專利名稱：防治單純皰疹病毒i型或ii型感染的重組減毒活疫苗和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠防治單純皰疹病毒I型或單純 皰疹病毒II型感染所致疾病的基因重組減毒活疫苗和制備方法。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)是一種經(jīng)皮膚和粘膜密切接觸傳播 的病毒，包括單純皰疹病毒I型(簡稱HSV-1)和單純皰疹病毒II型(簡稱HSV-2)，兩種 病毒具有83%以上的共同基因特征，50%以上的基因同源性。其中I型在人群的感染率可 高達80%以上，并長期潛伏于感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)，雖然大多數(shù)HSV-I感染者沒有明顯癥狀，但 少數(shù)感染者可產(chǎn)生終生的反復(fù)發(fā)作的面口皰疹、致盲性很高的眼內(nèi)眼炎以及致命性的皰疹 性肺炎和皰疹腦炎。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，占生殖器皰疹原發(fā)感染的90%以 上。II單純皰疹病毒感染人類后主要引起生殖系統(tǒng)原發(fā)性和復(fù)發(fā)性皰疹，可以終生潛伏在 神經(jīng)節(jié)內(nèi)，在機體免疫力降低時復(fù)發(fā)。孕婦感染HSV-II型病毒后易發(fā)生流產(chǎn)，也可致胎兒 先天畸形或智力低下。新生兒在分娩時感染可導(dǎo)致高熱、呼吸困難或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，其 中60% -70%的新生兒可能死亡。此外，有研究表明，生殖器皰疹可將艾滋病感染風(fēng)險增加 2-3倍，并促進艾滋病病毒的傳播。研究表明安全套并不能有效預(yù)防皰疹病毒感染，世界范 圍內(nèi)生殖器皰疹發(fā)病率在逐年上升，據(jù)美國最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國成人生殖器皰疹患病 率已經(jīng)上升到了 16%以上，在紐約已經(jīng)上升至25%以上，目前并無單純皰疹病毒感染，尤 其是復(fù)發(fā)性感染的特效治療方法，抗病毒藥物常規(guī)用藥雖能緩解一些臨床癥狀，但不能徹 底清除體內(nèi)潛伏的病毒，也不能減少復(fù)發(fā)次數(shù)，因此迫切需要開發(fā)能有效防治單純皰疹病 毒感染的疫苗。近數(shù)十年來世界各國HSV疫苗的研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位疫苗免 疫原性弱，僅能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，細胞免疫誘導(dǎo)效果較差；新型DNA疫苗雖能同時誘導(dǎo)體 液和細胞免疫，但是其轉(zhuǎn)染效率較低，經(jīng)粘膜免疫誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答能力更低。而在 單純皰疹病毒的免疫應(yīng)答過程中，細胞免疫和粘膜免疫發(fā)揮著更大的作用，但上述幾類疫 苗均不能有效誘導(dǎo)細胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答，因此，到目前為止，尚無可以在臨床上應(yīng)用的 疫苗上市，單純皰疹病毒疫苗基本上都處于臨床前或臨床研究階段。病毒減毒活疫苗是最為經(jīng)典的疫苗形式，這種類型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰質(zhì) 炎疫苗等在人類抵抗感染性疾病的歷史上發(fā)揮了不可替代的作用，為人類的健康做出了不 可磨滅的貢獻。減毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一 樣的感染和復(fù)制特性，但沒有致病作用，此類疫苗可以有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng) 答，相對于其它種類的疫苗而言，免疫原性強，保護效果好。傳統(tǒng)的減毒活疫苗主要是通過連續(xù)培養(yǎng)篩選得到的，但這種方法耗時費力，用這 種方法很難得到致病性降低的單純皰疹病毒毒株。近年來，研究者開始采用現(xiàn)代分子生物 學(xué)技術(shù)，將HSV基因組的特定基因進行敲除以獲得重組株。本發(fā)明則是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，以Genebank中的HSV-I和HSV-2基因組參考序列(HSV-I登錄號NC_001806，HSV-2 登錄號NC_001798)為藍本，通過聯(lián)合敲除多個基因，篩選出了 HSV-I型和HSV-2型重組減 毒株，它們的致病能力均發(fā)生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-I和HSV-2感染所
致疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠預(yù)防和治療單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II感染 所致疾病的重組減毒活疫苗及所述疫苗的制備方法。本發(fā)明涉及的單純皰疹病毒I型重組株或單純皰疹病毒II型重組株，均由野生型 HSV-I或野生HSV-I經(jīng)過重組、篩選和純化得來的。所采用的技術(shù)方案是取水泡較為明顯的口唇皰疹和生殖器皰疹患者的水泡液，分 離鑒定出野生型HSV-I和HSV-2 ；擴大培養(yǎng)后提取病毒完整基因組；和含有熒光表達基因及 擬定敲除的HSV基因左右兩側(cè)700bp至2000bp的同源側(cè)翼序列的穿梭載體共同轉(zhuǎn)染Vero 細胞；在熒光顯微鏡下使用一種或者聯(lián)合使用多種熒光蛋白基因作為標(biāo)記挑選出重組病 毒，經(jīng)過空斑純化后可獲得所需要的重組減毒活疫苗?？梢垣@得一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組中 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-1 重組株。可以獲得一種其上所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，在于聯(lián)合敲除 了其基因組中的UL43到UL4之間的基因片段和其它復(fù)制或感染非必需基因片段的HSV-I 重組株；所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是指US9、US10、US11、US12基因，UL55、UL56 到左側(cè)RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因或三者的任意組合。可以獲得一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組中 的US2、US3、US4和US5基因的HSV-I重組株?？梢垣@得一種如上所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，在于聯(lián)合敲除 了其基因組中的US2、US3、US4、US5基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片段的HSV-I重組 株；所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USll、US12基因，UL55、UL56到左 側(cè)RL2、RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意組合。可以獲得一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組 中的 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-2 重組株?？