專利名稱：藍刺菌素環(huán)肽化合物的純化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有至少一個可質子化氨基基團的環(huán)肽化合物的純化方法，特別地，本方法涉及藍刺菌素型化合物的純化，該方法是將混合物吸附在疏水性的反相層析介質上，連續(xù)用近乎線性梯度增加的乙酸進行洗脫。本方法還提供了選擇性地除去藍刺菌素發(fā)酵過程中的三肽-醛副產(chǎn)品，從而得到高純度的藍刺菌素化合物。
藍刺菌素環(huán)肽是具有抗真菌活性的天然產(chǎn)品。藍刺菌素環(huán)肽家族包括藍刺菌素B(ECB)、藍刺菌素C、阿庫來菌素Aγ、MuLundocandin、孢子真菌素A、肺炎菌素(Pneumocandin)A0、WF11899A以及肺炎菌素B0等天然產(chǎn)品。天然產(chǎn)品典型地是由各種微生物培養(yǎng)而得。例如藍刺菌素B是從真菌Aspergillus nidulans發(fā)酵得到的。
在尋找更有效物質的過程中，以各種方式對天然產(chǎn)品進行了修飾。其中最常用的修飾方法之一是取代天然產(chǎn)品上的N-酰基側鏈，得到半合成的衍生物。例如在美國專利Nos.4,293,489；4,320,052；5,166,135和5,541,160；以及EP359529；448353；447186；462531以及561639中描述了各種N-?；苌乃{刺菌素化合物，它們具有不同程度的抗真菌活性。
通過天然產(chǎn)品的脫?；磻约半S后用不同的?；鶊F進行再?；磻梢缘玫絅-?；苌铩５湫偷厥墙柚?例如脫酰酶)進行脫?；磻?。脫酰酶可從微生物Actinoplanes utaensis或Pseudomonas種獲得?？梢詤⒁娒绹鴮＠鸑os.4,293,489；4,304,716以及EP460,882。典型地，脫酰化產(chǎn)品是指相應天然產(chǎn)品的母核(即藍刺菌素B的脫?；a(chǎn)品是指藍刺菌素B核(ECBN))。不幸的是無論是發(fā)酵還是脫酰化過程均有副產(chǎn)品產(chǎn)生，它們很難去除，從而降低了所需的脫?；h(huán)肽核的純度。
美國專利Nos.4,874,843中描述了采用非分級樹脂以反相方式來純化藍刺菌素型產(chǎn)品的層析方法。盡管此方法改善了衍生自發(fā)酵過程產(chǎn)品的純度，但仍然需要進一步加以改進，其目的是去除那些很難從中間體脫酰化核及最終的?；幬锘钚曰衔镏蟹蛛x的污染物。由于最終藥物產(chǎn)品的活性強度取決于用來制備最終產(chǎn)品中間體的純度，因此，在制備過程的任何階段改善產(chǎn)品的純度都是非常必要的。理想的情況是，盡可能在制備過程的最早階段除去污染物。
在J.Chromatography，201，287-292(1980)以及Grieser，M.D.等人Analytical Chemistry，45，1348-1352(1973)中提供了有關非分級樹脂以及它們在液相分離中一般應用的討論。其中對分步或連續(xù)的梯度洗脫應用進行了討論；然而洗脫劑均含有顯量的有機溶劑。在制備過程中使用有機溶劑會涉及一些令人關注的問題，例如環(huán)境法規(guī)(如空氣排放標準)、特殊處理需要(如燃燒標準)以及廢棄限制(如毒性廢料法規(guī))。因此仍需要尋找洗脫系統(tǒng)，使之能最大限度地降低有機溶劑的使用同時又能將混合物分離成它們的純品成分。
本方法提供了含有至少一個可質子化氨基基團的各種發(fā)酵環(huán)肽產(chǎn)物(包括脫酰基藍刺菌素型化合物)從它們的發(fā)酵或混合肉汁中分離和純化的方法，具體講，該方法包括將混合物吸附在疏水的反相層析介質上，連續(xù)地用近乎線性增加的乙酸進行梯度洗脫，乙酸的濃度為0.1％至10.0％的水溶液(v/v)，優(yōu)選的是0.5％(pH＝5.5)至4.0％(pH＝2.5)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了純化藍刺菌素型化合物(包括其單一的衍生物)的方法，其中發(fā)酵混合物或部分純化混合物中的醛副產(chǎn)品(特別是三肽醛副產(chǎn)品)與衍生劑進行反應。優(yōu)選的是采用上述方法，在相應的藍刺菌素核純化前使發(fā)酵肉汁或混合肉汁與衍生劑進行反應。
這里所用的術語“衍生劑”是指可與三肽副產(chǎn)品上的醛功能基進行反應并生成中間體的試劑，該中間體在疏水性方面有很大不同，其足以使得三肽中間體能從所需的藍刺菌素型化合物中分離出來。
