專利名稱：一種白首烏中單體化合物的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從白首烏中分離純化單體化合物 bungeiside-A 禾口 bungeiside_B 的方法。
背景技術(shù)：
白首烏為蘿摩科鵝絨藤屬植物白首烏(Radix Cynanchi bungei)的塊根。主產(chǎn)于 我國泰山，與紫草、黃精、四葉參并稱為“泰山四大名藥”，具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂和免 疫調(diào)節(jié)等作用(徐凌川，等.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003,21(11) :1893;張如松，等.中草藥，2000， 31(8) :599;宋俊梅，等.食品科學(xué)，1997，18(9) :61;高麗君，等.中國中藥雜志，2005， 30(17) :352)。Li jim等研究表明白首烏的主要成分為戟葉牛皮消苷和苯乙酮類化合物(Li Jun, et al. Chem. Pharm. Bull. 1992,40(12) :3133)。目前國內(nèi)外多采用柱層析法等傳統(tǒng)方法分離純化白首烏中的bimgeiside-A和 bimgeiside-B等單體化合物，這類方法多使用大量的氯仿、甲醇等有毒的有機溶劑，而且柱 層析法的不足之處是分離周期長，回收率低，分離效果不理想。另外，由于白首烏中各主要 成分極性極為相近，通常無法在較短時間內(nèi)使目標(biāo)化合物得到有效的分離，需借助多次重 復(fù)分離而造成目標(biāo)化合物損失較多。高速逆、流色i普法(high speed counter-current chromatography, HSCCC)是一禾中 新型液-液色譜分離方法。他不同于傳統(tǒng)液相色譜法，該色譜法可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)高效 分離和分析，具有無固體載體，可以避免分離樣品與固體載體表面產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)而變性和 不可逆吸附等優(yōu)點，而且對樣品的預(yù)處理要求較低，適用于粗提取物的分離。因此，近年來， HSCCC在生物科學(xué)、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域廣為運用，在植物天然活性成分的分離制備中更為突 出，無論是一次制備的量，還是制備純度均得到極大的提高。高速逆流色譜是一種基于樣品在兩個互不混溶的溶劑之間分配作用的分離技術(shù)， 是分離科學(xué)技術(shù)的一個新分支。該技術(shù)是一種不用固態(tài)吸附劑的全液態(tài)的色譜方法。由于 不使用固態(tài)支撐體，與其它的色譜技術(shù)相比，HSCCC能夠完全消除支撐體導(dǎo)致的樣品不可逆 吸附和對樣品的沾染、失活、變性等影響，實現(xiàn)復(fù)雜混合物中各組分的高純度分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、高效分離白首烏中單體化合物bimgeiside-A 和bimgeiside-B的新方法，即使用高速逆流色譜法從白首烏中分離制備單體化合物的方 法。成品中采用高效液相色譜法測定bungeiside-A和bungeiside-B的純度均達(dá)到98% 以上。該方法分離條件溫和，分離效率高，且分離時間短，能得到高純度的bimgeiside-A和 bungeiside-B0本發(fā)明提供一種從白首烏中分離純化單體化合物bungeiside-A和bungeiside-B 的方法，包括如下步驟(1)制備白首烏提取物
取白首烏藥材，樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩。稱取干燥的白首烏粉末，加入20倍 重量的乙醇中，超聲波提取30-60min，過濾；將濾渣重復(fù)上述步驟，再提取2次，合并濾液， 減壓濃縮至浸膏狀，得白首烏提取物。(2)提取物的進(jìn)一步純化將上述步驟制得的白首烏提取物加適量水混懸后，過大孔吸附樹脂柱，使大 孔樹脂對提取液中的物質(zhì)充分吸附先用水溶液進(jìn)行充分洗脫除去水溶性雜質(zhì)，再用 10% -20%乙醇溶液洗脫，收集10% -20%乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，即得大孔樹脂粗分 離物。(3)高速逆、流色譜分離 bungeiside-A 禾口 bungeiside—B a.溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的配制在分液漏斗中配制正丁醇甲醇水(4 1 5，v/v)兩相溶劑體系，充分振搖 后在室溫下靜置過夜。使用前分別取分液漏斗中的上相(作為HSCCC的固定相)和下相 (作為HSCCC的流動相)，超聲脫氣30-60min。取步驟(2)中的大孔樹脂粗分離物，用相同 體積的上相和下相溶解樣品，備用。
b.高速逆流色譜分離制備過程首先將溶劑系統(tǒng)的上相注入高速逆流色譜儀分離管中，待上相充滿整個管路后調(diào) 整主機轉(zhuǎn)速850rpm/min，再以2. OmL/min流速泵入下相，待流動相從柱出口流出，兩相在分 離管中達(dá)到動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入a中的樣品溶液。在254nm波長下檢測，記錄色譜圖， 根據(jù)色譜圖收集流分I和II。c. bungeiside-A 禾口 bungeiside_B 白勺^>豐/ 禾口f 胃使用高效液相色譜對b中分離得到的流分I和II進(jìn)行純度檢測應(yīng)用C18色譜柱， 甲醇-水為流動相，梯度洗脫，檢測波長254nm，測得流分I和II均為單一峰，純度均高于 98% ；使用咕NMR和13C NMR對化合物I和II進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂柱為D101，NKA12型大孔吸附樹脂。本發(fā)明采用了合理的溶劑系統(tǒng)，控制了高速逆流色譜儀的主機轉(zhuǎn)速、流動相流速 和檢測器波長等條件，用本發(fā)明方法可得到純度較高的bungeiside-A和bungeiside-B。該 分離條件容易控制，分離時間短。由于不引入酸堿，而且在常溫下進(jìn)行分離，目標(biāo)化合物不 發(fā)生變化，最大程度的保持了化合物的穩(wěn)定性。
