專利名稱：一種從黑桑中提取的化合物在制備酪氨酸酶抑制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種黑桑提取物，更具體地說涉及一種從黑桑中提取的天 然化合物的用途。
背景技術：
隨著人民生活水平和審美標準的提高，人們對擁有健康美白的肌膚的 要求日益增加。所以，近些年皮膚美白類化妝品市場的開發(fā)日趨重視，美 白化妝品已成為護膚類化妝品的主流品種之一，其消費市場在不斷擴大。
研究表明，皮膚色素沉著是由于黑色素細胞內黑色素產(chǎn)生過多導致 的，而酪氨酸酶是黑色素生物合成過程中必不可少的關鍵酶。因此通過抑 制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮膚的色素沉著。
目前己有多種酪氨酸酶抑制劑用于美白，但依然存在問題，不能滿足 消費市場的需要。曲酸作為一種酪氨酸酶抑制劑，由于其不穩(wěn)定性，美白
效果較弱；氫醌化合物具有強烈的酪氨酸酶抑制作用，但由于其可以誘導 皮膚病以及細胞毒性，許多國家已經(jīng)禁止使用；熊果苷較為安全，也具有 酪氨酸酶抑制性，但作用微弱。因此，近幾年許多天然植物提取物被開發(fā) 成美白化妝品，由于其安全、溫和、能有效清除氧自由基，受到了大眾的 歡迎。但是由于化妝品中添加的提取物顏色較深，化妝品的外觀受到不良 影響，并且有效性不理想。因此，從天然植物中尋找安全、有效的美白化 合物己成為化妝品行業(yè)研究的趨向。
此外，果蔬魚蝦類保鮮是當前我國農(nóng)、水產(chǎn)品面臨的一個迫待解決的 課題，有些農(nóng)、水產(chǎn)品，例如水果、蔬菜、魚、蝦等，由于得不到及時有 效的保鮮方法處理，每年給我國經(jīng)濟帶來巨大的損失。而酪氨酸酶參與了 許多果蔬魚蝦的褐變反應，是這些果蔬魚蝦變褐生斑而失鮮的主要原因。 黑色素是苯酚類型的大分子，由黑色色素和蛋白質的復合物組成。這一多 聚體色素會出現(xiàn)在動物的皮膚、眼睛、毛發(fā)，鳥的皮毛和天然含有酚類化 合物而在加工時在內源性多酚氧化酶的影響下容易發(fā)生褐變反映的食品，這些現(xiàn)象可在當蘋果，土豆和香蕉的切面與空氣接觸產(chǎn)生的棕色表面中看 到。對于食物，如蔬菜，水果和魚、蝦等甲殼類產(chǎn)品，如果合成了較多的 黑色素，它們的質量就下降了。因此，尋求一種食物添加劑，其中含有作 為預防褐變的有效成分的化合物，使用在如水果，蔬菜和魚、蝦等甲殼類 產(chǎn)品中，通過尋找酪氨酸酶的特效抑制劑用于果蔬魚蝦保鮮是一種可取的 有效方法。
本發(fā)明的目的是提供一種結構如下式(I)的化合物的用途，該化合物 是一種從黑桑中提取得到的天然化合物，其對酪氨酸酶有強烈的抑制作 用，應用于防治色斑、雀斑、老年斑等皮膚的色素沉著和美白以及食品添 加劑。
上述化合物(I)可以從黑桑中提取得到，其制備方法如下(參考文獻
傅大煦，陳蕾，侯愛君*，《黑桑的化學成分研究》，中草藥，2005,36 (9)， 1296-1299.):黑桑莖粗粉2kg，用95%EtOH室溫浸提3次，合并提取液 減壓濃縮至干。將得到提取物(204g)加水懸浮，依次用石油醚、氯仿、 乙酸乙酯和正丁醇萃取。將石油醚萃取物(47g)進行硅膠柱層析，分別 用石油醚、石油醚-丙酮(30:1， 20:1， 10:1， 9:1， 6:1， 4:1)梯度洗脫后 得到組分1 17。組分15經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-乙醚(5:1)洗脫，然后進 行ODS柱層析，甲醇-水(7:3 9:1)洗脫，得到化合物1 lH-苯并呋喃[3, 2-b][l]苯并吡喃-ll-酮，5a,10a-二氫-l，3,8,10a-四羥基-5a-[(2E,6E)-3,7,ll-
發(fā)明內容三甲基-2,6,10-十二碳三烯-l-基]，如式(1)所示。該化合物的理化性質及 光譜數(shù)據(jù)如下分子式C3QH34 07;分子量506;其性狀為黃色無定形粉 末；旋光值[a]D2、 -171.7° (c0.58， Me2CO);電子轟擊質譜(質荷比) (%): 507[M+H]+(2)， 506[M]+(2)， 488(1)， 437(1)， 370(1)， 355(2)， 353(2)， 315(2)， 302(9)， 285(9)， 273(13)， 153(11)， 149(27)， 134(5)， 123(5)， 69(55)， 46(100); ]HNMR(300MHz)，化學位移ppm，偶合常數(shù)Hz，溶劑氘 代丙酮)511.69 (1H， s， 0H陽5) ， 9.23 (2H， br s， OH-7， 4') ， 7.41
