專利名稱：：等離子體合成的吡咯衍生的聚合物用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護和再連接的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及等離子體合成的吡咯衍生的非生物可降解聚合物用于制備植入物的用途，所述植入物可促進創(chuàng)傷后的神經(jīng)保護和脊髓的再連接。
背景技術(shù)：
：外傷性脊髓損傷(SCI)是與高死亡率有關(guān)的公共健康問題(DrydenDM,SaundersLD,RoweBH,MayLA,YiannakouliasN,SvensonLff,SchopflocherDP,VoaklanderDC.TheepidemiologyoftraumaticspinalcordinjuryinAlberta,Canada.Can.J.Neurol.Sci.2003；30:113-121)，其嚴重的后果會導致殘疾以及長期昂貴的康復治療。SCI除了具有高的社會和經(jīng)濟影響外，據(jù)報道，在美國、加拿大、澳大利亞、意大利和墨西哥，每年會新增1800萬5500萬SCI的病例(WoodruffBA，BaronRC.Adescriptionofnonfatalspinalcordinjuryusingahospital-basedregistry.Am.J.Prev.Med.1994；1010-14；DrydenDM,SaundersLD,RoweBHiMayLA，YiannakouliasN，SvensonLW,SchopflocherDP，VoaklanderDC.TheepidemiologyoftraumaticspinalcordinjuryinAlberta，Canada.Can.J.Neurol.Sci.2003；30113-121；0'-ConnorP.IncidenceandpatternsofspinalcordinjuryinAustralia·Accid·Anal.Prev.2002；34405-415；PagliacciMC，CelaniMG，ZampoliniM，SpizzichinoL，F(xiàn)ranceschiniM，BarattaS，F(xiàn)inaliG，GattaG，PerdonL；GruppoItalianoStudioEpidemiologicoMielolesioni.AnItaliansurveyoftraumaticspinalcordinjury.TheGruppoItalianoStudioEpidemiologicoMielolesionistudy.ArchPhysMedRehabi1.2003；84:1266_1275，PardiniMC.LaepidemiologiadelalesionmedulartraumaticaenelDistritoFederal.PhDthesisoftheSecretariadeSalubridadyAsistencia1998)?；加蠸CI的患者現(xiàn)在已經(jīng)有了用于防止長期體質(zhì)惡化的緩解和康復方案(HouleJD,TesslerA.Repairofchronicspinalcordinjury.ExpNeurol.2003；182247-260)。然而，這些患者需要能恢復其自主功能、減少神經(jīng)疼痛和恢復其行動能力的治療。由于這種疾病的重要性，因此在世界范圍內(nèi)已經(jīng)建立了一些研究機構(gòu)，這些機構(gòu)每年都會花費數(shù)億美元以支持該課題的研究，然而，直至現(xiàn)在還未有有效的治療方案(HouleJD,TesslerA.Repairofchronicspinalcordinjury.ExpNeurol·2003;182:247_260)。損傷的病理生理學現(xiàn)象首先表現(xiàn)在神經(jīng)組織的自毀、再生中斷和創(chuàng)傷周圍位置的愈合上(AldskogiusH,KozlovaEN.Strategiesforrepairofthedeafferentedspinalcord.BrainResBrainResRev.2002;40:301_308)。在急性期，會觀察到局部缺血的過程，對血液微循環(huán)的損傷會導致能量衰竭，從而轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓡蝺r離子(例如K+和Na+)和二價離子(例如Ca2+)的活動所引起的離子調(diào)節(jié)失控及水腫，導致脊髓休克(HulseboschCE.Recentadvancesinpatophysiologyandtreatmentofspinalcordinjury.Adv.Physiol.Educ.2003；26:238_255)。所有這些過程的結(jié)果是非常不利的，其不利于受損組織的創(chuàng)傷處及其周圍組織的愈合過禾呈(BeattieMS,FarooquiAA,BresnahanJC.Reviewofcurrentevidenceforapoptosisafterspinalcordinjury.JNeurotrauma.2000，17:915_925)，在星形神經(jīng)角質(zhì)瘢痕(astroglialscar)的周圍會形成空洞，其會演變成多葉的囊腔(multi-lobedcysticcavity)，該囊腔用作防止軸突再生(axonalregeneration)的物理和化學屏障(HouleJD,TesslerA.Repairofchronicspinalcordinjury.ExpNeurol.2003；182247-260；ProfyrisC，CheemaSS，ZangD，AzariMF，BoyleK，PetratosS.Degenerativeandregenerativemechanismsgoverningspinalcordinjury.NeurobiolDis.2004；15415-436)。