專利名稱：(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉的制藥應(yīng)用的制作方法
(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉的制藥應(yīng)用
本申請(qǐng)系申請(qǐng)日為1996年6月17日、申請(qǐng)?zhí)枮?6196328.X、發(fā) 明名稱為"用(2-咪唑啉-2-基氨基)喹喔啉治療視神經(jīng)損傷的方法"的發(fā) 明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及保護(hù)哺乳動(dòng)物眼睛的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜免受有害刺激的方 法，此有害刺激包括由于青光眼或其它病因因素導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高的壓迫性 (機(jī)械的)效應(yīng)以及供給這些神經(jīng)的血流受損。
青光眼是一種特征為眼內(nèi)壓升高的眼睛疾病。按病因分類，青光眼可 分為原發(fā)性及繼發(fā)性。進(jìn)一步地，成人的原發(fā)性青光眼可以是慢性開角型 或慢性閉角型。繼發(fā)性青光眼由先于其存在的眼睛疾病如色素膜炎，眼內(nèi) 腫瘤或增大的白內(nèi)障所致。
原發(fā)性青光眼的根本原因尚不很清楚。眼內(nèi)壓的升高是由于阻塞或房 水外流。在慢性開角型青光眼，前房角及其解剖結(jié)構(gòu)顯示正常，但房水引 流有障礙。在急性和慢性閉角型青光眼，前房角淺，濾過角狹窄，虹膜可 能在Schlemm管的入口外阻塞了小梁網(wǎng)絡(luò)。瞳孔擴(kuò)大可能推動(dòng)虹膜根部進(jìn) 一步壓迫房角，或可能產(chǎn)生瞳孔的阻滯，因此出現(xiàn)急性發(fā)作的眼內(nèi)壓升高。 前房角狹窄的眼易于出現(xiàn)各種嚴(yán)重程度的急性閉角型青光眼發(fā)作。
繼發(fā)性青光眼是由于對(duì)房水自后房角至前房角，并隨之至Schlemm 管流動(dòng)的任何干擾所致。
眼前部的炎癥性疾病可能引起虹膜"l^部位"(bombe)內(nèi)完全性后虹膜 粘連而阻礙房水外流，并且滲出物可能堵塞引流通道。其它常見的原因有眼內(nèi) 腫瘤，增大的白內(nèi)障，腹側(cè)視網(wǎng)膜靜脈閉塞，目艮部創(chuàng)傷，手術(shù)操作及眼內(nèi)出血。
將所有類型考慮在一起，在所有40歲以上的人中約2%發(fā)生青光眼， 并且在進(jìn)行性并到迅速視力喪失之前的許多年可以是無癥狀的。在無外科 手術(shù)適應(yīng)癥的情況，局部用|3 -腎上腺素受體拮抗劑是治療青光眼的選擇 藥物。然而，oc -腎上腺素能激動(dòng)劑正等待批準(zhǔn)用于治療眼內(nèi)壓升高，且 一旦它們得到應(yīng)用，將可能成為治療這種病的主力。
具有(X2激動(dòng)劑活性的各種喹喔啉衍生物已被建議作為治療劑，例 如Danielewicz等，美國專利第3, 890， 319和4， 029， 792號(hào)。他們公開
5了作為心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑的化合物，它具有如下通式:
其中2 -咪唑啉-2 -基氨基基團(tuán)可在喹喔啉母核的5 -、 6-、 7-或8-位置的任何一位； x、 y和z可在剩余的5-、 6-、 7-或8-位置的任何一位且可選自氳、卣素、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或三氟甲基； R是在喹喔啉母核的或2 -或3 -位置的任意取代基并且可以是氫、低 級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，目前有用的化合物可按照Danielewicz等提出的 步驟制備.美國專利第3， 890， 319和4， 029， 792號(hào)的內(nèi)容被在此全部收 載作為參考，
在"相對(duì)選擇性oc-2激動(dòng)劑(UK _ 14,304 - 18 )對(duì)貓、兔和猴 的8艮部效應(yīng)"〔J. A. Burke ,等，Current Eye Rsrch 5， ( 9 )， pp 665 -676 ( 1986 )〕中，查喔啉衍生物對(duì)降低兔、貓和猴的眼內(nèi)壓顯示有 效。此研究中的化合物被局部應(yīng)用于所研究動(dòng)物的眼，
很早就已知青光眼的后遺癥之一是對(duì)視神經(jīng)頭的損傷。此損傷，被 稱為"杯狀陷凹形"或"cupping"導(dǎo)致視盤的神經(jīng)纖維區(qū)域機(jī)能降低。 由于此cupping所致的視力喪失是進(jìn)行性的，且如果此疾病未得到有效 的治療則會(huì)致盲。
然而不幸的是，應(yīng)用藥物或外科手術(shù)促進(jìn)房水外流而降低眼內(nèi)壓并 不總能有效地避免青光眼狀況對(duì)神經(jīng)的損傷。這個(gè)明顯的矛盾由Cioffi 和Van Buskirk〔眼科學(xué)研究，38,增刊，p. S107 - 16 ,討論Sl 16-171994年5月〕在文章"前眼神經(jīng)的微血管系統(tǒng)，，中談到，摘要說明
