專(zhuān)利名稱(chēng)：代謝綜合征的預(yù)防劑和/或治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以蜜柑區(qū)柑橘類(lèi)提取物作為有效成分的代謝綜合征的預(yù)防和/或治療劑、含有上述提取物的用于代謝綜合征的預(yù)防和/或治療的藥物制劑、以及用于代謝綜合征的預(yù)防的功能性食品和健康食品。
背景技術(shù)：
由肥胖引起的高血糖、高血壓、脂質(zhì)異常等癥狀的增加是世界各國(guó)共通的社會(huì)問(wèn)題。將除了由內(nèi)藏脂肪組織的肥大化引起并導(dǎo)致體重增加的內(nèi)臟脂肪型肥胖以外，還兼具高血糖、高血壓、脂質(zhì)異常中的兩種以上的狀態(tài)稱(chēng)為“代謝綜合征(內(nèi)臟脂肪綜合征)”，美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃(NCEP)已經(jīng)公布了該病狀的診斷基準(zhǔn)。
將高血糖作為指標(biāo)進(jìn)行判定的糖尿病大致分為I型和II型。I型的病狀主要為由于遺傳的因素而完全喪失了本應(yīng)正常保持血糖值的激素胰島素的分泌，其占日本人糖尿病患者的5 10%。II型的病狀主要為后天喪失了胰島素的感受性(成為胰島素抵抗性)， 在日本人中也發(fā)現(xiàn)了伴隨胰島素分泌降低的病例。占糖尿病患者的90 95%、由代謝綜合征誘發(fā)的糖尿病屬于2型糖尿病。
已知患糖尿病的原因之一為過(guò)量飲食等生活習(xí)慣對(duì)腎臟等臟器造成負(fù)擔(dān)，根據(jù)最近的研究可知，作為肥胖原因的脂肪細(xì)胞的肥大化會(huì)引起脂肪組織內(nèi)的基因水平的變化， 通過(guò)血中的細(xì)胞因子或其他信號(hào)因子的濃度變化而對(duì)包含肝臟和骨骼肌在內(nèi)的全身造成影響，促使糖尿病的發(fā)病。在糖尿病治療中，吡格列酮作為非常有效的降血糖劑得到利用， 但存在副作用的問(wèn)題(日本特開(kāi)2003-119148、以下稱(chēng)為專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
另外，脂肪細(xì)胞的肥大化與脂質(zhì)異常有關(guān)。作為脂質(zhì)異常的指標(biāo)，一直以來(lái)使用了血中的總膽固醇(以下，稱(chēng)為“T-CH0”)值或中性脂肪(血中甘油三酯，以下稱(chēng)為“TG”)的值，目前，代替T-CHO而將血中LDL膽固醇值作為指標(biāo)之一。并且已知若患LDL膽固醇血癥、 高甘油三酯血癥，則罹患動(dòng)脈硬化等心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)變高。在這種脂質(zhì)異常的治療中使用了司他汀(statin)、貝特類(lèi)(fibrates)藥物。
另一方面，有報(bào)道指出在柑橘類(lèi)中含有對(duì)上述那樣的糖尿病、脂質(zhì)異常有效的物質(zhì)。此處，柑橘類(lèi)的分類(lèi)詳細(xì)記載于田中的分類(lèi)法(Tanaka，Τ.，Misunderstanding with regards Citrus classification and nomenclature. Bull. Univ. Osaka Pref. Ser. B,21, 139-145 (1969)，以下稱(chēng)為非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)中。需要說(shuō)明的是，針對(duì)柑橘類(lèi)中所含的聚甲氧基黃酮的種類(lèi)和量已有研究，并報(bào)道稱(chēng)在與基于田中的分類(lèi)法的分類(lèi)之間發(fā)現(xiàn)了關(guān)聯(lián)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。
WO 1999/056768A2(以下稱(chēng)為專(zhuān)利文獻(xiàn)2~)中，已知一種將在脂肪組織或脂肪細(xì)胞中表達(dá)的基因的表達(dá)量變化作為指標(biāo)而對(duì)物質(zhì)的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。報(bào)道了例如GDF-8 抑制劑促進(jìn)培養(yǎng)脂肪細(xì)胞內(nèi)的GLUT4的表達(dá)、以及該物質(zhì)對(duì)于糖尿病的處置有用的內(nèi)容。
另外，關(guān)于聚甲氧基黃酮(以下稱(chēng)為PMF)的效果，報(bào)道了下述例子。據(jù) W02007/024982A2(以下稱(chēng)為專(zhuān)利文獻(xiàn)；3)中報(bào)道，與接受高脂飲食的小鼠相比，在接受添加有由甜橙(Citrus sinensis)提取的包含PMF的成分的高脂飲食的小鼠中，體重的增加量和平均脂肪重量降低。
據(jù)日本特開(kāi)2001-240539(以下稱(chēng)為專(zhuān)利文獻(xiàn)4)中報(bào)道，若對(duì)自然患糖尿病的小鼠經(jīng)口給予作為PMF之一的蜜桔黃素或扁平橘(Citrus depressa)濃縮果汁，則與未給予這些物質(zhì)的小鼠相比，具有顯著的抑制血糖上升的效果。
據(jù)WO 2002/087567A2(以下稱(chēng)為專(zhuān)利文獻(xiàn)5)中報(bào)道，對(duì)倉(cāng)鼠僅提供果糖時(shí)、以及提供添加有食用橘皮素或柑橘類(lèi)PMF組合物的果糖時(shí)，血中總膽固醇濃度降低。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專(zhuān)利文獻(xiàn)
專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2003-119148
專(zhuān)利文獻(xiàn)2 國(guó)際公開(kāi)公報(bào)WO 1999/056768A2
