專利名稱：(e)-1-(2,4-二羥基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羥基苯基)丙烯-2-酮-1在藥 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領域，涉及天然化合物在制備抗腫瘤藥，骨質疏松，老年癡呆藥物方面的應用。
背景技術：
雌激素是一種由內分泌系統(tǒng)產生的類固醇類激素，它在生殖系統(tǒng)、骨組織、心血管、免 疫系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用[J Cell Sci, 2003; 116 (4): 585-586]。雌激素信 號傳遞系統(tǒng)在調節(jié)細胞生長、分化和凋亡過程中都起到很大的作用。雌激素依賴型腫瘤，如 乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜癌等的發(fā)生和發(fā)展都與雌激素有著密切的關系[J Steroid Biochem. Mol. Biol" 2002, 81 (1): 1-24, J Mammary Gland Biol. Neoplasia, 1998, 3(1): 49-61, Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord; 2001, 1 (1): 1-12, Cancer Res., 1998， 58(23): 5367-5373, J Psychiatry Neurosci, 2002;27(1): 1-27]，因此對雌激素受體的研究具有指導抗雌激素和雌激素 受體拮抗劑等藥物的開發(fā)和應用和指導對雌激素依賴型腫瘤等疾病的治療的重要意義[Nat. Rev. Drug Discov., 2004, 3 (11): 950-964]。
目前已知的雌激素受體分為a 、e兩種亞型。雌激素受體a在1958年被Toft和Gorski 等人[Proc. Natl. Acad. Sci. 1966, 55 (6): 1574-1581]率先從老鼠子宮細胞中分離得到，
1986年Green [Nature, 1986, 320 (6058): 134-139]和Greene [Science,1986, 231 (4742): 1150-1154]等人克隆得到第一個分子量為66kDa的人雌激素受體ERa ; 1996年，Kuiper等 [Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93 (12): 5925-5930]從大鼠前列腺中克隆得到另一種雌激素 受體ERP 。此后，Mosselman等人[FEBS Lett. 1996, 392 (1): 49-53]從人睪丸組織中克隆得到 不完整的人ER e ; Ogawa[Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 243 (1): 122-126]和Moore等 人[Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 247 (1):乃-78]相繼克隆得到完整的人ER P 。雌激 素受體ERa與ERP亞型具有類似的序列組成[FEBS Lett. 2003, 546: 17-24, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31: 56-59];它們都由三個獨立但又相互作用的功能區(qū)組成位于N端的A/B區(qū)， 中間的C區(qū)，以及C端的D/E/F區(qū)。N端的A/B區(qū)是一個不依賴于配體的轉錄活化區(qū)(AF-1)， 負責與共活化因子的結合以及轉錄激活相關的靶基因(圖1)。 C區(qū)是DNA結合區(qū)，含有兩個鋅 指結構，對于分子的二聚化以及和特定DNA序列的結合至關重要。C端的D/E/F區(qū)是一個配 體結合區(qū)，由它介導配體的結合，受體的二聚化，核定位，以及配體依賴的轉錄活化功能 (AF-2)。
