專利名稱：Exendin-4衍生物的復合物及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種修飾的Exendin-4衍生物，確切的說，涉及一種單甲氧基聚乙二醇-Exendin-4衍生物的復合物及其制備方法和應用，屬于肽或蛋白質(zhì)的修飾復合物及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是一組由于胰島素分泌缺陷及其生物學作用障礙引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。目前我國糖尿病的患病率和病死率正在呈快速上升趨勢，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的另一個嚴重危害人民健康的慢性非傳染性疾病，其中90%以上為II型糖尿病。目前，人們主要應用磺酰脲類和雙胍類等藥物來治療II型糖尿病，但是這些藥物的副作用較大，限制了其的臨床應用。Exendin-4是希拉毒蜥進食后由唾液腺產(chǎn)生的一種39肽的內(nèi)分泌激素，與哺乳動物胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)有53%的氨基酸序列重疊。Exendin-4與GLP-I有許多共同的糖代謝調(diào)節(jié)作用，包括葡萄糖依賴性促進胰島素分泌和抑制胰高血糖素過多分泌作用、 延緩胃排空、減少食物攝取等，Exendin-4與GLP-I相比的最大優(yōu)點是抗二肽?；拿窱V降解。但是Exendin-4在體內(nèi)也存在半衰期較短的問題，目前Exendin-4治療糖尿病的研究方向之一是通過對Exendin-4的結(jié)構(gòu)進行改變，得到Exendin-4衍生物，用該衍生物治療糖尿病，達到延長藥物在體內(nèi)的藥效時間的目的。
背景技術(shù)：
已經(jīng)提出一種Exendin-4衍生物及其制備方法，見申請?zhí)柡桶l(fā)明名稱分別為“200910045187. 6”和“一種Exendin-4衍生物及其固相化學合成”的發(fā)明專利，該Exendin-4衍生物的體內(nèi)降血糖活性較天然的Exendin-4 已有所提高。而本發(fā)明制備所得的Exendin-4衍生物的復合物在體內(nèi)的有效降血糖活性要顯著高于Exendin-4衍生物。蛋白/多肽類藥物普遍存在體內(nèi)半衰期短、穩(wěn)定性差、易被各種蛋白酶降解等特性，使得這些藥物需要在一天之內(nèi)多次注射，給病人帶來痛苦和不便。研究表明，從血漿中清除Exendin-4幾乎全部通過腎臟濾過而不是主要通過蛋白酶降解，因此對Exendin-4或其衍生物進行聚乙二醇化或其它修飾以增加分子大小是一種降低腎臟清除率的方法。目前對Exendin-4的修飾大都是多點修飾，產(chǎn)物存在多態(tài)性，分離純化產(chǎn)物較為困難，并且修飾產(chǎn)物的生物學活性有所降低。鑒于Exendin-4及其衍生物存在體內(nèi)的降血糖活性的時間有待進一步延長，且普通聚乙二醇修飾產(chǎn)物不均一等問題，因此迫切需要研制體內(nèi)降血糖時間更長，分離純化快速簡便且易于臨床應用的新型單點修飾的Exendin-4衍生物復合物產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種Exendin-4衍生物的復合物，該復合物由Exendin-4衍生物與經(jīng)馬來酰亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇組成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41, Xaa42, Xaa31, Xaa32 或 Xaa33 分別是 Cys，Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一個氨基酸；所述經(jīng)活化的單甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量為5 40kD ；所述復合物是通過Exendin-4衍生物中的游離巰基和mPEG-MAL基團的雙鍵形成的硫醚鍵連接而成。本發(fā)明Exendin-4衍生物的復合物中的Exendin-4衍生物可以是以下六種結(jié)構(gòu)之任何一種Exendin-4 (1-39) _Xaa40 (Seq ID No. 2)，Exendin-4 (1-39) _Xaa40_Xaa41 (Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42 (Seq ID No. 4)； Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq IDNo. 6)，Exendin-4(1-30)_Xaa31_Xaa32(Seq-ID-No. 7)和 Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa40 和 Xaa31 是 Cys，Xaa41， Xaa42, Xaa32 和 Xaa33 分別是 Cys，Ala, Gly, His, Set 或 Thr 中的任何一個氨基酸。更進一步地，該復合物中的Exendin-4衍生物可以是以下四種結(jié)構(gòu)之任何一種 Exendin-4 (1-39)-Xaa40_Xaa41(Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Se q ID No. 4) ；Exendin-4 (1-30)-)(aa31-)(aa32(^5q-ID-No· 7)和 Exendin-4 (1-30)-Xaa31_Xa a32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa41 和 Xaa32 是 Cys，Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分別是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一個氨基酸。