梢垣@得一種如上所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，在于聯(lián)合敲 除了其基因組中的UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片段 的HSV-2重組株所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是US9、US10、US11、US12基因，UL55 UL56到左側(cè)RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因，或者上述三者的任意組合?？梢垣@得一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組 中的US2、US3、US4和US5基因的HSV-2重組株?？梢垣@得一種如上所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，在于聯(lián)合敲 除了其基因組中的US2、US3、US4、US5基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片段的HSV-2重 組株；所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是US9、US10、USll、US12基因，UL55、UL56到左 側(cè)RL2和RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意組合。
用類似的方法在上述重組株的基礎(chǔ)上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一 步減低的重組株。作用在小鼠身上可證明，上述的重組株病毒致病能力均有不同程度的減弱，可以 保護小鼠免受致死量單純皰疹病毒I型或II型的攻擊；作用在豚鼠身上證明重組株可以預(yù) 防和治療豚鼠生殖器皰疹。上述重組株可以作為重組單純皰疹病毒減毒活疫苗以防治單純 皰疹病毒感染所致相關(guān)疾病。本發(fā)明用以構(gòu)建同源重組穿梭質(zhì)粒的pShuttle-CMV質(zhì)粒購自Stragene公司，序 列和物理圖譜見該公司的產(chǎn)品目錄。本發(fā)明所用熒光標(biāo)記基因是綠色熒光蛋白表達盒和紅色熒光蛋白表達盒。本發(fā)明的有益效果相比傳統(tǒng)疫苗而言，本發(fā)明制備的減毒活疫苗均是經(jīng)過基因 工程重組后的減毒活疫苗，不易發(fā)生毒力回復(fù)，其它生物學(xué)特性和野生型單純皰疹病毒相 似，但進入機體后僅能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答而無致病作用，具有良好的安全性；本疫苗保 留了單純皰疹病毒I型或II型的大部分抗原，具有較高的免疫原性，能很好地模擬野生型 HSV-I或HSV-2，有效地誘導(dǎo)機體粘膜和體液免疫應(yīng)答，構(gòu)建機體抵抗皰疹感染的第一道防 線，降低人群發(fā)病率；激發(fā)細胞免疫應(yīng)答，構(gòu)建機體的第二道防線，有可能清除已感染病毒， 控制皰疹的復(fù)發(fā)和傳播。


圖1重組單純皰疹病毒減毒活疫苗的構(gòu)建策略示意圖；圖2重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSHOlL結(jié)構(gòu)示意圖；圖3重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSHOILS結(jié)構(gòu)示意圖；圖4重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSH01S1結(jié)構(gòu)示意圖；圖5重組單純皰疹病毒減毒I型活疫苗JSH01SS結(jié)構(gòu)示意圖；圖6重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02L結(jié)構(gòu)示意圖；圖7重組單純皰疹病毒減毒11型活疫苗JSH02LS結(jié)構(gòu)示意圖；圖8重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02S1結(jié)構(gòu)示意圖；圖9重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02SS結(jié)構(gòu)示意圖；圖10重組單純皰疹病毒減毒I I型活疫苗JSH02LR結(jié)構(gòu)示意圖；圖11重組單純皰疹病毒減毒11型活疫苗JSH02RS結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案中單純皰疹病毒I型或II型重組減毒活疫苗的總體構(gòu)建策略參 見附圖1。提取野生型HSV-I和HSV-2完整基因組；構(gòu)建含有綠色或紅色熒光表達基因及 擬定敲除的HSV基因左右兩側(cè)700bp至2000bp的側(cè)翼序列的同源重組穿梭載體，二者共同 轉(zhuǎn)染Vero細胞，在熒光顯微鏡下挑選表現(xiàn)相應(yīng)顏色熒光的重組病毒，經(jīng)過空斑純化后可獲 得敲除了 HSV-I或HSV-2重組減毒活疫苗。其中敲除了HSV-I UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因的 HSV-1 重組株，命名為 JSHOlL ；敲除了HSV-I UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-1 重組株，命名為JSHOlLS。
5
敲除了HSV-1US2、US3、US4、US5 基因的 HSV-1 重組株，命名為 JSHOlS ；敲除了HSV-1US2、US3、US4、US5 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-I 重組株，命 名為 JSH01SS。敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因的 HSV-2 重組株，命名為 JSH02L ；敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-2 重組株，命名為JSH02LS。敲除了HSV-2US2、US3、US4、US5 基因的 HSV-2 重組株，命名為 JSH02S ；敲除了HSV-2US2、US3、US4、US5 和 US9、US10、US11 US12 基因的 HSV-2 重組株，命 名為 JSH02SS。用類似的方法在上述重組株的基礎(chǔ)上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一 步減低的重組株。實施例1重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL構(gòu)建1.分離野生型HSV-I和HSV-2(1)取臨床HSV感染的病人皰疹液和分泌物，加入ImlPBS緩沖液后用0. 45微米濾
器過濾ο(2)取一個六孔板，每孔傳2 X IO5個Vero細胞，在5個孔內(nèi)每孔加入200微升病 毒過濾液，一個孔留作對照。(3)放入37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時后觀察孔內(nèi)細胞病變效應(yīng)(CPE)。(4)待六孔板孔內(nèi)細胞出現(xiàn)完全CPE后將培養(yǎng)基和細胞一起收入離心管中。(5)將離心管在37°C -負80°C下凍融3次，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘后將上清轉(zhuǎn)入2ml EP管中，放入負80°C冰箱中備用。(6)自EP管中取200微升病毒液，利用HSV分型鑒定引物分型，分離一株HSV-I和 一株 HSV-2。2.提取HSV-I基因組(1)感染前一天，胰酶消化并計數(shù)vero細胞，每個IOcm平皿接種3 X IO6細胞，補 足IOmL含血清正常細胞生長培養(yǎng)液。(2)感染當(dāng)天，確認細胞達到80-90%融合。加原始HSV-I病毒粗體液100微升 (如果已知滴度則按MOI = 10)到細胞中，蝸旋平皿輕輕混勻。(3)在37°C C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到80-90%的細胞出現(xiàn)圓縮(一般感染后2_3天)。(4)用吸管輕輕吹打平皿，將細胞和培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移至無菌15mL離心管中， 于-80°C 30分鐘，然后在37°C水浴15分鐘解凍。重復(fù)此步驟三次，3000轉(zhuǎn)離心15min。(5)收集上清液于-80°C保存。(6)0. 45微米過濾后加保護劑保存于-80°C。若需要長期保存，則加入10%甘油， 置于-80°C。HSV-I在4°C保存時滴度下降比較快，所以HSV-I應(yīng)該分裝保存在一 80°C，每 次使用時取出實驗所需量，一次用完，無需反復(fù)凍溶，既能保證每次使用的滴度，又能大大 降低HSV-I被污染的機率。(7)取300微升病毒液加入700微升高純水，加入10微升蛋白酶K、10%的SDS50 微升(使終濃度分別稀釋為蛋白酶K的100倍稀釋、SDS的50倍稀釋)混勻。37°C水浴過 夜。
