專利名稱：用于制備并入了有效生物活性分子的微粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備藥物填充的聚合物微粒的方法，該聚合物微粒包括氣體內(nèi)核以及外殼，所述粒子適合于作為治療成分的部分，尤其適合用于藥物輸送。
背景技術(shù)：
使用基于微粒的超聲造影劑來增強醫(yī)療成像中的超聲對比度。最近的研究表明微粒對從脈管系統(tǒng)的藥物輸送也具有治療可能；微泡可以增大內(nèi)皮細胞的滲透性，并且因此降低從脈管系統(tǒng)的藥物輸送的障礙。藥物輸送還可以通過自身裝載了微泡的藥物直接進行，這將允許生物配送中的巨大改變，同時可能減少諸如細胞毒性藥劑的副作用。美國6，896，659涉及使用超聲將治療藥劑輸送到受試者內(nèi)局部區(qū)域、以便觸發(fā)藥劑從具有指定組的機械屬性的中空微泡釋放的方法。在美國6，896，659中所公開的藥劑具有受控脆性，其特征在于，均勻的壁厚度與直徑比(其定義了離散閾值力量強度)。美國 6，896，659專門公開了用于制備微泡的單一乳劑方法，其中，使用環(huán)辛烷作為在微泡創(chuàng)建中形成內(nèi)核的液體。在稍后步驟中通過凍干法移除該環(huán)辛烷。從現(xiàn)有技術(shù)中已知經(jīng)復(fù)乳劑(double emulsion)方法在聚合物球體中的藥物合并。(Sorisoles Diez 等’ European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics 63 (2006) 188-197)(Diez 等))根據(jù)這里所描述的復(fù)乳劑方法，通過將含藥水溶液添加到有機溶劑中的聚合物溶液內(nèi)以制備第一乳劑來合成聚合球體。隨后，使該第一乳劑再次乳化在水相中，其后萃取出有機溶劑。

發(fā)明內(nèi)容
期望合成這樣一種藥劑，其具有單獨一個大的氣態(tài)內(nèi)核，可以以在超聲藥物輸送中能夠接受的壓力和頻率在聲學(xué)上激活該氣態(tài)內(nèi)核，并且該藥劑具有包括親水和/或疏水 (hydrophopic)藥物的能力。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過使用特定比率的聚合物和溶劑獲得具有大的中空內(nèi)核的穩(wěn)定微粒時，合并的疏水和親水藥物的量都增加了。因此，在第一方面中，本發(fā)明涉及用于制備生物活性藥劑填充的聚合物微粒的下列方法，所述方法包括下列步驟通過混合有機溶劑(1)、生物可降解的聚酯以及對于聚合物的有機非溶劑(2)并且向該混合物添加從0到40%體積比(ν/ν)的水溶液來提供第一乳劑(Α)，其中，生物可降解的聚酯/有機非溶劑的比率是1 10到1 1，并且其中，將生物活性藥劑添加到有機混合物和/或水溶液；通過將過量水溶液添加到該第一乳劑(A)來制備第二乳劑(B)；施加用于使有機溶劑(1)揮發(fā)的條件；施加用于去除水的條件；
施加用于去除非溶劑O)的條件。通過使用該方法，獲得聚合微粒，其將對于親水和/或疏水藥物的高合并效率與大的優(yōu)選是中空的內(nèi)核相結(jié)合。經(jīng)由根據(jù)Diez等的方法形成的微粒帶來了具有比水的密度更高的聚合物球體，其因此可以用離心機而被分離到藥水瓶的底部。這意味著不存在大的內(nèi)核。然而，該大的內(nèi)核對于可以用于經(jīng)由超聲的實際藥物釋放的聲學(xué)屬性是必要的。通過執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法，獲得大小在0. 5-5微米范圍內(nèi)，特別是在1-3微米范圍內(nèi)的、具有單獨一個氣態(tài)內(nèi)核并且在再分散時穩(wěn)定的小的聚合微粒。在步驟a)中，在疏水藥劑的情況下將生物活性藥劑添加到有機溶劑并且對于親水藥劑將生物活性藥劑添加到水相中。在另一方面中，本發(fā)明涉及通過該方法獲得的粒子，它們包括在造影劑和治療藥劑中，并且涉及造影劑或者治療成分，其中，可以通過具有在用于超聲診斷成像的常用范圍內(nèi)的強度的超聲能量激活大多數(shù)粒子。在所附獨立和從屬權(quán)利要求中陳述了本發(fā)明的特定和優(yōu)選方面。可以酌情并且不只是如權(quán)利要求中所明確陳述的那樣將來自從屬權(quán)利要求的特征與獨立權(quán)利要求的特征以及其它從屬權(quán)利要求的特征相結(jié)合。