青光眼的傳統(tǒng)定義是眼內(nèi)壓(IOP )升高的異常，使得臨床狀況過 分簡單化。 一些青光眼病人從未具有高于正常的IOP,而另一些病人盡 管最大限度降低IOP仍繼續(xù)發(fā)生視神經(jīng)損傷 在青光眼病因?qū)W中的其它 可能因素是前眼神經(jīng)局部微血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié).相信微血管因素是重要的 一個(gè)理由是許多微血管疾病與青光眼視神經(jīng)病變有關(guān)。
繼Cioffi等之后，Matusi發(fā)表了關(guān)于"系統(tǒng)性血管炎的眼科學(xué)改 變"〔Nippon Rinsho， 52 (8)， p. 2158 - 63 , August 1994 〕的文章 進(jìn)一步支持許多微血管疾病與青光眼視神經(jīng)病變有關(guān)的觀點(diǎn)。摘要說 明
全身性血管炎如結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，巨細(xì)胞小血管炎和主動(dòng)脈炎綜合 癥的眼部表現(xiàn)已被評(píng)述.全身性紅斑狼疳未分類為全身性血管炎，然而 它的眼部表現(xiàn)是微血管病變。因此其眼部表現(xiàn)的評(píng)述亦包括在本文中。 這些疾病最常見的眼底發(fā)現(xiàn)是局部缺血性視神經(jīng)病變或視網(wǎng)膜血管閉 塞 因此一些關(guān)于視神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜血管閉塞的診斷或發(fā)病 機(jī)理的觀點(diǎn)得到討論。由于焚光素血管造影被應(yīng)用于這些疾病，脈絡(luò)膜 局部缺血已經(jīng)能夠臨床診斷。當(dāng)脈絡(luò)膜動(dòng)脈閉塞時(shí)，壓在上面的視網(wǎng)膜 色素上皮細(xì)胞將受到損傷，此導(dǎo)致上皮細(xì)胞的屏障功能受損，并使得來 自脈絡(luò)膜血管系統(tǒng)的液體能夠進(jìn)入感光層下的視網(wǎng)膜空間。這是漿液性 視網(wǎng)膜脫離的發(fā)病機(jī)理，視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞形成了無灌注詳見網(wǎng)膜。此缺氧 的視網(wǎng)膜釋放血管形成因子，它刺激視網(wǎng)膜和虹膜新生血管形成，而虹 膜新生血管形成可能造成新生血管性青光眼。
B. Schwartz在"眼科高血壓和高壓性開角型青光眼中視盤和視網(wǎng)膜 的循環(huán)缺陷"〔Surv. Ophthalmol., 38， Suppl. pp. S23 - 24 ， 1994年5 月〕一文中討論了與青光眼進(jìn)展有關(guān)的進(jìn)行性視神經(jīng)和視網(wǎng)膜缺陷的治 療，他i兌明
熒光素缺陷與視野喪失及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層喪失顯著相關(guān)。其次的 循環(huán)缺陷是視網(wǎng)膜血管，特別是視網(wǎng)膜靜脈內(nèi)熒光素流量的下降，以致 于年齡越大，舒張期血壓越高，眼壓及視野喪失越大，流量就越小。視 盤和視網(wǎng)膜循環(huán)缺陷均發(fā)生于未治療的眼壓過高的眼。這些觀察表明視 盤和視網(wǎng)膜循環(huán)缺陷發(fā)生于眼壓過高和開角型青光眼，且隨疾病的進(jìn)展 增力口。因此，顯然有著不能滿足的對(duì)一種藥物的需要，這種藥物具有眼內(nèi) 神經(jīng)保護(hù)作用，它能夠阻止或延緩青光眼或其它眼科疾病導(dǎo)致的神經(jīng)的 進(jìn)行性損傷。
發(fā)明概要
一種保護(hù)哺乳動(dòng)物眼睛的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜免受青光眼和其它有害 刺激傷害的新方法已被發(fā)明。此方法包括應(yīng)用于哺乳動(dòng)物或者全身性或
者球內(nèi)注射有效劑量的一種或多種某些芳香基-亞氨基-2-咪唑烷 (如在此定義)，其鹽類和其混合物。當(dāng)用作預(yù)防性治療時(shí)，此新方法 尤其有效，即用在神經(jīng)損傷發(fā)生之前，或用在疾病如青光眼的長期進(jìn)展 已經(jīng)發(fā)生之前。
發(fā)明的詳細(xì)描述
首先對(duì)圖作簡短的描述。
附圖


圖1是自谷氨酸治療的天數(shù)繪制的直方圖，顯示細(xì)胞被谷氨酸處理 后殺死的百分率。包括未用谷氨酸處理的對(duì)照以測定未用任何這種處理 時(shí)發(fā)生的細(xì)胞死亡。還顯示的有用AGN 191103和谷氨酸處理后，及用 MK-801和谷氨酸處理后的測定結(jié)果。MK-801是本領(lǐng)域熟知的神經(jīng) 保護(hù)制劑。在谷氨酸；AGN 191103+谷氨酸；和MK-801+谷氨酸直 方柱下面的數(shù)椐顯示用于各個(gè)例子的谷氨酸和藥物的濃度。在第8天， 在保護(hù)細(xì)胞免受谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性方面，AGN 191103和MK 801 顯示了類似的效應(yīng)。產(chǎn)生此圖的數(shù)椐的實(shí)驗(yàn)步驟詳見實(shí)施例1。