根據(jù)傳統(tǒng)理論，雌激素通過與細胞漿或核內的雌激素受體(ER)結合并通過調節(jié)基因轉 錄而發(fā)揮生物功能。近十年來對雌激素信號通路又有了許多新的認識雌激素信號轉導途徑 包括細胞核途徑(經(jīng)典途徑)和細胞膜途徑(非經(jīng)典途徑)。因此雌激素的生物效應，并不完 全依賴于配體-受體的細胞核激活途徑，還可通過其他信號通路發(fā)揮作用。非經(jīng)典雌激素信號 通路在不同細胞產生的效應各異，例如17 {3雌二醇(E2 e )可通過膜信號通路及P38激酶和 PI3K激酶調節(jié)心肌細胞調亡，從而對心血管系統(tǒng)具有保護作用[Curr. Treat. Options Cardiovasc. Med. 2001, 3 (1): 67-79];此外，細胞內幾個重要的信號傳導通路如G-蛋白信號通路、磷脂酶 C，腺苷酸環(huán)化酶及MAPK等信號傳導通路都和非經(jīng)典的雌激素膜信號通路有相互作用[Trends in Endocrinol. Metabol., 2002, 13, 349-354]。人們廣泛認為血清中的高水平雌激素通過經(jīng)典及 非經(jīng)典雌激素信號傳導途徑刺激腺管上皮細胞的持續(xù)增生，從而參與雌激素依賴型腫瘤，如 乳腺腫瘤、子宮內膜癌及卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。然而非經(jīng)典雌激素膜信號通路的作用目前尚 不清楚。
Flouriot等[EMBO, 2001, 19: 4688-4700]的研究發(fā)現(xiàn)除了全長的ER-a 66外還有一個 缺失了第一個外顯子所編碼的173個氨基酸的ER-a同源異構體。這個新發(fā)現(xiàn)的分子量為 46kDa的ER-a 同源異構體被稱為ER-a 46 ，而較早發(fā)現(xiàn)的分子量為66kDa的 ER-a [Nature, 1986, 320 (6058): 134-139; Science,1986, 231 (4742): 1150-1154]就被稱為 ER-a 66。該異構體缺失了 AF1功能區(qū)，但保持了其他功能區(qū)的完整性。進一步研究發(fā)現(xiàn) ER- a 46能競爭性抑制ER- a 66的AF1的功能，而對AF2的作用沒有影響。
2005年另一個分子量為36kDa的全新的ER-a的同源異構體被發(fā)現(xiàn)并克隆了，并將其命 名為ER- a 36 [Biochem. Biophy. Res. Commu. 2005, 336: 1023 - 1027; Proc. Natl. Acad. Sci. 2006, 103 (24):卯63-9068]。該異構體從存在于ER-a 66基因的第一個內含子中的啟動子開 始轉錄，經(jīng)一小段外顯子后，利用ER-a66的外顯子2-6進行編碼。因此，ER-a 36缺失兩 個轉錄功能區(qū)AF1和AF2，但保留了 DNA結合功能區(qū)和二聚化功能區(qū)。重要的是ER- a 36激 素配體結合區(qū)(ligand binding domain)缺失了 8-12螺旋區(qū)(helix),從而完全改變了其與激 素配體結合的專一性和親和力(圖l)。因此，ER-a 36具有和ER-a 66及ER-e完全不同的 激素配體結合能力，為篩選針對ER- a 36的特異性配體提供了結構基礎。
因ER- a 36缺失AF1和AF2功能區(qū)，ER- a 36本身缺失任何轉錄調節(jié)功能，但可以有效 地抑制ER-a 66介導的經(jīng)典的雌激素核信號通路。ER-a 36主要分布在細胞膜和細胞衆(zhòng)中， 少量分布于細胞核中。ER-a 36從而可通過非經(jīng)典的雌激素膜信號傳導通路并經(jīng)過MAPK/ERK
信號傳遞途徑刺激細胞分裂[Proc. Natl. Acad. Sci. t/&4， 2006, 103 (24): 9063-9068] 。 ER- a 36
在不同的雌激素依賴型腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜癌中皆有高表達。因此ER-a36
介導的信號途徑可能參與了多種雌激素依賴型腫瘤的形成和發(fā)展。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是通過對天然有效成分的研究，提供新的可以調節(jié)ER-a和-P生物傳導系 統(tǒng)的化合物，可以用于抗腫瘤，心臟疾病，骨質疏松和老年癡呆的作用. 式(I)化合物或式(I)化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物
(I)
在制備治療因雌激素受體ER- a亞型ER- a 36， ER- a 46以及ER- a 66和ER- e亞型 引起的疾病的藥物中的應用。
