專利名稱：一種長效人血管內(nèi)皮生長因子165的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人血管內(nèi)皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備屬于長效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域涉及DNA重組技術(shù)，藥物蛋白與HSA的融合使得藥物成為長效藥物。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長因子由!^errara等于1989年首次在牛垂體星狀濾泡細(xì)胞體外培養(yǎng)液中純化獲得，可刺激細(xì)胞遷移、増殖和內(nèi)皮細(xì)胞表達各種基因，特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)體內(nèi)血管的形成并增加血管通透性的細(xì)胞因子，是ー種最主要的血管生成因子。在改變心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、防治動靜脈血管損傷和防治血管再狹窄，以及促進心血管、胰島移植等方面均有重要作用，并為腫瘤治療的研究開辟了新的途徑。VEGF 根據(jù)VEGFmRNA剪接方式不同分為多個變構(gòu)體，有VEGF121、VEGF145, VEGF165、VEGF183、 VEGF189, VEGF206。VEGF165是體內(nèi)最多的亞型，其生物活性最強且cDNA擴增豐度最高， 故在臨床和實驗中應(yīng)用最廣，由于其能加速血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell, VEC)損傷的修復(fù)，使血管內(nèi)血栓形成及血栓性閉塞減少，并抑制內(nèi)膜增生，倍受國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。然而，由于hVEGF165分子量非常小，體內(nèi)代謝速度相當(dāng)快，因此為了達到治療效果，需要頻繁大劑量用藥。昂貴的價格和頻頻用藥造成的不便將嚴(yán)重限制了此種藥物的應(yīng)用。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血漿中的主要蛋白成分，它除了具有維持血漿滲透壓功能以外，還能擔(dān)當(dāng)許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，從而調(diào)節(jié)激素活性，所載物質(zhì)的毒性，以及藥物的利用度。成熟的HSA有585個氨基酸殘基組成，含有17對 ニ硫鍵，分子量約為66. 5KDa，如此大的分子量減小了它在內(nèi)循環(huán)時經(jīng)腎排泄的量，再正常情況下，不易被腎小球慮過，血漿半衰期在20天左右。同吋，HSA在人體內(nèi)沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，是ー種理想的生物活性蛋白載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個內(nèi)容是提供hVEGF165與HSA生理特性于一體的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白，該融合蛋白在保持了人血管內(nèi)皮生長因子165生理特性的基礎(chǔ)上，増加了作用位點，延長了體內(nèi)半衰期，具有優(yōu)良的藥學(xué)特性。該融合蛋白的基因序列及氨基酸序列如前所述。本發(fā)明的技術(shù)方案在前期的研究中本實驗室保藏了重組質(zhì)粒PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA質(zhì)粒。pBluescript-HSA質(zhì)粒上只有ー個Bsu361I酶切位點在HSA 末端，設(shè)計含有HSA Bsu361I酶切位點及下游表達區(qū)序列的hVEGF165上游引物和含有NotI 酶切位點下游引物，擴增得到hVEGF165基因，然后通過限制性雙酶切置入HSA下游，獲得 HSA-hVEGF165融合基因，中間不含任何連接肽序列。將該融合基因插入到克隆載體，轉(zhuǎn)化到宿主系統(tǒng)，融合基因就會整合到宿主的染色體中進行表達。
如此ー來，我們制備的人血清白蛋白的融合蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165，包括與人血清白蛋白至少90%序列同源的第一區(qū)和與人血管內(nèi)皮生長因子165至少90%序列同源的第二區(qū)；所述的與人血清白蛋白至少90%序列同源的的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，與人血管內(nèi)皮生長因子165至少90%序列同源第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述的與人血清白蛋白至少90%序列同源的的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，與人血管內(nèi)皮生長因子165至少90%序列同源第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽。優(yōu)選的是所述的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少95%序列同源的第一區(qū)和與人血管內(nèi)皮生長因子165至少95%序列同源的第二區(qū)。所述的融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人血管內(nèi)皮生長因子165氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述兩區(qū)的功能等同物。所述的功能等同物是在不改變所述的融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白的個別氨基酸的殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。本發(fā)明hVEGF165和HSA之間不加任何連接肽，可以避免因連接肽的加入而帶來的融合蛋白穩(wěn)定性和免疫源性方面的問題。本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供表達該融合蛋白編碼區(qū)的宿主和攜帶該融合蛋白編碼區(qū)的重組表達載體。表達融合蛋白的宿主可以是細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞。表達出來的融合蛋白可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以從宿主細(xì)胞中分泌出來；分泌所用的信號肽可以是天然的人血清白蛋白的信號肽，也可以是釀酒酵母阿爾法交配因子的信號肽，或者這兩種信號肽的類似物；目的基因可以被整合到宿主的染色體中，也可以插入到質(zhì)粒中。本發(fā)明優(yōu)選的宿主系統(tǒng)是酵母表達系統(tǒng)，優(yōu)選的酵母表達系統(tǒng)是畢赤酵母表達系統(tǒng)，優(yōu)選的畢赤酵母表達系統(tǒng)是GS115和X33。這種表達系統(tǒng)除了具備原核表達系統(tǒng)的易操作、生長迅速、營養(yǎng)要求簡單、易エ業(yè)放大的特點外，還具有真核細(xì)胞的蛋白后修飾系統(tǒng)，有利于大量生產(chǎn)高質(zhì)量的重組蛋白。與宿主對應(yīng)的表達載體大多可以購買商品化的，如畢赤酵母表達系統(tǒng)對應(yīng)的載體，分泌型的有 PPIC9K、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6，胞內(nèi)型有 pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、 pGAPZ.pGAPZa等。