(8)加入同體積的酚12000rpm離心5min。收集上層液體。一般情況下抽提2_3
次，至無蛋白析出。(9)加入同體積的酚氯仿異戊醇(即500微升氯仿異戊醇、500微升酚)12000rpm 離心5min抽提2-3次，收集上層液體。(10)加入4°C預(yù)冷的十分之一體積的乙酸鈉、2. 5倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙 醇，-20°C沉淀30min或過夜。(11) 12000rpm 4°C離心 15min。棄上清。(12) lml4°C預(yù)冷的 70% 乙醇洗 1-2 遍，12000rpm 4°C離心 5min。(13)棄上清，自然干燥或37°C干燥。3.構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle-01L-GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001806的HSV-1基因組UL區(qū)UL43 UL47的序列， 分別設(shè)計UL43基因的左側(cè)側(cè)翼序列和UL47基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。(2)UL43側(cè)翼序列的引物設(shè)計在UL43左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在UL43 左側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán) 后回收目的條帶。(3) UL47側(cè)翼序列的引物設(shè)計UL47右側(cè)翼序列上游引物5，末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，UL47 右側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回 收目的條帶。 (4) PCR擴增GFP表達質(zhì)粒pLK0_GFP (由本公司自己構(gòu)建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產(chǎn)物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切UL47側(cè) 翼序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)分兩步將步驟(5)和(6)中回收的產(chǎn)物克隆至pShuttle-CMV載體上后即構(gòu)建 成功 pShuttle-01L-GFP。4.同源重組生產(chǎn)HSV-I重組株JSHOlL(1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-OlL-GFP質(zhì)粒。(2)用脂質(zhì)體2000將HSV-I基因組和pShuttle-01L_GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株JSH01L，參見附圖2。(6)用Vero細胞增殖后用TCID50法測定滴度實驗操作
(6. 1)收集一瓶Vero細胞，計數(shù)。(6. 2)用 DMEM 2%準(zhǔn)備 20ml 105/ml 細胞。(6. 3)用12道排槍在2塊96孔板中每孔加入IOOul細胞懸液。(6. 4)稀釋病毒液，在第1管中加入0. 9ml DMEM 2%，其余加入1. 8ml。(6. 5)在第1管中再加入0. Iml病毒保存液。(6. 6)換用新槍頭，上下吸打5次混勻。(6. 7)從第1管中吸取0. 2ml加入第2管中。(6.8)反復(fù)稀釋至最高稀釋度。(6. 9)用同一管病毒保存液進行第2輪稀釋。(6. 10)最后8個稀釋液加入96孔板，每孔0. 1ml，每個稀釋度10孔，2孔為陰性對 照。陰性對照孔中加入0. Iml DMEM 2%監(jiān)測細胞存活情況。加樣時從最高稀釋度開始。(6. 11)37 °C 培養(yǎng) 10 天。(6. 12) 10天后倒置顯微鏡下觀察，計算每一排中出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。只要有一小點 或是一些細胞出現(xiàn)CPE即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較。(6. 13)計算每一排中出現(xiàn)陽性的孔數(shù)。如果陰性對照中無任何CPE且細胞生長良 好，最低稀釋度100%陽性而最高稀釋度100%陰性，則本測試即為有效。按照下述公式計 算滴度=T = 101+d(S-0. 5) IU/ml，其中d = LoglO稀釋倍數(shù)，S =從第一次稀釋起的陽性比 率之和，2次平行實驗得到的滴度值應(yīng)相差< 10°_7。實施例2重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL的致病能力減低1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增后測定滴度，滴度約為1 X 109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL 用Vero細胞擴增后滴度約為1 X IO9IU/ ml ；普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-30共30個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、正常劑量組和高劑量組三組。2.實驗操作經(jīng)鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰疹病毒I型20微升，正常劑量組給予20 微升JSH01L，高劑量組給予100微升JSH01L，觀察小鼠情況。3.結(jié)果對組組小鼠在滴鼻后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13天后全部死亡，死 亡率為100% ；正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，這說明和野生型相比，JSHOlL幾乎沒 有致病能力。實施例3活疫苗JSHOlL對小鼠的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增HSV-I后測定滴度，滴度約為 lX109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOlL 用Vero細胞擴增后滴度約為1 X IO9IU/ ml ；正常細胞裂解液培養(yǎng)皿中正常培養(yǎng)的Vero細胞刮下后在-80°C和37°C反復(fù)凍融后過濾。普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-30共30個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為15只/組，分為 陰性組和陽性組共兩組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量=IO7TCID5tl重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-1 進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。3.操作步驟(1)小鼠隨機分組后陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于50微升正常細胞裂解液；陽 性組同樣方法給于50微升JSH01L，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-I 病毒(含 IO8IU)。