專利名稱：非聚集的病毒制劑的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種病毒制劑，在該制劑中聚集被減至最少。
背景技術(shù)：
病毒可用于例如在基因治療中遞送基因。這樣的病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺 伴隨病毒和單純皰疹病毒。例如，W000/28059中公開了遞送功能性胸苷激酶的腺病毒，用 于與治療腦腫瘤及預防其復發(fā)有關的治療中。需要了解的是，對于治療的用途，必須滿足多種的調(diào)節(jié)要求。在生產(chǎn)用于基因治療 的病毒方面需要嚴格的控制，并且病毒制劑的穩(wěn)定性和效價是關鍵的考慮方面。
W000/28059和US6544769公開了甘油作為一種病毒制劑的穩(wěn)定劑。US7235391 公開了甘油作為一種病毒制劑的添加劑，用于在冰凍溫度下或冰凍溫度之上長期保持穩(wěn)定 性。還公開了多種其他添加劑，包括多種膨脹劑、冷凍保護劑、凍干保護劑、緩沖劑等。US6544769公開了 一種含有病毒與蔗糖、甘油、氯化鎂和聚山梨酯80的組合物。這 樣的一種表面活性劑的存在可導致微團產(chǎn)生。該表面活性劑還會溶解蛋白質(zhì)。Tris可被用 作一種緩沖劑。磷酸鹽緩沖系中通常存在離子物質(zhì)例如氯化鎂。生產(chǎn)、純化及保存腺病毒載體的方法會提供多個機會用于發(fā)生病毒蛋白修飾，這 些修飾有可能導致腺病毒聚集并降低生物活性。對于純化的腺病毒，聚集已經(jīng)被報道是濃 度、溫度、PH和保存容器的函數(shù)。常規(guī)的分析方法無法將天然的單體病毒與聚集的顆粒團 區(qū)分開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在表達胸苷激酶的腺病毒中，尤其是如W000/28059 中所述，聚集是一個難題并可導致失去效價，但這是可以避免的。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，一種組合物含有一種病毒、一種多元醇和一種兩性離子 化合物。所述病毒優(yōu)選為一種腺病毒。通常而言，所述腺病毒表達胸苷激酶。所述多元醇 優(yōu)選為甘油。所述兩性化合物優(yōu)選為HEPES。本發(fā)明的組合物可以是非離子的和/或無鹽的。它還可以是無血清的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，一種用于病毒聚集的測定法，包括確定所述病毒顆粒 的粒度，例如其中所述顆粒與一種多元醇混合或者在本發(fā)明的組合物中。該測定法優(yōu)選通 過動態(tài)光散射(DLS)(也被稱為光子相關光譜(PCS))進行，并且使得可以在生產(chǎn)和純化過 程中分析天然形式的病毒顆粒，因此能夠監(jiān)測可能的顆粒聚集形成。
具體實施例方式通常而言，根據(jù)本發(fā)明的組合物可含有如上文參考的現(xiàn)有技術(shù)中描述的類型形式 的化合物或具有上文參考的現(xiàn)有技術(shù)中描述的類型的化合物；這些出版物每篇的內(nèi)容均通 過引用納入本文。
所述病毒可以是野生型病毒或重組病毒。本發(fā)明可利用各種各樣的病毒。這些病 毒包括腺病毒、痘病毒、皰疹病毒和慢病毒。優(yōu)選一種可表達異源基因產(chǎn)物的腺病毒載體類 型。所述基因產(chǎn)物可適合用于治療，例如用于切除腦腫瘤后。如本領域普通技術(shù)人員熟知的，該病毒制品可通過密度分級例如使用鹽梯度得 至IJ。所述病毒還可以用色譜純化方法(例如陰離子交換和分子篩)與切向流過濾(TFF)結(jié) 合進行純化和配制。所述多元醇可在該階段或者在之前加入。已知有多種多元醇，但優(yōu)選甘油。甘油 在制劑中的濃度優(yōu)選至少2重量％或2體積％，更優(yōu)選至少5重量％或5體積％，例如最高 達30重量％或30體積％。