圖2顯示測量的視神經(jīng)纖維復(fù)合動(dòng)作電位(CAP)圖在左手的圖 框內(nèi)，測定于損傷后2周(即，神經(jīng)壓碎后)，用AGN19U03治療的 視神經(jīng)(上面的線)和用作對(duì)照的未治療的神經(jīng)(下面的線)；在右手 的圖框內(nèi)，為未損傷視神經(jīng)的對(duì)照CAP。在每個(gè)圖框中給出了圖的標(biāo)度。 損傷后的圖橫座標(biāo)標(biāo)度是未損傷圖標(biāo)度的25x (單位毫伏和毫秒)。 復(fù)合動(dòng)作電位的值以每一曲線下面積的積分計(jì)算。曲線的不規(guī)則性是復(fù) 合反應(yīng)分散的特征； 一些神經(jīng)細(xì)胞傳導(dǎo)較其它更為迅速，因此測量電壓 的振幅隨時(shí)間而變化。
圖3是以微伏(nV)表示的細(xì)胞最大CAP振幅的直方圖，這些細(xì) 胞是大鼠視神經(jīng)壓碎而損傷并用以下治療l)單用賦形劑；2)可樂 定和3 ) AGN 191103。每種藥物以四種不同的濃度試驗(yàn)(用作凈皮試-瞼對(duì)象體重的倍數(shù))并以圖中的直方柱表示.可樂定以其已被非常明確的
藥理學(xué)作用被選為標(biāo)準(zhǔn)ot2激動(dòng)劑化合物，與被試驗(yàn)化合物AGN 191103 相比較，但是當(dāng)可樂定較單用賦形劑相比的確顯示一些神經(jīng)保護(hù)活性 時(shí)，它只顯示AGN 191103最大CAP反應(yīng)的約一半值，
圖4是視覺激發(fā)性電位反應(yīng)的曲線圖，并顯示了作為視覺(光)刺 激的結(jié)果在視覺腦皮質(zhì)的表明激發(fā)的電的電位活性(類似于腦電圖)， 此試驗(yàn)在活的大鼠進(jìn)行并且是整個(gè)視覺系統(tǒng)的完整性的測量，即自視網(wǎng)
膜經(jīng)過視神經(jīng)進(jìn)入雙側(cè)膝狀核并最后進(jìn)入位于腦后部的神覺腦皮質(zhì)的 整個(gè)視覺系統(tǒng)。左手的圖框顯示無神經(jīng)壓碎損傷的反應(yīng)，右手的圖框顯 示于損傷后2周測量的用AGN 191103治療的大鼠的反應(yīng)，為上面的線 (標(biāo)為陽性)，及神經(jīng)壓碎前對(duì)照大鼠的反應(yīng)，為下面的線(標(biāo)為陰性)。 兩張圖均以^V對(duì)毫秒標(biāo)度，顯示于縱座標(biāo)軸下方，
關(guān)于神經(jīng)壓碎模型及其在評(píng)價(jià)神經(jīng)損傷和修復(fù)中它的重要性的討論 及文獻(xiàn)目錄參見"視神經(jīng)損傷后的功能修復(fù)及形態(tài)學(xué)變化"，Sabel， B. A,和Aschoff. A.，神經(jīng)精神生物學(xué)28,pp. 62 - 65 ( 1993 )
哺乳動(dòng)物視神經(jīng)的損傷，如同哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS )的 任何其它部位，致使軸突的變性及隨后細(xì)胞體喪失，軸突自幸存的神經(jīng) 元不能再生.起初，損傷的神經(jīng)的變性可能歸因于直接的神經(jīng)元損傷， 然而，損傷后立即發(fā)生于神經(jīng)中的有關(guān)生理和生化事件可能對(duì)隨后的進(jìn) 行性變性有作用，不僅是對(duì)直接損傷的軸突，而且是對(duì)那些避開了初次 的損傷而且在更大程度上決定了長期功能的后果。
立即的損傷誘導(dǎo)反應(yīng)極大地影響了隨后的變性反應(yīng).因此減少或減 弱立即反應(yīng)的治療似乎是達(dá)到最理想的預(yù)防或延緩繼發(fā)的變性過程。為 了監(jiān)測立即反應(yīng)，顯然優(yōu)逸應(yīng)用非侵入性的技術(shù)。修正的煙酰胺腺嘌呤 二核苷酸(NADH )監(jiān)測技術(shù)使得能夠測定最早期的創(chuàng)傷后事件，已 被證明是有價(jià)值的非侵入性方法，此技術(shù)的應(yīng)用使損傷的立即反應(yīng)能夠 在真實(shí)時(shí)間內(nèi)得到評(píng)價(jià)并在活體成年大鼠視神經(jīng)遭到仔細(xì)控制的壓碎 損傷之前和之后進(jìn)行的評(píng)價(jià)，在此實(shí)驗(yàn)范例中，損傷的視神經(jīng)代謝活性 的測定代表了損傷的軸突和它們相關(guān)的非神經(jīng)元細(xì)胞的活性，因此等于 評(píng)價(jià)了應(yīng)付損傷性應(yīng)激反應(yīng)的潛在能力 此模型還可用于各種試劑的活 性的監(jiān)測，這些試劑可以克服或緩解來自于此類應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞損 傷或死亡。在局部缺血性事件能夠被完全排除的情況下，最早期的損傷誘導(dǎo)反
應(yīng)是神經(jīng)的能量狀態(tài)減少。能量狀態(tài)的減少可能涉及1 )游離脂肪酸
水平在損傷后升高，這可能千擾線粒體功能并導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)運(yùn)的解偶聯(lián)；