圖1-7 經(jīng)由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的微粒的粒子大小分布。
具體實施例方式在本發(fā)明的上下文中使用下列定義。將參考特定實施例并且參考某些附圖對本發(fā)明進行描述，但是本發(fā)明不限于此， 而僅由權(quán)利要求來限定。不應(yīng)該將權(quán)利要求中的任何參考標(biāo)記解釋為對范圍的限制。所描述的附圖僅僅是示意性而不是限制性的。在附圖中，為了說明性目的，可能夸大一些要素的大小并且不按比例繪制。在本說明書和權(quán)利要求中使用術(shù)語“包括”的地方，不排除其它要素或者步驟。當(dāng)提及諸如“一”、“一個”、“這個”的單數(shù)名詞時，使用不定冠詞或者定冠詞， 除非特別聲明，否則這包括多個該名詞。本發(fā)明的方法步驟a)在根據(jù)本發(fā)明的方法中，步驟(a)包括提供包括外殼形成聚合物、第一溶劑(1)和第二非溶劑O)的混合物。該混合物優(yōu)選在從4至30°C的溫度下、并且更優(yōu)選是在大約室溫下制成。在本發(fā)明的上下文中，外殼形成聚合物是生物可降解聚酯，更優(yōu)選是從下列物質(zhì)的組中選擇生物可降解聚酯，該組包括L或者DL型的聚交酯、聚交酯-共-乙交酯和聚己內(nèi)酯、這些組合和這些的嵌段共聚物(blockco-polymer)。使用具有1. 000和200. 000g/mol 分子量范圍內(nèi)的生物可降解聚酯獲得中空聚合物微粒。更優(yōu)選地，生物可降解聚酯的分子量在1500和20. 000之間，并且更優(yōu)選地在1500和5000之間。在優(yōu)選實施例中，生物可降解聚酯包括以至少一個疏水基改性的至少一個基團 (moiety)，該至少一個疏水基優(yōu)選從下列組中選擇，該組包括氟化物、包括6至M個碳原子的烷基鏈、或者它們的組合。在本發(fā)明的上下文中，溶劑(1)優(yōu)選是用于外殼形成聚合物的良好溶劑。溶劑(1) 優(yōu)選是對于形成外殼的聚合物的良好溶劑，并且非溶劑( 是對于形成外殼的聚合物的不良溶劑。溶劑(1)優(yōu)選至少某種程度溶入水中。溶劑(1)優(yōu)選相對是揮發(fā)性的。溶劑(1)優(yōu)選是在步驟(C)條件下具有比水更高的蒸汽壓力的溶劑，并且更優(yōu)選地是從包括二氯甲烷、二氯乙烷或者三氯甲烷的組中選擇的，其中，二氯甲烷、二氯乙烷或者三氯甲烷是可以使用的溶劑的例子，不過也可以使用諸如乙酸異丙酯的不含氯溶劑。認為提供非溶劑( 是為了制造包括氣態(tài)內(nèi)核和外殼的粒子而不是固態(tài)粒子。因此，用于溶劑O)的合適成分是期望的相對非揮發(fā)性成分，其中，所選擇的外殼成分不溶解或者僅在非常低的程度上溶解。與溶劑1相反，對于非溶劑O)，水溶性優(yōu)選非常低，接近零。非溶劑( 從包括在步驟(d)條件下具有明顯低于水的蒸汽壓力的有機成分的組中選擇。更優(yōu)選地，在步驟(d)條件下，非溶劑O)的蒸汽壓力比水的蒸汽壓力的至少低2 倍，優(yōu)選低4倍。選擇非溶劑( ，使得其蒸汽壓力仍然足夠高，以便使得其能夠在冷凍干燥條件并可選地結(jié)合適當(dāng)減壓而被去除，使用公知的標(biāo)準(zhǔn)裝置可以很容易達到這樣的條件。該低蒸汽壓力和低溶解度將確保溶劑( 真正停留在正在形成的囊內(nèi)，導(dǎo)致最終形成具有中空氣態(tài)空間的囊。優(yōu)選地，囊包括至少一個中空空間。最優(yōu)選地，囊包括一個主要的中空空間。如果在溶劑1的去除完成之前非溶劑(2)從囊中消失，那么在步驟(c)中， 粒子將顯示太多收縮，從而增大它們的壁厚度。在優(yōu)選實施例中，從包括具有10至20個碳原子的碳鏈長度的烴類的組中選擇非溶劑O)。