(1H， d， J=8.2Hz， H-6') ， 6.55 (1H， dd， J=2.1， 8.2Hz， H-5') ， 6.42
(1H, d， J=2.1Hz， H畫3') ， 5.95 (1H， d， J=2.0Hz， H-6) ， 5.83 (1H， d， J=2.0Hz， H-8) ， 5.25 (1H， brt， J=8.0Hz， H-10) ， 5.08 (1H， m， H-20) ， 5.05 (1H， m， H-15) ， 3.22 (1H， brdd， J=8.9， 14.5Hz， H-9a)， 2.80 (1H， brdd， J=6.4， 14.5Hz， H-9b) ， 2.05 (2H， m， H2-19) , 1.95
(2H， m， H2-18) ， 1.83 (2H， m， H2-14) ， 1,81 (2H， m， H2-13)， 1.67 (3H， br s， H3-12) ， 1.65， 1.58 (各3H， br s， H3-22， 23) ， 1.56
(3H， brs， H3-17) ; 13CNMR (100 MHz)(化學位移ppm，溶劑気 代丙酮):5187.8 s(C-4)， 168.9 s(C-7)， 165.4 s(C-5)， 164.0 s (C-8a)， 161.2 s(C-2'，4')， 140.9 s(C-ll)， 135,8 s(C陽16)， 131.8 s(C-21)， 125.8 d(C-6')， 125.4 d(C-15)， 125.2 d(C-20)， 121.7 s(C匿l')， 118.4 d(C陽lO)， 110.1 d(C-5')， 102.7 s(C漏3)， 100.1 s(C-4a)， 99.5 d(C隱3')， 96.8 d(C隱6)，' 95.6 s(C-8)， 92.3 s(C-2)， 40.5 t(C-13) ， 40.3 t(C-18)， 31.9 t(C-9)， 27.4 t(C-19) ， 27.0 t(C-14)， 25.8q(C-23)， 17.8q(C-22)， 16.7 q(C-12)， 16.1 q(C-17)。
通過對化合物(I)酪氨酸酶抑制活性的測定并進行時間分析，發(fā)現(xiàn)該 化合物表現(xiàn)出酪氨酸酶抑制活性，并成劑量依賴性；同時以,酸作為對照 品，發(fā)現(xiàn)化合物(I)對酪氨酸酶的抑制作用明顯；同時通過時間分析發(fā)現(xiàn) 化合物(I)的抑制作用具有一定的穩(wěn)定性。
化合物(I)作為酪氨酸酶抑制劑可以單獨使用，也可以與其它化合物 混合使用，并含有藥學上所允許的藥用輔料或常規(guī)的藥用載體，用作抑制 黑色素生成的美白化妝品。本發(fā)明的化合物還可以添加其它美白劑成分， 這些美白劑成分可以采用但不限于下列成分熊果苷、曲酸衍生物，L-抗 壞血酸及其衍生物及它們的鹽、氫醌及其衍生物及它們的鹽；植物提取物如甘草提取物、蘆薈提取物等。美白劑成分可任意選擇1種或2種以上摻 入。
化合物(I)具有強烈的酪氨酸酶抑制作用，進一步地可以在制備藥品、 化妝品或食品添加劑中應用，其中化合物(I)的使用量可視不同的用途而 不同。
制備藥物或化妝品時，用該化合物與常規(guī)的藥用載體，如軟膏基質、 乳化劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑等制成乳劑或軟膏等外用制劑，制備工藝可 才采用常規(guī)的藥物制劑技術。其化合物在化妝品中或藥品的用量以重量百 分比計為0.01 10%比較合適。
酪氨酸酶參與了許多果蔬魚蝦的褐變反應，是這些果蔬魚蝦變褐生斑 而失鮮的主要原因。而化合物(I)具有酪氨酸酶抑制作用，能夠在預防褐 變的食物添加劑中應用。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供了一種從黑桑中提取的天然化合物(I)作為酪氨酸酶抑制 劑的用途。通過對其抑制活性的測定，證明化合物(I)的活性較強，并且 具有較好的穩(wěn)定性。


圖1:實施例1中化合物(I)對酪氨酸酶抑制作用曲線圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明，但實施例不限制本發(fā) 明的保護范圍。
