專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種從黑桑中提取的化合物作為酪氨酸酶抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種黑桑提取物，更具體地說(shuō)涉及一種從黑桑中提取的天然化合物的用途。
背景技術(shù)：
：隨著人民生活水平和審美標(biāo)準(zhǔn)的提高，人們對(duì)擁有健康美白的肌膚的要求日益增加。所以，近些年皮膚美白類(lèi)化妝品市場(chǎng)的開(kāi)發(fā)日趨重視，美白化妝品已成為護(hù)膚類(lèi)化妝品的主流品種之一，其消費(fèi)市場(chǎng)在不斷擴(kuò)大。研究表明，皮膚色素沉著是由于黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素產(chǎn)生過(guò)多導(dǎo)致的，而酪氨酸酶是黑色素生物合成過(guò)程中必不可少的關(guān)鍵酶。因此通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮膚的色素沉著。目前己有多種酪氨酸酶抑制劑用于美白，但依然存在問(wèn)題，不能滿足消費(fèi)市場(chǎng)的需要。曲酸作為一種酪氨酸酶抑制劑，由于其不穩(wěn)定性，美白效果較弱；氫醌化合物具有強(qiáng)烈的酪氨酸酶抑制作用，但由于其可以誘導(dǎo)皮膚病以及細(xì)胞毒性，許多國(guó)家己經(jīng)禁止使用；熊果苷較為安全，也具有酪氨酸酶抑制性，但作用微弱。因此，近幾年許多天^植物提取物被開(kāi)發(fā)成美白化妝品，由于其安全、溫和、能有效清除氧自由基，受到了大眾的歡迎。但是由于化妝品中添加的提取物顏色較深，化妝品的外觀受到不良影響，并且有效性不理想。因此，從天然植物中尋找安全、有效的美白化合物已成為化妝品行業(yè)研究的趨向。此外，果蔬魚(yú)蝦類(lèi)保鮮是當(dāng)前我國(guó)農(nóng)、水產(chǎn)品面臨的一個(gè)迫待解決的課題，有些農(nóng)、水產(chǎn)品，例如水果、蔬菜、魚(yú)、蝦等，由于得不到及時(shí)有效的保鮮方法處理，每年給我國(guó)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的損失。而酪氨酸酶參與了許多果蔬魚(yú)蝦的褐變反應(yīng)，是這些果蔬魚(yú)蝦變褐生斑而失鮮的主要原因。黑色素是苯酚類(lèi)型的大分子，由黑色色素和蛋白質(zhì)的復(fù)合物組成。這一多聚體色素會(huì)出現(xiàn)在動(dòng)物的皮膚、眼睛、毛發(fā)，鳥(niǎo)的皮毛和天然含有酚類(lèi)化合物而在加工時(shí)在內(nèi)源性多酚氧化酶的影響下容易發(fā)生褐變反映的食品，這些現(xiàn)象可在當(dāng)蘋(píng)果，土豆和香蕉的切面與空氣接觸產(chǎn)生的棕色表面中看到。對(duì)于食物，如蔬菜，水果和魚(yú)、蝦等甲殼類(lèi)產(chǎn)品，如果合成了較多的黑色素，它們的質(zhì)量就下降了。因此，尋求一種食物添加劑，其中含有作為預(yù)防褐變的有效成分的化合物，使用在如水果，蔬菜和魚(yú)、虹等甲殼類(lèi)產(chǎn)品中，通過(guò)尋找酪氨酸酶的特效抑制劑用于果蔬魚(yú)奸保鮮是一種可取的有效方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)構(gòu)如下式(I)的化合物的用途，該化合物是一種從黑桑中提取得到的天然化合物，其對(duì)酪氨酸酶有強(qiáng)烈的抑制作用，應(yīng)用于防治色斑、雀斑、老年斑等皮膚的色素沉著和美白以及食品添加劑。(I)上述化合物(I)可以從黑桑中提取得到，其制備方法如下(參考文獻(xiàn)傅大煦，陳蕾，侯?lèi)?ài)君*，《黑桑的化學(xué)成分研究》，中草藥，2005,36(9),1296-1299.):黑桑莖粗粉2kg，用95%EtOH室溫浸提3次，合并提取液減壓濃縮至干。將得到提取物(204g)加水懸浮，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。將石油醚萃取物(47g)進(jìn)行硅膠柱層析，分別用石油醚、石油醚-丙酮(30:1，20:1，10:1，9:1，6:1，4:1)梯度洗脫后得到組分117。組分17經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-異丙醇(20:110:1)洗脫，并經(jīng)ODS柱層析，甲醇-水(l:l)洗脫，得到化合物2-丙烯-l-酮，1-[2，4-二羥基-3-(3-甲基-2-丁烯基)苯基]-3-(2,4-二羥基苯基)，如式(I)所示?；衔?I)的理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)如下分子式C2。H2。