發(fā)現(xiàn)從環(huán)辛烷、環(huán)癸烷、癸烷、2-莰酮或者其組合中選擇非溶劑( 是有利的。 在最優(yōu)選的實施例中，非溶劑( 包括環(huán)辛烷，甚至更優(yōu)選地，非溶劑( 必須由環(huán)辛烷組成。在本發(fā)明的上下文中，“必須由組成”意味著非溶劑O)的至少80%重量、優(yōu)選是90% 至100%重量是環(huán)辛烷?？蛇x地，在步驟(a)中，預(yù)混合物使用溶劑(1)和O)以及外殼成分和溶劑(1)。添加到有機溶劑(1)和( 以及外殼形成聚合物的混合物的是0至0. 4，優(yōu)選是大約0. 2體積的水溶液，從而得到乳劑A。優(yōu)選地，該水溶液是緩沖的。為了生成乳劑，優(yōu)選施加攪拌或者另一種形式的攪動/剪切力?？蛇x地，包括另外的乳化處置以便形成具有所期望的、優(yōu)選是單分散的、粒子大小分布的乳劑。例如，從膠體磨、均化器、超聲波降解器中選擇獲得這種乳化處置的合適裝置?？蛇x地，在這種處置之前或者之后，將乳劑按壓通過玻璃過濾器。當(dāng)期望時，可以重復(fù)這種處置許多次。如果除氣相之外期望在微泡中有無極性液體貯存部，就可以將有機溶劑或者非溶劑與不能或者很難被冷凍干燥去除的油或者烷烴(諸如十六烷)混合?？梢越?jīng)該無極性液體貯存部將疏水治療成分包括在內(nèi)核中?？梢允褂檬榛蛘呤炗褪箖?nèi)核中的治療成分溶解?？梢园ㄔ诹Ｗ觾?nèi)核中的可能藥物包括諸如紫杉醇 (paclitaxel)的抗癌藥物。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)十六烷是對于疏水治療成分非常合適的載運液體。我們發(fā)現(xiàn)這些成分很容易保持溶解或者非常好地分散在十六烷中，并且因此將這些成分合并在粒子內(nèi)核內(nèi)部保持在油相中。因此，僅在采用超聲激活之后，從粒子中釋放所溶解的成分。因此，在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及所要求的、還包括用于治療成分的至少一種載運液體的粒子。最優(yōu)選的載運液體是十六烷。將親水藥物添加到乳劑A中的第一水溶液。步驟b)另一個步驟(b)包括將步驟(a)的乳劑與含水組合物結(jié)合，從而形成步驟(a)的混合物在水相的乳劑B。優(yōu)選將包含步驟(a)混合物的外殼成分添加到含水組合物。為了生成乳劑，優(yōu)選施加攪拌或者另一種形式的攪動/剪切力。可選地，包括另外的乳化處置以便形成具有所期望的、優(yōu)選是單分散的粒子大小分布的乳劑。例如，從膠體磨、均化器、超聲波降解器中選擇獲得這種乳化處置的合適裝置?？蛇x地，在這種處置之前或者之后，將乳劑按壓通過玻璃過濾器。當(dāng)期望時，可以重復(fù)這種處置許多次。生成所期望的具有狹窄分布的粒子大小的備選實施例是使用諸如噴墨技術(shù)或者使用具有微通道或者微孔的襯底的乳化產(chǎn)生單分散乳劑的方法。優(yōu)選地，對條件進行控制，使得水并且尤其是非溶劑( 還沒有被去除。可選地，在步驟(a)或者(b)中包括穩(wěn)定成分。優(yōu)選從包括諸如聚乙烯醇、白蛋白的表面活性劑和聚合物的組或者至少兩種表面活性劑和/或聚合物的組合中選擇這種穩(wěn)定成分。如果過程中包括這種穩(wěn)定劑，過程就優(yōu)選在去除溶劑(1)之后包括洗滌步驟，以便去除穩(wěn)定劑。優(yōu)選使用濃度在0. 1-20%之間、更優(yōu)選在5-15%之間的穩(wěn)定劑。步驟C)步驟(c)中的條件優(yōu)選使得大部分非溶劑( 尚未被去除，更優(yōu)選地，基本上沒有非溶劑( 被去除。因此，優(yōu)選地，在該步驟中不采取諸如應(yīng)用真空的任何措施減小混合物周圍的壓力。去除溶劑⑴的合適方式是增加溫度，例如，將溫度增加到比將要去除的溶劑的沸點低幾度的值，或者簡單地通過攪拌混合物給定時間量。不希望受任何理論約束，認為當(dāng)溶劑(1)蒸發(fā)時，乳劑內(nèi)相中外殼成分的濃度增大到溶解度閾值之上，并且在該時刻外殼成分將開始沉淀。該沉淀隨后導(dǎo)致在乳劑內(nèi)相表面(乳劑小滴)處形成聚合物的外殼。