數(shù)年來，在患上SCI后已經(jīng)使用了組織和細胞的移植來促進軸突生長、脊髓再生，并因此促進功能恢復(ZompaEA,CainLD，EverhartAW,MoyerMP，HulseboschCE.Transplanttherapy-recoveryoffunctionafterspinalcordinjury.JNeurotrauma.1997；14:479_506；TaokaY，OkajimaK.Spinalcordinjuryintherat.ProgNeurobiol.1998；56:341_358)。已經(jīng)使用胚胎和胎兒的神經(jīng)干細胞和多潛能前體細胞在創(chuàng)傷處進行移植(StokesBT,ReierPJ.Fetalgraftsalterchronicbehavioraloutcomeaftercontusiondamagetotheadultratspinalcord.ExpNeurol.1992，116:1-12，McDonaldJW,LiuXZ,QuY，LiuS，MickeySK,TuretskyD，GottliebDI,ChoiDW.Transplantedembryonicstemcellssurvive,differentiateandpromoterecoveryininjuredratspinalcord.NatMed1999，5:1410-1412)，也進行了胎兒細胞或胎兒脊髓組織的移植(ZompaEA，CainLD，EverhartAW,MoyerMP，HulseboschCE.Transplanttherapy-recoveryoffunctionafterspinalcordinjury.JNeurotrauma.1997，14:479_506，CoumansJV,LinTT，DaiHN，MacArthurL，McAteeM，NashC，BregmanBS.Axonalregenerationandfunctionalrecoveryaftercompletespinalcordtransectioninratsbydelayedtreatmentwithtransplantsandneurotrophins.JNeurosci.200；21:9334_9344)，還進行了外周神經(jīng)細胞和許旺細M(Schwanncell)白勺(MeneiP，Montero-MeneiC，WhittemoreSR,BungeRP,BungeMB.SchwanncellgeneticallymodifiedtosecretehumanBDNFpromoteenhancedaxonalregrowthacrosstransectedadultratspinalcord.EurJNeurosci1998，10:607-621)。為促進髓鞘再形成(remyelinization)，移植少突膠質(zhì)細胞(JefferyND,CrangAJ,O‘LearyMT,HodgeSJ,BlakemoreWF.Behavioralconsequencesofoligodendrocyteprogenitorcelltransplantintoexperimentaldemyelinatinginjuryintheratspinalcord.EurJNeurosci1999;11:1508_1514)，但是因為少突膠質(zhì)細胞會表達軸突生長抑制分子，結(jié)果導致對再生具有負面影響(Tessier-LavigneΜ,GoodmanCS.Perspectives-neurobiology.Regenerationinthenogozone.Science2000287813-814)0另外，已經(jīng)使用了未成熟的或非反應性的星形細胞來促進再生和增加髓鞘再形成并減少膠質(zhì)瘢痕的形成(FranklinRJ,CrangAJ,BlakemoreWF.Transplantedtype-1astrocytesfacilitaterepairofdemyelinatinginjuriesbyhostoligodendrocytesinadultratspinalcord.JNeurocytol1991,20:420-430)。為產(chǎn)生允許再生的環(huán)境，移植了小膠質(zhì)細胞(RabchevskyAG,WeinitzenJM,CoulpierΜ,FagesC，TinelM，JunierMP.Arolefortransforminggrowthfactoralphaasaninducerofastrogliosis.JNeurosci.1998，18:10541_10552)、嗅球的神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Keyvan-FouladiN，LiY，RaismanG·Howdotransplantedolfactoryensheathingcellsrestorefunction？BrainResBrainResRev.2002;40:325_327)，為誘導例如神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin)、神經(jīng)遞質(zhì)、酶、細胞外基質(zhì)分子和表面粘附分子的特異的蛋白合成，即使使用了干細胞，由遺傳工程學家操作或不由其操作，都未在功能恢復上取得良好的結(jié)果(McDonaldJW,LiuXZiQuY，LiuS，MickeySK,TuretskyD，GottliebDIiChoiDW.Transplantedembryonicstemcellssurvive,differentiateandpromoterecoveryininjuredratspinalcord.NatMed1999，5:1410-1412;BaramiKiDiazFG.Cellulartransplantandspinalcordinjury·Neurosurgery·2000:691_700)。