05;分子量340;其性狀為桔紅色無(wú)定形粉末；電子轟擊質(zhì)譜(質(zhì)荷比)(％):340[M]十(18)，324(100)，322(42)，307(25)，305(14)，279(81)，267(93)，205[RDAof340]十(18)，176(19)，161(39)，149(73)，134(19)，123(20);'H畫(huà)R(500MHz):(化學(xué)位移ppm，偶合常數(shù)Hz，溶劑氘代丙酮)S14.15(1H，s，OH隱2')，8.21(1H，d，J=15.4Hz，H-P)，7.88(1H，d，J=8.9Hz，H-6')，7.79(1H，d，J=15.4Hz，H-a)，7.67(1H，d，J=8.5Hz，H陽(yáng)6)，6.53(1H，d，J=2.0Hz，H-3)，6.52(1H，d，J=8.9Hz，H-5')，6.45(1H，dd，J=2.0，8.5Hz，H-5)，5.28(1H，brt，J=7.2Hz，H-2")，3.37(2H，brd，J=7.2Hz，H2-l")，1.78(3H，brs，H3-4〃)，1.64(3H，brs，H3-5〃)；13CNMR(125MHz)數(shù)據(jù)(化學(xué)位移ppm，溶劑氖代丙酮)5193.8s(C=0)，165.5s(C-2')，162.9s(C-4')，162.7s(C-4)，160.4s(C-2)，141.2d(C-卩)，132.1d(C-6)，131.7s(C-3")，130.3d(C-6')，123.8d(C-2")，118,0d(C-a)，116.5s(C-3')，115.7s(C-l)，114.9s(C-r)，109.6d(C-5)，108.3d(C畫(huà)5')，104.1d(C-3)，26.2q(C-5")，22.7t(C-1")，18.3q(C-4〃)。通過(guò)對(duì)化合物(I)酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定并進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析和時(shí)間分析，發(fā)現(xiàn)該化合物表現(xiàn)出酪氨酸酶抑制活性，并成劑量依賴性；同時(shí)以曲酸作為對(duì)照品，發(fā)現(xiàn)化合物(I)對(duì)酪氨酸酶的抑制作用更強(qiáng)。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明，化合物(I)是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；同時(shí)化合物(I)的抑制作用具有一定的穩(wěn)定性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)化合物(I)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并且可降低細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，同時(shí)又可降低細(xì)胞內(nèi)黑素生物合成的水平。化合物(I)作為酪氨酸酶抑制劑可以單獨(dú)使用，也可以與其它化合物混合使用，并含有藥學(xué)上所允許的藥用輔料或常規(guī)的藥用載體，用作抑制黑色素生成的美白化妝品。本發(fā)明的化合物還可以添加其它美白劑成分，這些美白劑成分可以采用但不限于下列成分熊果苷、曲酸衍生物，L-抗壞血酸及其衍生物及它們的鹽、氫醌及其衍生物及它們的鹽；植物提取物如甘草提取物、蘆薈提取物等。美白劑成分可任意選擇1種或2種以上摻入?；衔?I)具有強(qiáng)烈的酪氨酸酶抑制作用，進(jìn)一步地可以在制備藥品、化妝品或食品添加劑中應(yīng)用，其中化合物(I)的使用量可視不同的用途而不同。制備藥物或化妝品時(shí)，用該化合物與常規(guī)的藥用載體，如軟膏基質(zhì)、乳化劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑等制成乳劑或軟膏等外用制劑，制備工藝可才采用常規(guī)的藥物制劑技術(shù)。其化合物在化妝品中或藥品的用量以重量百分比計(jì)為0.0110%比較合適。酪氨酸酶參與了許多果蔬魚(yú)蝦的褐變反應(yīng)，是這些果蔬魚(yú)蝦變褐生斑而失鮮的主要原因。而化合物(I)具有酪氨酸酶抑制作用，能夠在預(yù)防褐變的食物添加劑中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種從黑桑中提取的天然化合物(I)作為酪氨酸酶抑制劑的用途。通過(guò)對(duì)其抑制活性的測(cè)定，證明化合物(I)的活性更強(qiáng)，并且具有較好的穩(wěn)定性?；衔?I)對(duì)于黑色素瘤細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并可顯著降低黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi)黑色素的生物合成水平。圖1:實(shí)施例1中化合物(I)對(duì)酪氨酸酶抑制作用曲線圖。圖2:實(shí)施例2中Linewearver-Burk曲線。圖3:實(shí)施例4中化合物(I)對(duì)B16細(xì)胞活力的影響。圖4:實(shí)施例5中化合物(I)對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響。圖5:實(shí)施例6中不同濃度下化合物(I)對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響。圖6:實(shí)施例6中化合物(I)對(duì)B16細(xì)胞黑素含量的影響。