專利名稱：人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗體融合蛋白作為心肌梗死治療藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人sDR5 (soluble death receptor 5, sDR5)蛋白和sDR5-Fc抗體融合蛋白(sDR5-Fc)的藥用用途，尤其是人sDR5蛋白和sDR5_Fc抗體融合蛋白作為心肌梗死急救和治療藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是指心肌的缺血性壞死,為在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上，冠狀動脈的血流急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌出現(xiàn)嚴重而持久的急性缺血，最終導致心肌的缺血性壞死?！ぜ毙孕募」Ｋ朗菄乐匚：θ祟惤】档男难芗蔽Ｖ匕Y。我國心肌梗死的發(fā)病率為50/10萬左右，每年死于心肌梗死及其并發(fā)癥的人數(shù)已超過100萬，且隨著人口老齡化程度的加劇，AMI發(fā)病率逐年攀升。另外值得注意的是，AMI發(fā)病年齡年輕化趨勢也日趨嚴重。世界衛(wèi)生組織有報告指出，即使從現(xiàn)在開始就采取有力的預防措施，我國心血管疾病發(fā)病率的上升趨勢也將持續(xù)到2020年左右。臨床研究證明心肌缺血及缺血-再灌注過程均會造成嚴重的損傷，引起心肌細胞死亡。目前，臨床對于急性心肌梗死的治療僅包括1)監(jiān)護和一般治療；2)解除疼痛；3)心肌血流再灌注，包括介入(PTA)和溶栓；4)消除心律失常；5)控制休克等在內(nèi)的對癥治療和血運重建，尚沒有直接基于心肌細胞死亡機制的治療藥物，這主要受限于對心肌細胞的死亡機制還不夠清楚。所以，對心肌細胞的死亡機制進行深入研究，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)效果好、特異性強、作用快、副作用少的心肌梗死治療藥物迫在眉睫。細胞死亡包括壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis),其中壞死曾一度被認為是心肌梗死的主導因素。近年來，凋亡在心肌梗死中的作用日益受到重視。死亡受體5 (Death receptor, DR5)與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNF — relatedapoptosis-inducing ligand, TRAIL)結(jié)合所激活的死亡受體通路,可通過招募相關(guān)蛋白形成DISC(death-inducing signaling complex),進而級聯(lián)式活化Caspase_8、3等，引起細胞凋亡。全長的DR5是含有411個氨基酸的I型跨膜糖蛋白?？扇苄运劳鍪荏w5( solubleDR5，sDR5)因缺乏跨膜區(qū)域不能在細胞膜上表達而被分泌至細胞外。sDR5在正常人外周血中表達較低，因其具有與TRAIL配體相結(jié)合的胞外段完整結(jié)構(gòu)，可與細胞膜上的死亡受體競爭性結(jié)合TRAIL分子，從而阻斷TRAIL誘導的細胞凋亡。有研究表明sDR5可通過阻斷TRAIL誘導的細胞凋亡來減輕乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝細胞損傷(參見Yu_Gang Liu , Su-Xia Liu , Xiao-Hong Liang et al.Blockade of TRAIL pathway ameliorates HBV-induced hepatocyte apoptosis in anacute hepatitis model. Biochemical and Biophysical Research Communications352 (2007) 329 - 334)及改善因缺血造成的中樞系統(tǒng)損傷(參見Min Cui，Limei Wang,Xiaohong Liang et al. Blocking TRAIL-DR5 signaling with soluble DR5 reducesdelayed neuronal damage after transient global cerebral ischemia. Neurobiologyof Disease 39 (2010) 138 - 147)。目前，sDR5對于同樣因缺血引起的心肌梗死是否存在治療作用，國內(nèi)外尚無報 道。