專利名稱：：抗邊緣無漿體msp5蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及單克隆抗體，尤其涉及一種抗邊緣無漿體MSP5蛋白的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及分泌該抗MSP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞林，屬于細胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：無漿體病，舊稱邊蟲病，是由立克次體目(Rickettsiales)、無漿體科(Anaplasmataceae)、無漿體屬的邊緣無漿體(Anaplasmamarginale)、中央無漿體(A.centrale)和綿羊無漿體(A.bovis)等種寄生于紅細胞內(nèi)所引起的血液性原蟲病，主要以吸血類節(jié)肢動物(蜱類、牛虻、廄蠅、蚊子等)傳播，是蜱傳播病中分布最廣的一種(RisticM.Bovineanaplasmosis.ParasiticProtozoa,editedbyKreierJP，1977，(IV):235—249)。1910年和1911年首次在北非發(fā)現(xiàn)了邊緣無漿體和中央無漿體。此后發(fā)現(xiàn)無漿體病在世界各地廣泛流行，其中邊緣無漿體的危害最大，它在急性病程中常引起動物嚴重貧血、體重下降、高燒、流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降，甚至死亡。在我國部分省市也開展了該病的流行病學(xué)調(diào)查，證實了存在不同程度的感染(何德肆，李海輝，歐陽敘向等.湖南省部分地區(qū)牛無漿體病感染情況調(diào)查[J]，中國草食動物，2009，29(1):41-43)。邊緣無漿體具有一個完整的環(huán)形基因組，約1.2-1.6Mb，利用SIGNALP(version3;ref18)軟件預(yù)測出163個含有信號肽的CDSs，由TMPRED(http:〃ch.embnet.org/software/TMPRED)軟件-惟測出每三個CDSs就包含一個跨膜區(qū)。由于PSORT(http:Vpsort.nibb.ac.jp/form.htmL)和PSORTB(http:〃psort.org/psortb/index)各自僅僅能夠預(yù)測出43和13個外膜蛋白(OMPs)，缺少許多已知的無漿體外膜蛋白，所以各個蛋白位置還無法推測(BraytonKA,KappmeyerLS,HerndonDR,etal.CompletegenomesequencingofAnaplasmamarginalerevealsthatthesurfaceiskewedtotwosuperfamiliesofoutermembraneproteins[J].ProcNatlAcadSciUSA.2005，102(3):844-849)。邊緣無漿體MSP1超家族主要由MSP1組成。MSP1是表面暴露的異側(cè)性復(fù)合物，由105ku和lOOku的多肽聚合而成，各自被命名為MSPla和MSPlb(BarbetAF，PalmerGH,MylerPLetal.Characterizationofani醒unoprotectiveproteincomplexofAnaplasmamarginalebycloningandexpressionofthegenecodingforpolypeptideAml05L[J].InfectI腿un.1987，55:2428-2435)。邊緣無漿體MSP2超家族主要包括MSP2、MSP3和MSP4，位于具有表面暴露區(qū)的外膜,MSP2和MSP3是免疫顯性蛋白而且抗原性是可變的，無漿體能夠在牛體內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)感染主要是因為MSP2和MSP3容易發(fā)生變異而逃避宿主免疫反應(yīng)(SimpsonCF.MorphologicalterationsofAnaplasmamarginaleincalvesaftertreatmentwithoxytetracycline[J].AmJVetRes，1975，(36):1443—1446;TettelinH，SaundersNJ,HeidelbergJ，etal.CompletegenomesequenceofNeisseriameningitidisserogroupBstrainMC58[J].Science.2000，287(5459):1809-1815)。邊緣無漿體MSP5是由633bp單拷貝基因編碼19ku的蛋白，在所有無漿體不同種(包括邊緣無漿體，羊無漿體和中央無漿體)之間相當(dāng)保守，適合作為診斷抗原(DuzgunA，SchuntnerCA，WrightIG，etal.AsensitiveEUSAtechniqueforthediagnosisofAnaplasmamarginaleinfections[J].VetParasitol，1988,29:127.)。