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一歩說(shuō)明，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:化合物(I)酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定。酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定以曲酸作為對(duì)照品，方法如下首先將底物多巴溶解在磷酸緩沖液(25mM，pH6.8)中達(dá)到8mM濃度。向96孔板中，加入20pL上述底物溶液，90liL磷酸緩沖液，以及20(iL不同濃度的化合物。加入70|liL含酪氨酸酶的磷酸緩沖液(100U/mL，pH6.8)，開(kāi)始反應(yīng)，37。C下反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)前后用MultiscanMK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo)在492nm下，測(cè)定每孔的吸光度。根據(jù)在492nm下的吸光度計(jì)算化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制率(％)，并將酶活性抑制率(％)達(dá)到50%時(shí)抑制劑的濃度測(cè)定為ICso值。抑制率(％)可以根據(jù)下式進(jìn)行抑制率(％)=[(A-B)-(C-D)]/(A-B)X100上式中，A表示反應(yīng)10分鐘后空白孔在492nm下的吸光度，B表示反應(yīng)前空白孔在492nm下的吸光度，C表示反應(yīng)10分鐘后樣品孔在492nm下的吸光度，D表示反應(yīng)前樣品孔在492nm下的吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖1及表1表1:酪氨酸酶抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)論從圖l可以看出，化合物(I)表現(xiàn)出酪氨酸酶抑制活性，成劑量依賴性；從表l可以看出，其IC5o為1.17±0.054pM，強(qiáng)于對(duì)照品曲酸。實(shí)施例2:對(duì)酪氨酸酶抑制的動(dòng)力學(xué)分析。將底物多巴溶解在磷酸緩沖液(25mM，pH6.8)中，配制成12mM、10mM、8mM、6mM等4個(gè)濃度。向96孔板中，加入20pL上述不同濃度的底物溶液，90)il磷酸緩沖液，以及20)il不同濃度的化合物。加入7(VL含酪氨酸酶的磷酸緩沖液(100U/mL，pH6.8)，開(kāi)始反應(yīng)，37。C下反應(yīng)IO分鐘。反應(yīng)前后在492nm下，測(cè)定每孔的吸光度。計(jì)算酶抑制率，方法同實(shí)施例l，繪制Lineweaver-Burk曲線(見(jiàn)圖2)。結(jié)論從圖2的Lineweaver-Burk曲線可以看出，化合物(I)是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。實(shí)施例3:對(duì)酪氨酸酶抑制的時(shí)間分析。首先將底物多巴溶解在磷酸緩沖液(25mM，pH6.8)中達(dá)到8mM濃度。向96孔板中，加入20pL上述底物溶液，90pL磷酸緩沖液，以及20pL終濃度為4|iM的化合物。加入70pL含酪氨酸酶的磷酸緩沖液(100U/mL，pH6.8)，開(kāi)始反應(yīng)，分別在不同時(shí)間測(cè)定每孔的吸光度。計(jì)算酶抑制率，方法同實(shí)施例1。結(jié)果見(jiàn)表2。表2:不同時(shí)間的酪氨酸酶抑制活性曰寸間(min)抑制率(％)60.69±3.321070.71±0.301574.62±2.193073.11±2.426069.47士2.779068.97±3.0512066.80±3.4215065.88±3.4318062.82±2.47結(jié)論化合物(I)在反應(yīng)15分鐘時(shí)酶抑制率為74.62%,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶抑制率有所下降，但在180分鐘內(nèi)對(duì)酪氨酸酶的抑制率依然保持在60%以上，因此化合物(I)具有一定的穩(wěn)定性。實(shí)施例4:對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞活力的影響。B16細(xì)胞接種于96孔板，2xl()3個(gè)細(xì)胞/L，用DMEM培養(yǎng)基(10。/。FBS，高糖)培養(yǎng)。第二天換上含100nM的a-MSH培養(yǎng)基，并加入不同濃度的化合物。48小時(shí)后棄培養(yǎng)基，加入100|iL5g/L的MTT，4小時(shí)后棄去上清液，加入150nLDMSO，酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為630nm。結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)論化合物(I)在50)iM時(shí)對(duì)細(xì)胞有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，但是當(dāng)濃度低于30|iM時(shí)對(duì)B16細(xì)胞活力沒(méi)有明顯影響。