急性心肌梗死及血運重建后再灌注損傷的發(fā)生與心肌細胞的過度凋亡密切相關(guān)，針對凋亡發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導通路，利用sDR5與膜型DR5競爭結(jié)合TRAIL，使TRAIL不能啟動凋亡程序的發(fā)生，這樣可減少心肌梗死范圍，延長心肌細胞死亡“窗口期”，改善患者長期預后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于研究人sDR5和sDR5-Fc抗體融合蛋白通過阻斷/封閉TRAIL-死亡受體通路來減少心肌細胞凋亡的作用，并進一步提供人sDR5和sDR5-Fc抗體融合蛋白作為心肌梗死治療藥物的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗體融合蛋白作為心肌梗死治療藥物的應(yīng)用，尤其是作為急性心肌梗死或心肌梗死-再灌注損傷治療藥物的應(yīng)用。人SDR5蛋白或SDR5-FC抗體融合蛋白在制備阻斷TRAIL誘導的細胞凋亡藥物中的應(yīng)用。所述人SDR5蛋白或SDR5-FC抗體融合蛋白通過阻斷TRAIL/DR5通路誘導的細胞凋亡，來減少心肌梗死面積，以達到保護心肌細胞的作用。人sDR5蛋白或sDR5_Fc抗體融合蛋白與其它藥物在急性心肌梗死中的協(xié)同治療應(yīng)用。人sDR5蛋白或sDR5_Fc抗體融合蛋白的蛋白序列、序列修飾及相關(guān)生物工程產(chǎn)品在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用酵母來源的人sDR5蛋白，在Wistar大鼠心肌梗死模型中測試了人sDR5對心肌梗死的治療作用，分別獲得所述人sDR5能夠減少心肌梗死面積、降低心肌細胞凋亡率的結(jié)果。實驗結(jié)果顯示通過單次尾靜脈注射,在心肌缺血6h模型中，O. 5 - 2mg/只所述的人sDR5與對照組相比均可明顯減少心肌梗死面積，最佳劑量為I. 5mg/只，可減少心肌梗死面積50% (見圖3)。另外，所述的人sDR5可明顯降低缺血模型中心肌細胞凋亡率(見圖4)。在心肌缺血72小時模型中，通過多次(Img/次)尾靜脈注射(_5、0、24h、48h，結(jié)扎冠脈時間計為0)，72h取材，實驗結(jié)果顯示所述的人sDR5與對照組相比可減少心肌梗死面積24% (見圖5);同樣的給藥方式在心肌缺血-再灌注模型中可減少心肌梗死面積32% (見圖6)。另外，本發(fā)明利用中國倉鼠卵巢細胞(CHO)來源的人sDR5_Fc抗體融合蛋白在大鼠心肌缺血6小時模型中通過3mg/只單次尾靜脈注射，與對照組相比可減少心肌梗死面積42. 7%，并且能顯著降低缺血模型中心肌細胞凋亡率(見圖8、9)。本發(fā)明通過動物實驗證實，所述的人sDR5和SDR5-FC抗體融合蛋白能阻斷TRAIL/DR5通路誘導的細胞凋亡，減少心肌梗死面積，達到保護心肌細胞的作用，對心肌梗死和心肌梗死-再灌注損傷有治療作用，作為新型候選藥物極具開發(fā)潛力和臨床應(yīng)用前景。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)及本發(fā)明所述人sDR5和sDR5_Fc抗體融合蛋白的作用效果，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明在制備治療急性心肌梗死的藥物中的應(yīng)用進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了理解和說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員或其他人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對其做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖I純化的人SDR5蛋白對TRAIL誘導Jurkat細胞凋亡的阻斷效應(yīng)；
A為純化前后蛋白考馬斯亮藍染色；B. 200ngTRAIL單獨或與Img人sDR5蛋白同時加入5 X IO6Jurkat細胞，24小時后流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，加入培養(yǎng)基組作為對照；圖2 TRAIL和DR5在大鼠急性心肌梗死中的表達；
A、B. real-time PCR檢測大鼠缺血6小時模型各處理組心肌組織DR5及TRAIL的mRNA水平；C 為 Western blot 檢測蛋白表達。MI myocardial infarction ；
圖3大鼠缺血6小時模型各處理組心肌組織TTC染色及心肌梗死面積統(tǒng)計；
其中將心肌梗死PBS處理組梗死面積計為100%，各處理組均為相對梗死面積；下
同；
圖4人sDR5可減少大鼠缺血6小時模型心肌細胞凋亡；
圖5缺血72小時大鼠模型中sDR5對心肌細胞的保護作用；
圖6缺血-再灌注72小時大鼠模型中sDR5對心肌細胞的保護作用；
IR: Ischemia Reperfusion ；
圖7人sDR5-Fc質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達和體外功能檢測；
WCL: whole cell lysis; IP: Immunoprecipitation ；