盡管有這些治療上的嘗試，但是用于治療SCI的大多數(shù)移植由于不能顯著恢復損失的神經(jīng)功能而已經(jīng)失敗，因此需要開發(fā)使用生物材料的新方法來嘗試修復脊髓。世界上首例報道顯示可使用炭絲植入物(carbonfilamentsimplants)用作大鼠脊髓中受損軸突進行生長的橋。Khan等人將炭絲植入脊髓完全切斷模型處理的大鼠(KhanΤ,DauzvardisΜ,SayersS.Carbonfilamentimplantspromoteaxonalgrowthacrossthetransectedratspinalcord.BrainResl991;541:139-145)，他們觀察到軸突在炭絲上和炭絲之間生長，因此推斷炭絲可用作一個表面以與生長的軸突有利地結(jié)合，以及炭絲可能起機械引導的作用。在1999年，Cao和Shoichet開發(fā)了一種促進軸突再生過程的生物工程學技術(shù)(CaoX,SchoichetMS.Deliveringneuroactivemolecularlesfrombiodegradablemicrospheresforapplicationincentralnervoussystemdisorders.Biomaterials.1999,20:329_339)，該技術(shù)使用了含有神經(jīng)生長因子(NGF)并以卵清蛋白包封的微球，該微球與位于創(chuàng)傷處的生物可降解聚合物連接。在PC12細胞中測定此技術(shù)已確定了釋放的NGF的生物活性。結(jié)果顯示在多至91天內(nèi)，NGF仍然保持有生物活性。合成了生物相容性的水凝膠聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺](PHPMA)，且具有纖維素結(jié)合蛋白的Arg-Gly和Asp細胞粘附區(qū)域，Woerly等人確定了其流變學結(jié)構(gòu)和介電性能(WoerlyS,PinetE,deRobertisL,VanDiepD,BousminaΜ.SpinalcordrepairwithPHPMAhydrogelcontainingRGDpeptides(NeuroGel).Biomaterials.2001；221095-1111)。在斯普拉格-道利鼠(Sprague-Dawleyrats)的脊髓半切除損傷模型中測試該生物材料。將水凝膠植入脊髓內(nèi)。結(jié)果顯示此水凝膠聚合物提供了一個三維結(jié)構(gòu)并連續(xù)穿過損傷區(qū)域，促進細胞的遷移和重組。在微結(jié)構(gòu)中觀察到了血管發(fā)生和軸突生長，并在其上有新組織，以及軸突生長進入了再生脊髓部分中的刺突上的區(qū)域，另外水凝膠的存在減少了壞死和空洞的形成，因此作者指出該聚合物有助于受損脊髓的修復。Oudega等人使用了一種能引導生長的軸突的管狀結(jié)構(gòu)的聚合物，并且將其用作過渡區(qū)域之間的橋的方法(OudegaM,GautierSE,ChaponP.FragosoM,BatesML,ParelJM,BungeMB.AxonalregenerationintoSchwanncellgraftswithinresorbablepoly(alpha-hydroxyacid)guidancechannelsintheadultratspinalcord.Bio-materials.2001，22:1125-1136)?？稍傥盏木酆衔镉删?D，L-乳酸)(PLA50)與一共聚合物(copolymer)制備，所述共聚合物是高分子量的聚(L-乳酸)混合有10%的聚(L_乳酸)(PLA100/10)低聚物的共聚合物，將所述可再吸收的聚合物植入脊髓完全切斷的Fisher屬(Fisherstrain)成年大鼠的神經(jīng)組織中，然后進行4個月的跟蹤研究。結(jié)果顯示，自第2周后，管狀物具有了脊髓神經(jīng)組織和血管。在植入1個月后可發(fā)現(xiàn)許多有髓鞘的軸突。在這篇論文中，其認為在將以PLA100/10聚合物制備的植入物植入脊髓后的2個月會有有髓鞘的神經(jīng)纖維生長于所述植入物中。但是此現(xiàn)象在4個月后明顯減少，因此作者認為需進一步研究以優(yōu)化該技術(shù)。另一種被制造出的用于在SCI后促進再生過程和引導軸突的生長的生物可降解材料是，以聚羥基丁酸酯(PHB)和纖維結(jié)合蛋白藻酸鹽+水凝膠制備的絲。在由Novikov^Aii^fWfF^S^(NovikovLN,NovikovaLN,MosahebiA,ffibergM,TerenghiG,KellerthJO.Anovelbiodegradableimplantforneuronalrescueandregenerationafterspinalcordinjury.Biomaterials.2002;23:3369_3376)，在脊柱LI位置切斷紅核脊髓束，觀察到植入PHB后細胞死亡率降低50%。使用單獨的組分對神經(jīng)元存活率沒有影響。而且，將新生許旺細胞加入PHB移植物，可觀察到軸突在植入物中再生并且遍布神經(jīng)組織，這表明這些生物材料以及許旺細胞可用于支持SCI后的增加的神經(jīng)再生。另一種修復脊髓損傷的方法是使用由聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯-共聚-甲基丙烯酸甲基酯)(P(HEMA-co-MMA))制備的水凝膠管，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中用作潛在的軸突生長引導通道。