專利名稱：五倍子緩釋凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療牙周病的緩釋劑，尤其是涉及一種五倍子緩釋凝膠的制備方法。
背景技術(shù)：
牙周病是口腔常見病和多發(fā)病，是導(dǎo)致成人失牙的主要原因之一。牙周病的治療一般分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療。非手術(shù)治療是通過(guò)機(jī)械性刮治，消除菌斑及其他局部刺激因素，并輔以藥物治療控制和提高治療效果，減少?gòu)?fù)發(fā)。但這些治療手段目前尚未得到滿意的臨床療效，其中基礎(chǔ)治療配合藥物輔佐治療對(duì)于減少牙周袋深度差別幅度不大(大多在Imm以內(nèi))。牙周病發(fā)展到較嚴(yán)重階段后，則需手術(shù)治療，其目的主要是促使牙周附著結(jié)構(gòu)的再生，即形成新的牙周附著。主要有植骨術(shù)或骨替代品植入術(shù)以及引導(dǎo)組織再生術(shù)等。 前者是采用骨或骨的替代品等移植材料來(lái)修復(fù)因牙周炎造成的牙槽骨缺損。后者是利用膜材料作為屏障以阻擋牙齦上皮在愈合過(guò)程中沿根面生長(zhǎng)，阻擋牙齦結(jié)締組織與根面的接觸，并提供一定的空間，引導(dǎo)具有形成新附著能力的牙周膜細(xì)胞優(yōu)先占領(lǐng)根面。但目前療效的把握性及預(yù)期性仍較小，適應(yīng)證范圍仍較局限，且需要經(jīng)歷創(chuàng)傷性手術(shù)治療，給患者帶來(lái)痛苦。既能殺滅牙周致病菌，又能拮抗各種細(xì)胞因子，且能起屏障作用的局部緩釋劑由于具有持續(xù)穩(wěn)定的有效藥物濃度，發(fā)揮較長(zhǎng)時(shí)間的治療作用，減少用藥頻率，毒副作用小， 患者的依從性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為牙周病治療的主要用藥方式。1979年，Goodson首次報(bào)告了用含四環(huán)素的空管纖維置于牙周袋中治療慢性牙周炎，其用藥量只相當(dāng)于全身用藥的 1/1000,由此開創(chuàng)了牙周局部緩釋治療的新途徑。研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用四環(huán)素纖維與全身用藥的 4-8 μ g/mL相比，其齦溝液中的平均藥物濃度可達(dá)1590 μ g /mL并保持10d，而且在抑制齦下微生物的同時(shí)也不會(huì)出現(xiàn)毒副作用，目前國(guó)外上市的四環(huán)素纖維有Actisite等。但缺點(diǎn)在于不可吸收，治療結(jié)束后必須將其取出，而且發(fā)現(xiàn)四環(huán)素纖維膜用于治療青少年牙周炎時(shí)，它對(duì)伴放線放線桿菌沒(méi)有抑制作用。我國(guó)自行研制的牙康已在治療牙周病臨床上應(yīng)用多年，其缺點(diǎn)是在牙周袋內(nèi)有效藥物濃度維持時(shí)間較短，約2-3d。歐陽(yáng)翔英等在比較其臨床療效時(shí)，實(shí)驗(yàn)組需每天放置藥物2次，操作比較頻繁，使用不便。國(guó)內(nèi)其他學(xué)者也研制了甲硝唑藥膜，同樣取得了一定療效，但亦存在性能單一，效用范圍有限的問(wèn)題，而且有研究報(bào)道在機(jī)械刮治的基礎(chǔ)上局部應(yīng)用甲硝唑?qū)σ种瓢榉啪€放線桿菌感染無(wú)效。凝膠類的緩釋劑產(chǎn)品如日本產(chǎn)的派麗奧，它是包含2%鹽酸二甲胺四環(huán)素的可生物吸收的持續(xù)緩釋劑，該制劑每周使用一次，但研究發(fā)現(xiàn)，該凝膠制劑只能減少牙齦卟啉單胞菌，而對(duì)中間普氏菌，具核梭桿菌，直腸彎曲菌，伴放線放線桿菌及微小消化鏈球菌均無(wú)影響，即使是聯(lián)合治療也不會(huì)改善牙周袋探診深度及牙周附著水平，即不能顯著增加刮治和跟面平整的療效，用作牙周炎輔助治療的長(zhǎng)期療效還有待商榷；美國(guó)產(chǎn)品鹽酸多西環(huán)素凝膠可生物降解，含10%強(qiáng)力霉素、33%聚合物(DL丙交酯)和57%NMP (N-甲基_2_吡咯烷酮)，分裝在兩個(gè)注射器中，用前混合注入牙周袋內(nèi)，其中的NMP被水置換使聚合物變成半固體，貼附在牙周袋內(nèi)緩慢分解釋放藥物，在齦溝中的藥物濃度可維持420 μ g/mL以上達(dá)7d，能有效減輕牙周炎的癥狀。但是對(duì)于這種用藥方式聯(lián)合根面平整能否增進(jìn)牙周健康尚無(wú)定論。近年來(lái)，對(duì)天然藥物五倍子在口腔疾病防治中的研究較多，天然藥物五倍子又名文蛤、百蟲倉(cāng)、木附子，為漆樹科植物鹽膚木(Rhus chinensis Mill.)、青麩楊(Rhus potaninii Maxim)或紅鉄楊(Rhus pun-jabensis Stew. var. sinica (Diels) Rehd. et Wils.)葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis (Bell) Baker寄生而形成，是我國(guó)特有的地產(chǎn)資源，產(chǎn)量極其豐富。五倍子味酸，澀，性寒。其功效為斂肺；止汗；澀腸；固精；止血；解毒。五倍子的化學(xué)成分主要包括①鞣質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)為C76H52O46,是倍酚葡萄糖的混合物，即葡萄糖上的羥基與沒(méi)食子酸所形成的酪類化合物的混合物，屬水解類鞣質(zhì)。鞣酸含量很高，最高可達(dá)80%。②沒(méi)食子酸，是藥物中間體，含量約占2% 4%。③五倍子油成分， 其化學(xué)成分為癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕?cái)R酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等8種。④礦物質(zhì)微量元素，五倍子中含有多種金屬礦物質(zhì)微量元素，包括銅、鋅、鐵、鎂、鈾、鈣等的化合物。⑤其他成分，如樹脂、脂肪物質(zhì)、淀粉、蠟質(zhì)等成分。但將其作為成熟的治療藥物作用于臨床，則尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有效治療牙周疾病的五倍子緩釋凝膠的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案 本發(fā)明所述的五倍子緩釋凝膠的制備方法，它包括下述步驟 第一步，五倍子凍干粉的制備
稱取五倍子原藥，敲開、清洗以去凈蟲垢，晾干；0°c條件下粉碎、過(guò)140目篩，然后加入去離子水，室溫下150rpm振搖48小時(shí)，過(guò)濾、離心，取上清，置入_70°C冷凍箱12小時(shí)后取出，將其放入凍干機(jī)內(nèi)，在0. 6mbar條件下，制成淡黃色凍干粉，60Co照射30分鐘，4°C冷
藏備用；
第二步，凝膠制備
取二氯甲烷和三乙酸甘油酯，按二氯甲烷三乙酸甘油酯=7:3之比例配制成混合溶劑，再加入聚乳酸_羥基乙酸共聚物，靜置，待聚乳酸一羥基乙酸共聚物完全溶解后，加入第一步制好的五倍子凍干粉；混合溶劑聚乳酸-羥基乙酸共聚物五倍子凍干粉 =61:35:4，充分?jǐn)嚢杈鶆?，漩渦震蕩，制成淡黃色五倍子凝膠，避光4°C保存24h即得成品。成品藥物于2-15度陰涼避光保管。藥品規(guī)格0. 5g/支，五倍子含量20mg/支。使用方法牙周病患者潔治或齦下刮治后，將本發(fā)明所制凝膠注滿患者牙周袋內(nèi)， 每周一次，連續(xù)用四周。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用具有可溶性，無(wú)毒、無(wú)抗原性的生物可降解材料一聚乳酸_羥基乙酸共聚物作為藥物緩釋載體，將其與五倍子凍干粉混合后制成凝膠注入牙周袋內(nèi)，凝膠遇水凝結(jié)，發(fā)揮屏障結(jié)構(gòu)的功能，以阻止牙結(jié)締組織、上皮與根面的接觸，以利于牙周膜細(xì)胞增殖并優(yōu)先占據(jù)根面，進(jìn)而形成新附著；五倍子凍干粉中的主要有效成分五倍子鞣質(zhì)可對(duì)常見的牙周可疑致病菌具有廣譜的抗菌作用，還可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞炎性因子的釋放，并能顯著降低膠原酶的活性，二者結(jié)合后制得的緩釋凝膠對(duì)牙周組織有明顯的保護(hù)作用，非常符合臨床標(biāo)準(zhǔn)，作為防治牙周病的藥物具有進(jìn)一步深入研究開發(fā)的醫(yī)藥價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其優(yōu)異效果主要表現(xiàn)為
1、本發(fā)明凝膠制劑質(zhì)地均勻，細(xì)膩，有一定粘稠度，能順利通過(guò)0. 45mm注射針頭，遇水凝結(jié)后質(zhì)軟，粘性大，能貼附在牙齒壁上，并且穩(wěn)定性好。凝膠中藥物釋放可持續(xù)7d，累計(jì)釋放率超過(guò)80%，最低藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于6. 25 μ g/mL。2、本發(fā)明凝膠制劑培養(yǎng)l-7d的細(xì)胞密度和形態(tài)均呈長(zhǎng)梭形和多角形，細(xì)胞突細(xì)長(zhǎng)，伸展性良好，呈放射狀排列，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核圓形或卵圓形。其細(xì)胞毒性均為1 級(jí)，可達(dá)到理想的生物安全性，符合臨床治療的要求。3、本發(fā)明凝膠制劑可有效拮抗LPS對(duì)HPDLFs的抑制作用，提高細(xì)胞ALP活性，有效抑制LPS介導(dǎo)細(xì)胞分泌MMP — 3，且抑制作用可持續(xù)7d。4、本發(fā)明凝膠制劑對(duì)/%·、/^、/^均有一定抑制作用，其中對(duì)/督和的抑菌效果明顯優(yōu)于日本產(chǎn)品派麗奧。5、本發(fā)明凝膠制劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中治療效果良好，/刃、召傲、67均有明顯好轉(zhuǎn)。其中 PD下降幅度較好；X線片顯示五倍子CEJ-B距離明顯縮短。


