專利名稱：一種利用納米二氧化硅包裹熒光蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用納米二氧化硅包裹熒光蛋白的方法，屬于納米無機材料及生物化學領域。
背景技術：
納米二氧化硅是一種無毒、生物相容性好的無機納米材料，且其表面易于修飾和改性，被廣泛的應用于生物標記、納米探針、載藥體系等生物醫(yī)學領域。利用納米二氧化硅包裹特定分子制備特殊材料應用十分廣泛，如利用納米二氧化硅包裹藥物、利用納米二氧化硅包裹熒光物質提高量子產率等，但是其潛在生物毒性是無法回避問題。本發(fā)明首次報到二氧化硅包裹熒光蛋白，具有優(yōu)異生物相容性和分散性并成功應用于小動物活體成像。

發(fā)明內容
根據(jù)現(xiàn)有技術存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種利用納米二氧化硅包裹熒光蛋白的方法，并且適用于其他蛋白質，具有以下的過程和步驟
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷與熒光蛋白共價連接取1-100 mg的熒光蛋白和50-1000ul的3_氛丙基二乙氧基娃燒,在10-500 mg I-(3-二甲氛基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和10-500 mg N-羥基丁二酰亞胺存在下反應，經G 25脫鹽和1000-10000 g超濾即得產物；
b.包裹近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅的制備將50-500mg的堿性氨基酸加入去離子水中充分攪勻，加入上述O. 1-1 ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷與熒光蛋白共價連接產物，再加入10-100 ul四乙氧基硅烷和環(huán)己烷，室溫攪拌反應完全后，3500g超濾洗滌3-5次除去氨基酸等雜質，即可得到包含熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的突出的優(yōu)點
本發(fā)明利用一種簡單的方法制備包裹熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒，將熒光蛋白包裹在納米二氧化硅內部，通過包裹改善了熒光蛋白的穩(wěn)定性，具有更好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，且具有不易被酶解和熒光不易被淬滅等優(yōu)良的性能，大大擴展了蛋白的利用范圍和領域。將所得的包含熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒分散在生理鹽水中，通過小動物尾靜脈注射，在小動物活體成像系統(tǒng)中能夠成功的進行小動物光學顯像。


圖I為本發(fā)明所得包含近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的透射電子顯微鏡(TEM)照片圖。圖2為本發(fā)明所得包含近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒的動態(tài)光散射(DLS)圖。圖3為本發(fā)明所得為同等濃度下的包含近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與近紅外熒光蛋白的熒光光譜圖。
圖4為本發(fā)明所得包含近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與近紅外熒光蛋白在小鼠肝臟S9體系中對比曲線圖。圖5為本發(fā)明所得包含近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒與近紅外熒光蛋白酶解對比曲線圖。圖6為本發(fā)明所得直接包裹近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒小鼠尾靜脈注射的小動物活體成像圖。
具體實施例方式下面結合附圖，將本發(fā)明的具體實施例進一步說明于后。
實施例I
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷與近紅外熒光蛋白共價連接取一定量的近紅外熒光蛋白(叫 650)，溶于14.6毫升pH為7. 5的磷酸鹽緩沖液，加入200毫克1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，250毫克N-羥基丁二酰亞胺，再加入400微升3-氨丙基三乙氧基硅烷，磁力攪拌24小時，經脫鹽和超濾即得產物；
b.包裹近紅外突光蛋白(eqFP650)的納米二氧化娃的制備取75mg賴氨酸加入15ml去離子水中充分攪勻，加入2. Iml上述3-氨丙基三乙氧基硅烷與熒光蛋白共價連接產物，再加入18ul四乙氧基硅烷和12ul環(huán)己烷，室溫劇烈攪拌反應12小時，在逐步加入18ul四乙氧基硅烷和12ul環(huán)己烷室溫攪拌12小時至完全反應。超濾洗滌(3500g /分左右)數(shù)次除去氨基酸等雜質，即可得到包含近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒。c.將所得的包含近紅外熒光蛋白(eqFP650)的納米二氧化硅顆粒分散在生理鹽水中，通過小鼠尾靜脈注射。在小動物活體成像系統(tǒng)中能夠成功的進行小動物光學顯像。實施例2