所述式(I)化合物或式(I)化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑合物是作為雌激素受體 ER-a和ER-e亞型的調節(jié)劑。
所述藥物包括片劑，口嚼劑，膠囊劑，懸浮液劑，溶液劑。
所述疾病包括腫瘤，骨質疏松，哮喘，心臟疾病或老年癡呆。
所述腫瘤為乳腺癌，卵巢癌，子宮內膜癌，胃癌，結腸癌，前列腺癌，血癌和肺癌。
所述腫瘤為乳腺癌，前列腺癌。
所述腫瘤為乳腺癌。
式(I)化合物可從豆科植物補骨脂果實中提取分離得到(Yao Xue Xue Bao. 2006,41(1)， 76-9; Biol Phann Bull. 2005, 28 (12), 2253-7)。其對ER受體的生物活性，尤 其對ER亞型ER- a 36的受體的生物活性以及由此產生的藥效未見報導。
實驗表明正常乳腺上皮細胞表達少量ER-a36，而在700例乳腺癌的檢査中發(fā)現(xiàn)大約 39. 9%乳腺癌樣品高表達ER- a 36，且40%雌激素受體陰性的乳腺癌樣品雖不表達ER- a 66， 但可表達ER-a36。 ER- a 36也表達在100% ER-， PR- and HER-2+乳腺癌樣品.上述結果表 明ER-a36不僅參與ER陽性的乳腺癌的形成和發(fā)展，而且可能參與過去被認為是ER陰性 的乳腺癌的形成和發(fā)展。迸一步研究表明，表達ER-a36的乳腺腫瘤預后極差，并對抗雌激 素藥物，如他莫昔芬的治療反應不強。
雌激素受體陰性的乳腺癌細胞系MDA-MB-231不表達ER-a 66，但高表達ER-a 36，而且 雌激素可促進MDA-MB-231細胞快速增殖。因此ER- a 36啟動的促細胞生長信號轉導可導致細
胞增殖。同時表達ER- a 66和ER- a 36的ER-陽性MCF7細胞，對雌激素刺激可產生更強增殖 反應，并對抗雌激素藥物如他莫昔酚有抵抗作用。
此外，研究表明，心臟疾病，骨質疏松和老年癡呆等疾病同ER-a36的生物功能有著直 接的關系.因此以ER- a 36為耙點篩選藥物將提供一種新的篩選抗腫瘤，心臟疾病，骨質疏松 和老年癡呆藥物的途徑。
通過實驗證明，式(I)化合物，在低濃度條件下，不改變ERa66， ERa46禾tl ER a 36 的表達。然而高濃度的化合物(I)能同時抑制三者的表達；同時化合物(I)能殺死表達ER a 66， ERa46和ERa36的乳腺癌細胞MCF7細胞。而式(I)化合物也可作為雌激素受體ER a 36的調節(jié)劑，用于治療因雌激素受體ERa36的異常表達而引起的疾病，如腫瘤，骨質疏 松，哮喘，心臟疾病或老年癡呆等病癥。


圖1雌激素受體的結構分區(qū)
圖2 ERa 66， ERa46和ERa36在6個不同患者的乳腺癌組織中的表達。
1、正常乳腺組織2、浸潤性導管癌組織，3、浸潤性導管癌組織，4、浸潤性導管癌組織，
5、浸潤性小葉癌，6、浸潤性小葉癌，7、非浸潤性導管癌
圖3 在乳腺癌細胞MDA- MB-231中，抗ER a 36特異性抗體顯色情況
aER-a36，陽性結果顯示為綠色，DAPI，陽性結果顯示為藍色，聯(lián)合顯色者標注為"Merge"。 圖4 MCF7細胞經(jīng)化合物(I)處理后，Western blot檢測ER a 66， ER a 46和ER a 36表達的 情況。
圖5 MCF7細胞經(jīng)化合物(I)處理后，存活細胞數(shù)量變化情況。
圖6式(I)化合物對僅表達ER a -36或ER a -66的HEK293細胞的ERK的活化情況。 具體實施方法
技術領域：
本發(fā)明中的化合物(I)問-1-(2,4-二羥基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羥基苯基)丙烯-2-酮-1從上海友思生物技術有限公司購買。
實施例1 式(I)化合物的體外生物試驗 試驗1-1
試驗方法含有不同患者乳腺癌組織蛋白的pre-blot濾膜片購至ProSci公司(Poway， CA)。 使用ER a 36特異性的抗ER a 36抗體[ER-a36特異抗體(針對ER-a36 C-端的20個氨基酸)
是由Alpha Diagnostic International (San Antonio, TX)制備，可參閱Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2006, 103 (24): 9063-9068]， HRP標記的二抗以及增強化學發(fā)光試劑(ECL， AmerShair Pharmacia Biotech)檢測濾膜片并顯色。該膜洗脫后，使用能同時檢測ER三種亞型(ERa 66， ERa 46和ERa 36)的抗ERa抗體H222 (Novocastra Laboratories Ltd, UK)檢測膜片。 (見圖2)
