專利名稱：制備聚乙二醇碳酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備聚乙二醇碳酸酯的方法。
背景技術(shù)：
與聚氧化烯(如聚乙二醇)共軛的生物活性化合物可提供化合物
增強(qiáng)的生物相容性，參見如USP 5,366,735和USP 6,280,745。 Zalipsky 在Bioconjugate Chem.， 1995, 6， 150-165頁(yè)上對(duì)該研究主題的綜述指 出，為了制備具有改良性質(zhì)(如相容溶解特性、降低的毒性、改良的 表面相容性、增長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間和降低的免疫原性)的共軛體，聚乙二 醇是與生物活性化合物(如藥物、蛋白質(zhì)、肽或酶)共軛的最好的生 物相容聚合物之一。
聚乙二醇(PEG)為以羥基封端的線性聚氧化烯， 一般以通式 HO(CH2CH20)nH表不。如Henmanson在Bioconjugate Techniques (1996)的第15章中所論述，經(jīng)常使用一般由通式CH30(CH2CH20)nH 表示的單甲基聚乙二醇(mPEG)，通常通過(guò)生物活性化合物與如 mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯的mPEG衍生物的偶聯(lián)反應(yīng)，以制備與生物活 性化合物共軛的聚乙二醇。在該技術(shù)領(lǐng)域?qū)⑴cPEG偶聯(lián)的生物活性 化合物稱作被"PEG化"。
如Seely和Richey在以全文引用方式并入本文的J. of Chrom. A， 908 (2001) 235-241中所論述，PEG化的生物藥物試劑的血清半衰期 隨PEG鏈的分子量的增大而增長(zhǎng)。增加PEG衍生試劑的分子量的一 種方法為形成"多臂"PEG衍生物。多臂PEG衍生物包含多個(gè)PEG 鏈，從而增加該多臂PEG衍生物的分子量。多臂PEG衍生物可為多 功育^ (如以全文引用方式并入本文的Seely和Richey， WO 97/32607 和USPAP 2003/0065134所論述)或單功能(如以全文引用方式并入 本文的美國(guó)專利5,919,455和5,932,462所論述)。
在USP 5286637、Fortier等人在Applied Biochemistry (1993) 17(1),115-130以及Veronese等人在Applied Biochem. Biotech. 11, 141-152 (1985)提出了制備如mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯的mPEG碳酸酯的現(xiàn)有技 術(shù)方法。USP 5286637基于mPEG在含有三乙胺的二氯甲烷溶劑中與 對(duì)硝基苯氯甲酸酯的反應(yīng)。Fortier等人使用吡啶代替三乙胺。Veronese 等人使用乙腈代替二氯甲垸。當(dāng)mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯的濃度相對(duì)較 高時(shí)，所有這些制備mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯的現(xiàn)有技術(shù)方法還會(huì)產(chǎn)生 雜質(zhì)(認(rèn)為該雜質(zhì)為水解的mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯的銨鹽)，該雜質(zhì) 難以從mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯中分離出來(lái)。因此，需要一種在相對(duì)較 高濃度下制備mPEG碳酸酯(如mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯)的改良方 法，同時(shí)該改良方法產(chǎn)生較少雜質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備聚烷撐二醇碳酸酯，優(yōu)選為聚乙二醇碳酸酯 的方法，該方法產(chǎn)生較少的上述種類的雜質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明提 供一種包含聚垸撐二醇(優(yōu)選為PEG)與選自碳酸酯或氯甲酸酯的試 劑在芳香溶劑和胺存在下進(jìn)行反應(yīng)的方法，其中聚垸撐二醇包含至少 一個(gè)羥基。