專(zhuān)利名稱(chēng)：超聲在溫敏材料包被藥物的智能控釋中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超聲在藥物智能控釋中的應(yīng)用，具體地說(shuō)，是超聲在溫敏材料包被藥物智能控釋中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溫敏材料因具臨界相轉(zhuǎn)變溫度，能因環(huán)境溫度的改變而發(fā)生膨脹/收縮狀態(tài)的改變，因而被作為藥物控釋體系的載體之一，成為近年來(lái)研究的新熱點(diǎn)。自1975年美國(guó)麻省理工學(xué)院田中豐一教授發(fā)現(xiàn)聚酰胺類(lèi)物質(zhì)可因溫度改變而發(fā)生相轉(zhuǎn)變以來(lái)，用于制備溫敏凝膠的高分子材料也不斷豐富，從天然的纖維素、殼聚糖到合成的聚丙烯酸類(lèi)、聚丙烯酰胺類(lèi)、聚肽類(lèi)等，如今多種嵌段共聚物也被不斷開(kāi)發(fā)和利用，如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、 N-異丙基丙烯酰胺-聚偏氟乙烯共聚物等。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN101862477A公開(kāi)了一種具有藥物溫敏控釋作用的支架及其應(yīng)用，所述的支架由起支撐作用的支架和覆蓋在支架表面的載藥涂層構(gòu)成，所述的載藥涂層是由具有藥物溫敏控釋作用的涂層以旋涂、浸涂或噴涂的方式涂敷到支架表面形成的，涂層具有良好的溫度敏感性和藥物控釋功能，載藥支架可有效殺傷癌細(xì)胞。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn) CN101653420A公開(kāi)了超聲控釋靶向藥物制劑及其制備方法，該藥物制劑能夠利用超聲波的輻照能量促進(jìn)藥物的釋放，起到用超聲波控制藥物釋放的效果。雖然單純超聲的輻照能量可使藥物釋放增加，但是關(guān)于超聲通過(guò)改變溫敏材料空間結(jié)構(gòu)使得藥物釋放量大幅度提高，以及超聲在溫敏材料包被藥物智能控釋中的應(yīng)用目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種超聲在溫敏材料包被藥物智能控釋中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是超聲在溫敏材料包被藥物智能控釋中的應(yīng)用，所述的溫敏材料是由溫敏聚合物與可降解疏水聚合物形成的兩親嵌段共聚物， 所述的藥物是至少一種疏水性藥物，所述的藥物包被在溫敏材料內(nèi)部。所述的兩親嵌段共聚物是N-異丙基丙烯酰胺-CO-N-羥甲基丙烯酰胺。所述的疏水性藥物選自阿霉素、山奈酚、長(zhǎng)春新堿、喜樹(shù)堿、表鬼白毒素、紫杉醇、 5 一氟尿嘧啶、血卟啉單甲醚、血卟啉乙二醇醚中的一種或其混合物。所述的疏水性藥物是阿霉素和血卟啉單甲醚。所述的超聲的功率1. 2MHz，超聲時(shí)間120s，單位面積功率lW/cm2。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)超聲通過(guò)改變溫敏材料空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)溫敏材料包被藥物釋放的顯著作用。利用超聲可以起到指定部位的藥物智能控釋的效果，發(fā)揮局部的抗癌作用，減少抗癌藥物對(duì)人體重要組織的毒副作用，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。為今后藥物智能化控釋提供了一種新方法，超聲作為“聲控開(kāi)關(guān)”及藥物智能化控釋在腫瘤藥物治療中有廣泛的應(yīng)用前景。


附圖1是體外膽管癌細(xì)胞QBC在不同的超聲條件下細(xì)胞的存活率。附圖2是體外QBC在不同的血卟啉單甲醚的加藥條件下的存活率。附圖3是體外QBC在聯(lián)合用藥條件下的存活率。附圖4是B/C/D三種材料在不同的時(shí)間點(diǎn)在超聲和非超聲的條件下體外抑制膽管癌細(xì)胞增殖的影響。附圖5是各時(shí)間點(diǎn)阿霉素和血卟啉單甲醚的藥物濃度。圖5-1 (材料B，HMME)，圖 5-2 (材料 B，D0X)，圖 5-3 (材料 C, HMME)，圖 5-4 (材料 C，D0X)。附圖6-7是三種材料的致細(xì)胞凋亡情況，圖6 (12h)，圖7 (24h)。附圖8是通過(guò)流式雙染檢測(cè)各種材料對(duì)QBC細(xì)胞的致凋亡情況。附圖9是對(duì)裸鼠進(jìn)行超聲的示意圖。附圖10是裸鼠腫瘤形成圖。附圖11是血液中超聲前后HMME和DOX的藥物濃度。附圖12是瘤體中超聲前后HMME和DOX藥物濃度。附圖13是治療后7天的瘤體差異，左圖為瘤體差異，右圖為治療后7天的腫瘤重量及藥物對(duì)腫瘤的抑制情況。附圖14是治療后14天的瘤體差異，左圖為瘤體差異，右圖為治療后14天的腫瘤重量及藥物對(duì)腫瘤的抑制情況。附圖15是各組材料藥物釋放前后電子聲顯微鏡掃描。附圖16是超聲作用前、后SEM掃描，左圖為非溫敏組(PLLA組)，右圖為溫敏組，A 為超聲作用前、B為超聲作用后掃描結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1體外細(xì)胞無(wú)損傷的超聲條件的確立
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定超聲體外條件，建立對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯傷害作用的超聲作用條件
2.實(shí)驗(yàn)原理
MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。MOSmarm(198;3)首先報(bào)道用此方法檢測(cè)細(xì)胞活性，因其簡(jiǎn)便、快速，所需細(xì)胞數(shù)較少，便于大規(guī)模進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，加之人為誤差較小而且較精確，沒(méi)有放射性污染，目前已廣泛用于臨床前抗癌藥物篩選研究，并已開(kāi)始用于新鮮腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性檢測(cè)。試驗(yàn)所用的顯色劑MTT是一種能接受氫原子的染料，化學(xué)名3_(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑藍(lán)?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶(NADP) 能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)呈正比。
3.實(shí)驗(yàn)方法步驟
(1)先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞2X IO5 cell/ml接種于35mm單孔培養(yǎng)板，每孔^il,培養(yǎng)M 小時(shí)。(2)超聲作用后，吸棄上清，然后每孔加入2ml的含5 mg/ml的MTT，37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。(3)小心吸棄上清，每孔加入2ml的DMSO溶解甲臜，振蕩lOmin，待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，從每皿吸出100 μ 1到96孔培養(yǎng)皿，在酶標(biāo)儀上用波長(zhǎng)為492nm，參比波長(zhǎng)為630nm 測(cè)定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。(4) 數(shù)據(jù) 處理細(xì)胞 生長(zhǎng) 抑制 率 =