實施例l:酪氨酸酶抑制活性的測定。
酪氨酸酶抑制活性的測定以曲酸作為對照品，方法如下。
首先將底物多巴溶解在磷酸緩沖液(25mM， pH6.8)中達到8mM濃 度。向96孔板中，加入20)iL上述底物溶液，90jiL磷酸緩沖液，以及20pL 不同濃度的化合物。加入70pL含酪氨酸酶的磷酸緩沖液(100U/mL， pH6.8)，開始反應，37。C下反應10分鐘。反應前后用Multiscan MK3全自動多功能酶標儀(Thermo)在492nm下，測定每孔的吸光度。
根據(jù)在492nm下的吸光度計算化合物對酪氨酸酶的抑制率(％)，并 將酶活性抑制率(％)達到50%時抑制劑的濃度測定為IC5o值。抑制率(％)
可以根據(jù)下式進行
抑制率(％) =[ (A-B) - (C-D) ]/ (A-B) xl00 上式中，A表示反應后空白孔在492nm下的吸光度， B表示反應前空白孔在492nm下的吸光度， C表示反應后樣品孔在492nm下的吸光度， D表示反應前樣品孔在492nm下的吸光度。 結果見圖1及表1
表1酪氨酸酶抑制活性
化合物ic50
曲酸32.62±1.24
化合物(I)50.56±1.89 一
結論上圖1可以看出，式(1)所示的化合物表現(xiàn)出酪氨酸酶抑制
活性，成劑量依賴性，從表l可以看出，其ICso為50.56±1.89 mM。 實施例2:對酪氨酸酶抑制的時間分析。
首先將底物多巴溶解在磷酸緩沖液(25mM， pH6.8)中達到8mM濃 度。向96孔板中，加入20^iL上述不同濃度的底物溶液，90 pl磷酸緩沖 液，以及20jiL終濃度為60pM的化合物。加入70pL含酪氨酸酶的磷酸緩 沖液(100U/mL， pH6.8)，開始反應，分別在不同時間測定每孔的吸光度。 計算酶抑制率，方法同"實施例1"。結果見表2。
表2 不同時間的酪氨酸酶抑制活性
時間(min)抑制率(％)
55.34±5.11
1059.58±5.24
1563.49±4.63
73060.46±5.28
6058.60±4.52
9057.77±4.15
12055.23±3.24
15055.40±4.37
18053.66±3.71
結論在反應15分鐘時酶抑制率為63.49%，隨著時間的延長，酶抑 制率有所下降,但在180分鐘內對酪氨酸酶的抑制率依然保持在50%以上, 因此式(1)所示的化合物具有一定的穩(wěn)定性。
權利要求
1. 一種自黑桑中提取的結構如下的化合物(I)在制備酪氨酸酶抑制劑中的應用，
2. 根據(jù)權利要求l所述的用途，其特征在于，化合物(I)在制備治療由 酪氨酸酶引起的皮膚變色、雀斑、斑點的藥物中的應用。
3. 根據(jù)權利要求l所述的用途，其特征在于，化合物(I)在制備抑制黑 色素生物合成的化妝品中的應用。
4. 根據(jù)權利要求l、 2或3所述的用途，其特征在于，化合物(I)單獨使 用，或者與其它藥學上可接受的藥用輔料、藥用載體或其它美白劑 混合使用。 '
5. 根據(jù)權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥用載體選自軟膏 基質、乳化劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑。
6. 根據(jù)權得要求4所述的用途，其特征在于，所述的美白劑選自熊果苷、 曲酸衍生物、L-抗壞血酸及其衍生物及其鹽、氫醌及其衍生物及其鹽、 甘草提取物、蘆薈提取物中的一種或幾種。'
7. 根據(jù)權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的化合物(I)在藥物 或化妝品中的含量以重量百分比計為0.01 10%。
8. 根據(jù)權利要求l所述的用途，其特征在于，化合物(I)在制備預防褐 變的食品添加劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從黑桑中提取的天然化合物(I)的用途。該化合物對酪氨酸酶有強烈的抑制作用，應用于防治皮膚色斑、雀斑、老年斑等皮膚的色素沉著和美白以及食品添加劑。通過對其抑制活性的測定，證明化合物(I)的活性很強，并且具有較好的穩(wěn)定性。
文檔編號A61K31/352GK101450052SQ20071017148
公開日2009年6月10日 申請日期2007年11月30日 優(yōu)先權日2007年11月30日
發(fā)明者侯愛君, 張小東, 王賀瑤, 曉 胡 申請人:中國科學院上海藥物研究所;復旦大學