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種制備線性 (優(yōu)選為烷基封端的)聚烷撐二醇碳酸酯(優(yōu)選為烷基聚乙二醇碳酸 酯)的方法，所述方法包含單烷基聚垸撐二醇(優(yōu)選為單烷基PEG) 與選自碳酸酯或氯甲酸酯的試劑在芳香溶劑和胺存在下進(jìn)行反應(yīng)的 步驟。在一個(gè)相關(guān)的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備多臂聚 烷撐二醇碳酸酯(優(yōu)選為多臂PEG碳酸酯)的方法，所述方法包含 多臂聚垸撐二醇(優(yōu)選為多臂PEG)與選自碳酸酯或氯甲酸酯的試劑 在芳香溶劑和胺存在下進(jìn)行反應(yīng)的步驟，其中多臂聚垸撐二醇含有至 少一個(gè)羥基。
具體實(shí)施例方式
優(yōu)選地，本發(fā)明使用的胺具有通式R3N，其中R獨(dú)立地在每個(gè)情 況下為包含兩個(gè)或兩個(gè)以上碳原子的有機(jī)基團(tuán)。R可為僅含有碳原子 和氫原子的烴，或者為含有雜原子的單元。R基團(tuán)可包含線性、分支、 飽和或不飽和的環(huán)狀或多環(huán)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，R為脂族或芳香烴，最優(yōu)選為垸基。R獨(dú)立地在每個(gè)情況下優(yōu)選包含少于十個(gè)碳原子。高度優(yōu) 選的胺為三戊胺。
試劑可為任何可與聚垸撐二醇上的羥基反應(yīng)生成碳酸酯基的碳 酸酯或氯甲酸酯試劑。優(yōu)選使用氯甲酸酯。氯甲酸酯優(yōu)選為芳基氯甲 酸酯，更優(yōu)選為苯基氯甲酸酯，最優(yōu)選為對(duì)硝基苯氯甲酸酯。
術(shù)語(yǔ)"芳香溶劑"指包含不飽和環(huán)基團(tuán)的溶劑，其中不飽和環(huán)基團(tuán) 含有一個(gè)或多個(gè)的環(huán)。高度優(yōu)選的芳香溶劑為甲苯。
根據(jù)優(yōu)選的具體實(shí)施方案，其中聚烷撐二醇為線性和烷基封端， 聚垸撐二醇化合物可由通式
Ri-(0-R、-OH表示，其中W為烴基，優(yōu)選為烷基，該烷基更優(yōu) 選含有至少l個(gè)碳原子，再優(yōu)選含有不超過(guò)7個(gè)碳原子，還優(yōu)選含有 l或2個(gè)碳原子；Fe為烴基，優(yōu)選為亞垸基，該亞烷基更優(yōu)選含有至 少1個(gè)碳原子，再優(yōu)選含有不超過(guò)5個(gè)碳原子。R'最優(yōu)選為甲基， R"最優(yōu)選為亞乙基。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案，聚烷撐二醇(PAG)為"多 臂"的。這里所用的多臂聚烷撐二醇含有一個(gè)普通的核以及一個(gè)或多 個(gè)羥基，所述羥基位于PAG的鏈端，或位于除了PAG鏈端之外的一 處或多處，前提是若PAG為線性，則PAG鏈含有至少兩個(gè)羥基。優(yōu) 選的聚烷撐二醇為多臂聚乙二醇碳酸酯，該多臂聚乙二醇碳酸酯可為 單官能(包含一個(gè)碳酸酯基)或多官能(包含超過(guò)一個(gè)碳酸酯基)。
任選地，在加入氯甲酸酯和胺之前可通過(guò)共沸蒸餾混合和干燥單 烷基聚乙二醇和芳香溶劑。優(yōu)選地，反應(yīng)在25至75攝氏度的溫度下 進(jìn)行。最優(yōu)選地，反應(yīng)在50至60攝氏度的溫度下進(jìn)行，且氯甲酸酯 為對(duì)硝基苯氯甲酸酯。氯甲酸酯與聚烷撐二醇的摩爾比優(yōu)選為至少 5:1，更優(yōu)選為至少8:1;且優(yōu)選不超過(guò)20:1，更優(yōu)選不超過(guò)12:1。胺 與單垸基聚乙二醇的摩爾比優(yōu)選為至少2.5:1，更優(yōu)選為至少4:1;且 優(yōu)選不超過(guò)10:1，更優(yōu)選不超過(guò)6:1。每千克單烷基聚乙二醇所使用 的溶劑量?jī)?yōu)選為至少2升，更優(yōu)選為至少4升；且優(yōu)選不超過(guò)10升， 更優(yōu)選不超過(guò)6升。
聚垸撐二醇的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選為至少約500，更優(yōu)選為至少約1000，最優(yōu)選為至少約5000。所述數(shù)均分子量?jī)?yōu)選不大于約100,000， 更優(yōu)選不大于約60，000。