認為一旦大多數(shù)或者全部溶劑(1)已蒸發(fā)，就得到外殼成分，其覆蓋包括非溶劑O)、水和可選的可以在過程早期階段已添加的其它材料的內(nèi)核。步驟d)在該步驟中，使微粒與水相隔離，并且可選地，對微粒進行洗滌以凈化粒子。由于微粒具有比水更低的密度，所以可以很容易通過諸如離心分離來促進粒子的分離。步驟e)在另一個步驟(e)中，施加從內(nèi)核去除水的條件。這之后立即進行在步驟(f)中對非溶劑O)的去除。非常優(yōu)選地，將水和非溶劑O)的去除分開在兩個不同步驟中。實際上，在這些步驟之間不可避免地有一些交疊，但是優(yōu)選應(yīng)該避免交疊。一般情況下，通過諸如冷凍干燥技術(shù)獲得水的去除。非溶劑O)的去除可能需要進一步減小壓力。在步驟(e)之后得到的粒子在使用之前通常再次懸浮在合適的液體中。如果將要使用的藥劑作為用于動物或者人類的造影劑或者治療劑，就優(yōu)選將粒子再次懸浮在生理鹽水溶液中。通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的聚合粒子本發(fā)明的優(yōu)選方面涉及包括氣體內(nèi)核和聚合外殼的聚合粒子，其中，粒子具有0.5 至5微米的平均粒子大小。更優(yōu)選地，至少90%的粒子具有0. 5至5微米的粒子大小，甚至更優(yōu)選地95%以上的粒子具有0. 5至5微米的粒子大小。可以通過應(yīng)用機械指數(shù)最多為3、更優(yōu)選地最多為1. 6、更優(yōu)選地最多為1. 2、甚至更優(yōu)選地最多為1. 0、甚至更優(yōu)選地最多為0. 8的超聲在聲學(xué)上激活這種粒子。優(yōu)選在0. 2以上的機械指數(shù)上、更優(yōu)選地在0. 2和0. 8之間、甚至更優(yōu)選地在0. 2 和0.6之間的下限處引起激活。對于超聲調(diào)節(jié)的藥物釋放應(yīng)用，期望聚合微粒再次懸浮在合適的液體中形成分散。最優(yōu)選地，治療成分包括如上所述的粒子，其中，一旦施加了在至多是3、優(yōu)選低于 2的機械指數(shù)上的超聲，至少聲學(xué)地激活80%、優(yōu)選是90%至100%的粒子，其中，將機械指數(shù)定義為峰值負壓力除以頻率的平方根。通常，這意味著一旦施加超聲至少80%的粒子從內(nèi)核釋放氣體和其它組分。非常期望該釋放發(fā)生在很短時間范圍內(nèi)并且在很小的機械指數(shù)范圍內(nèi)。可以通過在示例中描述的事件計數(shù)設(shè)置對該聲學(xué)激活進行監(jiān)控。在該設(shè)置中，當(dāng) (從所激活的微粒)接收的散射信號的幅度大于檢測系統(tǒng)噪聲級別的兩倍時，對激活事件進行量化和計數(shù)。在示例性實施例中，本發(fā)明涉及包括粒子的治療成分，所述粒子包括氣體內(nèi)核和聚合外殼，其中，在0. 01至3的機械指數(shù)范圍內(nèi)、更優(yōu)選在0. 1至2的機械指數(shù)范圍內(nèi)、更優(yōu)選在0. 4至2的機械指數(shù)范圍內(nèi)，在0. 5單位的機械指數(shù)窗內(nèi)、優(yōu)選在0. 4單位的窗內(nèi)、 更優(yōu)選在0. 3單位的窗內(nèi)，通過超聲能量激活至少80%的粒子。在示例中所指定的條件下，優(yōu)選通過事件計數(shù)增大到至少50來證明該激活。該事件計數(shù)的增大優(yōu)選對應(yīng)于回波強度增大到如上所述的機械指數(shù)窗和范圍內(nèi)的初始值至少1000倍(times)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)超聲換能器提供超聲能量?？梢悦}沖觸發(fā)該聲能，但是為了最大化地觸發(fā)藥物釋放，優(yōu)選以連續(xù)波提供超聲能量?？梢允褂迷谂R床可接受的對于患者安全的診斷功率水平下的若干聲脈沖對包含粒子的氣體進行成像。現(xiàn)在，通過下列非限制性示例對本發(fā)明進行說明。藥物組合物可選地，將根據(jù)本發(fā)明的微粒配制成診斷成分，其優(yōu)選用于腸胃外給藥。例如，腸胃外藥物劑型有利地包含無菌水溶液或者根據(jù)本發(fā)明的微粒懸浮液。用于制備合適的藥物溶液和懸浮液的各種技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。這些溶液還可以包含藥劑上可接受的緩沖劑以及可選地，諸如但不限于電解液(諸如氯化鈉)或者抗氧化劑的添加劑。腸胃外成分可以直接注射或者與聲學(xué)成像中慣用的一種或多種佐劑混合注射。