專(zhuān)利文獻(xiàn)3 國(guó)際公開(kāi)公報(bào)WO 2007/024982A2
專(zhuān)利文獻(xiàn)4 日本特開(kāi)2001-240539
專(zhuān)利文獻(xiàn)5 國(guó)際公開(kāi)公報(bào)WO 2002/087567A2
非專(zhuān)利文獻(xiàn)
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 Tanaka, Τ. , Misunderstanding with regards Citrus classification and nomenclature. Bull. Univ. Osaka Pref. Ser. B,21,139-145(1969)
2 :Nogata, Y. ， Sakamoto, K. ， Shiratsuchi, H. , Ishii, Τ. , Yano Μ.， and Ohta, H. , Flavonoid Composition of Fruit Tissues of Citrus Species, Biosci. Biotechnol. Biochem.，70，178—192 (2006)發(fā)明內(nèi)容
如上所述，代謝綜合征是由內(nèi)臟脂肪型肥胖所誘發(fā)的，因此為了提高治療效果，必須改善肥胖度、即縮小脂肪組織。但是，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的抗肥胖藥，而且尚未得到認(rèn)可， 因此將飲食療法和運(yùn)動(dòng)療法合用。
上述吡格列酮存在促進(jìn)脂肪細(xì)胞的成長(zhǎng)的矛盾點(diǎn)，若長(zhǎng)期服用則存在體重和體脂肪增加、降血糖作用減弱的問(wèn)題。另外，司他汀類(lèi)、貝特類(lèi)的藥物存在橫紋肌溶解和由肝臟分泌的脂肪酸增多的問(wèn)題。
代謝綜合征的治療中飲食的限制和適度的運(yùn)動(dòng)是重要的。其目的在于切斷下述不好的流動(dòng)攝入到肌肉中但未被消耗的血中的糖分被儲(chǔ)存在脂肪組織中，肥大化的脂肪細(xì)胞會(huì)分泌引起循環(huán)系統(tǒng)的并發(fā)癥的中性脂肪。即，為了提高治療效果，抑制糖分的供給源的過(guò)量攝取、將所攝取的糖分消耗盡是必要的。此處，抑制糖分的供給源(即攝食量)必須小心進(jìn)行，以免引起低血糖或骨質(zhì)疏松癥等。另外，若所攝取的糖分在肌肉中的血糖攝入和代謝得到促進(jìn)，則會(huì)促進(jìn)血糖的消耗，因而攝入到肥大化的脂肪組織中的血糖減少，脂肪細(xì)胞的肥大化得到抑制，中性脂肪等的分泌也得到抑制。
此外，如上所述，代謝綜合征合并了多種病狀，因此在針對(duì)各病狀進(jìn)行給藥的對(duì)癥療法中存在極限。因此，社會(huì)強(qiáng)烈要求對(duì)下述物質(zhì)進(jìn)行篩選(A)改善肥胖和高血糖、且不妨礙脂質(zhì)異常的改善的物質(zhì)；或(B)改善肥胖和脂質(zhì)異常、且不妨礙高血糖的改善的物質(zhì)。
另外，為了進(jìn)行上述代謝綜合征的預(yù)防和/或治療，最希望發(fā)現(xiàn)可同時(shí)改善內(nèi)臟CN 102549153 A脂肪型肥胖、高血糖、脂質(zhì)異常這三種病狀；且無(wú)高血壓和其他副作用或者副作用小的物質(zhì)，將該物質(zhì)作為藥物糖提供。但是，即使無(wú)法同時(shí)改善上述三種病狀，若能在改善內(nèi)臟脂肪型肥胖的病狀的同時(shí)改善高血糖或脂質(zhì)異常的任一種病狀，則只要另一種病狀不惡化則也沒(méi)有問(wèn)題。
此外，若這種物質(zhì)的安全性高，則不僅可以以藥物制劑的形式提供，還可以以功能性食品或健康食品的形式提供，可以期待預(yù)防代謝綜合征患者的發(fā)生的效果。
因此，社會(huì)高度要求提供這種物質(zhì)。
本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的。即，本發(fā)明的發(fā)明人立足于與內(nèi)臟脂肪型肥胖、 高血糖、脂質(zhì)異常相關(guān)的復(fù)雜機(jī)理，并且注意了安全性和副作用，開(kāi)發(fā)了對(duì)代謝綜合征的治療有效的成分的篩選方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)骨骼肌組織或骨骼肌細(xì)胞中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，能夠篩選出對(duì)代謝綜合征的治療有效的組合物，通過(guò)進(jìn)行該篩選，發(fā)現(xiàn)由針對(duì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的效果而賦予了特征的柑橘類(lèi)提取物的成分具有以往未知的顯著作用，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的第1方式為代謝綜合征的治療用物質(zhì)的篩選方法，所述代謝綜合征表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血糖和脂質(zhì)異常，該篩選方法包括下述的工序(1) (3)。(1)提取工序，由以規(guī)定的量按規(guī)定的期間給予被測(cè)物質(zhì)的構(gòu)成被測(cè)物質(zhì)給藥組的非人哺乳動(dòng)物、 和未以所述規(guī)定的量按所述規(guī)定的期間給予所述被測(cè)物質(zhì)的構(gòu)成被測(cè)物質(zhì)非給藥組的非人哺乳動(dòng)物分別采集骨骼肌，由骨骼肌提取總RNA級(jí)分；(2)定量工序，利用規(guī)定的方法，對(duì)所述提取工序中提取的各總RNA級(jí)分中所含的、編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量進(jìn)行定量；和C3)判定工序，對(duì)于分別構(gòu)成所述被測(cè)物質(zhì)給藥組和被測(cè)物質(zhì)非給藥組的所述非人哺乳動(dòng)物在所述規(guī)定期間中的體重增加量、攝食量和編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量，在組間進(jìn)行比較分析，從而判定針對(duì)所述代謝綜合征的效果。上述工序( 中定量的所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因優(yōu)選為小鼠GLUT4及其同源物。