優(yōu)選的是畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有組氨酸缺陷型的選擇性標(biāo)記基因HIS4、AOXl啟動子、MFa分泌信號肽和G418抗性基因等元件。AOXl (醇氧化酶操縱子)5’序列、3’序列用于方便編碼基因整合至酵母基因組和控制編碼基因的表達。轉(zhuǎn)化帶有融合cDNA的表達載體到宿主細(xì)胞中，可以用鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)體法、電穿孔法或化學(xué)轉(zhuǎn)化等方法。轉(zhuǎn)化之后，可以用多種方法鑒定是否成功，如提取基因組 DNA進行PCR鑒定，或者對細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白進行rhHSA抗體和rhVEGF165多抗檢測。生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白可以通過培養(yǎng)帶有本發(fā)明構(gòu)件的DNA的宿主系統(tǒng)來進行， 具體的培養(yǎng)方法可以用搖瓶或生物反應(yīng)器。培養(yǎng)分為兩個階段宿主系統(tǒng)生長階段和融合蛋白合成階段。之后可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離純化融合蛋白，包括鹽析、沉淀、超濾、層析、制備電泳等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。


圖1 圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-rhHSA/VEGF165物理圖譜
圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K-rhHSA/VEGF165的酶切鑒定M =DNA Ladder Marker ；1 pPIC9K-rhHSA/VEGF 165 經(jīng) EcoRI/NotI 雙酶切；圖3 融合蛋白的SDS-PAGE分析M 為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :pPIC9K空質(zhì)粒重組菌表達結(jié)果；2_9為 GSl 15 (pPIC9K-rhHSA/VEGF165 的發(fā)酵液上清)圖4 =Blue-Sepharose層析純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析M 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1-3 :1M精氨酸洗脫收集液圖5 重組蛋白對HUVEC細(xì)胞増殖的影響。增值率為加入重組蛋白與未加(100% ) 的百分比。圖 6:重組蛋白的半衰期。A)rhVEGF165B)rhHSA/VEGF165。具體實施方法一、實驗材料JM109 空菌、DH5a/pPIC9K、畢赤酵母 GS115 (his4Mut+)、PIC9K_rhVEGF165 以及pBluescript-HSA質(zhì)粒為本實驗室保藏；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PyrobestDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、 DNALadderMarker等購自寶生物工程(大連)有限公司；所有引物由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成；所有測序服務(wù)由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。ニ、實驗方法實施例1 :pPIC9K-HAS/VEGF165畢赤酵母表達質(zhì)粒的構(gòu)建。以PIC9K-rhVEGF165為模板，通過PCR擴增出rhVEGF165基因，引物如下上游引物5‘ -GCCCTTAGGCTTAGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3 ‘(劃線為Bsu361I酶切位點)下游引物5‘ -GTAGCGGCCGCTTACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3 ‘(劃線為NotI酶切位點)用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，回收500bp左右的片斷，用Bsu361I、 NotI對回收片斷和pBluescript-HSA質(zhì)粒進行雙酶切，連接再轉(zhuǎn)化到新鮮制作的JM109感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽性轉(zhuǎn)化子進行酶切驗證。陽性重組子提取質(zhì)粒再通過EcoRI/NotI雙酶切獲得片斷插入到PPIC9K對應(yīng)的酶切位點，獲得正確的pPIC9K-rhHSA/VEGF165畢赤酵母表達質(zhì)粒(圖1)，并通過EcoRI/NotI雙酶切(圖2、及測序進行驗證。實施例2 重組酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建及融合蛋白的表達；活化并過夜培養(yǎng)JM109 (pPIC9K-rhHSA/VEGF165)，提取的質(zhì)粒，經(jīng)SalI線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母65115，轉(zhuǎn)化物涂布與含0.2511^/1111 G418的MD平板上，30°C培養(yǎng)72小吋， 挑取所有的長出的菌落到含0.5mg/ml G418的YPD平板上，30°C培養(yǎng)2_3天。挑取長勢好的菌落到20ml液體YPD培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，提取GSl 15全基因組DNA，PCR鑒定出陽性重組子，并把它保存在含20%甘油的YPD中，凍存于-80°C，命名為GSl 15 (pPIC9K_rhHSA/ VEGF165)。將GS115(pPIC9K-rhHSA/VEGF165)接種到裝有 30ml BMGY (IOOmM 磷酸鉀，PH 6.0; 1. 34% YNB ；4 X Kr5 %生物素；3%甘油)的250ml三角瓶中，215rpm，30°C培養(yǎng)24-36小時， 冷凍沉降菌體，棄去上清，加入25ml BMMY(100mM磷酸鉀，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4Χ1(Γ5%生物素；2.5%甲醇)。每對小時補加一次甲醇，誘導(dǎo)3天。SDS-PAGE檢測重組融合蛋白的表達情況采用5%濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮藍R-250染色(圖 3)。挑選表達量較高的菌株擴大培養(yǎng)，收集離心得上清，上清液經(jīng)IOkDa分子截留量的膜超濾濃縮，再經(jīng)Blue-Sepharose層析分離，IM精氨酸洗脫獲得較純的rhHSA/VEGF165融合蛋白(圖4)實施例3 重組融合蛋白的活性評價；將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC消化后用無生長因子培養(yǎng)基調(diào)整濃度至4X 104/ml， 每孔100 μ 1接至96孔培養(yǎng)板，于37°C培養(yǎng)Mh。將不同濃度的重組融合蛋白rhHSA/ hVEGF165、rhVEGF165加入至HUVEC繼續(xù)培養(yǎng)Mh，MTT法觀察重組蛋白對HUVEC增殖活性的影響。由結(jié)果可以看出rhHSA/hVEGF165基本保留了 rhVEGF165的活性(圖5)。實施例4 重組融合蛋白的半衰期評價；將Iyg 的 rhVEGF165 或 4yg 的 rhHSA/VEGF165 分另丨」于 lmin，5min，15min， 30min, 60min, 2h，4h，8h，16h，32h進行小鼠尾靜脈注射(每組三個平行)。眼球采血，用 VEGF165ELISA試劑盒進行VEGF165含量測定。發(fā)現(xiàn)融合蛋白(rhHSA/VEGF165)的半衰期為 4. 27h 約為 rhVEGF165 的 18. 6 倍(圖 6)。