本發(fā)明的線性烷基聚垸撐二醇碳酸酯組合物的優(yōu)選的特征在于 低的多分散性和相對(duì)較高的確定分子量，其中多分散性和分子量由尺 寸排阻色譜法確定。低的多分散性指小于U的多分散性。所述烷基 聚乙二醇碳酸酯的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選為至少約500，更優(yōu)選為至少約 1000，最優(yōu)選為至少約5000。所述數(shù)均分子量?jī)?yōu)選不大于約100,000， 更優(yōu)選不大于約60，000?？蛇x擇特定的分子量以適用于需要所述組合 物的特定生物醫(yī)藥用途，例如分子量為10,000、 20,000、 30,000或 40,000。
聚烷撐二醇碳酸酯(為方便，整個(gè)說(shuō)明書中的聚烷撐二醇碳酸酯 特指但不限于優(yōu)選的甲基PEG碳酸酯或mPEG碳酸酯)優(yōu)選地通過(guò) 下述步驟分離冷卻混合物并加入反溶劑(如MTBE的醚，或如己 烷或庚烷的垸烴)沉淀出產(chǎn)物，過(guò)濾該沉淀并用新鮮反溶劑洗滌。 mPEG碳酸酯隨后優(yōu)選地通過(guò)下述步驟提純將mPEG碳酸酯在溶劑 中(如甲醇或四氫呋喃)再溶解并加入反溶劑(如異丙醇，以及如 MTBE的醚，或如己烷或庚烷的烷烴)沉淀出產(chǎn)物，過(guò)濾該沉淀并用 新鮮反溶劑洗滌。mPEG碳酸酯隨后可在25至35攝氏度的真空烘箱 中干燥。優(yōu)選通過(guò)質(zhì)子核磁共振和臨界條件的液相色譜分析所述產(chǎn) 物。
實(shí)施例1
將1千克平均分子量為20,000克每摩爾的多分散性小于1.1的 mPEG和6升甲苯加入具有底部泄流和熱電偶套管的20升直壁夾套 反應(yīng)器(該反應(yīng)器裝有頂部攪拌器、冷水冷凝器和氮?dú)膺M(jìn)口)。以250 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌所得溶液并加熱至60°C，隨后加入73毫升三戊胺和 101克對(duì)硝基苯氯甲酸酯。溶液立即產(chǎn)生黃色，但該黃色迅速消失。 反應(yīng)在60°C惰性氣氛下攪拌直至臨界條件的HPLC分析表明反應(yīng)基 本完全。反應(yīng)在加熱約18至24小時(shí)后冷卻至35°C，在增強(qiáng)的攪拌 下(轉(zhuǎn)速為350 rpm)迅速加入全部甲基叔丁基醚(MTBE， 10升， 10毫升每克的mPEG-OH)。將得到的濃稠漿料冷卻至0°C并攪拌30分鐘，然后在燒結(jié)玻璃漏斗上通過(guò)真空過(guò)濾分離出固體。用冰冷
MTBE (2.0升，2毫升每克的mPEG-OH)沖洗反應(yīng)燒瓶，并用該沖 洗液洗滌分離出的固體。在吸氣器真空下保留固體直至沒有明顯的更 多的濾液。半干燥的固體隨后轉(zhuǎn)移回20升反應(yīng)器中，加入甲醇 (MeOH， 2.2升，2.2毫升每克的mPEG-OH)，所述甲醇包括分離漏 斗中的100毫升MeOH沖洗液。輕微攪拌(200 rpm)所得混合物， 并在惰性氣氛下加熱至40°C直至得到均勻溶液(注意若該溶液保 持渾濁，優(yōu)選再次過(guò)濾該溶液)。在1小時(shí)內(nèi)加入異丙醇(IPA， 13.8 升，13.8毫升每克的mPEG-OH)，固體開始從溶液中沉淀出來(lái)。隨 后冷卻該混合物至0°C。將得到的濃稠漿料攪拌60分鐘，然后在燒 結(jié)玻璃漏斗上通過(guò)真空過(guò)濾分離出固體。用冷的IPA (6.3升，6.3毫 升每克的mPEG-OH)沖洗反應(yīng)燒瓶，并用該沖洗液洗滌分離出的固 體。在吸氣器真空下保留固體直至沒有明顯的更多的濾液。將半干燥 的固體溶解在甲醇中，并再進(jìn)行兩次上述的從MeOH/IPA中的沉淀。 最終的濕濾餅在40°C下高真空干燥48小時(shí)，得到約850克白色至微 黃的固體產(chǎn)物。利用臨界條件的高效液相色譜和質(zhì)子核磁共振分析所 得產(chǎn)物。
實(shí)施例2