常規(guī)的賦形劑是藥劑上可接受的適合于腸胃外、腸內(nèi)或者局部施用的有機或者無機載體物質(zhì)，其與藥劑不發(fā)生有害反應(yīng)。合適的藥劑上可接受的佐劑包括但是不限于水、 鹽溶液、乙醇、阿拉伯樹膠、植物油、聚乙二醇、明膠、乳糖、淀粉糖、硬脂酸鎂、滑石粉、硅酸、 粘性石蠟、香水油、脂肪酸單甘酯和雙甘酯、雙季戊四脂肪酸酯、胺基酸、聚乙烯基吡咯烷酮等。可以對藥物制備進行殺菌，并且如果期望，將其與諸如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、 乳化劑、用于影響滲透壓的鹽分、緩沖劑、著色、調(diào)味和/或芳香物質(zhì)等的輔助劑混合，輔助劑不與活性成分發(fā)生有害反應(yīng)。對于腸胃外應(yīng)用，特別合適的是可注射的無菌溶液，優(yōu)選是油或者水溶液、也可以是懸浮液、乳劑或者包括栓劑的植入劑。安瓿是方便的單位劑量。優(yōu)選在諸如可注射溶液的腸胃外施用中使用包含微粒的造影劑。以常規(guī)方式在超聲過程中使用本發(fā)明的治療成分。以充足量施予治療成分，以便給溫血動物提供全身或者將要進行成像的器官或者組織的局部的充足可視化和/或藥物輸送，隨后使動物經(jīng)受該過程。取決于所使用的診斷技術(shù)以及將要成像的器官，該劑量可以大范圍變化。示例狐‘儲#夕卜龍馳、100%氣ι·鋪碰如在Chlon等中所描述的那樣制備的具有含氟端基的0. Ig的pLLA(M 2400g/ mol)。將比率1 8、1 5或者1 3的生物大分子2009和環(huán)辛烷(Aldrich C109401)溶入0. 5g 二氯甲烷中。添加120μ1、ρΗ 7. 5的30mMTrisHCl緩沖劑，并且在室溫、以IlOW對其進行兩次3秒的聲處理(1秒時間間隔)。給該第一乳劑添加aiil 9%的聚乙烯醇(pVA、 MW13. 000-23. 000、Aldrich 363170)，并且在室溫使用 25. OOOrpm 的 Ultra turrax 分散機使其均勻。將復(fù)乳劑逐滴添加到使用磁攪拌器以660rpm攪動的8ml9%的PVA中。在室溫攪拌3小時之后在4000rpm(G大約是1720g)用離心機分離樣本45分鐘以去除DCM。重新取回頂部餾分并且用超純水再洗滌兩次(two more times)，持續(xù)20分鐘。在_80°C、在預(yù)先冷卻的藥水瓶中對樣本進行快速冷凍。使用Christ epsilon 2_6冷凍干燥機進行M小時冷凍干燥。在冷凍干燥之后，給系統(tǒng)充滿氮。將樣本儲存在4°C。在冷凍干燥之前，pLLA-pFO微囊包含環(huán)辛烷。在冷凍干燥之后，對于如圖1中所示的外殼厚度的所有變化，充氮的微粒保持它們的大小分布(庫爾特計數(shù)器)。經(jīng)冷凍干燥的微泡再次懸浮在水相中顯示它們都是漂浮的。50%氣體填充的pLLA-pFO微粒如在Chlon等中所描述的那樣制備具有含氟端基的0. 0166g的pLLA_(Mw 2400g/ mol)。將生物大分子 2009、0. 0417g 十六烷(Aldrich H6703)和 0. 0417g 環(huán)辛烷(Aldrich C109401)溶入0. 5g 二氯甲烷中。添加120 μ UpH 7. 5的30mM TrisHCl緩沖劑，并且在室溫、1 IOff對其進行兩次3秒的聲處理(1秒時間間隔)。給該第一乳劑添加aiil 9 %的聚乙烯醇(pVA、MW13. 000-23. 000,Aldrich 363170)，并且在室溫使用 25. OOOrpm 的 Ultra turrax 分散機使其均勻。將復(fù)乳劑逐滴添加到使用的磁攪拌器以660rpm攪動的8ml 9%的PVA 中。在室溫攪拌3小時之后，在4000rpm(G大約是1720g)用離心機分離樣本45分鐘，以去除DCM。