上述篩選方法中，更優(yōu)選所述規(guī)定的方法包括以下工序使用逆轉(zhuǎn)錄酶由編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；使用所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因特異性引物，以所述 cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的工序；使用選自由熒光標(biāo)記核酸、同位素標(biāo)記核酸和核酸染色劑組成的組中的試劑，利用與所述試劑對(duì)應(yīng)的檢測(cè)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量的工序；和對(duì)編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量進(jìn)行確定的工序。
另外，代替利用規(guī)定的方法對(duì)編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量進(jìn)行定量的工序，還可以為利用規(guī)定的方法對(duì)所述基因所編碼的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行定量的工序。該情況下，在所述比較分析中，代替所述RNA的表達(dá)量而優(yōu)選在組間對(duì)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行比較分析。
用于對(duì)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行定量的規(guī)定的方法優(yōu)選包括以下工序利用選自由蛋白質(zhì)印跡法、ELISA和免疫染色法組成的組中的任一種方法測(cè)定糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)量的工序；以及確定該表達(dá)量的工序。另外，還可以合用依據(jù)所述RNA的表達(dá)量的方法和依據(jù)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量的方法，均可以用于所述比較分析中。另外，所述被測(cè)物質(zhì)中含有化合物和組合物。
本發(fā)明的第2方式為用于實(shí)施上述篩選方法的試劑盒。上述試劑盒優(yōu)選包含逆轉(zhuǎn)錄酶、以cDNA為模板對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增的酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因特異性引物。上述試劑盒優(yōu)選還具備核酸染色劑。
本發(fā)明的第3方式為一種代謝綜合征的治療用組合物，所述代謝綜合征是糖尿病發(fā)病前的表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血糖和脂質(zhì)異常的代謝綜合征，其中，所述組合物含有在干燥重量中含70 100重量％的蜜桔黃素的蜜柑區(qū)(Acrumen(VII)seCtion)柑橘類(lèi)的果皮提取級(jí)分，以所述果皮提取級(jí)分的干燥重量換算，以每天5 200mg/kg的用量經(jīng)口給藥，所述組合物具有下述作用或特征(1) G)。(1)抑制體重增加量的上升而不影響攝食量的作用；( 促進(jìn)骨骼肌組織內(nèi)或骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的小鼠GLUT4及作為其同源物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的蛋白質(zhì)表達(dá)的作用；(3)促進(jìn)肥大化內(nèi)臟周邊白色脂肪組織縮小的作用；(4)降低血中葡萄糖濃度而不影響血中甘油三酯濃度的作用。
上述組合物中，所述蜜柑區(qū)(Acrumen(VII)seCti0n)柑橘類(lèi)優(yōu)選為扁平橘 Citrus cbpressa，所述蜜桔黃素優(yōu)選在干燥重量中為95 100重量％，所述用量?jī)?yōu)選為每天10 100mg/kg，另外，作為所述作用或特征，優(yōu)選還具有(5)促進(jìn)內(nèi)臟周邊白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞縮小的作用；(6)改善糖耐量的作用。
本發(fā)明的第4方式為一種代謝綜合征的預(yù)防和/或治療用組合物，所述代謝綜合征表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血糖和脂質(zhì)異常，其中，所述組合物含有在干燥重量中含 45 55重量％的蜜桔黃素和45 55重量％的橘皮素的蜜柑區(qū)(Acrumen (VII) section)柑橘類(lèi)果皮提取級(jí)分，以所述果皮提取級(jí)分的干燥重量換算，每人每天經(jīng)口攝取0. 5 8. Og, 所述組合物具有下述作用或特征(1) G)。(1)抑制體重增加量的增加而不影響攝食量的作用；( 促進(jìn)骨骼肌組織內(nèi)或骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的小鼠GLUT4及作為其同源物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的作用；(3)促進(jìn)肥大化內(nèi)臟周邊白色脂肪組織縮小的作用； (4)降低血中甘油三酯濃度而不影響血中葡萄糖濃度的作用。