臨床上應(yīng)用的常恥險查方法是根據(jù)該病的流行病學(xué)、臨床癥狀、尸體剖檢和血涂片檢查等手段進行綜合診斷的。由于本病的流行有三種基本的因素，即病原、硬蜱和易感動物，三者形成一個流行的鏈環(huán)，缺少其中任何一個因素都不可能使本病發(fā)生和流行。所以，在診斷本病時，看本地是否曾有本病流行史，是否有易感動物來自非疫區(qū)，是否有傳播病原的媒介蜱的活動。本病在自然條件下，多發(fā)于夏、秋季。通常當(dāng)每毫升血液有大于109個紅細胞被感染時就會產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，此時能夠通過姬姆薩染色鏡檢方法檢測出來，但當(dāng)每毫升血液中被感染的紅細胞數(shù)小于106個時就不能通過姬姆薩染色鏡檢的方法檢測出來(AguirreDH,BermudezAC,MangoldAJ，etal.NaturalinfectionwithAnaplasmamarginaleincattleoftheHereford,CriollaandNelorebreedsinTucuman,Argentina.Rev.Latinoam.Microbiol.1988,30:37-41)。Ristic(1962)才艮道用吖啶橙染色可大大縮短這一時間，但該方法對未成熟的紅細胞的核酸著色不好(RisticM.Acapillarytube-agglutinationtestsforanaplasmosis-Apreliminaryreport.AmJVetMedAss，1962，(141):588-594)。由于常規(guī)檢查難以及早檢測到本病，也不利于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，為了解決這些矛盾，許多血清學(xué)方法就應(yīng)用到了該病的檢查上。目前常用的血清學(xué)方法有補體結(jié)合試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接熒光抗體試驗以及毛細管凝集試l^,卡片凝集試驗和平板凝集試驗等(GonzalezEF，LongRF，TodorovicR.A.Comparisonsofthecomplement-fixation,indirectfluorescentantibody,andcardagglutinationtestsforthediagnosisofbovinea卿lasmosis.AmJVetRes1978，39(9):1538-41;DuzgunA，SchuntnerCA,WrightIG,etal.AsensitiveEUSAtechniqueforthe5diagnosisofAnaplasmamarginaleinfections.VetParasitol,1988，29(1):l-7jSchindlerK，RisticMandWokatschR.VergleichendeUntersuchungenmitAnaplasmamarginaleandA.centrale.ZTropenmedParasitol,1966，(17):337-360),這些方法在疾病診斷上存在著各種各樣的弊端和缺點，交叉反應(yīng)尤其突出。由此可見，由于邊緣無漿體在體外難于培養(yǎng)，因此給其病原學(xué)研究帶來很大的困難，目前國內(nèi)檢測邊緣無漿體的方法主要是血涂片法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，但是血涂片法容易與附紅細胞體相混淆，難于鑒別，血清學(xué)方法主要是應(yīng)用國外進口的試劑盒進行檢測，價格昂貴，不適合于臨床大規(guī)模使用，分子生物學(xué)方法特異性高、結(jié)果確實，但對實驗條件及操作人員的要求較高，因此多用于實驗室研究，很難進入臨床應(yīng)用階段。酶免疫測定技術(shù)將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高度專一性有機結(jié)合起來，具有靈敏度高、特異性強、對儀器設(shè)備要求不高、成本低、操作簡便快捷、無放射性污染、自動化程度高、試劑保存時間長等優(yōu)點，適用于大批量現(xiàn)地檢測工作，將可能成為極具推廣價值的診斷方法。目前，由于邊緣無漿體病在國內(nèi)的研究剛剛開展，還沒有其單克隆抗體方面的報道，因此在很大程度上限制了單克隆抗體在邊緣無漿體病在臨床診斷中的應(yīng)用，因此研制檢測邊緣無漿體病的ELISA診斷試劑盒對該病的疫情監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查及完善免疫策略等都具有重要意義(周潔，姜驀，張洪英等.犬瘟熱病毒重組核衣殼蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J]，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)才艮，2007，29(7):528-532)。在此過程中，單克隆抗體是不可缺少的工具。