所述組合物優(yōu)選是非離子的?？梢圆患尤臌}。一種糖例如蔗糖可用于本發(fā)明中，但糖的存在不是必須的。蔗糖已知為一種冷凍 防護劑，但它對于防止冷凍時的局部PH影響是重要的。這一點是重要的，因為本發(fā)明的組 合物通常將被凍干并保存于低溫例如-70°C下。除了一種多元醇之外，所述新型制劑的另一組分是一種兩性離子。已知許多這 樣的化合物，它們適合用于意欲作為治療用途的組合物中。優(yōu)選HEPESjp 4-(2_羥乙 基)-1_哌嗪乙烷磺酸，但其他內(nèi)有機胺/酸可能是適合的。該組分的濃度通常為至少ImM， 例如最高達IOmM或20mM。如下實施例用來描述本發(fā)明。實施例1分析制備用于W000/28059中描述的用途的病毒樣品中聚集物的存在情況，這時 使用了一種含有5mM HEPES和20%甘油的pH 7. 8緩沖劑。在粒度分析后冷凍樣品，并在一次凍融后再次進行分析。對于在含20%甘油的終 制劑緩沖劑中配制的純化產(chǎn)物的情況，沒有檢測到樣品粒度譜中的變化。然而，當在一次冰 凍和融化后對所述含聚集病毒的樣品再次評價的時候，檢測到了明顯的粒度譜變化。從所 有其他測試樣品得到了相似的結(jié)果。針對重復凍/融對一個純化批次的粒度譜的影響進行了評價。沒有檢測到聚集 體，甚至在將純化的樣品進行5個冷凍和融化循環(huán)后仍沒有檢測到聚集。實施例2在該實施例中，粒度分布使用Mcomp 380 ZLS粒度確定體系得到。該裝置在粒度 分析中使用 了 DLS(http//www. pssnicomp. com/nicomptheory. htm)將一激光束直接射 向所分析的樣品并從90°角方向測量散射光強度。當激光束遇到存在于所述樣品緩沖劑中 的固體顆粒的時候，會發(fā)生光的散射。在一個具體方向上散射光的強度會隨時間周期性變 化，這是由于分散的顆粒在液體中向周圍移動所致。粒度越小，顆粒在周圍液體中移動的速 度越快，散射光強度的變化越快。顆粒半徑可基于從光強相對于時間譜的波動獲得的數(shù)據(jù) 進行計算。這里，來自Malvern Instruments的ZetasizerNano S粒度確定裝置被用于確 定病毒粒度。該裝置還利用DLS方法進行粒度分析。依據(jù)該裝置的制造商，DLS可確定下 至Inm的粒度，而基于激光衍射的方法可以可靠地確定下至約IOOnm的粒度。在如實施例1中所述的終制劑緩沖劑中制成了多批次腺病毒，包括㈧在 W098/20027中描述的產(chǎn)品和⑶在W000/28059中描述的產(chǎn)品。批次⑶含有切向流過濾(TFF)之前及之后的樣品。這樣做是為了研究CsCl對過程中病毒顆粒穩(wěn)定性和聚集的影 響。取自TFF過程后的樣品中含有的CsCl量一般可忽略不計。對這些批次進行腺病毒聚集的存在情況的分析，目的是評價甘油對腺病毒粒度測量值的影響。樣品中含有氯化銫(CsCl)。在將從超離心管收集的含腺病毒的帶混合并在 5mM HEPES中稀釋5倍后得到這些樣品。為了得到陽性的聚集樣品，將取自純化過程中的樣品在37°C下孵育不同時間0天、2天和7天，但未添加甘油。將甘油加入至所選樣品中，得到20%的終濃度。將等體積的5mMHEPES加入至另一 組HEPES預處理的樣品中。將配制進終制劑緩沖劑(20%甘油，5mM HEPES, pH 7.8)的含病毒的樣品在37°C 下孵育，并且在不進行任何預處理情況下分析。還借助使用多克隆腺病毒抗體(Abcam，Cambridge，UK ;1 100稀釋)的免疫沉 淀制備病毒聚集物。在粒度分析后，將所有樣品冷凍并在-70°C下保存。將在37°C下孵育 7天并使用多克隆抗體免疫沉淀的樣品融化后立即用來確定制劑緩沖劑對樣品粒度分布的影響。應當很清楚的是，樣品緩沖劑組合物可影響所得到的病毒粒度。當所述樣品緩沖 劑含有20%的甘油的時候，所測量的病毒粒度為約200nm，而在TFF之前取得的樣品(無甘 油)中，該粒徑為約llOnm。根據(jù)文獻，一個完整腺病毒顆粒的直徑為約80-90nm。觀察的 病毒粒度和報道的病毒粒度之間的差異(尤其在含甘油的樣品的情況下)可以用樣品緩沖 劑組成的影響來解釋。由于甘油會使樣品緩沖劑更加粘，顆粒在周圍緩沖劑中的運動降低， 這會導致粒度確定不準確?？蓪comp粒度確定裝置設定為假設所分析的樣品被配制于 具有一些預設性質(zhì)的水性緩沖劑中。