圖8缺血6小時大鼠模型中人sDR5-Fc融合蛋白對心肌細胞的保護作用；
圖9人sDR5-Fc可減少大鼠缺血6小時模型心肌細胞凋亡。
具體實施例方式 以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。實施例I :
人sDR5蛋白的制備活化含pGAPZaA — sDR5的畢赤酵母GS115菌株(參見Song K,Chen Y, Goke R, et al. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) is an inhibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progression.J Exp Med, 2000; 191(7) :1095- 1104)，挑取轉(zhuǎn)化陽性的酵母菌，30°C培養(yǎng)72小時后收集培養(yǎng)上清，經(jīng)Eppendorf離心機低溫高速離心(4 °C,8 000 rpm, 30 min)后利用His親和層析柱純化重組sDR5蛋白。獲得純化的重組人sDR5蛋白，經(jīng)SDS-PAGE (見圖I A)檢測純度；BCA法測定純化后的濃度并稀釋至lmg/ml ;用流式細胞術(shù)進行Annexin V及PI雙染檢測純化的人sDR5蛋白對TRAIL誘導人白血病細胞系Jurkat細胞凋亡作用的阻斷效應(yīng)，200ng/ml TRAIL誘導Jurkat細胞凋亡達80%，人sDR5預處理可基本阻斷細胞凋亡(見圖IB)。轉(zhuǎn)化陽性的畢赤酵母GS115菌株可成功表達分子量大小約為20 kD的sDR5蛋白，純化后的sDR5蛋白經(jīng)鑒定，結(jié)果顯示獲得了高純度的重組人sDR5蛋白，蛋白產(chǎn)量達20 mg/L ;經(jīng)去內(nèi)毒素和過濾除菌后進行體外活性檢測，結(jié)果顯示純化的人sDR5蛋白可阻斷TRAIL誘導的Jurkat細胞凋亡。最后，將經(jīng)上述驗證后的人sDR5蛋白-80 °C保存，備用。實施例2 :人sDR5蛋白對急性心肌梗死大鼠心肌細胞的保護作用(I)急性心肌梗死大鼠動物模型的制備
清潔級雄性Wistar大鼠(體重200 — 250g)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 — 4ml/kg)，氣管插管并在打開肋間隙之前接呼吸機，調(diào)參數(shù)吸呼比1:2，呼吸頻率90 - 120次/分，潮氣量2 — 4ml ;胸骨左緣3 — 4肋間橫行切口，剪開心包，暴露心臟，以肺動脈圓錐與左心耳交界處的左冠狀靜脈為標志，于左心耳下緣正中約O. Icm處繞左前降支穿線結(jié)扎，同時設(shè)假手術(shù)組作為對照(只穿線不結(jié)扎)。術(shù)后常規(guī)注射青霉素40萬U/只。將進行冠狀動脈結(jié)扎的大鼠隨機分組，分為PBS組、人血清白蛋白組(HSA)和人sDR5組，每組根據(jù)劑量不同再分為三小組，每小組6只老鼠，實驗均重復三次，具體實驗方法及結(jié)果敘述如下。在冠狀動脈結(jié)扎后30min，人sDR5組通過大鼠尾靜脈分別注射人sDR5 O. 5mg,lmg, I. 5mg, 2mg ;HSA組分別通過尾靜脈注射人血清白蛋白O. 5mg, lmg, I. 5mg, 2mg ;PBS組則通過尾靜脈注射相應(yīng)劑量的無菌PBS?！?2)TRAII^PDR5在大鼠急性心肌梗死中的表達
把所用到的耗材和器械進行去RNA酶處理。將新鮮的各處理組大鼠心肌組織置于裝有Trizol的EP管中，剪碎并勻漿，抽提總RNA。經(jīng)去除基因組DNA和逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后進行real-time PCR檢測TRAIL、DR5的RNA水平，GAPDH作為內(nèi)參。與假手術(shù)組相比，缺血6小時注射PBS及注射HSA的大鼠心肌組織TRAIL、DR5的RNA水平明顯升高(見圖2A、2B)。將心肌組織進行勻漿，提取總蛋白，用Western blot檢測TRAIL、DR5蛋白表達，得到類似結(jié)果(見圖2C)。( 3)大鼠心肌組織TTC (氯化三苯四唑)染色
用水合氯醛將大鼠麻醉，開胸并快速剪下左心室，將取下的組織在預冷的生理鹽水中漂洗三次，置_20°C冷凍I小時。染色前從冰箱中取出組織，在錫箔紙上迅速切成Imm厚的切片并置于裝有TTC染液的12孔板中，37°C避光孵育15min，然后用組織沖洗應(yīng)用液(TTC染液試劑盒，南京建成科技有限公司)將組織表面多余的染液沖掉，觀察并拍照。與假手術(shù)組相比，缺血6小時注射PBS及注射HSA的大鼠心肌出現(xiàn)大面積灰白區(qū)(即梗死區(qū))，而注射sDR5的大鼠梗死區(qū)縮小，其中注射劑量達到I. 5mg時梗死面積最小，與對照組相比減少達50% (見圖3 A，3B)。心肌梗死面積計算方法梗死區(qū)心肌重量/左心室心肌重量X 100% ;心肌梗死面積減少率計算方法(缺血組梗死面積-用藥組梗死面積)/缺血組梗死面積X100%。在心肌缺血72小時模型及缺血-再灌注(結(jié)扎半小時后打開結(jié)扎線)72小時模型中，通過多次(lmg/次)尾靜脈注射(_5、0、24、48h，結(jié)扎冠脈時間計為0)，72h取材，經(jīng)染色取得與上述類似的結(jié)果，其中缺血72小時模型sDR5可減少心肌梗死面積24% ;缺血-再灌注72小時模型sDR5可減少心肌梗死面積32% (見圖5，6)。(4)人sDR5和sDR5_Fc抗體融合蛋白對心肌細胞凋亡的抑制