將700克平均分子量為10,000克每摩爾的多分散性小于1.1的 mPEG和4升甲苯加入具有底部泄流和熱電偶套管的20升直壁夾套 反應(yīng)器(該反應(yīng)器裝有頂部攪拌器、冷水冷凝器和氮?dú)膺M(jìn)口 )。以250 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌所得溶液并加熱至60。C，隨后加入100毫升三戊胺和 140克對(duì)硝基苯氯甲酸酯。溶液立即產(chǎn)生黃色，但該黃色迅速消失。 反應(yīng)在60。C惰性氣氛下攪拌直至臨界條件的HPLC分析表明反應(yīng)基 本完全。反應(yīng)在加熱約18至24小時(shí)后冷卻至35°C，在增強(qiáng)的攪拌 下(轉(zhuǎn)速為350rpm)迅速加入全部甲基叔丁基醚(MTBE， 7升，10 毫升每克的mPEG-OH)。將得到的濃稠漿料冷卻至0°C并攪拌30分 鐘，然后在燒結(jié)玻璃漏斗上通過(guò)真空過(guò)濾分離出固體。用冰冷MTBE (1.4升，2毫升每克的mPEG-OH)沖洗反應(yīng)燒瓶，并用該沖洗液洗 滌分離出的固體。在吸氣器真空下保留固體直至沒有明顯的更多的濾液。半干燥的固體隨后轉(zhuǎn)移回20升反應(yīng)器中，加入甲醇(MeOH， 1.4升，2.2毫升每克的mPEG-OH)，所述甲醇包括分離漏斗中的100 毫升MeOH沖洗液。輕微攪拌(200 rpm)所得混合物，并在惰性氣 氛下加熱至40°C直至得到均勻溶液(注意若該溶液保持渾濁，優(yōu) 選再次過(guò)濾該溶液)。在l小時(shí)內(nèi)加入異丙醇(IPA， 9.6升，13.8毫 升每克的mPEG-OH)，固體開始從溶液中沉淀出來(lái)。隨后冷卻該混 合物至0°C。將得到的濃稠漿料攪拌60分鐘，然后在燒結(jié)玻璃漏斗 上通過(guò)真空過(guò)濾分離出固體。用冷的IPA (4.4升，6.3毫升每克的 mPEG-OH)沖洗反應(yīng)燒瓶，并用該沖洗液洗滌分離出的固體。在吸 氣器真空下保留固體直至沒有明顯的更多的濾液。將半干燥的固體溶 解在甲醇中，并再進(jìn)行兩次上述的從MeOH/IPA中的沉淀。最終的濕 濾餅在40°C下高真空干燥48小時(shí)，得到約666克白色至微黃的固體 產(chǎn)物。利用臨界條件的高效液相色譜和質(zhì)子核磁共振分析所得產(chǎn)物。 臨界條件液相色譜的條件
高壓液相色譜裝置裝有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和設(shè)定在270納米的 紫外檢測(cè)器。色譜柱為Zorbax 330 SB (4/6x150毫米，5微米孔徑) 并保持在29攝氏度。洗脫液為(A)體積比為40/60的乙腈/水，以 及(B)體積比為50/50的乙腈/水。
可使用的適當(dāng)裝置包括Agilent 1100系列液相色譜G1311A四 元泵；G1322A真空脫氣機(jī)；G1313A ALS自動(dòng)進(jìn)樣器；G1313A COLCOM柱恒溫器；G1314A可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。Alltech 2000蒸發(fā)光 散射檢測(cè)器。
29攝氏度的Zorbax 300SB-C18柱4.6x150毫米，5微米孔徑。 0.75毫升/分鐘的洗脫液流速。 5微升的進(jìn)樣量。
270納米的紫外檢測(cè)，峰寬大于0.1分鐘，2秒的響應(yīng)時(shí)間，1000 mAu的衰減。
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器3.0毫升/分鐘的氮?dú)饬髁浚?10。C的管溫， 增益(gain)為1，撞擊器關(guān)閉。
軟^f牛Agilent LC Chemstation Revision A.09.01洗脫液(A)體積比為40/60的乙腈/水；(B)體積比為50/50 的乙腈/水。
通過(guò)以一定比例結(jié)合洗脫液(A)和(B)確定臨界條件，以使 分子量為6000和36,000的PEG 二醇具有相同的保留時(shí)間。
樣品制備以50毫克/1克將干燥的PEG樣品溶解于洗脫液A中。 以80毫克/1克將PEG在MTBE中的濕濾餅溶解于洗脫液A中。 以150毫克/1克將PEG在IPA中的濕濾餅溶解于洗脫液A中。 結(jié)論
盡管已經(jīng)參考其優(yōu)選的具體實(shí)施方案描述本發(fā)明，但在本文的實(shí) 質(zhì)和范圍內(nèi)可進(jìn)行修改。因此，該申請(qǐng)用于涵蓋使用本文公開的基本 原理而對(duì)本發(fā)明所做的任何改變、應(yīng)用或改編。此外，本申請(qǐng)用于涵 蓋在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域已知或常規(guī)的實(shí)踐范圍內(nèi)，并且落入所附權(quán) 利要求限定范圍內(nèi)的對(duì)本文公開內(nèi)容的偏離。