2)小鼠腹腔內(nèi)注射HSV-10. lml。3)觀察小鼠情況結(jié)果小鼠攻毒后陰性組死亡情況。攻毒后第5d開始出現(xiàn)死亡情況，第13后全部 死亡，陽性組存活。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量單純皰疹病毒I型攻擊。實施例4重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOILS構(gòu)建JSHOILS的構(gòu)建策略和方法類似實施例1，具體詳述如下1.構(gòu)建舊9、舊10、舊11、舊12基因聯(lián)合敲除的把￥-1敲除株幾!1015。(1)構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle-01-RED。1. 1)參考NCBI上登錄號為NC_001806的HSV-1基因組的US區(qū)US9 US12的序 列，分別設(shè)計US9基因的左側(cè)側(cè)翼序列和US12基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。1. 2)US9側(cè)翼序列的引物設(shè)計在US9左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US9左 側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后 回收目的條帶。1. 3) US12側(cè)翼序列的引物設(shè)計US12右側(cè)翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US12 右側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回 收目的條帶。1. 4)用 BglII 和 BamHI 雙酶切 pDsredl-cl，連接，轉(zhuǎn)化，得 pDsredbb 質(zhì)粒。1. 5)用AseI和MluI切pDsredbb質(zhì)粒，電泳回收1. 5kb片段1. 6)用NotI和PmeI酶切US9側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切US12側(cè) 翼序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。1. 7)將步驟1. 5)和1. 6)中回收的產(chǎn)物分兩步克隆至pShuttIe-CMV載體后即構(gòu) 建成功 pShuttle-01-RED。(2)同源重組生產(chǎn)HSV-I敲除株JSHOlS2. 1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-Ol-RED質(zhì)粒。2. 2)用脂質(zhì)體2000將HSV-I基因組和pShuttle-01-RED質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細胞。2. 3)在倒置熒光顯微鏡下將紅色CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。2. 4)將EP管在_80°C -37°C反復(fù)凍融三次。2. 5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯 微鏡下挑出紅色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I重組株JSH01S。2. 6)用Vero細胞擴增JSHOlS后提取基因組備用。2.聯(lián)合應(yīng)用紅色和綠色熒光標(biāo)記構(gòu)建HSV-I重組減毒活疫苗JSH01LS—一同源重 組生產(chǎn)HSV-I敲除株JSHOILS(1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-OlL-GFP質(zhì)粒。(2)用脂質(zhì)體2000將表達紅色熒光JSHOlS基因組和pShuttle-OlL-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn) 染至vero細胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將同時表現(xiàn)紅色和綠色熒光的CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移 至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在_80°C -37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I重組株JSH01LS，參見附圖3。實施例5重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01LS的致病能力減低1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增HSV-I后測定滴度，滴度約為 lX109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01LS 用Vero細胞擴增后滴度約為1 X IO9IU/ ml ；普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-30共30個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、正常劑量組和高劑量組三組。2.實驗操作 經(jīng)鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰疹病毒I型20微升，正常劑量組給予20 微升JSH01LS，高劑量組給予100微升JSH01LS，觀察小鼠情況。3.結(jié)果對照組小鼠在滴鼻后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13天后全部死亡，死 亡率為100% ；正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，死亡率是0，這說明和野生型相比， JSHOILS幾乎沒有致病能力。實施例6活疫苗JSH01LS對小鼠的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒I型用Vero細胞擴增HSV-I后測定滴度，滴度約為 lX109IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01LS 用Vero細胞擴增后滴度約為IX IO9IU/ ml ；正常細胞裂解液培養(yǎng)皿中正常培養(yǎng)的Vero細胞刮下后在-80°C和37°C反復(fù)凍融后過濾。普通級別實驗小白鼠30只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-30共30個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為15只/組，分為 陰性組和陽性組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量107TCID50重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-I 進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。3.操作步驟(1)小鼠隨機分組后，陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于50微升正常細胞裂解液； 陽性組同樣方法給于50微升JSH01LS，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-1 病毒(含 IO8IU)。2)小鼠腹腔內(nèi)注射HSV-10. lml。3)觀察小鼠情況4.結(jié)果小鼠攻毒后陰性組死亡情況。攻毒后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13后 全部死亡，死亡率為100% ；陽性組全部存活，死亡率是0。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗 可抵抗致死量病毒攻擊。