圖1是本發(fā)明緩釋凝膠釋放液對(duì)L-929細(xì)胞的增殖率和毒性分級(jí)。圖2是不同時(shí)間點(diǎn)凝膠釋放液對(duì)LPS抑制HPDLFs增殖的影響。圖3是不同時(shí)間點(diǎn)凝膠釋放液對(duì)LPS抑制HPDLFs中ALP活性的影響。圖4是本發(fā)明緩釋凝膠、派麗奧軟膏、蒸餾水和2%洗必泰對(duì)牙齦卟啉單胞菌iPg) 的抑菌環(huán)。
圖5是本發(fā)明緩釋凝膠、派麗奧軟膏、蒸餾水和2%洗必泰對(duì)具核酸桿菌(Fn)的抑菌環(huán)。圖6是本發(fā)明緩釋凝膠、派麗奧軟膏、蒸餾水和2%洗必泰對(duì)中間普氏菌(Pf)的抑菌環(huán)。圖7是非藥物載體空白對(duì)照組的臨床觀察圖片。圖8是派麗奧對(duì)照組的臨床觀察圖片。圖9-10是本發(fā)明緩釋凝膠的臨床觀察圖片。圖11、圖12是非藥物載體空白對(duì)照組的基線、用藥4w后的X線片。圖13、圖14是是派麗奧對(duì)照組的基線、用藥4w后的X線片。圖15、圖16是本發(fā)明緩釋凝膠組的基線、用藥4w后的X線片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的五倍子緩釋凝膠的制備方法，它包括下述步驟 第一步，五倍子凍干粉的制備
稱取五倍子原藥400g，敲開、清洗以去凈蟲垢，于陰涼通風(fēng)處晾干；使用低溫超微粉碎機(jī)(ZMD-40，中國(guó)江蘇)在0°C條件下進(jìn)行超微粉碎，過(guò)140目篩，加入1200ml去離子水，室溫下150rpm振搖48小時(shí)(使用HYD恒溫?fù)u床，中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠制)，過(guò)濾、離心，取上清，置入_70°C冷凍箱12小時(shí)后取出，使用凍干機(jī)(Christ Alphal_2，德國(guó))在0. 6mbar 條件下，運(yùn)行288小時(shí)，制成150g淡黃色凍干粉，60Co照射30分鐘后4°C冷藏備用；
第二步，凝膠制備
取二氯甲烷(DCM，批號(hào)20081018，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)和三乙酸甘油酯(GTA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)，按二氯甲烷三乙酸甘油酯=7:3之比例配制成混合溶劑，再加入聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA502H)，靜置，待聚乳酸一羥基乙酸共聚物完全溶解后，加入第一步制好的五倍子凍干粉，混合溶劑占61%，聚乳酸-羥基乙酸共聚物占35%，五倍子凍干粉占4%，(均指質(zhì)量百分比);用恒溫磁力攪拌器(78H-I，杭州儀表電機(jī)廠)充分?jǐn)嚢杈鶆颍鰷u震蕩，制成淡黃色五倍子凝膠，避光4°C保存24h即得成品。一、本發(fā)明緩釋凝膠的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)采用該制劑，通過(guò)MTT法，以商品化的日本產(chǎn)派麗奧軟膏作對(duì)照，考察其對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L-929的毒性。1、材料
1.1主要材料與儀器
L-929小鼠成纖維細(xì)胞(華西醫(yī)科大學(xué)口腔生物學(xué)教研室)。超凈工作臺(tái)(YJ-875 型，蘇州凈化設(shè)備廠);01ympus CH型顯微鏡(BH — 2日本工業(yè)株式會(huì)社)。MTT (Sigma，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胰蛋白酶(1:250, Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；青、鏈霉素(哈爾濱制藥廠)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇天由有限公司)；LXJ - II型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠);78H-I恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠);96孔培養(yǎng)板(丹麥 NUNC公司);BI0-RAD680酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司);派麗奧軟膏(日本新時(shí)代制藥株式會(huì)社， 批號(hào) X19992084)。1. 2藥物緩釋液的制備