和2 )細(xì)胞內(nèi)游離Ca^水平顯著升高。已知軸突的損傷通常隨后出現(xiàn)細(xì) 胞外鉀離子的升高，它通過電壓敏感通道(L， T或N型)或受體-操縱的Ca"通道，刺激了Ca^的攝取。細(xì)胞內(nèi)游離Ca"的顯著升高能加 速不利于細(xì)胞生存的過程，包括那些涉及Ca"依賴性的酶，主要是脂 酶，蛋白酶和核酸內(nèi)切酶的過程，這可能引起線粒體損傷并最后導(dǎo)致細(xì) 胞死亡。為了克服這些事件，細(xì)胞需要更多的能量以便主動(dòng)地恢復(fù)離子 的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定.在損傷部位由于線粒體功能障礙所致的增加的能量需求 和減少的能量保存的組合可能是損傷后隨之發(fā)生的不同逆性神經(jīng)損傷 及神經(jīng)變性的主要原因。因此對(duì)代謝活性的早期測定能夠提示軸突，與 其相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和它的非神經(jīng)元細(xì)胞體的命運(yùn)。從上述可得出， 在預(yù)防損傷后神經(jīng)發(fā)生變性中，線粒體活性的恢復(fù)可能是關(guān)鍵性的。
由于在神經(jīng)壓碎模型中，加在神經(jīng)上的損傷是良好控制的，校準(zhǔn)過 的和可重復(fù)的損傷，因而有可能將早期創(chuàng)傷后代謝缺損和通過藥物或其 它治療可能將其減輕，與長期的形態(tài)學(xué)的及生理學(xué)的效應(yīng)相聯(lián)系。
從前面的圖及討論可見，對(duì)于谷氨酸i秀導(dǎo)的毒性及在神經(jīng)壓碎模型 中的物理損害，顯然神經(jīng)細(xì)胞是得到了神經(jīng)保護(hù)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在視神經(jīng)細(xì)胞受到損傷前或之后但在細(xì)胞死亡之前的時(shí) 期內(nèi)，將式I的藥物施用于哺乳動(dòng)物的視神經(jīng)和/或視網(wǎng)膜，視神經(jīng)細(xì)胞 得到了神經(jīng)保護(hù)，
其中，2 -咪唑啉-2 -基氨基基團(tuán)可以在喹喔啉母核的 5-或 6-位；x、 y和z可在剩余的5-、 6-、 7 -或8 -位的任一位置 并且是選自氫，卣素，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的2 -或3 -位的任意取代基且可能是氬，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。
其化學(xué)名稱為6 -甲基-(2 -咪唑啉-2 -基氨基)喹喔啉。
鑒定為MK - 801的神經(jīng)保護(hù)劑稱之為地佐環(huán)平并具有以下化學(xué)結(jié)
構(gòu)
在第11版Merck索引專題第3392號(hào)中有附加的鑒定和描述。 人的劑量和施用
本發(fā)明的方法可用于治療任何哺乳動(dòng)物，包括人類。 按照本發(fā)明，哺乳動(dòng)物用藥學(xué)有效量的神經(jīng)保護(hù)劑治療 一 段時(shí)間， 并在對(duì)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜的毒性刺激沒有殺死或未永久性損傷神經(jīng)細(xì)胞 的時(shí)候使用。保護(hù)劑可以口服或應(yīng)用下面描述的或本領(lǐng)域熟知的任何合 適的給藥方法。
按照本發(fā)明，藥學(xué)有效劑量的保護(hù)劑可單獨(dú)給藥以治療神經(jīng)損傷或 預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞死亡?；蛘撸Ｗo(hù)劑可與抗青光眼藥物順序地或同時(shí)使 用，如與(3-阻滯劑，a2-激動(dòng)劑，繩覃堿類制劑如毛果蕓香鹼，碳酸 酐酶抑制劑(CAI ),或其它用于維持眼內(nèi)壓(IOP )于正常水平或 降低升高的IOP的藥物。保護(hù)劑最有效的給藥方式和劑量程序取決于欲 治療的疾病類型，該疾病病程和嚴(yán)重程度，先前的治療，病人的健康狀
定義
鑒定為AGN 191103的化合物具有所示的化學(xué)結(jié)構(gòu):態(tài)，對(duì)藥物的反應(yīng)以及治療醫(yī)師的判斷。一45:地說，神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)該給 藥的劑量為達(dá)到血清或玻璃體內(nèi)濃度為O.OlnM至50nM ,優(yōu)選神經(jīng)保 護(hù)劑在神經(jīng)損傷前使用，但也可在損傷發(fā)生后使用，效果較差。
可以應(yīng)用保護(hù)劑，如MK- 801的常規(guī)給藥方式及標(biāo)準(zhǔn)劑量程序， 與其他藥物，如一種IOP降低藥，與神經(jīng)保護(hù)劑，合并給藥的最佳劑量， 可用本領(lǐng)域熟知的方法決定。基于與神經(jīng)保護(hù)劑同時(shí)給藥的藥物的劑量 和病人對(duì)療程的反應(yīng)，可按具體病人調(diào)整神經(jīng)保護(hù)劑的劑量。也可將保 護(hù)劑在一 定時(shí)間或經(jīng)一 系列治療期間給藥于病人，
不能通過血/腦屏障的試劑，如MK - 801 ，可局部給藥，如通過 眼球內(nèi)注射至玻璃體內(nèi)，或鞘內(nèi)應(yīng)用。能夠通過血/腦屏障的試劑，如 AGN 191103可以全身性給藥，如口服，靜脈內(nèi)；或注射。