權(quán)利要求
1、一種制備聚烷撐二醇碳酸酯的方法，該方法包含羥基功能化的聚烷撐二醇與選自碳酸酯或氯甲酸酯的試劑在芳香試劑和胺存在下進(jìn)行反應(yīng)的步驟。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中聚烷撐二醇碳酸酯為線性，且該聚垸撐二醇碳酸酯的一端由垸基封端，另一端由碳酸酯封端。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中聚烷撐二醇為甲基聚乙二醇。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中聚烷撐二醇碳酸酯為多臂聚 烷撐二醇碳酸酯。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中聚烷撐二醇為聚乙二醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中試劑為芳基氯甲 酸酯。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中試劑為苯基氯甲酸酯。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中試劑為對(duì)硝基苯氯甲酸酯。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法，其中胺具有通式R3N， 其中R獨(dú)立地在每個(gè)情況下為包含兩個(gè)或兩個(gè)以上碳原子的有機(jī)基 團(tuán)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中R獨(dú)立地在每個(gè)情況下為 烴基。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中R為烷基。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法，其中反應(yīng)在25至 75攝氏度的溫度下進(jìn)行。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中對(duì)硝基苯氯甲酸酯與聚烷 撐二醇的摩爾比介于5:1至20:1。
14、 根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的方法，其中胺與聚烷撐二 醇的摩爾比介于2.5:1至10:1。
15、 根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的方法，其中每千克聚烷撐 二醇使用2至10升的芳香溶劑。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法，其中芳香溶劑為甲 苯，胺為三戊胺。
17、 根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)所述的方法，其中試劑與聚垸撐 二醇的摩爾比介于8:1至12:1 ，胺與聚烷撐二醇的摩爾比介于4:1至6:1 ， 每千克聚垸撐二醇使用4至6升的甲苯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備烷基聚乙二醇碳酸酯的方法，該方法包含如平均分子量為20,000克每摩爾及多分散性小于1.1的單烷基聚乙二醇(mPEG)的mPEG、如對(duì)硝基苯氯甲酸酯的氯甲酸酯、如甲苯的芳香溶劑和如三戊胺的胺進(jìn)行反應(yīng)的步驟。本發(fā)明還涉及一種通過(guò)具有至少一個(gè)羥基的多臂聚乙二醇、氯甲酸酯、芳香溶劑和胺進(jìn)行反應(yīng)的步驟制備多臂聚乙二醇碳酸酯的方法。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101500614SQ200780007079
公開日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2007年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者D·E·維拉爾 申請(qǐng)人:雷迪實(shí)驗(yàn)室(歐洲)有限公司