實施例7重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01S1的構(gòu)建1.構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle-01S-GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001806的HSV-I基因組US區(qū)US2 US5的序列，分 別設(shè)計US2基因的左側(cè)側(cè)翼序列和US5基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。(2) US2側(cè)翼序列的弓丨物設(shè)計在US2左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US2左 側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后 回收目的條帶。(3)US5側(cè)翼序列的引物設(shè)計US5右側(cè)翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US5右 側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收 目的條帶。(4) PCR擴增GFP表達質(zhì)粒pLK0_GFP (由本公司自己構(gòu)建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產(chǎn)物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切US2側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切US5側(cè)翼 序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)分兩步將1. 5)和1. 6)步驟中回收的產(chǎn)物克隆至pShuttle_CMV載體上即構(gòu)建 成功 pShuttle-01 S-GFP。2.同源重組生產(chǎn)HSV-I敲除株JSH01S1(1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-OlS-GFP質(zhì)粒。
(2)用脂質(zhì)體2000將HSV-I基因組和pShuttle-OlS-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在_80°C -37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株JSH01S1，參見附圖4。實施例8重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH01S1的復(fù)制感染能力減低1.實驗材料野生型HSV-I，JSHOlSi, Vero細胞，六孔板。2.實驗方法六孔板內(nèi)每孔傳入5 X IO5個Vero細胞，培養(yǎng)24小時，按感染復(fù)數(shù) (MOI) 0. 1和1分別用野生型HSV-I和JSH01S1感染六孔板其中四孔，剩余兩個孔做為對照， 觀察病毒感染孔細胞病變效應(yīng)產(chǎn)生情況。3.結(jié)果預(yù)期野生型HSV-148小時至72小時左右完全產(chǎn)生CPE，而JSH01S1在6 到7天左右方可產(chǎn)生完全CPE，說明重組株JSH01S1相對于野生型HSV-I而言復(fù)制和感染能 力明顯降低。實施例9重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOISl的致病能力減低1.實驗方法和實施例2所用方法相同，經(jīng)鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰 疹病毒I型20微升，正常劑量組給予20微升JSH01S1，高劑量組給予100微升JSH01S1，觀 察小鼠情況。2.結(jié)果預(yù)期對照組小鼠在滴鼻后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13天后全部死 亡，死亡率為100%;正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，死亡率是0，說明和野生型相比， JSHOISl幾乎沒有致病能力。實施例10活疫苗JSH01S1對小鼠的免疫保護實驗1.實驗方法和實施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，預(yù)期陰性組攻毒后第5 天開始出現(xiàn)死亡情況，第13后全部死亡，死亡率為100%;陽性組全部存活，死亡率是0。預(yù) 期陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例11聯(lián)合應(yīng)用紅色和綠色熒光標(biāo)記構(gòu)建重組單純皰疹病毒減毒活疫苗 JSHOISS1.用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取實施例4中構(gòu)建的pShuttle-01-RED 質(zhì)粒。2.擴增實施例7所構(gòu)建的表達綠色熒光的重組型病毒JSH01S1。3.用實施例1中基因組提取方法提表達綠色熒光的重組型病毒JSH01S1的基因組。4.用脂質(zhì)體2000將JSH01S1基因組和pShuttle_01-RED質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細 胞。5.在倒置熒光顯微鏡下將同時表現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光的CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn) 移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。6.將EP管在_80°C -37°C反復(fù)凍融三次。7.將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微鏡下挑出同時表現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光的空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株 JSHOlSSo參見附圖5。實施例12重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSHOISS的致病能力減低實驗方法和實施例2所用方法相同，經(jīng)鼻腔滴注途徑給予對照組野生型單純皰疹 病毒I型20微升，正常劑量組給予20微升JSH01SS，高劑量組給予100微升JSH01S1，觀察 小鼠情況。結(jié)果預(yù)期對組組小鼠在滴鼻后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13天后全部死亡， 死亡率為100% ；正常劑量組和高劑量組小鼠全部存活，死亡率是0，這說明和野生型相比， JSHOISS幾乎沒有致病能力。實施例13活疫苗JSH01SS對小鼠的免疫保護實驗實驗方法和實施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，預(yù)期陰性組攻毒后第5天 開始出現(xiàn)死亡情況，第13后全部死亡，死亡率為100%;陽性組全部存活，死亡率是0。預(yù)期 陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例14重組單純皰疹病毒II型減毒活疫苗JSH02L構(gòu)建1.按照實施例1中HSV-I基因組提取方法提取HSV-2基因組。2.構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle-02L_GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的UL43-UL47的序列，分別 設(shè)計UL43基因的左側(cè)側(cè)翼序列和UL47基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。