利用TUNEL標記試劑盒(ROCHE)，分別將各組大鼠心肌組織石蠟包埋切片進行TUNEL染色，顯微鏡下觀察心肌組織細胞凋亡情況。與假手術(shù)組相比，缺血6小時注射PBS及注射HSA的大鼠心肌出現(xiàn)大量凋亡細胞(TUNEL染色胞核呈棕色)，而注射人sDR5和sDR5_Fc抗體融合蛋白組大鼠凋亡心肌細胞顯著減少(見圖4、9)。實施例3 :人sDR5_Fc融合蛋白的制備和應(yīng)用
以實施例I中帶人sDR5的酵母菌為PCR模板，將DR5胞外段基因序列(133個氨基酸)克隆入帶人IgG Fe段的真核表達載體pGS-Fc中，設(shè)計引物為SenSe (5’ -3’)ggaagcttgccaccATG GAA CAA CGG GGA CAG, antisense (5，-3，): aagaattcTCT GGT CGTGGT GCA GGG ;質(zhì)粒構(gòu)建如圖7A、7B所示。提取高純度質(zhì)粒(OMEGA Plasmid Midi Kit)并調(diào)整濃度為500 ng/μ 1，將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，48小時后收集上清和細胞，用ProteinA/G珠子對上清和細胞裂解液進行吸附，Western blot檢測融合蛋白表達(見圖7C)。復蘇CH0/K1細胞，調(diào)整細胞狀態(tài)至最佳，瞬時電轉(zhuǎn)(300v，間隔時間O. 125s，持續(xù)時間O. Ims,電擊三次)，24小時后收集上清并經(jīng)親和層析柱純化得到人sDR5-Fc抗體融合蛋白。目前本發(fā) 明融合蛋白產(chǎn)量可達到10mg/L。用純化后的蛋白進行體外功能驗證，檢測其是否可以阻斷TRAIL誘導的人白血病細胞系Jurkat細胞凋亡，結(jié)果顯示人sDR5_Fc抗體融合蛋白有很好的阻斷效應(yīng)(見圖7 D)。將上述人sDR5_Fc融合蛋白用于心肌缺血6小時大鼠模型中(方法同人sDR5)，經(jīng)TTC染色發(fā)現(xiàn)與對照組相比，3mg人SDR5-FC抗體融合蛋白單次注射可減少心肌梗死面積達42. 7%，且大鼠凋亡心肌細胞顯著減少(見圖8、9)。
權(quán)利要求
1.人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗體融合蛋白作為心肌梗死治療藥物的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人sDR5或sDR5-Fc抗體融合蛋白作為急性心肌梗死或心肌梗死-再灌注損傷治療藥物的應(yīng)用。
3.人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗體融合蛋白在制備阻斷TRAIL誘導的細胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求I至3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗體融合蛋白通過阻斷TRAIL/DR5通路誘導的細胞凋亡，來減少心肌梗死面積，以達到保護心肌細胞的作用。
5.人sDR5蛋白或sDR5-Fc抗體融合蛋白的蛋白序列、序列修飾及相關(guān)生物工程產(chǎn)品在制備治療心肌梗死藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人sDR5(可溶性死亡受體5，solubleDR5，簡稱sDR5)蛋白和sDR5-Fc抗體融合蛋白(sDR5-Fc)的藥用用途，尤其是人sDR5和sDR5-Fc抗體融合蛋白作為心肌梗死急救和治療藥物的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)實驗證實，所述的人sDR5蛋白和sDR5-Fc抗體融合蛋白在大鼠心肌缺血模型和缺血-再灌注模型中可明顯減少心肌梗死面積，并顯著降低心肌細胞凋亡率。本發(fā)明作為治療心肌梗死的新型候選藥物，極具開發(fā)潛力。
文檔編號A61K38/17GK102949708SQ20121044268
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者馬遠方, 陳有海, 王明麗, 王耀輝, 張軍, 劉廣超, 李淑蓮, 劉峰濤, 胡延忠 申請人:河南大學