權(quán)利要求
1.人血清白蛋白與rhVEGF165的融合蛋白的基因序列和蛋白質(zhì)序列，如下 (1)基因序列GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGA TTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCT GATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATG GCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAG GTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCC CCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGAT GAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCA GTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCAT GGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGT GAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAA AGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTC GTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGAT GAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTA TTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAA CATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGAC AGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAAT GCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACAC AAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGC TTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAAAAAGAGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAG TACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATC ACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAA GATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAA AACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCA gatgtgacaagccgaggcgg (2)氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF⑶K LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAF TECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLA KYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYL SVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLKRAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCG GCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELN ERTCRCDKPRR。
2.人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白的制備方法，其特征是人血清白蛋白融合與rhVEGF165基因，中間不加任何連接肽對應(yīng)的核苷酸序列；得到的rhHSA/ VEGF165融合基因插入到克隆載體，轉(zhuǎn)化到宿主系統(tǒng)中進行表達，融合基因被整合到宿主的染色體中。
3.權(quán)利要求1和2所述的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白，其特征是包括與人血清白蛋白至少90%序列同源的第一區(qū)和與人血管內(nèi)皮生長因子至少 90%序列同源的第二區(qū)；所述的第一區(qū)位于融合蛋白的N或C末端，第二區(qū)位于另外一端， 中間不加任何連接肽。
4.權(quán)利要求1、2和3所述的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人血管內(nèi)皮生長因子165氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述兩區(qū)的功能等同物。
5.權(quán)利要求4所述的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白，其特征是所述的功能等同物是在不改變所述的融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白的個別氨基酸的殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6.權(quán)利要求1、2或3所述的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白，其特征是提供攜帯編碼融合蛋白的基因序列的重組表達載體，pPIC9K-rhHSA/VEGF165。
7.權(quán)利要求1、2或3所述的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白，其特征是表達融合蛋白的宿主優(yōu)選是酵母，酵母中優(yōu)選畢赤酵母，畢赤酵母中優(yōu)選是GS115， X-33。
8.權(quán)利要求1、2或3所述的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白在替代rhVEGF165中的應(yīng)用。
全文摘要
人血管內(nèi)皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備屬于長效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域，藥物蛋白與HSA的融合使得藥物成為長效藥物。本發(fā)明提供了hVEGF165與HSA生理特性于一體的人血清白蛋白與人血管內(nèi)皮生長因子165的融合蛋白及其表達載體，表達的重組融合蛋白在保持了人血管內(nèi)皮生長因子165生理特性的基礎(chǔ)上，增加了作用位點，延長了體內(nèi)半衰期，具有優(yōu)良的生理學(xué)特性。
文檔編號A61P7/02GK102586298SQ20111045520
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者戴慧云, 朱瑞宇, 李琪, 金堅 申請人:無錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司