(2)UL43側(cè)翼序列的引物設(shè)計在UL43左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在UL43 左側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán) 后回收目的條帶。(3)UL47側(cè)翼序列的引物設(shè)計UL47右側(cè)翼序列上游引物5，末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，UL47 右側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回 收目的條帶。(4) PCR擴增GFP表達質(zhì)粒pLK0_GFP (由本公司自己構(gòu)建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產(chǎn)物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切UL47側(cè) 翼序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)分兩步將步驟2. 5)和2. 6)中回收的產(chǎn)物克隆至pShuttle-CMV載體即構(gòu)建成 功 pShuttle-02-GFP。3.同源重組生產(chǎn)HSV-2敲除株JSH02L(1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02L_GFP質(zhì)粒。(2)用脂質(zhì)體2000將HSV-2基因組和pShuttle-02L_GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株JSH02L(圖6)。(6)用Vero細胞增殖后用TCID5tl法測定滴度。實施例15應(yīng)用綠色和紅色熒光標(biāo)記構(gòu)建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LSJSH02LS的構(gòu)建策略和方法類似先前的JSH01LS的構(gòu)建方法，具體詳述如下1.構(gòu)建US9、US10、US11和US12基因聯(lián)合敲除的HSV-2重組株JSH02S。(1)構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle-02-RED。1. 1)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的US區(qū)US9-US12的序列， 分別設(shè)計US9基因的左側(cè)側(cè)翼序列和US12基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。1. 2)US9側(cè)翼序列的引物設(shè)計在US9左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US9左 側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后 回收目的條帶。1. 3) US12側(cè)翼序列的引物設(shè)計US12右側(cè)翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US12 右側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回 收目的條帶。1. 4)用 BglII 和 BamHI 雙酶切 pDsredl-cl，連接，轉(zhuǎn)化，得 pDsredbb 質(zhì)粒。1. 5)用AseI和MluI切pDsredbb質(zhì)粒，電泳回收1. 5kb片段1. 6)用NotI和PmeI酶切US9側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切US12側(cè) 翼序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。1. 7)分兩步將1. 5)和1. 6)步驟中回收的產(chǎn)物克隆至pShuttle-CMV載體后即構(gòu) 建成功 pShuttle-012-RED。(2)同源重組生產(chǎn)HSV-2敲除株JSH02S2. 1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02L-RED質(zhì)粒。2. 2)用脂質(zhì)體2000將HSV-2基因組和pShuttle_02L-RED質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細 胞。2. 3)在倒置熒光顯微鏡下將紅色CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。2. 4)將EP管在_80°C -37°C反復(fù)凍融三次。2. 5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯 微鏡下挑出紅色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02S。2. 6)用Vero細胞擴增JSH02S后提取基因組備用。2.構(gòu)建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LS——同源重組生產(chǎn)HSV-2敲除株JSH02LS(1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02L_GFP質(zhì)粒。(2)用脂質(zhì)體2000將JSH02S基因組和pShuttle-02L_GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細 胞。
(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02LS，參見附圖7。實施例16重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02S1的構(gòu)建1.構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle-02S_GFP。(1)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的US2-US5的序列，分別設(shè) 計US2基因的左側(cè)側(cè)翼序列和US5基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。(2)US2側(cè)翼序列的引物設(shè)計在US2左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US2左 側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后 回收目的條帶。(3)US5側(cè)翼序列的引物設(shè)計US5右側(cè)翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US5右 側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收 目的條帶。(4) PCR擴增GFP表達質(zhì)粒pLK0_GFP (由本公司自己構(gòu)建)上的GFP表達盒，上游 引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保 護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產(chǎn)物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切US2側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切US5側(cè)翼 序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)將上述步驟(5)和(6)中回收的產(chǎn)物分兩步克隆至pShuttle-CMV載體后即構(gòu) 建成功 pShuttle-02S-GFP。2.同源重組生產(chǎn)HSV-2敲除株JSH02S1(1)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02S_GFP質(zhì)粒。(2)用脂質(zhì)體2000將HSV-2基因組和pShuttle-02S_GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細 胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在-80°C -37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微 鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02S1，參見附圖8。實施例17聯(lián)合應(yīng)用綠色和紅色熒光標(biāo)記構(gòu)建重組單純皰疹病毒減毒活疫苗 JSH02SS1.用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle-02-RED質(zhì)粒。2.提取實施例16中構(gòu)建的重組病毒JSH02S1基因組，用脂質(zhì)體2000將JSH02S1 基因組和pShuttle-02-RED質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細胞。