重新取回頂部餾分并且用超純水再洗滌兩次，持續(xù)20分鐘。在-80°C、在預(yù)先冷卻的藥水瓶中對樣本進行快速冷凍。使用Christ epsilon 2_6冷凍干燥機進行M小時冷凍干燥。在冷凍干燥之后，給系統(tǒng)填充氮。將樣本儲存在4°C。在如圖2中所示的冷凍干燥之后，維持包含十六烷和環(huán)辛烷的微粒的大小分布(庫爾特計數(shù)器)，其中，通過凍干法用氮取代環(huán)辛烷，導(dǎo)致半充滿的粒子。經(jīng)冷凍干燥的微泡再次懸浮在水相中顯示它們都是漂浮的、指示完整的粒子。100%氣體填充的dDLA-dFO微粒將0. 0166g 的 pDLA-pFOO^ 4000g/mol)和 0. 0833g 的環(huán)癸烷(Flul ^8699)溶入 0. 5g 二氯甲烷中。添加120μ1、ρΗ 7. 5的30mM TrisHCl緩沖劑，并且在室溫、IlOW對其進行兩次3秒的聲處理(1秒時間間隔)。給該第一乳劑添加aiil 9%的聚乙烯醇(pVA、MW 13. 000-23. 000、Aldrich363170)，并且在室溫使用 25. OOOrpm 的 Ultra turrax 分散機使其均勻。將復(fù)乳劑逐滴添加到使用磁攪拌器以660rpm攪動的8ml 9%的PVA中。在室溫攪拌 3小時之后，在4000rpm(G大約是1720g)用離心機分離樣本45分鐘，以去除DCM。重新取回頂部餾分并且用超純水再洗滌兩次，持續(xù)20分鐘。在-80°C、在預(yù)先冷卻的藥水瓶中對樣本進行快速冷凍。使用Christepsilon 2-6冷凍干燥機進行M小時的冷凍干燥。在冷凍干燥之后，給系統(tǒng)填充氮。將樣本儲存在4°C。如在圖3中所示，由無定形pDLA-pFO制成的微粒在冷凍干燥之后顯示出與在冷凍干燥之前大小分布可比較的大小分布(庫爾特計數(shù)器)。形成少量聚集體導(dǎo)致大小分布峰值稍微增寬。在將這些微泡再次懸浮在水相中之后，粒子都是漂浮的，指示粒子完整。填充以模型疏水分子的微泡100%和50%氣體填充的裝載了蘇丹黑的微粒將0. 0166g pLLA-pFO (Mw 2400g/mol)和溶入 0. 0833g燒烴(環(huán)辛燒，F(xiàn)luka 28699 或者比率1 1的具有十六烷Aldrich H6703的環(huán)辛烷)中的0. 23mg蘇丹黑溶入0. 5g 二氯甲烷中。添加120μ 1超純水，并且在室溫、110W對其進行兩次3秒的聲處理(1秒時間間隔)。給該第一乳劑添加 anl 9% 的聚乙烯醇(p VA, MW 13. 000-23. 000,Aldrich 363170)， 并且在室溫使用25. OOOrpm的Ultra turrax分散機使其均勻。將復(fù)乳劑逐滴添加到使用磁攪拌器以660rpm攪動的8ml 9 %的PVA中。在室溫攪拌3小時之后在4000rpm (G大約是1720g)用離心機分離樣本45分鐘，以去除DCM。重新取回頂部餾分并且用超純水再洗滌兩次，持續(xù)20分鐘。在_80°C、在預(yù)先冷卻的藥水瓶中對樣本進行快速冷凍。使用Christ epsilon 2_6冷凍干燥機進行M小時的冷凍干燥。在冷凍干燥之后，給系統(tǒng)填充氮。將樣本儲存在4°C。在冷凍干燥之前和之后，包含100%和(en) 50%氣體填充的具有蘇丹黑的粒子的微粒大小分布是可比較的，并且低于5微米。經(jīng)冷凍干燥的微泡再次懸浮在水相中顯示它們都是漂浮的、指示粒子完整?？梢猿晒Φ貙⒆鳛槭杷Ｐ突衔锏奶K丹黑合并到用復(fù)乳劑制備的微粒中。封裝效率通過從在十二烷產(chǎn)品中提取染劑測量吸光度確定，對于100%氣體填充的微泡，給出合并效率是84%，對于半氣體填充的微泡，給出合并效率是93%。由單乳劑方法制成的樣品顯示對于100%氣體填充和50%氣體填充的微泡的合并效率分別是46和 76% (Kooiman 等，J. Contr. Rel. 2009)。100%氣體填充的具有疏水模型化合物尼羅紅的pLLA-pFO微粒將0.0166g pLLA-pFO (Mw 2400g/mol)和 0. 0833g 環(huán)辛燒(AldrichC109401)溶入0. 