試驗結果ERa 66， ERa 46和ER a 36在浸潤性導管癌(泳道2)、浸潤性小葉癌(泳道5) 和非浸潤性導管癌(泳道7)中表達。此外，ERa36在浸潤性導管癌(泳道4)和浸潤性小 葉癌(泳道6)中表達。泳道2和泳道3是來源于兩位不同患者的浸潤性導管癌。泳道5和 泳道6是來源于兩位不同患者的浸潤性小葉癌。該結果顯示ER a 36可以在ER a 66和ER a 46 表達陰性的乳腺癌中表達，而在正常乳腺組織中無表達(泳道l)。 試驗1-2:
試驗方法:MDA-MB-231細胞系是公認的缺乏ERa 66和ER a 46表達的乳腺癌細胞系[Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. iSresst C朋cer AfesearcA a刀c/ 7>eatoe 7f 2004， 83: 249-289] MDA-MB-231細胞(購至ATCC細胞庫)傳代 置于8孔BI0C0AT玻片(BD Science Discovery Labware)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，并在37°C， 5%C02的條件下培養(yǎng)12小時。使用無菌PBS沖洗兩遍，4X多聚甲醛(PBS 配制，PH7.4)在室溫固定30分鐘；然后用PBS洗，和0.5% (v/v) Triton X-100破膜10 分鐘；PBS洗，3%血清在室溫封閉l小時；抗ERa36特異性抗體在室溫孵育1小時，含0. 5 % TritonX-100的PBS (PBST)洗三次；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的熒光二抗孵育1小 時；PBST洗三次，PBS洗一次；防淬滅封片劑(Molecular Probes, Eugene, OR)封片。于 Nikon E600顯微鏡下觀察，使用MRC-1024激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad)拍攝圖像。(見圖3) 試驗結果在ER a 66和ER a 46表達陰性的的乳腺癌細胞MDA-MB-231中，抗ER a 36特異性 抗體顯色陽性(標注為aER-a36，陽性結果顯示為綠色)，并可以被用作免疫的多肽所阻斷。 細胞核使用4, 6-聯(lián)咪_2-苯基-lH-吲哚染色(標注為DAPI，陽性結果顯示為藍色)。聯(lián)合顯 色者標注為"Merge"。(圖中的+P印tide表明在實驗中加免疫源多肽來阻斷抗體) 試驗1-3:
MCF7細胞經(jīng)濃度為0ym至25iim的化合物(I)處理后，免疫印跡法(Western blot)檢測ER a 66， ERa46和ERa36表達的情況。(見圖4)。
試驗結果如圖所示，隨著化合物(I)濃度的上升，ERa66和ERa46的表達下降。然而高濃 度的化合物(I)能抑制三者的表達。 試驗1-4:
試驗方法'.MCF7細胞系是高表達ERa66， ER a 46和ER a 36的乳腺癌細胞系(Relevance of
breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. Marc Lacroix， Guy Leclercq, Area" rreat廳t ，《83; 249-289。) MCF7細胞(購
至ATCC細胞庫)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)，在37。C和5% C02 的條件中培養(yǎng)12小時?；衔?I)(購至上海有思生物技術公司)，通過DMS0溶解稀釋。MCF7 細胞按IX 105的密度接種于100mm直徑的培養(yǎng)皿中，由濃度為0 u m至25 u m的化合物(I) 處理兩周后，使用血球計數(shù)器在顯微鏡下對存活的細胞進行計數(shù)。按照濃度進行分組，5個 培養(yǎng)皿為一組。(見圖5)圖示的是MCF7細胞經(jīng)濃度分別為0um， 5 y m， 10 ym, 15 um， 20 和25um的化合物(I)處理兩周后，細胞數(shù)目變化的表現(xiàn)。細胞計數(shù)的單位為1X104個。