這些管狀物的特征在于與具有層之間以大孔相互連接的凝膠相似的柔軟性和彈性，通過化學制劑控制(DaltonPD,FlynnL,ShoichetMS.Manufactureofpoly(2-hydroxyethylmethacrylate-co-methylmethacrylate)hydrogeltubesforuseasnerveguidancechannels.Biomaterials.2002,23:3843_3851)。但是，已顯示這些聚合物的降解可引起炎癥反應，雖然其中一些在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是免疫惰性的，特別是免疫抗性的(MarchantRE,AndersonJM，DillinghamE0Invivobiocompatibilitystudies.VII.Inflammatoryresponsetopolyethyleneandtoacytotoxicpolyvinylchloride.JBiomedMaterRes1986,2037~50；GautierSE,OudegaM,FragosoM,ChaponP,PlantGff,BungeMB,ParelJM.Poly(alpha-hydroxyacids)forapplicationinthespinalcord:resorbabilityandbiocompatibilitywithadultratSchwanncellsandspinalcord.JBiomedMaterRes1998，42:642_654)。已報道了對于一些聚合物，軸突與這些化合物的粘連較差，但是Rangappa等人(RangappaN,RomeroA,NelsonKD,EberhartRC,SmithGM.Laminin-coatedpoly(L-lactide)filamentsinducerobustneuritegrowthwhileprovidingdirectionalorientation.JBiomedMaterRes2000，51:625_634)使用了層粘連蛋白基質(zhì)涂覆的網(wǎng)狀物，這樣能增加軸突對基質(zhì)的粘連。另一策略是開發(fā)具有結(jié)合緩釋的包封肽(營養(yǎng)因子、藥物等)能力的生物材料(PecharM,UlbrichK,SubrV,SeymourLff,SchachtEH.Poly(ethyleneglycol)multiblockcopolymerasacarrierofanti-cancerdrugdoxorubicin.BioconjugChem2000，11:131_139)，但是此策略未獲得滿意的結(jié)果。膠原纖維單獨使用或與其他材料組合可用作軸突生長的引導和支持，并誘導再生(Heffner⑶，LumsdenAG，0‘LearyDD.Targetcontrolofcollateralextensionanddirectionalaxongrowthinthemammalianbrain.Science.1990；247:217_220；TongXJ，HiraiK，ShimadaH,MizutaniY，IzumiT，TodaN，YuP.Sciaticnerveregenerationnavigatedbylaminin-fibronectindoublecoatedbiodegradablecollagengraftsinrats.BrainRes1994，663:155-162)。使用生物相容性材料恢復損傷的神經(jīng)組織的進展迅速，開發(fā)用作橋的材料以修復脊髓，然而這些聚合物通常通過化學方法和電化學聚合合成(WangJ，NeohKG，KangET.Comparativestudyofchemicallysynthesisedandplasmapolymerizedpyrroleandthiophenethinfilms.ThinSolidFilms2004,446205-217)，由于已顯示這些聚合物的降解可引起炎癥反應，因此會干擾這些聚合物的有益作用。Schmidt等人說明了為促進降解，使用了吡咯和噻吩片段與柔性的脂肪族酯鏈的混合物和組合合成的生物可降解聚合物(u.S.PatentNo.6，696，575B2，2004)，這些聚合物由于其化學和電性能，被認為可以在組織工程學領(lǐng)域用作供選的治療方法。這些材料是柔性的，且其化學結(jié)構(gòu)使得電子可在鏈間自由運動，從而提高了其導電性質(zhì)。在這篇專利中，作者提示將這些生物材料用于促進脊髓外周神經(jīng)組織以及其他組織(骨、肌肉等)的再生。然而，并沒有證據(jù)支持其這樣的用途。用于合成聚合物的另一方法是使用等離子體(plasma)獲得導電性的聚合物膜。在合成過程期間，單體在氣相中反應，并且在反應中不需要化學介質(zhì)。觀察到使用此方法合成的聚合物的化學結(jié)構(gòu)不同于化學合成的聚合物，其純度更高、粘性更大并且交聯(lián)及擴展性更好(WangJ,NeohKG,KangET.Comparativestudyofchemicallysynthesisedandplasmapolymerizedpyrroleandthiophenethinfilms.ThinSolidFilms2004,446:205-217)。Cruz等人(CruzGJ,MoralesJ,OlayoR.Filmsobtainedbyplasmapolymerizationofpyrrole.ThinSolidFilms1999,342:119-126)報道了吡咯衍生的材料的等離子體合成方法，在其中發(fā)現(xiàn)了碘摻雜(doping)的材料。這些材料不是生物可降解的，因此將其用于神經(jīng)系統(tǒng)會降低炎癥應答，從而使其具有更高的效率，這是因為在一些研究中表明炎癥應答是二次損傷的機理之一，二次損傷可破壞位于創(chuàng)傷周圍的神經(jīng)組織。導電性材料是通過具有交替或共軛的雙鍵的長鏈烴形成的那些材料，這使得其具有金屬的導電性能和塑料的機械性能。