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一抹能分別分泌抗邊緣無漿體MSP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞林；本發(fā)明的目的之二是將上述雜交瘤細胞林所分泌的抗邊緣無漿體MSP5蛋白單克隆抗體應(yīng)用于診斷或預(yù)防邊緣無漿體??；本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明采用大腸桿菌表達的邊緣無漿體MSP5蛋白純化后作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾淋巴細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)篩選獲得一桐l定分泌抗MSP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞林。一林能分別分泌抗邊緣無漿體MSP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞林，其分類命名為分泌抗邊緣無漿體MSP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞抹；其微生物保藏號是CGMCCNO.3205;分類命名是分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞；保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2009年7月23日。由該雜交瘤細胞林所分泌的抗邊緣無漿體MSP5蛋白單克隆抗體，命名為1D8。本發(fā)明釆用間接ELISA方法測定了單克隆抗體1D8的效價測定，測定結(jié)果表明，單克隆抗體1D8誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水效價分別為106,細胞上清的效價達到104。亞型鑒定結(jié)果表明，本發(fā)明單克隆抗體lD8的重鏈為IgG2b，輕鏈為K鏈。本發(fā)明采用Westernblot分析了一林單克隆抗體的免疫活性，Westernblot檢測結(jié)果表明，本發(fā)明單克隆抗體lD8能與原核表達的rMSP5蛋白特異性結(jié)合。本發(fā)明單克隆抗體1D8能與邊緣無漿體MSP5發(fā)生反應(yīng)，同時能與牛邊緣無漿體和羊邊^(qū)彖無漿體發(fā)生特異性反應(yīng)，而與霉形體、新孢子蟲及附紅細胞體等不發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明單克隆抗體可用于鑒別邊緣無漿體和其它相關(guān)的病原，為建立一種快速、筒易、準確的診斷方法以及在免疫機制研究、免疫功能檢測、檢測方法的建立等方面的研究提供物質(zhì)^^出圖1本發(fā)明單抗亞類鑒定結(jié)果。圖2Westernblot檢測本發(fā)明單抗的免疫活性結(jié)果。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。細胞、實驗動物和生化試劑(1)重組質(zhì)粒pQE30-MSP5、SP2/0細胞均由本實驗室保存；(2)8周齡實驗用雌性BALB/c小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供；(3)Ni-NTAHis-BindResins購自Amersco公司；標(biāo)準胎牛血清、培養(yǎng)基DMEM購于Gibco公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、選擇性培養(yǎng)基HAT和HT、細胞融合用PEG(MW4000)、單克隆抗體亞型鑒定試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(HRP-IgG)購于Sigma公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司。8實施例l單克隆抗體的制備1、重組蛋白的純化與檢測將誘導(dǎo)后的蛋白rMSP5在5h后收獲菌液，6000rpm.miiT'離心10min,加lOmL的結(jié)合緩沖液。重懸菌液，將樣品置于水浴中超聲波裂解(30°/功率)裂解3s、間隔15s、超聲至液體透明。然后11000rpm'mir^離心20min,去除細胞碎片，將上清液移入新管中。分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE以確定表達的蛋白是否為可溶性蛋白。利用pQE30載體帶有的His-tag選擇性標(biāo)簽,應(yīng)用Novagen公司說明書純化蛋白，具體純化步驟如下1)將3mL無菌去離子水與樹脂混均，待樹脂完全下沉后，將上清吸出。洗兩次。將3ml的結(jié)合液(pH8.0)與樹脂混均，待樹脂完全下沉后，將上清液吸出，洗兩次。2)將3mL裂解液上清與1.5mL樹脂混均，4'C在搖床上振蕩孵育2h或過夜(要保證樹脂懸浮)。