5g溶解了尼羅紅的二氯甲烷中。添加120 μ 1、pH 7. 5的30mM TrisHCl緩沖劑，并且在室溫、IlOW對其進行兩次3秒的聲處理(1秒時間間隔)。給該第一乳劑添加aiil 9%的聚乙烯醇(pVA、MW13. 000-23. 000、Aldrich 363170)，并且在室溫使用 25. OOOrpm 的 Ultra turrax分散機使其均勻。將復(fù)乳劑逐滴添加到使用磁攪拌器以660rpm攪動的8ml9%的 PVA中。在室溫攪拌3小時之后，在4000rpm(G大約是1720g)用離心機分離樣本45分鐘以去除DCM。重新取回頂部餾分并且用超純水再洗滌兩次，持續(xù)20分鐘。在-80°C、在預(yù)先冷卻的藥水瓶中對樣本進行快速冷凍。使用Christ epsilon 2_6冷凍干燥機進行M小時的冷凍干燥。在冷凍干燥之后，給系統(tǒng)填充氮。將樣本儲存在4°C。在冷凍干燥之前和之后，包含尼羅紅的微粒的大小分布(庫爾特計數(shù)器)是可比較的，并且在圖4中示出。將經(jīng)冷凍干燥的微泡再次懸浮在水相中顯示它們都是漂浮的、指示粒子完整。可以成功地將作為疏水模型化合物的尼羅紅合并到采用復(fù)乳劑制備的微粒中。熒光顯微鏡顯示尼羅紅合并在外殼中。100%和50%氣體填充的裝載了紫杉醇的dLLA-DFO微粒將0. 0166g pLLA-pFO (Mw 2400g/mol)和 0. Ig烷烴(環(huán)辛烷(AldrichC109401)，或者比率1 1的具有十六烷Aldrich H6703的環(huán)辛烷)溶入0. 5g0.6%的紫杉醇的二氯甲烷溶液中。添加120 μ UpH 7. 5或者pH 8. 0的30mMTrisHCl緩沖劑，并且在室溫、IlOW對其進行兩次3秒的聲處理(1秒時間間隔)。給該第一乳劑添加aiil 9%的聚乙烯醇(pVA、 MW 13. 000-23. 000,Aldrich 363170)，并且在室溫使用 25. OOOrpm 的 Ultra turrax 分散機使其均勻。將復(fù)乳劑逐滴添加到使用660rpm的磁攪拌器攪動的8ml 9%的PVA中。在室溫攪拌3小時之后，在4000rpm(G大約是1720g)用離心機分離樣本45分鐘以去除DCM。重新取回頂部餾分并且用超純水再洗滌兩次，持續(xù)20分鐘。在-80°C、在預(yù)先冷卻的藥水瓶中對樣本進行快速冷凍。使用Christepsilon 2-6冷凍干燥機進行M小時的冷凍干燥。在冷凍干燥之后，給系統(tǒng)填充氮。將樣本儲存在4°C。圖5示出了對于由復(fù)乳劑技術(shù)制成的100%和50%氣體填充的粒子的大小分布 (庫爾特計數(shù)器)，在冷凍干燥之前，兩種大小分布都在1-5 μ m范圍內(nèi)。50%氣體填充的粒子顯示出一些聚合，這對于具有殘油的粒子是眾所周知的。所使用的緩沖劑的PH值對大小分布沒有任何影響。雖然由單乳劑方法制成的粒子一般在大小上稍大，但是由單乳劑技術(shù)制成的粒子在冷凍干燥之前和之后顯示出相同的大小分布趨勢。這在圖中示出。在通過單乳劑或者復(fù)乳劑處理使100%和50%氣體填充的粒子再次懸浮在水相中之后，它們都開始漂浮，指示粒子完整。通過反相液相層析法(pevered phase liquid chromatography)確定紫杉醇濃度。在Agilent 1200HPLC系統(tǒng)上使用反相液相層析法(RP-LC)分離在二甲基甲酰胺中的所有樣本的10和20 μ L的等份，該Agilent 1200HPLC系統(tǒng)由二進制泵、溫度受控孔板取樣器和二極管陣列檢測器組成，裝配了以0. 7mL/min流速在A (水中0. FA)中施加20 分鐘B (ACN中0. 1 % FA)的線性梯度的苯基-己基(4. 6*100mm，3. 5 μ m粒子)柱。隨后，使用在254nm的UV檢測和能夠在m/z 200-2000的質(zhì)量范圍中以交替(在正和負之間切換)模式執(zhí)行串聯(lián)質(zhì)譜法測量的Agilent ESI離子阱(MSD)質(zhì)譜儀對洗脫化合物進行分析。在表1中給出了所得到的封裝效率，作為如在Kooiman等的J. ControledRelease 2009中所描述的單乳劑微粒的合并效率的參考。表1 對于通過單或者復(fù)乳劑制備的微粒的紫杉醇裝載效率