其導電性主要是由于加入了某些量的其他化學產(chǎn)品(摻雜)，也是由于能傳導電子流的共軛雙鍵的存在。摻雜技術(shù)涉及加入具有電負性的原子。這些原子可向聚合鍵提供自由電子或除去電子，所述除去電子等同于產(chǎn)生了正電荷。在兩種情況下，聚合物鏈均變得電不穩(wěn)定，并且若應用了電位差，電子會運動通過聚合物(CruzGJ,MoralesJ,OlayoR.FilmsObtainedbyplasmapolymerizationofpyrrole.Thinsolidfilms1999,342:119_126)。雖然將聚合物轉(zhuǎn)變成導體的物理機理還不清楚，但是純度及聚合物鏈的組織看起來具有重要的影響。因此，當修飾了聚合的結(jié)構(gòu)組織時會改善聚合物的導電性。用作導體的聚合物主要由碳和氫原子組成，與任何其他的聚合物相似，碳和氫原子排列于重復的單體單元中。通常這些單元具有例如氮和硫的雜原子。碳原子通過交替設(shè)置的單鍵和雙鍵相互連接(...=C-C=C-C=C-...)，即其表現(xiàn)為超共軛鍵，這是所有導電聚合物的一般特征。由于電子(e_)的移動會形成電的傳導。電子在材料中自由移動是必要的。在固體導體中，電子穿過被稱為層的離散的能態(tài)(來自分子軌道理論(MolecularOrbitalTheory)對整個固體晶體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的延伸)。固體僅在其最外層是半充滿狀態(tài)時(良好的導體或金屬導體)，或雖最外層為空但可從最外層附近激發(fā)時(半導體)，是可以導電的。如果電子從滿帶躍遷至空帶所需能量較大，則其可以被認為是絕緣體(CruzGJ,MoralesJ,OlayoR.FilmsObtainedbyplasmapolymerizationofpyrrole.Thinsolidfilms1999,342:119-126)。聚吡咯(PPy)是帶有正電荷化學結(jié)構(gòu)的導電性聚合物，可向其中加入各種化學物質(zhì)(摻雜劑)以改變其電性質(zhì)。PPy由于其生物相容性，已用作生物傳感器來檢測血糖(Lopez-CrapezE,LivacheT,MarchandJ,GrenierJ.K-rasmutationdetectionbyhybridizationtoapolypyrroleDNAchip.ClinChem2001;47:186-194)。另外，由于其導電性，聚吡咯(PP)具有刺激下列細胞增殖的能力神經(jīng)細胞(KotwalA,SchmidtCE.Electricalstimulationaltersproteinadsorptionandnervecellinteractionswithelectricallyconductingbiomaterials.Biomaterials.2001；221055-1064)、嗜鉻細胞(AokiT，TaninoM，SanuiK，OgataN，KumakuraK.Secretoryfunctionofadrenalchromaffincellsculturedonpolypyrrolefilms.Biomaterials.1996；171971-1974)及內(nèi)皮細胞(GarnerB，GeorgevichA，HodgsonAJ，LiuL，WallaceGG.Polypyrrole-heparincompositesasstimulus-responsivesubstratesforendothelialcellgrowth.JBiomedMaterRes1999,44:121—129)。Schmidt等人表明電剌激可加速在聚吡咯(PP)膜上的PC-12細胞中的軸突生長(neuritegrowth)(SchmidtCE,ShastriVR，VacantiJP，LangerR.Stimulationofneuriteoutgrowthusinganelectricallyconductingpolymer.ProcNatlAcadSciU.S.A.1997；94:8948-8953)。最近的研究表明聚吡咯(PP)在體外(ZhmgZ，RoyR，DugreFJ，TessierD，DaoLH.Invitrobiocompatibilitystudyofelectricallyconductivepolypyrrole-coatedpolyesterfabrics.JBiomedMaterRes2001,57:63_71)禾口體內(nèi)(JiangX，MaroisY，TraoreA，TessierD，DaoLH，GuidoinR,ZhangZ.Tissuereactiontopolypyrrole-coatedpolyesterfabrics:aninvivostudyinrats.TissueEng.2002；8635-647)均有可接受的生物相容性，此結(jié)果給予了將PPy及其衍生物用于某些生物醫(yī)學和組織工程學應用的支持?；谶@些信息，決定將兩種半導體聚合物，聚吡咯與聚乙二醇的共聚合物(PPy/PEG)和碘摻雜的聚吡咯(PPy/I)，用于大鼠脊髓全切斷模型中。發(fā)明_既述聚吡咯/聚乙二醇共聚合物及碘摻雜聚吡咯的合成聚合物在薄膜中合成，此薄膜借助于亮度電休克法(electricshocksofbrilliance)在一帶有不銹鋼凸緣(flange)的直徑為9厘米長為30厘米的玻璃管式反應器中形成。將壓力設(shè)為1.5X10-2托以引發(fā)聚合反應，壓力設(shè)為5X10_2托以延續(xù)化學反應。電場振蕩頻率為13.5MHz。不銹鋼電極直徑為7厘米。其中一個電極接地，其他電極連接至RF信號，它們之間間隔為9厘米。將單體和摻雜劑置于不同的容器中，由于反應器與容器之間的壓力差，將單體和摻雜劑的小蒸汽流引入反應器，并將兩者在反應器中混合。反應物的溫度約為20°C。聚合時間為300分鐘。反應開始在氣相中發(fā)生，隨著聚合物分子量的增加，反應在固相中結(jié)束。