phase3FLEX study(EGFR表 達作為晚期非小細胞肺癌患者中一線化療外加西妥昔單抗的存活預(yù)測物：來自in期FLEX 研究的分析數(shù)據(jù)" Lancet 13:33。
[0322] Costanzo, R. , M. C. , Picciri 11 〇 (20 11) ^Gefitinib in non small cell lung cancer(非小細胞肝癌中的吉非替尼吉非替尼）."J Biomed Biotechno12011:815269. 815269〇
[0323] Herbst，R. S. and A. Sandler (2008) "Bevacizumab and erlotinib:A promising new approach to the treatment of advanced NSCLC(貝伐珠單抗和厄洛替尼：一種治療 晚期NSCLC的有前景的新方法）." 0ncologistl3:1166。
[0324] Yauch, R. L. , T. Januario (2005) "Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients (上皮表型與間充質(zhì)表型決定體外敏感性并預(yù)測厄洛替尼在肺癌患 者中的臨床活性）."Clin Cancer Res5:8686。
[0325] Witta 等人，Cancer Res. 66:944-950, 2006
[0326] Akashi，Υ·，Okamoto, Τ·等人，（2008)，Br J Cancer98:749。
【權(quán)利要求】
1. 一種藥物組合，包含簇集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合，其中該簇集蛋白抑制劑能夠抑制上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn) 變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合，其中該簇集蛋白抑制劑是抗簇集蛋白抗體或 其抗原結(jié)合片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合，其中該抗簇集蛋白抗體或抗原結(jié)合片段與人簇集 蛋白β -亞基的C末端部分的氨基酸421至443結(jié)合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的藥物組合，其中該EGFR抑制劑是酪氨酸激酶抑 制劑或抗EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要5所述的藥物組合，其中該酪氨酸激酶抑制劑是吉非替尼、厄洛替尼、伊 馬替尼、拉帕替尼或神馬替尼。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合，其中該酪氨酸激酶抑制劑是吉非替尼。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合，其中該抗體是西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗 或莫蘇珠單抗。
9. 一種治療癌的方法，包括向患有或疑似患有癌的個體施用簇集蛋白抑制劑和EGFR 抑制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該簇集蛋白抑制劑能夠抑制上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)變 (EMT)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中該簇集蛋白抑制劑是抗簇集蛋白抗體或其 抗原結(jié)合片段。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該抗簇集蛋白抗體或抗原結(jié)合片段與人簇集蛋 白β -亞基的C末端部分的氨基酸421至443結(jié)合。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項所述的方法，其中該EGFR抑制劑是酪氨酸激酶抑制 劑或抗EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該酪氨酸激酶抑制劑是吉非替尼、厄洛替尼、伊 馬替尼、拉帕替尼或神馬替尼。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該酪氨酸激酶抑制劑是吉非替尼。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該抗體是西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗或 莫蘇珠單抗。
17. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該抗簇集蛋白抑制劑和該EGFR抑制劑依次施用。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該抗簇集蛋白抑制劑在該EGFR抑制劑之前施 用。
19. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該抗簇集蛋白抑制劑與該EGFR抑制劑同時施用。
20. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，包括在施用該EGFR抑制劑之前檢驗癌細胞的上皮至 間充質(zhì)表型的逆轉(zhuǎn)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求9至20中任一項所述的方法，其中該癌是前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi) 膜癌、卵巢癌、肝細胞癌、結(jié)直腸癌、頭頸癌、肺癌、胰腺癌或腎細胞癌。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中該乳腺癌是三陰性乳腺癌或基底樣乳腺癌。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中該肺癌是非小細胞肺癌。
24. 根據(jù)權(quán)利要求9至23中任一項所述的方法，其中該癌包含表征為抵抗EGFR抑制劑 的細胞。
25. 根據(jù)權(quán)利要求9至23中任一項所述的方法，其中該癌包含表達EMT標志物的細胞。
26. 根據(jù)權(quán)利要求9至25中任一項所述的方法，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段包含如 SEQ ID NO. :USEQ ID NO. :2,SEQ ID NO. :3,SEQ ID NO. :4,SEQ ID NO. :5,SEQ ID NO. :6, SEQ ID NO. :45、SEQ ID NO. :46、SEQ ID NO. :47、SEQ ID NO. :48、SEQ ID NO. :49或 SEQ ID NO. :50中所述的互補性決定區(qū)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合區(qū)包含如SEQ ID NO. :1中所 述的CDRH1、如SEQ ID NO. :2中所述的CDRH2和如SEQ ID NO. :3中所述的CDRH3。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合區(qū)包含如SEQ ID NO. :45中 所述的CDRH1、如SEQ ID NO. :46中所述的CDRH2和如SEQ ID NO. :47中所述的CDRH3。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合區(qū)包含如SEQ ID NO. :4 中所述的CDRL1、如SEQ ID NO. :5中所述的CDRL2、如SEQ ID NO. :6中所述的CDRL3。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合區(qū)包含如SEQ ID NO. :48中所述的CDRL1、如SEQ ID NO. :49中所述的CDRL2和如SEQ ID NO. :50中所述的 CDRL3。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的藥物組合用于治療癌的用途。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的藥物組合在制造用于治療癌的藥劑中的用途。
33. -種試劑盒，包含簇集蛋白抑制劑和EGFR抑制劑。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中該簇集蛋白抑制劑是抗體或其抗原結(jié)合片 段。
【文檔編號】A61K31/5377GK104159611SQ201380010493
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月22日
【發(fā)明者】G·B·特姆勃雷, E·維奧, M·菲林 申請人:阿萊斯亞生物療法股份有限公司