權(quán)利要求
1.一種用于制備生物活性藥劑填充的聚合物微粒的方法，所述方法包括下列步驟(f)通過混合有機溶劑(1)、生物可降解的聚酯以及對于聚合物的有機非溶劑( 并且向該混合物添加從0到40%體積比的水溶液來提供第一乳劑(A)，其中，生物可降解的聚酯 /有機非溶劑的比率是1 10到1 1，并且其中，將生物活性藥劑添加到所述有機混合物和/或水溶液；(g)通過將過量水溶液添加到該第一乳劑㈧制備第二乳劑⑶；(h)施加用于使所述有機溶劑(1)揮發(fā)的條件；(i)施加用于去除水的條件；(j)施加用于去除所述非溶劑O)的條件。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，生物活性藥劑填充的聚合物微粒具有在0.5和 5μπι之間的平均微粒大小。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物可降解的聚酯具有在1.000和200. OOOg/ mol之間的分子量。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物活性藥劑是親水的。
5 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物活性藥劑是疏水的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物可降解的聚酯/有機非溶劑(2)的比率是 1 8 至 1 3。
7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，將在步驟e)中不被去除的非溶劑(3) 添加到步驟a)。
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，從包括下列的組中選擇所述聚合物L(fēng) 或者DL型的聚交酯、聚交酯-共-乙交酯、聚己內(nèi)酯、這些的組合或者這些的嵌段共聚物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述聚合物包括以至少一個疏水基改性的至少一個基團，所述疏水基優(yōu)選從包括下列的組中選擇氟化物、包括6至M個碳原子的烷基鏈、 或者這些的組合。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，從包括線性或者環(huán)形烴類的組中選擇非溶劑，所述烴類的碳鏈長度為從6至14個碳原子。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，從包括環(huán)辛烷、環(huán)癸烷、癸烷或者這些的組合的組中選擇所述非溶劑。
12.一種根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的方法能夠獲得的包括生物活性藥劑的聚合物微粒，所述聚合物微粒具有在0. 5和5 μ m之間的范圍內(nèi)的微粒大小。
13.如權(quán)利要求12所述的聚合物微粒，其中，所述生物活性藥劑是親水的。
14.如權(quán)利要求12所述的聚合物微粒，其中，所述生物活性藥劑是疏水的。
15.一種包括如權(quán)利要求12至14中的任一項所述的聚合物微粒的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備藥物填充的聚合物微粒的方法，該聚合物微粒包括氣體內(nèi)核以及外殼，所述粒子適合于作為治療成分的部分，其尤其用于藥物輸送。通過使用該方法，獲得了聚合微粒，其將親水和/或疏水藥物與大的優(yōu)選是中空的內(nèi)核以高合并效率組合。
文檔編號A61K49/00GK102470100SQ201080033986
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者C·H·T·什洛, M·R·博默 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司