3.在倒置熒光顯微鏡下將同時表現(xiàn)紅色和綠色熒光的CPE處的細胞吸出，轉(zhuǎn)移至 含有IML培養(yǎng)基的EP管中。4.將EP管在_80°C -37°C反復(fù)凍融三次。5.將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯 微鏡下挑出同時表現(xiàn)紅色和綠色熒光的空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株 JSH02SS，參見附圖9。實施例18重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02S1和JSH02SS的復(fù)制感染能力減 低實驗材料野生型HSV-2，JSH02S1, JSH02SS, Vero細胞，六孔板。實驗方法六孔板內(nèi)每孔傳入5X IO5個Vero細胞，培養(yǎng)24小時，按感染復(fù)數(shù) (MOI)O. 1和1分別用野生型HSV-2、JSH02S1和JSH02SS感染孔內(nèi)細胞，觀察病毒感染孔細 胞病變效應(yīng)產(chǎn)生情況。結(jié)果預(yù)期野生型HSV-2 48小時至72小時左右完全產(chǎn)生CPE，而JSH02S1和 JSH02SS在6到7天左右方可產(chǎn)生完全CPE，說明重組株JSH02S1和JSH02SS相對于野生型 HSV-2而言復(fù)制和感染能力明顯降低。實施例19重組單純皰疹病毒II型活疫苗的致病性減弱1、實驗材料 野生型單純皰疹病毒II型用Vero細胞擴增HSV-2后測定滴度，滴度約為 lX107IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS 用Vero細 胞擴增后將滴度均調(diào)整約為IX 107IU/ml ；普通級別實驗小白鼠50只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-50共50個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 組。2、實驗操作經(jīng)腹腔注射途徑給予對照組野生型單純皰疹病毒II型200微升，其它組分別給予 200 微升 JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS，觀察小鼠情況。3、結(jié)果預(yù)期對組的小鼠在滴鼻后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13天后全部死亡， 其它組小鼠存活，JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS的致病性均減弱。實施例20重組單純皰疹病毒II型活疫苗對小鼠的免疫保護實驗1.實驗材料野生型單純皰疹病毒II型和重組單純皰疹病毒減毒活疫苗同上述實施例。正常細胞裂解液培養(yǎng)皿中正常培養(yǎng)的Vero細胞刮下后在-80°C和37°C反復(fù)凍融 后過濾。普通級別實驗小白鼠50只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做 好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-50共50個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為10只/組，分為 陰性組、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量106TCID50重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-2 進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。
3.操作步驟(1)小鼠隨機分組后，陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于50微升正常細胞裂解液， 其它組分別給于50微升JSH02L、JSHOlLS, JSHOISl和JSH01SS JSH02L，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-2 病毒(含 IO6IU)。2)小鼠腹腔內(nèi)注射HSV-20. Iml。3)觀察小鼠情況4、結(jié)果陰性對照組小鼠攻毒后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13后全部死亡，其它 組全部存活。其它組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例21重組單純皰疹病毒II型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫保護實驗1、實驗材料野生型單純皰疹病毒II型用Vero細胞擴增HSV-2后測定滴度，滴 度約為1 X 107IU/ml ；重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS 用Vero細胞擴增后將滴度均調(diào)整約為IX 107IU/ml ；普通級別實驗豚鼠50只，雌性，體重275 土 5g，每一只都在其身體的不同部位做 好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-50共50個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為10只/組，分為 對照組、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 組。2、免疫及攻毒方案免疫劑量=IO5TCID5tl重組活疫苗；途徑鼻腔滴注，在0周實施初次免疫，2周(14 天)以后進行加強免疫一次，再過兩周以后，即第5周(35天)用野生型HSV-2進行攻擊試 驗，計算豚鼠外陰皮損累計積分，確定保護效果。3、操作步驟(1)第0周，初次免疫豚鼠隨機分組后陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于50微升 細胞裂解液；陽性組同樣方法分別給于50微升JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS，觀察 豚鼠情況。(2)第2周，加強免疫陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于100微升細胞裂解液；陽 性組同樣方法給于100微升JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS，觀察豚鼠情況。(3)第5周，攻毒實驗；1)用棉簽蘸生理鹽水擦洗豚鼠外陰。2)用ImL注射器配上灌胃針頭吸取0. 2mlHSV_2病毒(含IO6IU)。3)將針頭伸入陰道內(nèi)陰道穹隆后將病毒液注入，緩慢退出。4)用明膠海棉塞住陰道維持病毒液體24h。豚鼠出現(xiàn)癥狀紅腫、起皰、潰瘍、結(jié)痂。評分標(biāo)準(zhǔn)0無癥狀0.5，僅輕微紅腫；1.0，紅腫明顯，無水皰；1. 5，單個小水皰(彡2mm)；2. 0，單個大水皰(> 2mm)；2. 5，多個小水皰和/或陰道潰瘍(出血)；