8實(shí)施例5:對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響。B16細(xì)胞接種于48孔板，6xl()3個(gè)細(xì)胞/孔，用DMEM培養(yǎng)基(10。/。FBS，高糖)培養(yǎng)。第二天換上含100nM的a-MSH培養(yǎng)基，并加入不同濃度的化合物。48小時(shí)后棄培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每孔加入190pl的1%TritonX-lOO溶液，振蕩裂解細(xì)胞5分鐘，加入10jiL20mM的L-Dopa溶液，37。C反應(yīng)30分鐘，于492nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)論化合物(I)處理B16細(xì)胞48小時(shí)后，顯著降低了細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性。在30iiM濃度時(shí)，酪氨酸酶活性只有空白組的一半(p<0.05)實(shí)施例6:對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素合成的影響。B16細(xì)胞接種于48孔板，6xl()3個(gè)細(xì)胞/孔，用DMEM培養(yǎng)基(10。/。FBS，高糖)培養(yǎng)。第二天換上含100nM的a-MSH培養(yǎng)基，并加入不同濃度的化合物。48小時(shí)后，顯微鏡觀察并拍照(見(jiàn)圖5)。棄培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每孔加入200|il的1NNaOH溶液，60。C水浴30分鐘，于405nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)論從圖5可以看出，化合物(I)處理組的黑素顆粒明顯少于空白組。而黑素含量測(cè)定(圖6)顯示，化合物(I)顯著降低了B16細(xì)胞內(nèi)黑素含量(p<0.05)，尤其是化合物濃度為30pM時(shí)，黑素含量只有空白組的1/4。因此，式化合物(I)可以有效降低B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑素生物合成。權(quán)利要求1.一種自黑桑中提取的結(jié)構(gòu)如下的化合物(I)在制備酪氨酸酶抑制劑中的應(yīng)用，2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，化合物(I)在制備治療由酪氨酸酶引起的皮膚變色、雀斑、斑點(diǎn)的藥物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，化合物(I)在制備抑制黑色素生物合成的化妝品中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的用途，其特征在于，化合物(I)單獨(dú)使用，或者與其它藥學(xué)上可接受的藥用輔料、藥用載體或其它美白劑混合使用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥用載體選自軟膏基質(zhì)、乳化劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑。6.根據(jù)權(quán)得要求4所述的用途，其特征在于，所述的美白劑選自熊果苷、曲酸衍生物、L-抗壞血酸及其衍生物及其鹽、氫醌及其衍生物及其鹽、甘草提取物、蘆薈提取物中的一種或幾種。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的化合物(I)在藥物或化妝品中的含量以重量百分比計(jì)為0.0110%。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，化合物(I)在制備預(yù)防褐變的食品添加劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種從黑桑中提取的天然化合物(I)的用途。該化合物對(duì)酪氨酸酶有強(qiáng)烈的抑制作用，應(yīng)用于防治皮膚色斑、雀斑、老年斑等皮膚的色素沉著和美白以及食品添加劑。通過(guò)對(duì)其抑制活性的測(cè)定，證明化合物(I)的活性很強(qiáng)，并且具有較好的穩(wěn)定性?；衔?I)對(duì)于黑色素瘤細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，可顯著降低黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi)黑色素的生物合成水平。文檔編號(hào)A61K31/045GK101450047SQ20071017148公開(kāi)日2009年6月10日申請(qǐng)日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者侯?lèi)?ài)君,張小東,王賀瑤,曉胡申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所;復(fù)旦大學(xué)