這些療法中應(yīng)用的組合物也可以是多種形式，它們包括，例如，固
體，半固體，和液體劑量形式。如片劑，丸劑，粉劑，液體溶液或懸浮
劑，脂質(zhì)體，栓劑，可注射和輸注溶液。組合物還優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)
人員熟知的常規(guī)的可供藥用的栽體。
下列非限制性的實(shí)施例描述了分析和測定。用于l)測定保護(hù)神經(jīng)細(xì)
胞免于谷氨酸誘導(dǎo)的毒性和2)在機(jī)械損傷的神經(jīng)壓碎模型中，測定神經(jīng) 保護(hù)劑給予的神經(jīng)保護(hù)作用的方法。 實(shí)施例1 :
在谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞興奮中毒效應(yīng)的模型中測定神經(jīng)保護(hù)作用的
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實(shí)驗(yàn)方法
4氐密度大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物是用Goslin和Banker的方法制備 的。蓋片在瓷制架中清洗和滅菌以使它們不相互粘連(Cohen蓋玻片染 色架，Thomas Scientific )蓋片(13mm ) -故置于染色架中，用蒸餾水 沖洗(四次沖洗，每次1分鐘)以除去灰塵并轉(zhuǎn)移至濃HN03中36小 時(shí)。蓋片于蒸餾水中沖洗(四次換水，3小時(shí)以上)并用干熱滅菌(225 。C過夜)將蓋片轉(zhuǎn)移至24 -孔板上，每孔一個(gè)蓋片。在共培養(yǎng)時(shí)，為 支撐在神經(jīng)膠質(zhì)上的蓋片，在置入蓋片前將石蠟點(diǎn)置于板上，并用uv 照射(30分鐘)。將lmg/ml聚-L -賴氨酸氧溴酸鹽(PLL ) ( Sigma ) (MW 30,000 - 70,000 )溶解于硼酸緩沖液中(0.1M, pH8.5 )，過 濾，滅菌并用于覆蓋每個(gè)蓋片過夜。除去PLL，蓋片用蒸餾水沖洗(沖 洗兩次，每次2小時(shí))，加入平板培養(yǎng)基〔Eagle's MEM與Earle's的鹽，它含有額外的葡萄糖(600mg/L )和10 %馬血清〕并將板貯存 于孵育器中。星形神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物制備自新生大鼠的腦，.系.用類似于 Levinson和Mc Carthy描述的方法，只是它們以較低的密度鋪平板接 種以便它們主要含有I型星形神經(jīng)膠質(zhì)。每孔平板接種105細(xì)胞.神經(jīng) 膠質(zhì)培養(yǎng)物飼以平板培養(yǎng)基每周兩次并在接種后約2周達(dá)到融合后使 用。使用前一天，除去平板培養(yǎng)基，加入神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(MEM含 有N2補(bǔ)充物)，并繼續(xù)孵育。3 x 104有活力的大鼠海馬神經(jīng)(El8 胚胎)被平板接種于PLL -處理的保存于平板培養(yǎng)基中的蓋片上。3 -4小時(shí)后，當(dāng)大部分神經(jīng)元附著后，將蓋片轉(zhuǎn)移至含有在維持培養(yǎng)基 中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的器孤中，且讓神經(jīng)元一邊面對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)，神經(jīng)膠質(zhì)支 持神經(jīng)元的生存和生長，為減少神經(jīng)膠質(zhì)增殖，在平板接種后2天于培 養(yǎng)物中加入阿糖胞苷(1 - p - D -阿糖咬喃胞嘧，定)(Calbiochem ) (5 x IOM終濃度)。于培養(yǎng)第6天，用lmM谷氨酸或用谷氨酸與或 者AGN - 191103 - O.lnM ( MW - 200 )或者M(jìn)K - 801 - 10nM 一起處理細(xì)胞(每種處理用2-3個(gè)蓋片)，
孵育24小時(shí)后，用臺(tái)盼藍(lán)行細(xì)胞染色。隨機(jī)選擇培養(yǎng)物視野(每 個(gè)蓋片5個(gè)視野)計(jì)數(shù)活的和死的神經(jīng)元。計(jì)算死亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 實(shí)施例2
神經(jīng)壓碎損傷和測量損傷后復(fù)合動(dòng)作電位(CAP )的方法 A部分。 代謝測定
所用動(dòng)物按照關(guān)于研究動(dòng)物的應(yīng)用的ARVO決議。雄性Sprague -Dawley ( SPD )大鼠，體重300 - 400g用戊巴比妥鈉麻醉(腹腔內(nèi)， 35mg/kg )。氣管內(nèi)插入插管以備需要時(shí)人工通氣。將動(dòng)物的頭用頭架 固定于一定位置，于雙目操作顯微鏡下行側(cè)面眥切開術(shù)且結(jié)膜被側(cè)面切 開至角膜。分離眼球收縮肌后，確定視神經(jīng)且行鈍性分離自近眼球處暴 露303.5mm長度。保留硬膜完整并注意不要損傷神經(jīng)。光導(dǎo)裝置架(見 下文)的第一部分被插入視神經(jīng)下方并且將視神經(jīng)輕輕釋放入光導(dǎo)管 道內(nèi)。然后將第二部分固定于一定位置，以使光導(dǎo)裝置位于距視神經(jīng)將 要被損傷處的lmm視神經(jīng)表面。 表面焚光光度測定-反射系數(shù)測定