上述組合物中，所述蜜柑區(qū)(Acrumen(VII)seCti0n)柑橘類(lèi)優(yōu)選為扁平橘 Citrus cbpressa，所述用量?jī)?yōu)選為1. 0 6. Og/人/天，另外，作為所述作用或特征，優(yōu)選還具有( 促進(jìn)內(nèi)臟周邊白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞縮小的作用；(6)改善瘦素抵抗性的作用。
另外，本發(fā)明的第5方式為一種含有上述代謝綜合征的治療用組合物的功能性食品。本發(fā)明的第6方式為一種含有上述代謝綜合征的治療用組合物的健康食品。另外，本發(fā)明的第7方式為一種含有上述代謝綜合征的治療用組合物的藥物制劑。
根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，能夠選擇出具有以下作用或特征的物質(zhì)、或者含有所述物質(zhì)的組合物(1)抑制體重增加量的增加而不影響攝食量的作用；( 促進(jìn)骨骼肌組織內(nèi)或骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的以小鼠GLUT4為首的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的作用。
利用本發(fā)明的所述含有蜜桔黃素的組合物，能夠提供一種代謝綜合征的預(yù)防和/ 或治療用藥物制劑、功能性食品或健康食品，其特征在于，其具有抗肥胖效果，具有高血糖治療等效果，且不妨礙脂質(zhì)異常的改善。利用本發(fā)明的所述含有蜜桔黃素和橘皮素的組合物，能夠提供一種代謝綜合征的預(yù)防和/或治療用藥物制劑、功能性食品或健康食品，其特征在于，其具有抗肥胖效果，具有脂質(zhì)異常治療等效果，且不妨礙高血糖的改善。
通過(guò)利用規(guī)定的方法給予本發(fā)明的藥物制劑，能夠預(yù)防和/或治療代謝綜合征。 另外，通過(guò)攝取本發(fā)明的功能性食品和健康食品，能夠促進(jìn)代謝綜合征的預(yù)防和/或治療。


圖IA是表示扁平橘果皮提取物的HPLC分析的結(jié)果的曲線圖。曲線圖的縱軸以檢測(cè)電壓(mV)表示UV檢測(cè)器的電位變化。
圖IB是表示溫州蜜柑果皮提取物的HPLC分析的結(jié)果的曲線圖。曲線圖的縱軸以檢測(cè)電壓(mV)表示UV檢測(cè)器的電位變化。
圖2A是表示實(shí)施例3中提供低脂飲食(LFD)、高脂飲食(HFD)、添加扁平橘提取物的高脂飲食(HFD+1SPE)和添加高濃度扁平橘提取物的高脂飲食(HFD+1. 5SPE)后小鼠的體重增加量的曲線圖。
圖2B是表示實(shí)施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的攝食量的重量的曲線圖。
圖2C是表示實(shí)施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE, HFD+1. 5SPE后小鼠的肝臟、腎臟和白色脂肪組織的重量的曲線圖。
圖3A是表示實(shí)施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的中性脂肪 (甘油三酯)、總膽固醇、葡萄糖的血中濃度的曲線圖。
圖;3B是表示實(shí)施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的瘦素的血中濃度的曲線圖。
圖3C是表示實(shí)施例3中提供LFD、HFD、HFD+1SPE、HFD+1. 5SPE后小鼠的白色脂肪組織的脂質(zhì)生物合成相關(guān)基因群的相對(duì)表達(dá)量(設(shè)LFD = 1時(shí))的曲線圖。
圖4A是觀察實(shí)施例3中提供LFD后小鼠的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
圖4B是觀察實(shí)施例3中提供HFD后小鼠的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
圖4C是觀察實(shí)施例3中提供HFD+1SPE后小鼠的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
圖4D是觀察實(shí)施例3中提供HFD+1. 5SPE后小鼠的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
圖5A是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供僅溶劑(Vehicle)、蜜桔黃素(No200)和吡格列酮(P30)時(shí)葡萄糖的血中濃度的曲線圖。
圖5B是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)針對(duì)糖耐量的經(jīng)口葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)的結(jié)果的曲線圖。
圖6A是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)白色脂肪組織中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4基因的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖6B是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)上述GLUT4的蛋白質(zhì)表達(dá)量的電泳圖像照片及表示其表達(dá)量的曲線圖。
圖6C是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)骨骼肌中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4的蛋白質(zhì)表達(dá)量的電泳圖像照片及表示表達(dá)量的曲線圖。