起始反應物的結(jié)構(gòu)簡式為C4H5N:8<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>吡咯單體將聚合物用丙酮潤濕并干燥數(shù)個循環(huán)之后，將其從反應器表面分離。在23個循環(huán)之后，以刮鏟機械地回收聚合物，然后將其研磨成片狀物，且將該片狀物用作測試受試者的脊髓植入物。制備碘摻雜的聚吡咯(PPy/I)衍生物和聚吡咯和聚乙二醇共聚合物(PPy/PEG)片狀物作為對比(tablets)。以紅外光譜分析結(jié)構(gòu)圖1A的光譜顯示了3個對應于PPy/PEG共聚合物的復合吸收譜帶。第一個吸收譜帶在400和1200cm—1之間，第二吸收譜帶在1200和2000CHT1之間，第三吸收譜帶在2400和3600CHT1之間。覆蓋在400和1200CHT1之間的寬峰包含許多對應于烯烴的吸收。峰寬表明了分支、交聯(lián)和PPy環(huán)之間的相互作用。最強的峰對應于PPy的共振(vibration)。圖1B顯示了PPy/I樣品的透射光譜，可以看到有兩個共振的復合的寬共振譜帶，這是等離子體合成的聚合物的特征。第一個共振譜帶在2400和SeOOcnT1之間，其他的在500和1800CHT1之間。在3600和2400CHT1之間的區(qū)域表示處于不同結(jié)構(gòu)的N_H、0_H和C-H鍵的吸收，特征的是伯胺在3349CHT1的共振峰，以及飽和脂肪鏈位于2932CHT1的峰。在第二復合吸收譜帶中，對應于伯、仲、叔胺的在1639cm—1的共振是特征的。甲基(C-H)的變形在1452cm—1。在747cm—1，顯示了對應于碳-碳鍵的共振。電性質(zhì)PPy/PEG的電阻為GQ，因此其被認為是一種半導體聚合物。PPy/I的電阻(resistance)為1.3MQ，電阻率(resistivity)為45.94MQ-cm,電導率約為21nS/cm。形態(tài)學圖2A顯示了以掃描電子顯微鏡拍攝的PPy/PEG共聚合物表面的圖像，其中可觀察到均質(zhì)的結(jié)構(gòu)并且該結(jié)構(gòu)外觀為海綿狀。圖2B顯示了對應于PPy/I聚合物的圖像，在表面上可以看到大小約為510ym的材料的小塊。PPy/PEG共聚合物微細地在薄膜中獲得，將聚合物壓成細粉然后壓制形成片狀物。圖1(A)聚吡咯/聚乙二醇共聚合物的紅外光譜；(B)碘摻雜的聚吡咯聚合物的紅外光譜。圖2以掃描電子顯微鏡拍攝的植入生物材料的顯微照片。(A)聚吡咯與聚乙二醇的共聚合物。(B)碘摻雜的聚吡咯。標尺對應于50ym。圖3顯示了以BBB評級(Basso，Beattie和Bresnahan)評估的運動恢復結(jié)果的圖，其從脊髓完全切斷之后的首日(D1)起至4周(S)結(jié)束。圖4脊髓完全切斷并未植入植入物的動物創(chuàng)傷后一個月的脊髓縱切片。(A)創(chuàng)傷區(qū)域及殘留的組織(2.5X)；(B)過渡區(qū)域的放大圖(5X)；(C)創(chuàng)傷區(qū)域細胞結(jié)構(gòu)的缺失9(20X；(D)存在的炎癥細胞(40X)。蘇木素/曙紅技術(shù)。SB:白色物質(zhì)，SG:灰色物質(zhì)，ZL:創(chuàng)傷區(qū)域，CI炎癥細胞。圖5脊髓完全切斷并植入聚吡咯/聚乙二醇共聚合物的動物創(chuàng)傷后一個月的脊髓縱切片。(A)表明植入物整合至神經(jīng)組織的圖片(2.5X)；B)過渡區(qū)域的放大圖(5X)；(C)創(chuàng)傷區(qū)域(20X)；⑶存在的炎癥細胞(40X)。SB白色物質(zhì)，SG灰色物質(zhì)，ZL創(chuàng)傷區(qū)域，CI炎癥細胞。蘇木素/曙紅技術(shù)。SB白色物質(zhì)，SG灰色物質(zhì)，ZL創(chuàng)傷區(qū)域，PPy/PEG聚吡咯和聚乙二醇共聚合物的移植物，MM修飾過的巨噬細胞。圖6脊髓完全切斷并植入鹵素摻雜的聚吡咯的動物創(chuàng)傷后一個月的脊髓縱切片。(A)表明植入物整合至神經(jīng)組織的圖片(2.5X)；B)過渡區(qū)域的放大圖(5X)；(C)創(chuàng)傷區(qū)域(20X)；(D)存在的炎癥細胞(40X)。SB:白色物質(zhì)，SG:灰色物質(zhì)，ZL創(chuàng)傷區(qū)域，CI炎癥細胞。蘇木素/曙紅技術(shù)。SB白色物質(zhì)，SG灰色物質(zhì)，ZL創(chuàng)傷區(qū)域，PPy/I碘摻雜的聚吡咯植入物，CGCE異物巨細胞。圖7表明在研究結(jié)束時動物的總體健康和功能恢復狀況的圖。(A)未植入植入物的對照動物；(B)植入了聚吡咯/聚乙二醇共聚合物的動物，及(C)植入了聚吡咯/碘的動物。具體實施例方式在大鼠脊髓完全切斷模型中評估用作神經(jīng)功能的神經(jīng)保護體和神經(jīng)再生體的等離子體合成的聚合物。組成三個實驗組，每組三只動物，分組如下A)對照組，在第九胸椎處(T9)完全切斷脊髓的動物，B)PPy/PEG組，脊髓完全切斷并植入了PPy/PEG的動物，C)PPy/I組，以上述外科手術(shù)過程處理的并植入了PPy/I片狀物的動物。所有的實驗組每組均有3只大鼠。動物通過每千克體重肌肉注射77.5毫克氯胺酮和12.5毫克的鹽酸賽拉嗪的混合物麻醉。麻醉后清理外科手術(shù)處，在皮膚中切開一縱向切口，然后切開脊椎骨突(spinalapophysis)的椎旁肌肉。從T9-T10中切除兩個脊椎骨突以觀察這些椎骨的層狀結(jié)構(gòu)(laminarprocess)。最后，進行兩個水平的椎板切除術(shù)，將其雙向延伸以形成平面結(jié)構(gòu)。保持腦脊膜(meninges)完整。在椎板切除手術(shù)完成后，在腦脊膜上切開一約5毫米長的縱切口，兩側(cè)切口均以9-0縫合線的單點(singlepoint)縫合(聚酰胺6單絲)，然后完全切斷脊髓，并通過顯微外科牽引鉤(microsurgicalhook)確認沒有神經(jīng)通路仍然連接。