3)將鎳柱垂直靜止放置，待樹脂完全下沉后，將上清液吸出。加入3mL的BufferB清洗液(pH8.0)重懸樹脂。待樹脂完全下沉后，將液體從下方流出，重復(fù)兩次。4)然后用3mlBufferC的清洗液(pH6.3)重懸樹脂，待樹脂完全下沉后，將液體從下方流出，重復(fù)三次。5)加入600ul清洗液(pH5.9)重懸樹脂，待樹脂完全下沉后，將液體從下方流出，重復(fù)4次。6)加入500ul洗脫液(PH4.5)重懸樹脂，待樹脂完全下沉后，以2mL.min—1的流速收集液體。并將收集到的管液編號，進行SDS-PAGE分析。試驗結(jié)果純化后蛋白具有較高的純度并且蛋白量沒有明顯的損失。2、小鼠免疫以純化的重組MSP5蛋白作為免疫原，對7周齡、雌性的BALB/c小鼠進行3次免疫。免疫方案如下首免，每只小鼠用50iag的重組MSP5蛋白與等量FCA混合制成乳化劑，頸背部皮下多點和腹腔注射；二免于首免后2周進行，將FCA換成FICA，劑量和方法同上；三免于二免后2周進行，劑量和方法同二免。細胞融合前3天進行加強免疫，方法是腹腔注射IOO|ig純化的重組MSP5蛋白。3、細l包融合融合前2d準備祠養(yǎng)細胞，按照常規(guī)方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中待用。斷頸處死待取脾的小鼠，無菌取其脾細胞，按脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞5zl的比例用PEG進行融合，融合后的細胞鋪于準備好的祠養(yǎng)細胞之上(KohlerG,MilsteinC.Continuousculturesoffusedcellsecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature,1975，256(5517):495-497.)。4、陽性雜交瘤細胞林的篩選及亞克隆取純化的rMSP5，以碳酸鹽緩沖液(O.225MNa2C038mL,0.2MNaHC0317mL,加去離子水至100mL，pH9.6)稀釋至最佳包被濃度；以50|iL/孔加入ELISA板中，37。C，3h;PBST(O.01M,pH7.3,PBS+0.05%Tween-20)洗滌3次，5min/次；加PBST/FCS(0.01M，pH7.3，PBST+磨CS)，200jliL/孔，37。C封閉3h或4。C過夜；PBST洗3次，5min/次，拍干，-20。C或4。C存放備用。通過方陣試驗確定抗原的最佳稀釋倍數(shù)，即將rMSP5融合蛋白包被96孔板，進行方陣試驗，獲得抗原的使用濃度及原核表達蛋白rMSP5免疫鼠陽性血清的稀釋倍數(shù)。同時設(shè)置陰性小鼠血清做為陰性對照。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果選擇抗原的最佳包被濃度。按10常規(guī)間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清。將酶標(biāo)板置于ELISA酶標(biāo)儀上讀值，以P/N》2.l作為陽性判定標(biāo)準。挑選出抗rMSP5的雜交瘤細胞克隆孔。按上述篩選方法，將篩選得到的陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，亞克隆采用有限稀釋法，將原始孔細胞用HT培養(yǎng)基稀釋后重新分96孔細胞板，一個原始孔細胞分一塊板子。亞克隆完成后注意觀察每個孔的細胞個數(shù)及狀態(tài)。取亞克隆后分泌抗體穩(wěn)定并且盡可能是單個克隆的孔進行第二次亞克隆。經(jīng)過三次亞克隆后原先是單克隆的亞克隆板子的檢測結(jié)果的陽性率應(yīng)達到100%。獲得了l林能夠穩(wěn)定分泌特異性針對MSP5蛋白的單克隆抗體(命名為1D8)的雜交瘤細胞抹。5、單克隆抗體的大量制備給10周齡左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟，0.5mL/只，lw后腹腔注射105個雜交瘤細胞，7-10d后當(dāng)小鼠腹部極度膨脹時抽取腹水，隔2d抽一次，將抽取的腹水IO000r/min離心10min,去除上層油脂和沉淀，上清分裝于-20°C或-7Q。C保存。試驗例1單克隆抗體的鑒定1、抗體的效價測定用間接ELISA方法，即將細胞上清或腹水進行倍比稀釋后作為一抗加入包被有抗原的酶標(biāo)板中，并設(shè)置陽性、陰性小鼠血清做對照。以P/N》2.l為陽性判定標(biāo)準，對獲得的陽性細胞林培養(yǎng)上清以及腹水進行抗體效價檢測。檢測結(jié)果見表1和表2,單克隆抗體1D8誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水效價為106,細胞上清的效價達到104。