圖7A是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)肝臟組織中的糖異生相關(guān)基因PEPCK的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖7B是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)肝臟組織中的糖異生相關(guān)基因G6I^ase的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖8A是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)脂聯(lián)素的血中濃度的曲線圖。
圖8B是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30時(shí)脂聯(lián)素基因的mRNA 表達(dá)量的曲線圖。
圖9A是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)脂肪細(xì)胞因子基因 TNF-α的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖9B是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)脂肪細(xì)胞因子基因 MCP-I的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖9C是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供Vehicle、No200和P30時(shí)脂肪細(xì)胞因子基因 IL-6的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖IOA是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30時(shí)脂肪細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子基因PPAR γ的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖IOB是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30時(shí)脂質(zhì)生物合成相關(guān)基因aP2的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖IOC是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30時(shí)脂質(zhì)蓄積控制相關(guān)基因LPL的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖IOD是表示對(duì)糖尿病模型小鼠提供VehiCle、NO200和P30時(shí)脂質(zhì)蓄積控制相關(guān)基因Perilipin的mRNA表達(dá)量的曲線圖。
圖1IA是表示實(shí)施例6中進(jìn)行低脂飲食喂食+溶劑給藥的LFD攝取組(LFD，無(wú)肥胖誘導(dǎo)的比較例)、以及利用高脂飲食(HFD)進(jìn)行肥胖誘導(dǎo)后進(jìn)行高脂飲食喂食+溶劑給藥的HFD攝取組(HFD)和進(jìn)行高脂飲食喂食+橘皮素給藥的T200給藥組(HFD+T200)的白色脂肪組織中的脂肪細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子PPAR Y基因和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4基因的mRNA表達(dá)量的電泳圖像照片及表示表達(dá)量的曲線圖。
圖IlB是表示實(shí)施例6中上述肥胖誘導(dǎo)后的LFD、HFD、HFD+T200的骨骼肌中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4基因的mRNA表達(dá)量的電泳圖像照片和表示表達(dá)量的曲線圖。
圖12A是表示實(shí)施例6和7中利用高脂飲食(HFD)進(jìn)行肥胖誘導(dǎo)和給予蜜桔黃素或橘皮素的時(shí)間表。
圖12B是表示實(shí)施例7中進(jìn)行低脂飲食喂食+溶劑給藥的LFD攝取組(LFD，無(wú)肥胖誘導(dǎo)的比較例)、以及利用高脂飲食(HFD)進(jìn)行肥胖誘導(dǎo)后進(jìn)行高脂飲食喂食+溶劑給藥的HFD攝取組(HFD)、進(jìn)行高脂飲食喂食+蜜桔黃素給藥的IONo給藥組(HFD+lONo)和進(jìn)行高脂飲食+高濃度蜜桔黃素給藥的IONo給藥組(HFD+lOONo)的5周的體重總增加量的曲線圖。
圖12C是表示實(shí)施例7中LFD、HFD、HFD+1 ONo、HFD+IOONo的5周的平均攝食量的曲線圖。
圖13A是表示實(shí)施例7中LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的肝臟、腎臟和白色脂肪組織的重量的曲線圖。
圖1 是表示實(shí)施例7中LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的中性脂肪(甘油三酯)、總膽固醇、葡萄糖的各血中濃度的曲線圖。
圖14A是實(shí)施例7中通過(guò)經(jīng)口葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)表示LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的糖耐量的曲線圖。
圖14B是表示實(shí)施例7中LFD、HFD、HFD+IONo, HFD+IOONo的前期OGTT的血中葡萄糖濃度曲線的時(shí)間積分值的曲線圖。
圖15A是觀察實(shí)施例7中LFD的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