在完成通過完全切斷大鼠脊髓的創(chuàng)傷過程后，立即在切斷位置處橫向引入直徑約為3毫米的聚合物片狀物。在植入植入物后，以單點縫合用9-0縫合線縫合腦脊膜。最后，外科切口處縫合2排，肌肉筋膜和皮膚分別用5-0縫合線(聚丙烯單絲)單點和連續(xù)縫合。在手術(shù)后，在單鼠籠中在室溫下觀察動物，飼以市售的食物和水，視情況可以混合濃度為3.2克/100毫升對乙酰氨基酚(將10毫升以水稀釋至2升，以飲用水給藥72小時)，也通過肌肉注射給予250微升/250克重量的芐星青霉素(每單劑量1，200,000國際單位)。聚合物再生作用的評價10為測定生物材料的再生引導作用，在切斷脊髓后的4周，使用BBB評級(Basso，BettieandBresnahan)(BassoDM,BeattieMS,BresnahanJC.GradedhistologicalandlocomotoroutcomesafterspinalcordcontusionusingtheNYUweight-dropdeviceversustransection.ExpNeurol.1996；139244-256)評價動物運動功能的恢復，所述BBB評級如下所述BBB評級級別0未發(fā)現(xiàn)下肢(EP)的主要活動。級別1一個或兩個關(guān)節(jié)，通常是髖關(guān)節(jié)和/或膝關(guān)節(jié)的活動受限(arc<50%)。級別2—個關(guān)節(jié)自由活動(arc>50%)，另一關(guān)節(jié)不能自由活動或可以自由活動。級別3兩個關(guān)節(jié)自由活動。級別4下肢的三個關(guān)節(jié)(髖、膝和踝)活動受限。級別5兩個關(guān)節(jié)活動受限，第三個自由活動。級別6兩個關(guān)節(jié)自由活動，第三個活動受限。級別7下肢的三個關(guān)節(jié)(髖、膝和踝)自由活動。級別8下肢腿部均可節(jié)律性運動(協(xié)調(diào))，但不能支撐重量或者能以足底站立(plantarplacement)但不能支撐重量。級別9在不走動或偶然走動(<0=50%)時以足底站立并支持重量，頻繁地(51%94%)或持續(xù)地(95%100%)以背部支持重量而不能以足底支持重量。級別10偶然走動時以足底支持重量，但前肢(EA)與后肢之間不協(xié)調(diào)。級別11頻繁地或持續(xù)地走動時以足底支持重量，但是前肢與后肢之間不協(xié)調(diào)。級別12頻繁地或持續(xù)地走動時以足底支持重量，前肢與后肢之間偶然是協(xié)調(diào)的。級別13頻繁地或持續(xù)地走動時以足底支持重量，前肢與后肢之間通常是協(xié)調(diào)的。級別14持續(xù)地走動時以足底支持重量，ES和EI之間保持持續(xù)協(xié)調(diào)，并且會有腿的向外或向內(nèi)偏轉(zhuǎn)，主要是在與地面接觸時或離開地面時。也能頻繁地足底走動(plantarstep),EA與EP之間保持持續(xù)協(xié)調(diào)，偶爾背側(cè)走動。級別15持續(xù)地足底走動、且EA與EP之間保持協(xié)調(diào)地走動。。腳趾不能分開或偶爾僅在其向前邁步的時候分開。當與地面接觸時，腿部經(jīng)常與身體平行排列。級別16在行走過程中，EA與EP之間保持協(xié)調(diào)且足底走動。當腿向前邁出時腳趾分開可經(jīng)常發(fā)生。當與地面接觸時，腿部經(jīng)常與身體平行排列，但是當其提腿時會發(fā)生偏轉(zhuǎn)。級別17在行走過程中，EA與EP之間保持協(xié)調(diào)且足底走動。當腿向前邁出時腳趾分開可經(jīng)常發(fā)生。當與地面接觸時，腿部經(jīng)常與身體平行排列，但是當其提腿時仍然保持對齊(不發(fā)生偏轉(zhuǎn))。級別18在行走過程中腳趾保持持續(xù)分開。當與地面接觸時，腿部經(jīng)常與身體平行排列，但是當其提腿時會發(fā)生偏轉(zhuǎn)。級別19在行走過程中，EA與EP之間保持協(xié)調(diào)且足底走動。在運動期間腳趾保持持續(xù)分開。當與地面接觸時，腿部經(jīng)常與身體平行排列。有時或總是搖動尾部。級別20足底走動，協(xié)調(diào)走動，并持續(xù)保持腳趾分開。當與地面接觸并抬腿時，腿部經(jīng)常與身體平行排列，尾部持續(xù)抬起，軀干不穩(wěn)定。級別21與上相似，但是軀干穩(wěn)定。聚合物神經(jīng)保護作用的評價神經(jīng)保護作用及聚合物的整合(polymersintegration)可在創(chuàng)傷一個月后的組織學切片上看到。動物通過心內(nèi)途徑麻醉(perfuse)。在麻醉之后，切出脊髓，以在在創(chuàng)傷的中心區(qū)域向脊柱的尾部和頭部切出獲得1.5厘米的片段。將組織置于固定劑中5天，然后嵌入石蠟。以顯微鏡用薄片切片機制備10微米厚的連續(xù)的縱向切片，從10片切片中選擇獲得4個樣品。將選定的切片通過在45°C下的浮選水浴，將其置于玻璃板上通過Harris法以蘇木素與曙紅染色。統(tǒng)計分析當結(jié)果表現(xiàn)為正態(tài)分布和方差齊性時，使用參數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果。使用重復測量的AN0VA檢測，然后使用鄧奈特檢驗。值取在p<0.05以確定統(tǒng)計顯著性的極限。MM功能評價的結(jié)果在圖3中顯示。在此實驗中觀察到，植入了PPy/PEG的動物的恢復率比對照組高5倍，植入了PPy/I的動物的恢復率也比對照組高10倍(p<0.05)。在兩組接受植入的組中，功能恢復率表明動物具有自主神經(jīng)功能，因為使用BBB評級將觀察到的植入了PPy/PEG的動物評為4級，表明后肢三個關(guān)節(jié)(髖、膝和踝)活動受限，然而植入了PPy/I的動物平均級別為7，表明后肢三個關(guān)節(jié)(髖、膝和踝)發(fā)展到能自由活動。