線粒體內(nèi)NADH氧化-還原狀態(tài)的監(jiān)測是基于NADH于366nm處的熒光，導(dǎo)致發(fā)射出峰強(qiáng)度在450nm的藍(lán)光，它不同于它的氧4t形式， NAD + ，后者缺乏此熒光.366nm激發(fā)的來源是100-W空氣冷卻的用 強(qiáng)366nm濾器裝備的Coroing 5860 ( 7 - 37 )加9782 ( 4 - 96 )) 水銀燈.柔韌的Y形光學(xué)纖維束(光傳導(dǎo))用于傳送到達(dá)或來自視神經(jīng) 的光，因此使得體內(nèi)測定在技術(shù)上可行.激發(fā)光通過激發(fā)纖維束傳送至 神經(jīng).發(fā)射自神經(jīng)的光，在傳送通過第二纖維束后，分開為90 : IO的 比例量，以測定在450nm的焚光(90 % )和在366nM的反射光(10 % ),它是通過連接于一通道直流電熒光計(jì)-反射計(jì)的二個(gè)光電倍增管進(jìn) 行的，為減小動(dòng)物間的變異，在記錄開始時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)校正程序。實(shí) 驗(yàn)中熒光和反射信號(hào)的變化按相對(duì)于校正的信號(hào)計(jì)算.此種類型的校 正，盡管不是絕對(duì)值，然而在各種動(dòng)物和不同的實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了可 靠的和可重復(fù)的結(jié)果。
繼發(fā)于動(dòng)JJ^血壓和神經(jīng)容量改變的血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)和視神經(jīng)運(yùn)動(dòng) 導(dǎo)致的組織吸收值的改變是與反射光的改變相互關(guān)連，熒光測定值發(fā)現(xiàn) 可被適當(dāng)修正為NADH氧化-還原狀態(tài)測定值，這是通過將熒光中減 去反射光(366nm ) ( 1:1比例)以獲得修正的熒光信號(hào)。 代謝測定
將仍然麻醉狀態(tài)的動(dòng)物在30分鐘從上迷的外科步驟復(fù)蘇，然后暴 露于缺氧和多氧條件，通過讓大鼠在100 %氮?dú)庵泻粑鼉煞昼娺_(dá)到缺氧 狀態(tài)，之后將其返回空氣中。當(dāng)動(dòng)物未自動(dòng)恢復(fù)至正常呼吸時(shí)，通過向 氣管內(nèi)吹氣兩次進(jìn)行通氣，多氧狀態(tài)是通過讓動(dòng)物在100 %氧中呼吸6 -10分鐘誘發(fā)的，為評(píng)價(jià)視神經(jīng)的代謝活性，在壓碎損傷前后，測定 了對(duì)缺氧和多氧的反應(yīng)引起的反射光和熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化。 代謝測定的實(shí)驗(yàn)方案
用校正的交叉作用(cross - action )鑷子，在眼和光傳導(dǎo)架之間 的神經(jīng)上進(jìn)行仔細(xì)校正的適度的壓碎損傷，相應(yīng)壓力為120g 30秒 鐘。
B部分
生理學(xué)測定
記錄復(fù)合動(dòng)作電位(CAP )的實(shí)驗(yàn)
在去除視神經(jīng)行電生理測定之前，大鼠以70mg/kg戊巴比妥深度麻 醉，自顱骨去除皮膚，自眼球分離視神經(jīng)。行次全斷頭術(shù)并用咬骨鉗打顱骨。大腦移置側(cè)面，暴露視神經(jīng)的顱內(nèi)部分，在交叉水平分離使能夠
切除全部長度的神經(jīng)，并將它轉(zhuǎn)移至裝有新鮮冷Krebs溶液的玻璃瓶 中.Krebs溶液舍有NaCl ( 125mM ) , KC1 ( 5mM ) , KH2P04 (1.2mM ) , NaHC03 ( 26mM ) , MgS04 ( 0.6mM ) , CaCI2 (24mM ) D -葡萄糖(llmM ),用95 % 02和5 % 0)2通氣。神 經(jīng)保存在此溶液中，在其中電活性將至少3 - 4小時(shí)保持穩(wěn)定。1小時(shí) 恢復(fù)后，將神經(jīng)于37 'C浸入Krebs溶液中。在矩壓碎損傷的遠(yuǎn)端神經(jīng) 處獲得電生理記錄，由于神經(jīng)太小，不允許在壓碎的兩側(cè)進(jìn)行測定。然 后將神經(jīng)末端連接于浸在浴液中的兩個(gè)吸入Ag - AgCl電極。經(jīng)近端 的電極應(yīng)用刺激脈沖并經(jīng)遠(yuǎn)端電極記錄動(dòng)作電位。Grass SD9刺激器 用作電刺激(2V , 50ps )。信號(hào)被傳遞至Medelec PA63前置放大 器并由此到Medelec MS7肌電圖儀和AA7T放大器。溶液，刺激器和 放大器有共同的基座，8個(gè)平均的CAPs的最大波幅用波拉羅伊德 (Polaroid )照相機(jī)記錄和照像。剩余的神經(jīng)(未損傷的)用于測定正 常神經(jīng)的參考值并校正用以壓碎的鑷子， 視覺激發(fā)性電位(VEP )反應(yīng)的記錄