圖15B是觀察實(shí)施例7中HFD的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
圖15C是觀察實(shí)施例7中HFD+lONo的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
圖15D是觀察實(shí)施例7中HFD+lOONo的白色脂肪組織的脂肪細(xì)胞的照片。
具體實(shí)施方式
以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
本說(shuō)明書(shū)中，只要沒(méi)有特別聲明，則代謝綜合征是指表現(xiàn)出內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血糖和脂質(zhì)異常狀態(tài)的代謝綜合征。另外，本申請(qǐng)發(fā)明中，抗肥胖效果包括使肥大化的內(nèi)藏脂肪組織縮小的效果。
作為被測(cè)物質(zhì)，可以使用任意的物質(zhì)。被測(cè)物質(zhì)優(yōu)選混合到食物中、或是溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)娜軇┲校缓蠼?jīng)口給藥到被測(cè)對(duì)象動(dòng)物中。另外，被測(cè)物質(zhì)為脂溶性物質(zhì)時(shí)，也可以經(jīng)皮給藥到被測(cè)對(duì)象動(dòng)物中。
本發(fā)明的篩選方法中作為被測(cè)對(duì)象的非人哺乳動(dòng)物優(yōu)選為嚙齒目(Rodentia)，更優(yōu)選為實(shí)驗(yàn)用小鼠(小家鼠；Mus musculus ；以下稱(chēng)為小鼠)。優(yōu)選小鼠構(gòu)成以規(guī)定的量按規(guī)定的期間給予被檢物質(zhì)的被檢物質(zhì)給藥組、和未以所述規(guī)定的量按所述規(guī)定的期間給予所述被檢物質(zhì)的被檢物質(zhì)非給藥組這兩組，或者除此之外構(gòu)成改變給藥量、食物條件等規(guī)定條件的多個(gè)組。
本發(fā)明的篩選方法中，作為肥胖的指標(biāo)，優(yōu)選測(cè)定體重。進(jìn)而優(yōu)選通過(guò)解剖取出內(nèi)藏白色脂肪組織，測(cè)定其重量，并測(cè)定內(nèi)臟脂肪型肥胖的程度。進(jìn)而優(yōu)選對(duì)脂肪組織進(jìn)行顯微鏡觀察，測(cè)定脂肪細(xì)胞的肥大化的程度。另外，作為不伴有解剖的方法，還可以利用測(cè)定被測(cè)對(duì)象動(dòng)物的電阻值的方法、或測(cè)定比重的方法來(lái)測(cè)定體脂肪率。作為本發(fā)明的攝食量的測(cè)定方法，在籠內(nèi)使小鼠攝食并測(cè)定所提供的食物的減少量的方法因簡(jiǎn)便而優(yōu)選。
作為本發(fā)明的用于所述篩選的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因，優(yōu)選GLUT4、GLUTU GLUT2、 AMH(等。若代謝綜合征的治療用物質(zhì)在骨骼肌控制這些基因的表達(dá)，則通過(guò)控制血糖在骨骼肌組織中的攝入效率，能夠改善胰島素抵抗性、糖耐受不良或高血糖。此外，通過(guò)減少葡萄糖在脂肪細(xì)胞中的攝入量，可抑制脂肪細(xì)胞和脂肪組織的肥大化，另外，對(duì)于已經(jīng)肥大化的脂肪細(xì)胞和脂肪組織可以促進(jìn)縮小。通過(guò)使由這樣縮小后的脂肪細(xì)胞和脂肪組織的脂質(zhì)分泌正?；?，能夠改善脂質(zhì)異常。進(jìn)而若代謝綜合征的治療用物質(zhì)可促進(jìn)骨骼肌內(nèi)的 GLUT4、AMH(等糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，則對(duì)于需要運(yùn)動(dòng)療法的代謝綜合征患者而言， 可以期待其輔助效果。另外，在高血糖中，這些基因的表達(dá)的促進(jìn)具有通過(guò)胰島素抵抗性改善而防止向更嚴(yán)重的糖尿病轉(zhuǎn)移的效果。這些篩選用基因中，從所述物質(zhì)具有改善高血糖以及脂質(zhì)異常癥狀的作用的可能性高的方面考慮，特別優(yōu)選骨骼肌的GLUT4。
本發(fā)明的基因表達(dá)的測(cè)定可以通過(guò)測(cè)定mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)量來(lái)進(jìn)行。這些測(cè)定可以利用公知的方法進(jìn)行。mRNA的測(cè)定優(yōu)選包括以下工序。
(1)由骨骼肌組織片、或骨骼肌細(xì)胞提取含有mRNA的級(jí)分的工序；
(2)使用逆轉(zhuǎn)錄酶，由編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；
(3)使用所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因特異性引物，對(duì)所述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增的工序；
(4)使用規(guī)定的試劑，利用與該試劑對(duì)應(yīng)的檢測(cè)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量的工序； 和
(5)對(duì)編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量進(jìn)行確定的工序。
所述規(guī)定的試劑優(yōu)選為選自由熒光標(biāo)記核酸、同位素標(biāo)記核酸和核酸染色劑組成的組中的任一種試劑，從篩選效率的觀點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)選為核酸染色劑。作為所述核酸染色劑，從檢測(cè)效率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為STOR(注冊(cè)商標(biāo))Green。作為所述檢測(cè)法，從測(cè)定值的準(zhǔn)確性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為實(shí)時(shí)PCR法。作為確定所述表達(dá)量的方法，優(yōu)選將甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)作為標(biāo)準(zhǔn)使用的比較Ct法。