圖中的縮寫分別對應于切片脊髓完全切斷但未植入植入物，切片+聚吡咯(PP)/PEG脊髓完全切斷并植入了聚吡咯和聚乙二醇共聚合物，切片+PPy/I脊髓完全切斷并植入了碘摻雜的聚吡咯。結(jié)果以每組3只動物的平均值士SE表示。結(jié)果以重復測量的AN0VA檢測分析，然后以鄧奈特檢驗分析。*p<0.05。在圖4、5和6中顯示了組織學實驗的結(jié)果。在對照組中，神經(jīng)組織損傷擴大并且觀察到炎癥細胞的存在。在PPy/PEG組中，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織損傷較輕，沒有發(fā)現(xiàn)異物巨細胞，但是存在海綿狀巨噬細胞、炎癥細胞和T淋巴細胞。在PPy/I中，植入的聚合物與脊髓的神經(jīng)組織結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)了炎癥細胞，T淋巴細胞、被稱為異物巨細胞的修飾的巨噬細胞。在圖像中顯示的縮寫是指圖4，(A)創(chuàng)傷區(qū)域和殘留組織(2.5X)；(B)過渡區(qū)域放大圖(5X)；(C)創(chuàng)傷區(qū)域中細胞結(jié)構(gòu)的缺失(20X)；(D)存在的炎癥細胞(40X)。SB:白色物質(zhì)，SG灰色物質(zhì)，ZL損傷區(qū)域，CI炎癥細胞。圖5，(A)植入物整合至神經(jīng)組織的圖像(2.5X)；⑶過渡區(qū)域放大圖(5X)；(C)創(chuàng)傷區(qū)域(20X)；(D)存在的炎癥細胞(40X)。SB白色物質(zhì)，SG灰色物質(zhì)，ZL創(chuàng)傷區(qū)域，CI炎癥細胞。蘇木素/曙紅技術(shù)。SB白色物質(zhì)，SG灰色物質(zhì)，ZL:創(chuàng)傷區(qū)域，PPy/PEG:聚吡咯和聚乙二醇共聚合物移植物，MM:修飾過的巨噬細胞。圖6，(A)植入物整合至神經(jīng)組織的圖像(2.5X)；(B)過渡區(qū)域放大圖(5X)；(C)創(chuàng)傷區(qū)域(20X)；(D)存在的炎癥細胞(40X)。SB:白色物質(zhì)，SG:灰色物質(zhì)，ZL創(chuàng)傷區(qū)域，CI炎癥細胞。蘇木素/曙紅技術(shù)。SB白色物質(zhì)，SG灰色物質(zhì)，ZL損傷區(qū)域，PPy/I碘摻雜的聚吡咯植入物，CGCE異物巨細胞。圖7顯示了每周對動物總體健康狀況的觀察結(jié)果。在這些圖片中，可以觀察到皮膚感染的存在。同樣，在研究性分析中確認了在檢測期間，沒有觀察到呼吸系統(tǒng)和腎感染。最后，此實驗沒有發(fā)現(xiàn)副作用或生物材料排斥反應，生存率為100%。圖中的各組對應于(A)未植入植入物的對照動物；(B)植入了聚吡咯/聚乙二醇共聚合物的動物，及(C)植入了聚吡咯/碘的動物。結(jié)果表明等離子體合成的聚合物可用作脊髓有效的神經(jīng)保護器和神經(jīng)再生器，所述脊髓是完全切斷大鼠脊髓導致的創(chuàng)傷之后的脊髓，并且沒有嚴重的副作用。通過上述說明，認為將等離子體合成的吡咯衍生的聚合物用于制備促進創(chuàng)傷后神經(jīng)保護和神經(jīng)再連接的植入物的用途具有新穎性。同時也將考慮聚吡咯和聚乙二醇共聚合物的等離子體合成方法。因此，本文要求了以上權(quán)利要求。權(quán)利要求等離子體合成的吡咯衍生的聚合物和共聚合物用于制備植入物的用途，所述聚合物和共聚合物是摻雜或不摻雜的、具有任何數(shù)量、外形或幾何形狀的，所述植入物用于促進創(chuàng)傷后的神經(jīng)保護和脊髓再連接。2.聚吡咯和聚乙二醇共聚合物的等離子體合成方法，所述聚合物用于制備促進創(chuàng)傷后神經(jīng)保護和脊髓再連接的植入物。3.權(quán)利要求1或2中所述的聚合物的任一化學衍生物的用途，用于提高用作暫時性的或永久性的植入人體的任意器械的生物相容性。4.權(quán)利要求1或2中所述的聚合物的任一化學衍生物的用途，用于提高用于向人體輸送藥物的任意器械的生物相容性。5.上述任一項權(quán)利要求所述的聚合物的用途，其中可在創(chuàng)傷后的任何時間應用。全文摘要本發(fā)明目的在于證明以聚吡咯和聚乙二醇共聚合物和碘摻雜的以等離子體合成的吡咯聚合物制備的半導體非生物可降解植入物具有創(chuàng)傷后神經(jīng)保護作用，并可誘導脊髓的重新連接；在涉及大鼠脊髓完全切斷模型中證明該作用；功能評價的結(jié)果證明植入了聚吡咯-聚乙二醇共聚合物的動物與僅對脊髓進行完全切斷的對照組相比，其恢復率高5倍；另外，植入了碘摻雜的聚吡咯的組與對照組相比，恢復率高10倍；在植入和未植入植入物的三個實驗組的組織學研究中，鑒別了創(chuàng)傷處的各種炎癥和免疫細胞，發(fā)現(xiàn)了脊髓神經(jīng)組織中的聚合物的整合；最后，在任何動物中均未發(fā)現(xiàn)呼吸系統(tǒng)、腎臟或皮膚感染、副作用或生物材料的排斥反應。文檔編號A61L31/06GK101821814SQ200780100078公開日2010年9月1日申請日期2007年6月1日優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日發(fā)明者吉列爾莫·J·克魯茲克魯茲,安娜·L·阿爾瓦雷斯梅吉亞,瑪麗亞·D·L·A·A·迪亞斯魯伊斯,瑪麗亞·G·奧拉尤岡薩雷斯,羅伯托·奧拉尤岡薩雷斯,羅德里戈·蒙德拉貢洛扎諾,胡安·C·A·莫拉萊斯瓜達拉馬,胡安·莫拉萊斯科羅納,赫梅林達·薩爾加多塞巴洛斯,路易斯·C·里奧斯卡斯塔涅達申請人:首都自治大學;曼努埃爾貝拉斯科蘇亞雷斯國家神經(jīng)學與神經(jīng)外科研究院;墨西哥社會保障研究院;國家核研究院