如果將這些預設的測量參數(shù)改變成對應于含甘油的緩 沖劑的相應參數(shù)，那么可對所得到的結(jié)果重新進行計算，以得到正確的粒度讀數(shù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甘油似乎對觀測的粒度值有影響，但還出現(xiàn)了對腺病毒聚集的阻止。在 于37°C下孵育O天和2天的任何分析樣品中均未檢測到聚集的病毒。在37°C下孵育7天 后，在預處理后立即進行粒度分析的樣品中出現(xiàn)聚集的顆粒。然而在第7天時，配制于終制 劑中的病毒樣品仍未出現(xiàn)可檢測的顆粒聚集體。同時，當在37°C下孵育過程中在樣品緩沖 劑中包含甘油時，沒有可檢測的病毒聚集。將樣品在每個分析時間點后冷凍。當將來自笫 7天的冷凍樣品融化并再次分析的時候，取自TFF之前的該預處理樣品的粒度受到了影響， 而終制劑緩沖劑中的病毒似乎是完整的。加入多克隆腺病毒抗體引起了病毒顆粒聚集。在抗體處理的樣品中腺病毒聚集的 存在可通過透射電子顯微鏡(TEM)進行確證。在未處理的對照樣品中沒有聚集體。然而， 在抗體處理的樣品中檢測到了大的聚集腺病毒簇。在配制于所述終制劑緩沖劑中的任何純化的測試樣品中均不存在聚集體。在預備 實驗過程中發(fā)現(xiàn)，Nicomp 380 ZLS粒度確定系統(tǒng)的檢測極限值為1 X IO11個非聚集病毒顆 粒/ml。這里，Zetasizer Nano S粒度確定裝置被用于粒度分析。該裝置的檢測極限值也 被確證為IX IO11個病毒顆粒/ml。病毒顆粒的聚集會導致信號強度降低。
權(quán)利要求
一種組合物，所述組合物含有一種病毒、一種多元醇和一種兩性離子化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述病毒為一種腺病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述腺病毒可表達胸苷激酶。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述多元醇為甘油。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述兩性離子化合物為HEPES。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的組合物，所述組合物是非離子的。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的組合物，所述組合物是經(jīng)凍干的。
8.一種用于病毒聚集的測定法，所述測定法包括分析一個樣品中病毒顆粒的粒度，其 中所述顆粒與一種多元醇混合；并從所述粒度確定所述樣品是否基本上僅含有可接受的非 聚集顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的測定法，其中所述顆粒在根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的組合物中。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的測定法，其中所述分析通過動態(tài)光散射進行。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項的測定法，其中所述粒度不超過200nm。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的測定法，其中所述粒度不超過lOOnm。
全文摘要
本發(fā)明為一種含有一種病毒、一種多元醇和一種兩性離子化合物的組合物。本發(fā)明還為一種用于病毒聚集的測定法，所述測定法包括分析一個樣品中病毒顆粒的粒度，在所述樣品中所述顆粒與一種多元醇混合；并從所述粒度確定所述樣品是否基本上僅含有可接受的非聚集顆粒。
文檔編號A61K9/19GK101815508SQ200880102567
公開日2010年8月25日 申請日期2008年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月11日
發(fā)明者M·諾凱萊寧, R·肖, S·伊阿-赫特圖阿拉, T·門蒂萊 申請人:Ark治療學有限公司