分別取本發(fā)明人緩釋凝膠和派麗奧軟膏各0. 2g注入含有IOml DMEM培養(yǎng)液的棕色瓶中，加蓋，置37°C恒溫水浴振蕩箱中24h，收集全部釋放溶液用于實(shí)驗(yàn)。2、方法
2.1細(xì)胞傳代和培養(yǎng)
將L-929細(xì)胞，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37°C 50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)傳代48 72 h，取生長(zhǎng)旺盛期，用2. 5 g/L的胰酶消化5 10 min，Hanks液洗3次， 混懸于完全培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為4 XlO4 /mL。2. 2本發(fā)明緩釋凝膠對(duì)L-929細(xì)胞增殖的影響及毒性觀察
將L-929細(xì)胞懸液接種于12塊96孔培養(yǎng)板，每孔IOOuL, 37°C，50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)24h后，棄原液及未貼壁細(xì)胞，并隨機(jī)分為6組(每組復(fù)6孔)，分別加入本發(fā)明五倍子緩釋凝膠釋放液、派麗奧軟膏釋放液、含苯酚終末濃度為0. 2g/ml的DMEM培養(yǎng)液(陽(yáng)性對(duì)照) 以及不含任何藥物的DMEM培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后l、3、5、7d各時(shí)間點(diǎn)先用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)，然后每孔加20ul 5mg/mL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞楓(DMSO) 150ul，渦旋混合器震蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔在490nm處的吸光度值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組的吸光值/陰性對(duì)照組的吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率(RGR)。依據(jù)美國(guó)藥典中RGR的細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，把RGR 值轉(zhuǎn)換成5級(jí)反應(yīng)以評(píng)定材料的毒性程度。
權(quán)利要求
1. 一種五倍子緩釋凝膠的制備方法，其特征在于它包括下述步驟 第一步，五倍子凍干粉的制備稱取五倍子原藥，敲開、清洗以去凈蟲垢，晾干；0°c條件下粉碎、過(guò)140目篩，然后加入去離子水，室溫下150rpm振搖48小時(shí)，過(guò)濾、離心，取上清，置入_70°C冷凍箱12小時(shí)后取出，將其放入凍干機(jī)內(nèi)，在0. 6mbar條件下，制成淡黃色凍干粉，60Co照射30分鐘，4°C冷藏備用；第二步，凝膠制備取二氯甲烷和三乙酸甘油酯，按二氯甲烷三乙酸甘油酯=7:3之比例配制成混合溶劑，再加入聚乳酸_羥基乙酸共聚物，靜置，待聚乳酸一羥基乙酸共聚物完全溶解后，加入第一步制好的五倍子凍干粉；三者之間的比例為混合溶劑聚乳酸_羥基乙酸共聚物 五倍子凍干粉=61 35 4，將其充分?jǐn)嚢杈鶆?，漩渦震蕩，制成淡黃色五倍子凝膠，避光4°C 保存24h即得成品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種五倍子緩釋凝膠的制備方法，它包括1、稱取五倍子原藥，粉碎、過(guò)140目篩，用去離子水振搖、過(guò)濾、離心，取上清，置入冷凍箱冷凍后放入凍干機(jī)內(nèi)制成凍干粉，60Co照射，4℃冷藏備用；2、取二氯甲烷和三乙酸甘油酯配制成混合溶劑，再加入聚乳酸-羥基乙酸共聚物，溶解后，加入制好的凍干粉；三者之間比例為61:35:4，充分?jǐn)嚢杈鶆?，漩渦震蕩，制成淡黃色五倍子凝膠，避光4℃保存24h即得成品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于凝膠遇水凝結(jié)，利于牙周膜細(xì)胞增殖并優(yōu)先占據(jù)根面，形成新附著；五倍子鞣質(zhì)可對(duì)常見的牙周可疑致病菌具有廣譜的抗菌作用，作為防治牙周病的藥物具有深入研究開發(fā)的醫(yī)藥價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K35/64GK102406666SQ20111037098
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者張春喜, 張爽, 慕秀囡, 殷霄, 王建華, 王怡心, 王鵬飛, 程燕民 申請(qǐng)人:張爽