試驗結果如圖所示，MCF7細胞經(jīng)濃度為5um的化合物(I)處理后活細胞數(shù)量明顯下降。 試驗1-5:式(I)化合物對僅表達ER a -36或ER a -66的HEK293細胞的ERK的活化(見圖 6)
試驗方法HEK293, HEK 293/ERa-36 (HEK293細胞用ER-a36表達質粒轉染并高表達ER-a36 的細胞株)；HEK 293/ERa-66 cells (HEK293細胞用ER-a66表達質粒轉染并高表達ER-a66的 細胞株)在10%胚胎牛血清(FBS)和無酚紅的DMEM中，禾B 5%C02， 37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細胞在含5%活性碳處理的FBS的DMEM中培養(yǎng)24小時后，以2X10"培養(yǎng)皿的密度接種在 (D100 mm培養(yǎng)皿中。細胞在經(jīng)過24小時后，加到無血清的DMEM介質中培養(yǎng)18小時。細 胞然后DMSO和化合物(I)在10—15, 10-1G禾n 1(T6M (圖六中標為0, -15, -10, -6)處理10 分鐘。細胞用PBS洗兩次，收獲和裂解細胞，用針對磷酸化或非磷酸化ERK的抗體做Western blotting分析。
試驗結果式(I)化合物可活化表達ER-a36的293細胞中的MAPK/ERK磷酸化，但不活 化表達ER-a66的293細胞中的ERK磷酸化。這一結果表明式(I)化合物可和ER-a36特異 性結合并活化下游ERK信號通道。
權利要求
1.式(I)化合物或式(I)化合物(E)-1-(2，4-二羥基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羥基苯基)丙烯-2-酮-1的藥學上可接受的鹽或溶劑合物id="icf0001" file="S2007101796719C00011.gif" wi="114" he="25" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>在制備治療與所有雌激素受體ER-α亞型和ER-β亞型相關疾病的藥物中的應用，所述ER-α亞型包括ER-α36，ER-α46以及ER-α66。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，所述式(I)化合物或式(I)化合物的藥學上可接受的 鹽或溶劑合物是作為雌激素受體ER-a的調節(jié)劑。
3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，所述藥物包括片劑，口嚼劑，膠囊劑，懸浮液劑，溶液劑。
4. 根據(jù)權利要求l所述的應用，所述疾病為腫瘤，骨質疏松，哮喘，心臟疾病或老年癡 呆。
5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，所述腫瘤為乳腺癌，卵巢癌，子宮內膜癌，胃癌，結腸 癌，前列腺癌，血癌或肺癌。
6. 根據(jù)權利要求5所述的應用，所述腫瘤為乳腺癌，前列腺癌。
7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，所述腫瘤為乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物(E)-1-(2，4-二羥基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羥基苯基)丙烯-2-酮-1及其藥學上可接受的鹽或溶劑合物在制備治療與雌激素受體ER-α亞型和ER-β亞型相關疾病的藥物中的應用，屬醫(yī)藥領域。該化合物在低濃度條件下，不改變ERα66，ERα46和ERα36的表達，而高濃度下能同時抑制三者的表達；同時該化合物能殺死表達ERα66，ERα46和ERα36的乳腺癌細胞MCF7細胞；因此該化合物也可作為雌激素受體ERα36的調節(jié)劑，用于治療因雌激素受體ERα36的異常表達而引起的疾病，如腫瘤，骨質疏松，哮喘，心臟疾病或老年癡呆等病癥。
文檔編號A61K31/122GK101185643SQ20071017967
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月17日 優(yōu)先權日2007年12月17日
發(fā)明者坤 孟, 靖 李 申請人:北京珅奧基醫(yī)藥科技有限公司