3.0，多個大水皰；3. 5，嚴重外陰腫脹；4.0，多個小/大疤融合；4. 5，后肢癱瘓；5.0，外陰潰瘍，后肢癱瘓4、實驗結(jié)果預(yù)期攻毒后陰性對照組發(fā)病情況攻毒后3天全部出現(xiàn)初發(fā)感染癥狀，大約6 7 天，豚鼠皮損程度最嚴重，逐漸減輕，第10天后基本消失。中間偶有豚鼠病重死亡。初次發(fā) 病后13天后出現(xiàn)復(fù)發(fā)感染，整體評分較大；各陽性組預(yù)期偶有豚鼠出現(xiàn)輕微紅腫癥狀，無 其它明顯癥狀，整體評分較小。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可預(yù)防生殖器皰疹。實施例22重組單純皰疹病毒II型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫治療實驗1、實驗材料同上述實施例2、實驗方法用HSV-2病毒攻擊豚鼠后第5天，將豚鼠隨機分為5組，分別經(jīng)鼻腔 途徑給予JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS各50微升；第一次免疫治療后的14天，同 途徑和劑量進行第二次免疫治療，兩周后再免疫一次，待豚鼠初發(fā)感染癥狀消退后用紫外 燈照射豚鼠外陰10分鐘以誘發(fā)復(fù)發(fā)感染，觀察豚鼠復(fù)發(fā)情況，計算皮損指數(shù)。3、實驗結(jié)果預(yù)期給藥后對照組復(fù)發(fā)癥狀明顯，評分較大，各陽性組復(fù)發(fā)癥狀輕 微，評分較小，本疫苗在豚鼠身上對復(fù)發(fā)型生殖器皰疹有一定的治療作用，可以減輕復(fù)發(fā)癥 狀。實施例23致病性進一步減低的重組單純皰疹病毒I型和II型活疫苗的構(gòu)建用構(gòu)建JSHlSS和JSH02SS類似的方法進一步敲除重組單純皰疹病毒I型或II型 基因組上其他復(fù)制或感染非必需的US9到US12之間的基因片段(US9、US10、USll和US12 基因)，UL55到左側(cè)RLl基因之間的基因片段(包含UL55、UL56、RL2和RLl基因)，US2到 US5之間的基因片段(包含US2、US3、US4、US5基因)，UL43到UL47基因之間的基因片段 (包含UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因)或其任意組合基因片段，以構(gòu)建致病性進一 步減低的重組單純皰疹病毒I型或II型活疫苗，設(shè)計欲敲除基因片段兩側(cè)的側(cè)翼序列的引 物，擴增出約700bp至2000bp左右的側(cè)翼序列，將700bp至2000bp左右的側(cè)翼序列和空斑 篩選標(biāo)記基因克隆至pShuttle-CMV載體，使空斑篩選標(biāo)記基因位于兩側(cè)側(cè)翼序列之間，和 野生型或重組型重組單純皰疹病毒I型或II型基因組共轉(zhuǎn)染至Vero細胞中，進行同源重 組，空斑純化篩選出重組致病性進一步減低的重組單純皰疹病毒減毒活疫苗如JSH02LR，參 見附圖10和JSH2RS，參見附圖11等。
18
權(quán)利要求
一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因。
2.一種如權(quán)利要求1所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯(lián)合 敲除了其基因組中的UL43到UL47的基因片段和其它復(fù)制或感染非必需基因片段；所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到 左側(cè)RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因或三者的任意組合。
3.一種單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中的US2、 US3、US4 禾口 US5 基因。
4.一種如權(quán)利要求3所述的單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯(lián)合 敲除了其基因組中的US2、US3、US4、US5基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片段；所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到 左側(cè)RL2、RL1基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意組合。
5.一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中的 UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因。
6.一種如權(quán)利要求5所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯(lián) 合敲除了其基因組中的UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片 段所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到左 側(cè)RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因，或者上述三者的任意組合。
7.—種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中的 US2、US3、US4 禾口 US5 基因。
8.—種如權(quán)利要求7所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯(lián)合 敲除了其基因組中的舊2、舊3、舊4、到舊5基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片段；所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到左 側(cè)RL2和RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46到UL47基因，或者上述三者的任意組合。
9.一種如權(quán)利要求1、2、3、4所述的單純皰疹病毒I型或者如權(quán)利要求5、6、7、8所述的 單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗的制備方法，其特征在于步驟一取皰疹患者的水泡液，分離鑒定出野生型單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒 II型；步驟二 擴大培養(yǎng)后提取病毒完整基因組，設(shè)計引物擴增出擬定敲除的基因片段的左 右兩側(cè)700bp至2000bp的同源側(cè)翼序列；步驟三將步驟二所述同源側(cè)翼序列和熒光蛋白基因克隆至PShuttle-CMV載體，使熒 光蛋白基因位于同源側(cè)翼序列之間，再和野生型或重組型單純皰疹病毒I型或II型基因組 共轉(zhuǎn)染至Vero細胞中，進行同源重組；步驟四在熒光顯微鏡下使用一種或者聯(lián)合使用多種熒光蛋白基因作為標(biāo)記挑選出重 組病毒；經(jīng)過空斑純化后可獲得單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫田ο
全文摘要
本發(fā)明提供一種防治單純皰疹病毒I型或II型感染的重組減毒活疫苗和制備方法，該重組減毒活疫苗在于敲除了其基因組中UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因；該方法包括分離鑒定出野生型單純皰疹病毒；擴大培養(yǎng)后提取病毒完整基因組，設(shè)計引物擴增出擬定敲除的基因片段的同源側(cè)翼序列；將同源側(cè)翼序列和熒光蛋白基因克隆至pShuttle-CMV載體，進行同源重組；使用熒光蛋白基因作為標(biāo)記挑選出重組病毒；經(jīng)過空斑純化后可獲得單純皰疹病毒基因重組減毒活疫苗。本發(fā)明制備的減毒活疫苗均是經(jīng)過基因工程重組后的減毒活疫苗，不易發(fā)生毒力回復(fù)，其它生物學(xué)特性和野生型單純皰疹病毒相似。
文檔編號A61P31/22GK101926992SQ20101025360
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者劉景偉 申請人:鄭州金森生物科技工程有限公司