表l單抗腹水效價的測定\^稀103104105io61071081D8i.,8811.7471.5950.5490.1170.053表2單抗上清效價的測定"""^x^稀e"ss_押坊上\^數(shù)清原倍稀釋10102io31041051D81.7351.771.741.5970.7380.132、單克隆抗體亞類鑒定使用捕獲ELISA試劑盒檢測單克隆抗體的亞類(1)將表位特征性抗體IgA，IgGl，IgG2b,IgG2a，IgG3，IgM分別用PBS進行l(wèi):IOOO稀釋，100ul/孔包被，每種特征性抗體包被兩孔，37。C孵育lh。(2)用洗滌液PBST洗滌3次，5min/次。(3)每孔加入100ul待檢測的單抗上清，37。C孵育lh。(4)用洗滌液洗滌3次，5min/次。(5)用PBST將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Fab片段)進行1:IOOO稀釋,每孔100ul，37。C孵育30min。(6)用洗滌液洗滌三次，5min/次。(7)每孔加入新鮮配置的底物溶液IOOul,37。C避光孵育20min。(8)每孔加入50ul2MH2S04終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取OD490的值，以O(shè)D值明顯高于其他各個孔的表位特征性抗體判為其單抗亞類。亞型鑒定結(jié)果見表3和圖1，本發(fā)明單克隆抗體lD8的重鏈為IgG2b,輕鏈為K表3單抗亞類鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3、McAbs免疫活性鑒定Westernblot用于分析單克隆抗體的免疫活性，Westernblot程序如下將純化的重組MSP5蛋白和預(yù)染蛋白Marker進行SDS-PAGE電泳(膠濃度為12%),電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC),剪下每個泳道的重組MSP5蛋白條帶及預(yù)染蛋白Marker條帶(保存?zhèn)溆?，然后將含有重組MSP5蛋白的NC膜條帶放入去離子水中清洗10min，5%脫脂乳室溫封閉1h，封閉后的NC膜條帶分別與1:IOO倍稀釋的由1-D8單抗誘生小鼠產(chǎn)生的腹水以及正常SP2/0細胞的培養(yǎng)上清液37。C作用lh,PBST(0.01mol/L，pH7.2;含O.05。/。的Tween-20)洗滌3次，然后與HRP-羊抗鼠IgG(1:8000)37。C作用lh，PBST洗5次，用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(訓(xùn))底物溶液進行顯色。Westernblot檢測結(jié)果表明，單抗均能與原核表達的rMSP5蛋白特異性結(jié)合(圖2)。權(quán)利要求1、一株分泌抗邊緣無漿體MSP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其微生物保藏號是CGMCCNO.3205。2、由權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞林分泌的單克隆抗體。3、權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備診斷或檢測邊緣無漿體病試劑中的用途。4、權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備預(yù)防或治療邊緣無漿體病藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了抗邊緣無漿體MSP5蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明采用大腸桿菌表達的邊緣無漿體MSP5蛋白純化后作為免疫原，免疫小鼠，經(jīng)細胞融合，篩選得到一株穩(wěn)定分泌抗MSP5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其微生物保藏號為CGMCCNo.3205。由該雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體能與邊緣無漿體MSP5發(fā)生反應(yīng)，同時能與牛邊緣無漿體和羊邊緣無漿體發(fā)生特異性反應(yīng)，而與霉形體、新孢子蟲及附紅細胞體等不發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明單克隆抗體可用于鑒別邊緣無漿體和其它相關(guān)的病原，為建立一種快速、簡易、準確的診斷方法以及在免疫機制研究、免疫功能檢測、檢測方法的建立等方面的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。文檔編號A61P31/04GK101671654SQ20091017848公開日2010年3月17日申請日期2009年10月13日優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日發(fā)明者倪宏波,周玉龍,姜海芳,孫進華,宮大慶,王春仁,辛九慶,錢愛東申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所