更進一步地，該復合物中的hendin-4衍生物可以是以下兩種結(jié)構(gòu)之任何一種E xendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41_Xaa42(Seq ID No. 4) ；Exendin-4(1-30)-Xaa31_Xaa32_Xaa 33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa42 和 Xaa33 是 Cys，Xaa40, Xaa41, Xaa31 和 Xaa32 分別是 Cys， Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一個氨基酸。本發(fā)明所涉及的“Exendin-4” 包括 Exendin-4 (1-39)。其序列(Seq ID No. 1)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser0本發(fā)明所涉及的“Exendin-4”還包括Exendin-4的截短形式Exendin (1-30)，其序列(Seq ID No. 5)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A la_Val_Arg_Leu_Phe_Ile_Glu_Trp_Leu_Lys_Asn_Gly_Gly0上述Exendin-4衍生物，見本申請人的發(fā)明專利申請申請?zhí)枮?“200910045187. 6”，發(fā)明名稱為“一種Exendin-4衍生物及其固相化學合成”中提出的 Exendin-4 衍生物。本發(fā)明提供的Exendin-4衍生物的復合物，其中，經(jīng)活化的單甲氧基聚乙二醇是 mPEG-MAL,其分子量為5 40kD ；該Exendin-4衍生物的復合物是通過Exendin-4衍生物中游離巰基(-SH)和單甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺mPEG-MAL基團的末端雙鍵進行加成反應形成的硫醚鍵連接而成(結(jié)構(gòu)如下圖所示)。該Exendin-4衍生物中游離巰基(-SH) 可以實現(xiàn)mPEG-MAL的定點修飾，從而得到均一的修飾產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種Exendin-4衍生物的復合物，其特征在于，該復合物由Exendin-4衍生物與經(jīng)馬來酰亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇組成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq IDNo. 3，Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 Seq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41，Xaa42， Xaa31,Xaa32或Xaa33分別是Cys，Ala, Gly，His, Ser或Thr中的任何一個氨基酸；所述經(jīng)活化的單甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量為5 40kD ；所述復合物是通過Exendin-4 衍生物中的游離巰基和mPEG-MAL基團的雙鍵形成的硫醚鍵連接而成。
2.如權(quán)利要求1所述的Exendin-4衍生物的復合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物為 Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8 ；其中，Xaa41 和 Xaa32 是 Cys ；Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分別是 Cys, Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一個氨基酸。
3.如權(quán)利要求2所述的Exendin-4衍生物的復合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物為 Seq ID No. 4 或 Seq ID No. 8 ；其中，Xaa42 和 Xaa33 是 Cys ；Xaa40,Xaa41,Xaa31 和 Xaa32分別是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一個氨基酸。
4.如權(quán)利要求1所述Exendin-4衍生物的復合物的制備方法，其特征在于，具體步驟如下第一步，將Exendin-4衍生物溶解于磷酸鹽緩沖液中；第二步，再加入mPEG-MAL ；第三步，在4 40°C，pH3. O 9. O條件下進行mPEG修飾反應0. 5 M小時；第四步，置于_20°C終止上述mPEG修飾反應，制得所述Exendin-4衍生物的復合物的粗品溶液；第五步，取以上粗品溶液用Tris-HCl緩沖液稀釋，ikpharose Q XL層析柱，梯度洗脫，收集穿透峰和洗脫峰的洗脫溶液；第六步，將以上洗脫液用截留分子量為1 IOkD的超濾管濃縮，冷凍干燥，得到產(chǎn)物即所述Exendin-4衍生物的復合物的純品，所述產(chǎn)物的分子量介于8. 5 44. 3kD。
5.權(quán)利要求1所述的Exendin-4衍生物的復合物在制備治療糖尿病的藥物中的用途。
6.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有有效量的權(quán)利要求1所述的Exendin-4衍生物的復合物，以及藥學可接受的成分。
全文摘要
本發(fā)明公開一種Exendin-4衍生物的復合物及其制備方法和應用，該Exendin-4衍生物的復合物是由Exendin-4衍生物與經(jīng)馬來酰亞胺活化的單甲氧基聚乙二醇組成，該Exendin-4衍生物的復合物的生物穩(wěn)定性高，體內(nèi)半衰期長，生物利用度高。其制備方法操作簡便，原料易得。
文檔編號A61P3/10GK102234331SQ20101016845
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者勞勛, 吳自榮, 張洪丹, 楊燕, 蔣子威, 黃靜 申請人:華東師范大學