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷與近紅外熒光蛋白共價連接取一定量的近紅外熒光蛋白(叫 650)，溶于14.6毫升pH為7. 5的磷酸鹽緩沖液，加入200毫克1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，250毫克N-羥基丁二酰亞胺，再加入400微升3-氨丙基三乙氧基硅烷，磁力攪拌24小時，經脫鹽和超濾即得產物；
b.包裹mNeptune熒光蛋白的納米二氧化硅的制備取IOOmg賴氨酸加入15ml去離子水中充分攪勻，加入I. Iml上述3-氨丙基三乙氧基硅烷與熒光蛋白共價連接產物，再加入18ul四乙氧基硅烷和12ul環(huán)己烷，室溫劇烈攪拌反應12小時，在逐步加入18ul四乙氧基硅烷和12ul環(huán)己烷室溫攪拌12小時至完全反應。超濾洗滌(4000 g /分左右)數(shù)次除去氨基酸等雜質，即可得到包含近紅外熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒。c.將所得的包含mNeptune熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒分散在生理鹽水中，通過小鼠尾靜脈注射。在小動物活體成像系統(tǒng)中能夠成功的進行小動物光學顯像。實施例3
可將實施例I中的近紅外突光蛋白換成其他紅外突光蛋白(Infrared FluorescentProteins),其他操作方法參照實施例1，仍可得到包裹紅外熒光蛋白的納米二氧化硅材料應用于活體成像中。a.所制備的包含熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒具有優(yōu)異的分散性。將制備的納米顆粒分散在磷酸鹽緩沖液，生理鹽水，細胞培養(yǎng)液，牛血清中靜置三個月仍能夠均勻分散在溶液中沒有出現(xiàn)沉淀。b.所制備的包含熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒在穩(wěn)定性和熒光強度方面較單純的熒光蛋白有顯著的提升。所制備的熒光納米顆粒在抗變性劑，抗蛋白酶解，抗小鼠肝S9方面較熒光蛋白有著顯著的提升，且在相同濃度下其熒光強度時單純熒光蛋白的I. 5倍。c.所制備的包含熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒具有優(yōu)異的生物相容性和生物安全性。所制備的包裹熒光蛋白的納米顆粒相對于傳統(tǒng)的含有重金屬的量子點熒光探針來說，具有優(yōu)異的生物相容性，不會對生物體產生潛在安全隱患。
d.納米二氧化硅包裹的熒光蛋白能夠成功的應用于動物水平成像。將所得的包含熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒分散在生理鹽水中，通過小鼠尾靜脈注射。在小動物活體成像系統(tǒng)中能夠成功的進行小動物光學顯像。
權利要求
1.一種利用納米二氧化硅包裹熒光蛋白的方法，其特征在于，具有以下的步驟 a.3-氨丙基三乙氧基硅烷與熒光蛋白共價連接取1-100 mg的熒光蛋白和50-1000ul的3_氛丙基二乙氧基娃燒,在10-500 mg I-(3-二甲氛基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和10-500 mg N-羥基丁二酰亞胺存在下反應，經G 25脫鹽和1000-10000 g超濾即得產物； b.包裹熒光蛋白的納米二氧化硅的制備將50-500mg的堿性氨基酸加入去離子水中充分攪勻，加入上述3-氨丙基三乙氧基硅烷與熒光蛋白共價連接產物O. 1-3 ml，再加入10-100 ul四乙氧基硅烷和環(huán)己烷，室溫攪拌反應完全后，3500g超濾洗滌3-5次除去氨基酸等雜質，即可得到包含熒光蛋白的納米二氧化硅顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用納米二氧化硅包裹蛋白質的方法。屬于納米無機材料及生物醫(yī)學領域。本發(fā)明方法的主要步驟是將一定量的3-氨丙基三乙氧基硅烷與蛋白質共價連接，然后，利用堿性氨基酸催化四乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷與蛋白質共價連接產物水解，即可得到包裹近紅外、紅外、綠色熒光蛋白的熒光納米二氧化硅顆粒；制備方法簡單易行，所制得的納米顆粒具有極好穩(wěn)定性、分散性和生物安全性，且具有不易被酶解優(yōu)良的性能；能成功的應用于小動物活體成像。
文檔編號A61K49/00GK102961762SQ201210442948
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權日2012年11月8日
發(fā)明者曹傲能, 楊宇, 崔陽冬, 韓凱, 王海芳 申請人:上海大學