具體實施例方式實施例1(1)制備白首烏提取物取白首烏藥材，樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩。稱取干燥的白首烏粉末20g，加入 20倍重量的乙醇中，超聲波提取30min，過濾；將濾渣重復(fù)上述步驟，再提取2次，合并濾液， 減壓濃縮至浸膏狀，得白首烏提取物。(2)提取物的進(jìn)一步純化將上述步驟制得的白首烏提取物加適量水混懸后，過大孔吸附樹脂柱，使大孔樹 脂對提取液中的物質(zhì)充分吸附先用水溶液進(jìn)行充分洗脫除去水溶性雜質(zhì)，再用15%乙醇 溶液洗脫，收集15%乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，即得大孔樹脂粗分離物1. 2g。
(3)高速逆、流色譜分離 bungeiside-A 禾口 bungeiside—B a.溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的配制在分液漏斗中配制正丁醇甲醇水(4 1 5，v/v)兩相溶劑體系，充分振搖 后在室溫下靜置過夜。使用前分別取分液漏斗中的上相(作為HSCCC的固定相)和下相 (作為HSCCC的流動相)，超聲脫氣30min。取步驟(2)中大孔樹脂粗分離物，用lmL上相和 lmL下相溶解樣品，備用。b.高速逆流色譜分離制備過程用最大流速(9. 99mL/min)將溶劑系統(tǒng)的上相泵入高速逆流色譜儀分離管中，待 上相充滿整個管路后調(diào)整主機轉(zhuǎn)速850rpm/min，再以2. OmL/min流速泵入下相，待流動相 從柱出口流出，兩相在分離管中達(dá)到動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入a中的樣品溶液，同時在出 液端接紫外檢測器，在254nm波長處對流出液連續(xù)檢測，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖收集流分 I 和 II。c. bungeiside-A 禾口 bungeiside—B 的分析禾口鑒定使用高效液相色譜儀對b中分離得到的流分I和II進(jìn)行純度檢測應(yīng)用Symmetry C18色譜柱(300mmX7.8mm i. d.，7 y m)，甲醇-水為流動相，梯度洗脫，在0到30min，甲醇 由10%升到34%，檢測波長為254nm，測定溫度為室溫。測得流分I和II均為單一峰，純度 分別為98. 2 %和98. 4 %。將流分I和II揮干，得化合物I褐色粉末8. 9mg,化合物II褐色粉 末7. 6mg。使用屮NMR和13C NMR對單體化合物I和II進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比，確 定化合物 I 為 bungeiside-A 化合物 II 為 bungeiside-B。
權(quán)利要求
一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于包括如下步驟(1)取白首烏藥材，樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩；稱取干燥的白首烏粉末，加入乙醇，超聲波提取，過濾；將濾渣重復(fù)上述步驟，再提取2次，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，得白首烏提取物；(2)將上述步驟制得的白首烏提取物加適量水混懸后，過大孔吸附樹脂柱，使大孔樹脂對提取液中的物質(zhì)充分吸附先用水溶液進(jìn)行充分洗脫除去水溶性雜質(zhì)，再用乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，即得大孔樹脂粗分離物；(3)在分液漏斗中配制兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后在室溫下靜置過夜。使用前分別取分液漏斗中的上相(作為HSCCC的固定相)和下相(作為HSCCC的流動相)，超聲脫氣；取步驟(2)中的大孔樹脂粗分離物，用相同體積的上相和下相溶解樣品；(4)將溶劑系統(tǒng)的上相注入高速逆流色譜儀分離管中，待上相充滿整個管路后調(diào)整主機轉(zhuǎn)速，泵入下相，待流動相從柱出口流出，兩相在分離管中達(dá)到動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入(3)中的樣品溶液；在254nm波長下檢測，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖收集得到單體化合物bungeiside-A和bungeiside-B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟 (1)中所述白首烏粉末與加入的乙醇重量比為1 20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟(1)中超聲波提取30-60min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟(2)中使用10%-20%乙醇溶液洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟(2)中所述的大孔樹脂為D101，NKA12型大孔吸附樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟(3)中所述溶劑系統(tǒng)為正丁醇甲醇水(4 1 5，ν/ν)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟(3)中超聲脫氣30-60min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟(4)中所述高速逆流色譜儀的主機轉(zhuǎn)速為850rpm/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，其特征在于步驟 (4)中所述高速逆流色譜儀的流動相流速為2. OmL/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白首烏中單體化合物的分離純化方法，具體涉及從白首烏中分離純化單體化合物bungeiside-A和bungeiside-B的方法。本發(fā)明采用乙醇溶液超聲波提取制備白首烏粗提取物，采用大孔吸附樹脂柱先以水洗脫去除水溶性雜質(zhì)，再用較低濃度乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮得白首烏大孔樹脂粗分離物，再采用高速逆流色譜儀對粗分離物進(jìn)行分離純化，得到純度高于98％的bungeiside-A和bungeiside-B。本發(fā)明制備方法操作簡便、分離效率高、產(chǎn)品純度好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07H15/203GK101851260SQ201010181138
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者劉政波, 孫印石, 王建華 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)