損傷的用藥物治療的大鼠于損傷后2周檢查，評(píng)價(jià)其功能恢復(fù)。在 此組實(shí)驗(yàn)中，從初級(jí)視覺腦皮質(zhì)記錄了對(duì)光刺激反應(yīng)引起的縱行電位圖 形。電位被來源于視網(wǎng)膜的光激發(fā)并延著存活的軸突傳播到達(dá)它們的最 終目標(biāo)，視覺皮質(zhì).只有那些在初級(jí)及次級(jí)變性過程中存活下來的軸突 能夠傳導(dǎo)動(dòng)作電位。對(duì)治療的及未治療的動(dòng)物的場電位圖形的比較分 析，將揭示治療對(duì)軸突存活的作用。
將麻醉的大鼠(Rumpon， Ketalar )置于一小的動(dòng)物sterotaxic儀器 中。暴露顱骨后，用圓柱形鉆頭鉆兩個(gè)孔，并保持硬膜完整以減小皮質(zhì) 損傷。 一個(gè)孔，鉆于鼻骨上方，用作參考點(diǎn)，第二個(gè)孔在OC1區(qū)域， 坐標(biāo)為前顱#8mm，側(cè)面弁3mm。連接于螺絲釘?shù)慕鹩|針被用作電極， 它被擰緊在孔中并用丙埽酸粘接劑膠粘于顱骨。場電位用頻閃儀刺激激 發(fā)，平均每分鐘90掃描。通過應(yīng)用Lab View數(shù)據(jù)收集和處理系統(tǒng)分析 閃光-激發(fā)性電位。場電位被數(shù)字化并貯存行脫機(jī)分析。 C部分
檢測神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)的藥物效果的測定
第一組的實(shí)驗(yàn)包括代謝測定.每種藥物以7種不同的濃度腹腔內(nèi)注射.每組藥物在一組8只動(dòng)物中檢測，同時(shí)有8只對(duì)照(損傷的動(dòng)物預(yù) 緩沖賦形劑處理)。在各個(gè)例中，于損傷前，損傷后0.5小時(shí)和以后的 4 - 6小時(shí)的每一小時(shí)進(jìn)行線上的代謝測定。獲得的數(shù)據(jù)用ANOVA分析。
長期效果的測定。生理學(xué)活性 CAPS
損傷后即刻將待檢測的藥物注射于IO只動(dòng)物，并用賦形劑注射10 只對(duì)照動(dòng)物.二周后每個(gè)神經(jīng)的CAPs被體外記錄，用吸入電極。對(duì)側(cè) 的一邊用作內(nèi)部對(duì)照。結(jié)果表明被檢測的藥物是否對(duì)挽救剩余的軸突和 /或延援變性具有任何電位效應(yīng)。陽性結(jié)果將導(dǎo)致繼續(xù)對(duì)各個(gè)有前途藥 物測定最佳劑量。 VEP效應(yīng)
于兩組年齡-和性別-匹配的首次用作實(shí)驗(yàn)的SPD大鼠的皮質(zhì)內(nèi) 植入電極，植入后即刻，當(dāng)光線閃爍于右眼而左眼被覆蓋時(shí)，左側(cè)記錄 VEP效應(yīng)。然后在視神經(jīng)上進(jìn)行仔細(xì)控制的壓碎損傷，并將預(yù)先已確定 的最佳劑量的藥物立即施用.對(duì)照動(dòng)物以相同的方法處理，只是施用賦 形劑而不是藥物。每只動(dòng)物的VEP效應(yīng)于手術(shù)后1天，l周、2周和4 周記錄。
雖然本發(fā)明已通過各種具體實(shí)施例和實(shí)施方案進(jìn)行描述，應(yīng)理解到 本發(fā)明不限于此，而只應(yīng)通過所附權(quán)利要求書的范圍的闡述來解釋。
權(quán)利要求
1.下式I化合物或其可供藥用的鹽或其混合物在制備用于保護(hù)哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜或視神經(jīng)細(xì)胞以抑制或防止神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡的藥物方面的應(yīng)用，該哺乳動(dòng)物的所說的神經(jīng)細(xì)胞正遭受有害的作用或經(jīng)受有害作用的危險(xiǎn)，式I其中2-咪唑啉-2-基氨基基團(tuán)位于喹喔啉母核的5-或6-位；x、y和z位于剩余的5-、6-、7-或8-位的任一位置，并且選自氫、鹵素、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或三氟甲基；R是在喹喔啉母核的2-或3-位的任意取代基并且可以是氫、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。
2. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中有害的作用是青光眼的眼內(nèi)壓升高。
3. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中有害的作用是與青光眼有關(guān)的局部缺血。
4. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中有害的作用是糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
5. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中有害的作用是非青光眼性局部缺血。
6. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中有害的作用的性質(zhì)是微血管病變并且 是選自下列疾病的癥狀，所述疾病包括結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，巨細(xì)胞動(dòng)脈 炎，主動(dòng)脈炎綜合癥和全身性紅斑狼瘡。
7. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物通過口服將化合物全身應(yīng)用 于哺乳動(dòng)物。
8. 權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中施用的化合物的劑量是5-15mg/kg。
9. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物通過應(yīng)用在眼中的球內(nèi)注射 將化合物提供給哺乳動(dòng)物。
10. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物通過應(yīng)用非經(jīng)腸道給藥將化 合物全身應(yīng)用于哺乳動(dòng)物。
11. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物通過應(yīng)用肌內(nèi)注射將化合物 全身應(yīng)用于哺乳動(dòng)物。
12. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式I的化合物于喹喔啉環(huán)的6-位有2-咪唑啉-2-基氨基，y和z均是氫和位于7-位和8-位，和x位 于p全喔啉環(huán)的5-位上。
13.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式I的化合物是<formula>formula see original document page 3</formula>
14.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式I的化合物是
15.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式I的化合物是<formula>formula see original document page 3</formula>其中x如權(quán)利要求1所定義，且有害的作用是眼內(nèi)壓升高。
16.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式l的化合物是<formula>formula see original document page 3</formula>其中x如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用是與青光眼有關(guān)的局部 缺血。
17.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式I的化合物是其中X如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用是糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
18.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式I的化合物是其中x如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用是非青光眼性的局部缺 血。
19.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中式I的化合物是其中x如權(quán)利要求1所定義，并且有害的作用的性質(zhì)是微血管病變并 且選自下組疾病，所述疾病是結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，巨細(xì)胞血管炎，主動(dòng) 脈炎綜合癥和全身性紅斑狼瘡。
全文摘要
公開了下式I化合物在制備用于保護(hù)哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜或視神經(jīng)細(xì)胞以抑制或防止神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡的藥物方面的應(yīng)用，該哺乳動(dòng)物的所說的神經(jīng)細(xì)胞正遭受有害的作用或經(jīng)受有害作用的危險(xiǎn)。式I中2-咪唑啉-2-基氨基基團(tuán)可以在喹喔啉母核的5-或6-位；x、y和z可以在剩余5-、6-、7-或8-位的任何位置并且選自氫、鹵素、低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基或三氟甲基；并且R是在喹喔啉母核的2-或3-位的任意取代基并且可以是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。
文檔編號(hào)A61P27/06GK101683343SQ200910178530
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期1996年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月28日
發(fā)明者E·沃德穆塞, L·A·維勒, R·K·黎 申請(qǐng)人:阿勒根公司