1-實(shí)驗(yàn)組QD 對(duì)照組OD Xl004
4.實(shí)驗(yàn)儀器、材料
細(xì)胞株QBC細(xì)胞(人膽管癌細(xì)胞)
試劑 噻唑藍(lán)(3- , 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)、RPMI 1640 培養(yǎng)基、小牛血清、DMSO (二甲基亞砜)、PBS、0. 25% 胰酶。實(shí)驗(yàn)儀器Bio-Rad公司酶標(biāo)儀(550型)、Heraeus公司(X)2培養(yǎng)箱(BB 5060型)、 96,24孔培養(yǎng)皿、多功能超聲儀。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
探討在體外膽管癌細(xì)胞QBC在不同的超聲條件下，細(xì)胞的存活率情況，采用單孔板，面積為9cm2，經(jīng)過(guò)條件的摸索，在超聲功率1. 2MHz、超聲時(shí)間120s，單位面積功率lW/cm2的條件下，細(xì)胞的存活率和對(duì)照組無(wú)顯著差異，請(qǐng)參照附圖1(經(jīng)過(guò)三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn))。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13. 0進(jìn)行ttest統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與空白對(duì)照組相比/7>0. 05無(wú)顯著性差異，*/7<0. 05表示有顯著差異。選擇該超聲條件進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以避免單純超聲殺傷細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)施例2體外無(wú)明顯膽管癌殺傷作用的血卟啉單甲醚(HMME)和阿霉素(DOX)的藥物作用濃度確定
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定體外血卟啉單甲醚和阿霉素作用無(wú)明顯殺傷膽管癌細(xì)胞的藥物濃
度
2.實(shí)驗(yàn)方法步驟
(1)先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞2X IO5 cell/ml接種于35mm單孔培養(yǎng)板，每孔^il,培養(yǎng)M 小時(shí)。(2) HMME組實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度(0、5、10、20、40、80 μ g/ml)藥物的培養(yǎng)液，對(duì)照組則用等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)以上的平行孔，超聲作用后置37°C，5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)M h；
DOX 組實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度(0、0. 15625、0. 3125、、0. 625、1. 25、2. 5、5、10 μ g/ ml)藥物的培養(yǎng)液，對(duì)照組則用等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)以上的平行孔，超聲作用后置 37°C, 5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)M h。(3)吸棄上清，然后每孔加入2ml的含5mg/ml的MTT，37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
(4)小心吸棄上清，每孔加入2ml的DMSO溶解甲臜，振蕩lOmin，待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，從每皿吸出100 μ 1到96孔培養(yǎng)皿，在酶標(biāo)議上用波長(zhǎng)為492nm，參比波長(zhǎng)為630nm 測(cè)定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。(5)數(shù)據(jù)處理細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=
權(quán)利要求
1.超聲在溫敏材料包被藥物智能控釋中的應(yīng)用，其特征在于，所述的溫敏材料是由溫敏聚合物與可降解疏水聚合物形成的兩親嵌段共聚物，所述的藥物至少是一種疏水性藥物，所述的藥物包被在溫敏材料內(nèi)部。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的兩親嵌段共聚物是N-異丙基丙烯酰胺-CO-N-羥甲基丙烯酰胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的疏水性藥物選自阿霉素、山奈酚、 長(zhǎng)春新堿、喜樹(shù)堿、表鬼白毒素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、血卟啉單甲醚、血卟啉乙二醇醚中的一種或其混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疏水性藥物是阿霉素和/或血卟啉單甲醚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的超聲的功率1.2MHz，超聲時(shí)間 120s，單位面積功率lW/cm2。
全文摘要
本發(fā)明涉及超聲在溫敏材料包被藥物智能控釋中的應(yīng)用，其特征在于，所述的溫敏材料是由溫敏聚合物與可降解疏水聚合物形成的兩親嵌段共聚物，所述的藥物是至少一種疏水性藥物，所述的藥物包被在溫敏材料內(nèi)部。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)超聲具有促進(jìn)溫敏材料包被藥物釋放的顯著作用，利用超聲可以起到指定部位的藥物智能控釋的效果，發(fā)揮局部的抗癌作用，減少抗癌藥物對(duì)人體重要組織的副作用，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。為今后藥物智能化控釋提供了一種新方法，超聲作為“聲控開(kāi)關(guān)”及藥物智能化控釋在腫瘤藥物治療中有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K47/32GK102319434SQ20111023582
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者全志偉, 劉穎斌, 李松崗, 譚慶剛 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院