另外，蛋白質(zhì)的表達(dá)量的測(cè)定優(yōu)選包括以下工序由骨骼肌組織片或骨骼肌細(xì)胞提取全部蛋白質(zhì)級(jí)分的工序；利用蛋白質(zhì)印跡法法、ELISA法、其他公知的方法測(cè)定所述蛋白質(zhì)級(jí)分中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)量的工序；確定該表達(dá)量的工序。另外，蛋白質(zhì)的表達(dá)量也可以利用骨骼肌組織或骨骼肌細(xì)胞的免疫染色來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明的被測(cè)物質(zhì)針對(duì)代謝綜合征的效果的判定優(yōu)選根據(jù)以下條件進(jìn)行。
S卩，優(yōu)選為以下條件在所述規(guī)定的條件下，與所述被測(cè)物質(zhì)非給藥組相比，(條件ι)抑制所述被測(cè)物質(zhì)給藥組的體重的增加、或體重增加量的上升；(條件i)不伴有攝食量的明顯增加、減少；(條件幻促進(jìn)所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。利用所述(條件1)選擇具有肥胖抑制效果的物質(zhì)，利用(條件2)排除伴有作為副作用指標(biāo)的攝食量的抑制的物質(zhì)、和與肥胖的亢進(jìn)相關(guān)的增加攝食量的物質(zhì)。另外，利用(條件3)選擇促進(jìn)如上所述可期待對(duì)高血糖或脂質(zhì)異常有改善效果的、骨骼肌中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)的物質(zhì)。
關(guān)于本發(fā)明的代謝綜合征的預(yù)防和/或治療用組合物的提取，從提取效率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選從蜜柑區(qū)柑橘類(lèi)的果皮提取。在蜜柑區(qū)柑橘類(lèi)中，從組合物的含量的方面考慮， 進(jìn)一步優(yōu)選花良治(Keraji ；Citrus Keraji ；以下相同)、櫳柑(Ponkan ；C. reticulata)、 丹西橘(Dancy tangerine ；C. tangerine)、天臺(tái)蜜橘(Jimikan ；C. succosa)、四會(huì)柑 (Shikaikan ；C. suhuiensis)、立花橘(Tachibana ；C. tachibana)、小紅蜜柑(Kobenimikan ； C. erythrosa)、紀(jì)州蜜柑(Kishumikan ；C. kinokuni)、扁平橘(Shiikuwasha ；C. depressa)、 柑子(Koji ；C. Ieiocarpa)等。
從由果實(shí)得到果皮時(shí)的作業(yè)效率和所述組合物的提取效率的方面考慮，進(jìn)一步優(yōu)選由扁平橘(Shiikuwasha ;C.cbpreSSa)的果皮提取。所述果皮可以通過(guò)陽(yáng)光或機(jī)械干燥機(jī)進(jìn)行干燥，但通過(guò)陽(yáng)光干燥可以降低干燥所消耗的能量、防止成分變性，因而優(yōu)選。
作為本發(fā)明的代謝綜合征的預(yù)防和/或治療用組合物，可以?xún)?yōu)選使用由所述蜜柑區(qū)柑橘類(lèi)的干燥果皮進(jìn)行甲醇提取等而得到的提取物。所述提取物以規(guī)定的比例含有下述式(I)表示的蜜桔黃素和/或式(II)表示的橘皮素。另外，所述蜜桔黃素和橘皮素的骨架部分是共通的，通常將其甲氧基的數(shù)量和部位不同的化合物組稱(chēng)為聚甲氧基黃酮(PMF)，本說(shuō)明書(shū)中也使用該名稱(chēng)。
權(quán)利要求
1.一種代謝綜合征的治療用物質(zhì)的篩選方法，所述代謝綜合征表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血糖和脂質(zhì)異常，該篩選方法包括下述工序(1) (3)(1)提取工序，由以規(guī)定的量按規(guī)定的期間給予被測(cè)物質(zhì)的構(gòu)成被測(cè)物質(zhì)給藥組的非人哺乳動(dòng)物、和未以所述規(guī)定的量按所述規(guī)定的期間給予所述被測(cè)物質(zhì)的構(gòu)成被測(cè)物質(zhì)非給藥組的非人哺乳動(dòng)物分別采集骨骼肌，由骨骼肌提取總RNA級(jí)分；(2)定量工序，利用規(guī)定的方法，對(duì)所述提取工序中提取的各總RNA級(jí)分中所含的、編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量進(jìn)行定量；和(3)判定工序，對(duì)于分別構(gòu)成所述被測(cè)物質(zhì)給藥組和被測(cè)物質(zhì)非給藥組的所述非人哺乳動(dòng)物在所述規(guī)定期間中的體重增加量、攝食量和編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量，在組間進(jìn)行比較分析，從而判定針對(duì)所述代謝綜合征的效果。
2.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其中，所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)樾∈驡LUT4及其同源物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的篩選方法，其特征在于，所述規(guī)定的方法包括以下工序使用逆轉(zhuǎn)錄酶由編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA合成cDNA的工序；使用所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因特異性引物，對(duì)所述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增的工序；使用選自由熒光標(biāo)記核酸、同位素標(biāo)記核酸和核酸染色劑組成的組中的試劑，利用與所述試劑對(duì)應(yīng)的檢測(cè)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量的工序；和對(duì)編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量進(jìn)行確定的工序。
4.一種代謝綜合征的治療用組合物，所述代謝綜合征是糖尿病發(fā)病前的表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血糖和脂質(zhì)異常的代謝綜合征，其中，所述組合物含有在干燥重量中含70重量％ 100重量％的蜜桔黃素的蜜柑區(qū) (Acrumen (VII) section)柑橘類(lèi)的果皮提取級(jí)分，以所述果皮提取級(jí)分的干燥重量換算，以每天5mg/kg 200mg/kg的用量經(jīng)口給藥，所述組合物具有下述作用(1) (4)(1)抑制體重增加量的上升而不影響攝食量的作用；(2)促進(jìn)骨骼肌組織內(nèi)或骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的小鼠GLUT4及作為其同源物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的蛋白質(zhì)表達(dá)的作用；(3)促進(jìn)肥大化內(nèi)臟周邊白色脂肪組織縮小的作用；和(4)降低血中葡萄糖濃度而不影響血中甘油三酯濃度的作用。
5.如權(quán)利要求4所述的代謝綜合征的治療用組合物，其中，所述蜜柑區(qū)(Acrumen(VII) section)柑橘類(lèi)為扁平橘(ShiikuWaSha;C. d印ressa)，所述果皮提取級(jí)分中的蜜桔黃素含量在干燥重量中為95重量％ 100重量％，所述用量為每天10mg/kg 100mg/kg。
6.一種代謝綜合征的預(yù)防和/或治療用組合物，所述代謝綜合征表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪型肥胖、高血糖和脂質(zhì)異常，其中，所述組合物含有在干燥重量中含45重量％ 55重量％的蜜桔黃素和45重量％ 55 重量％的橘皮素的蜜柑區(qū)(Acrumen (VII) section)柑橘類(lèi)果皮提取級(jí)分，以所述果皮提取級(jí)分的干燥重量換算，以0. 5g/人/天 8. Og/人/天的用量經(jīng)口攝取，所述組合物具有下述作用或特征⑴ ⑷(1)抑制體重增加量的增加而不影響攝食量的作用；(2)促進(jìn)骨骼肌組織內(nèi)或骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的小鼠GLUT4及作為其同源物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的作用；(3)促進(jìn)肥大化內(nèi)臟周邊白色脂肪組織縮小的作用；和(4)降低血中甘油三酯濃度而不影響血中葡萄糖濃度的作用。
7.如權(quán)利要求6所述的代謝綜合征的預(yù)防和/或治療用組合物，其中，所述蜜柑區(qū) (Acrumen (VII) section)柑橘類(lèi)為扁平橘Citrus cbpressa，所述用量為1. Og/人/天 6. Og/人 / 天。
8.一種功能性食品，其含有權(quán)利要求4 7所述的代謝綜合征的治療用組合物。
9.一種健康食品，其含有權(quán)利要求4 7所述的代謝綜合征的治療用組合物。
10.一種藥物制劑，其含有權(quán)利要求4 7所述的代謝綜合征的治療用組合物。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供表現(xiàn)出內(nèi)臟脂肪型肥胖和脂質(zhì)代謝異常的代謝綜合征的治療用物質(zhì)的篩選方法、所述綜合征的預(yù)防和/或治療用組合物。所述篩選方法包括下述工序(1)提取工序，由以規(guī)定的量按規(guī)定的期間給予被測(cè)物質(zhì)的構(gòu)成被測(cè)物質(zhì)給藥組的非人哺乳動(dòng)物、和未給予所述被測(cè)物質(zhì)的構(gòu)成被測(cè)物質(zhì)非給藥組的非人哺乳動(dòng)物分別采集骨骼肌，由骨骼肌提取總RNA級(jí)分；(2)定量工序，利用規(guī)定的方法，對(duì)所述提取工序中提取的各總RNA級(jí)分中所含的、編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的mRNA的表達(dá)量進(jìn)行定量；和(3)判定工序，對(duì)于分別構(gòu)成所述被測(cè)物質(zhì)給藥組和被測(cè)物質(zhì)非給藥組的所述非人哺乳動(dòng)物在所述規(guī)定期間中的攝食量、體重增加量和編碼所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的RNA的表達(dá)量，在組間進(jìn)行比較分析，從而判定針對(duì)所述代謝綜合征的效果。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102549153SQ20108003271
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者山川博, 崔鳳根, 崔宜實(shí), 李永實(shí), 永井和夫, 照屋俊明, 王曉星, 禹濟(jì)泰, 米澤貴之, 車(chē)炳允, 齊藤清人 申請(qǐng)人:株式會(huì)社艾莉娜