術語“藍刺菌素型化合物”是指具有下列通用結構的化合物，包 其中R為氫或-C(O)R’，其中的R’為烷基，鏈烯基，鏈炔基，芳基基團或至少與一個可質子化的氨基基團相連的雜芳基；R1為-H或-OH；R2為-H或-CH3；R3為-H，-CH3，-CH2CONH2或-CH2CH2NH2；R4為-H或-OH；R5為-OH，-OPO3H2，或-OSO3H；并且R6為-H或-OSO3H?！八{刺菌素核”是指脫?；乃{刺菌素化合物，其中R為氫。“ECBN”是指藍刺菌素B核，其中的R1，R4和R5為羥基，R2，R3和R7為甲基；并且R1和R6為氫。
除非另有說明，術語“烷基”是指含有1-30個碳原子并具有通式CnH2n+1的烴基。烷基可以是直鏈(例如甲基、乙基、丙基、丁基等)，也可以是支鏈的(例如異丙基、異丁基、叔丁基、新戊基等)，環(huán)狀的(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基)，或多環(huán)(例如雙環(huán)[2.2.1]庚烷，螺旋[2.2]戊烷等)。烷基可以是取代的，也可未被取代。相似地，烷氧基或鏈烷酸酯的烷基部分具有同樣的定義。
術語“鏈烯基”是指含有至少一個碳-碳雙鍵的無環(huán)烴。鏈烯基基團可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或多環(huán)的。鏈烯基可以是取代的，也可未被取代。
術語“鏈炔基”是指含有至少一個碳-碳三鍵的無環(huán)烴。鏈炔基可以是直鏈或支鏈的。鏈炔基可以是取代的，也可未被取代。
術語“芳基”是指具有單一(例如苯環(huán))或稠合環(huán)系統(tǒng)(例如萘、蒽和菲等)的芳香基團。芳基可以是取代的，也可未被取代。
術語“雜芳基”是指在其芳香環(huán)系統(tǒng)中含有至少一個雜原子的芳香基團(例如吡咯、吡啶、吲哚、噻吩、呋喃、苯并呋喃、咪唑、嘧啶、嘌呤、苯并咪唑、喹啉等)。芳香基團可由單一或稠合環(huán)系統(tǒng)組成。雜芳香基團可以是取代的，也可未被取代。
在有機化學尤其是有機生物化學的范圍內通常認為化合物的顯著取代是可以耐受甚至是有用的。例如在本發(fā)明中，術語烷基允許帶有取代，其為經(jīng)典的烷基，例如甲基、乙基、丙基、己基、異辛基、十二烷基、硬脂基等)。術語“基團”特別預想為并允許是帶有本領域內常見烷基上取代基，它們是羥基、鹵素、烷氧基、羰基、酮基、酯基、氨甲酸酯基(carbamato)等，也包括未取代基團。然而本領域內的專業(yè)人員通常明白，應當選擇取代基以使之不對化合物的藥物特性產(chǎn)生副作用或干擾藥物的用途。上述所定義的任意基團的合適取代基包括烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、鹵素、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、單-和二-烷氨基、季銨鹽、氨基烷氧基、羥基烷氨基、氨基烷硫基、氨甲?；?、羰基、羧基、乙醇?；?、甘氨?；?、肼基、脒基以及它們的組合物。
發(fā)酵和混合肉汁含有許多副產(chǎn)品，它們非常難于從需要的環(huán)肽產(chǎn)品中分離出去。“混合肉汁”是指轉化混合物，其中直接用脫酰酶處理發(fā)酵肉汁且不經(jīng)純化生成的脫酰化產(chǎn)品(例如ECBN)。過去采用反相液相層析并獲得一定的成功。然而為了得到更高純度的化合物，需要更好的純化方法。本發(fā)明申請人發(fā)現(xiàn)，通過使用反相層析介質并結合連續(xù)的近乎線性的乙酸梯度洗脫方案，可以使得從需要的含有可質子化氨基基團的發(fā)酵產(chǎn)品中分離發(fā)酵副產(chǎn)品的效果有所改善。
合適的疏水層析介質包括反相二氧化硅和有機聚合物，例如苯乙烯和二乙烯基苯共聚體、甲基丙烯酸酯聚合物。各種反相二氧化硅有市售，例如BTR，E.Merck，Eka Nobel，Millipore，Phenomenex，Whatman，或YMC。二氧化硅可由鏈長范圍在C1-C18(C1，C4，C8和C18是最常見的)的直鏈烷基烴或其它疏水配體(例如苯基或氰基)衍生而來。各種用于反相層析、液相層析的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂也有市售，例如DiaionTMHP和SP樹脂(可從Mitsubishi ChemicalIndustries Limited，Tokyo，Japan獲得)，大孔樹脂XAD-2，4和16樹脂(可從Rohm和Haas Chemical Co.，Philadephia，PA獲得)，以及來自Toso Haas(Montgomeryville，PA)的CG-161，300和1000Amberchrom樹脂。非分級樹脂通常以它們的孔體積(0.5-4.5ml/g)、特殊的表面積(200-800m2/g)、孔徑(40-1300)、孔粒徑分布和/或小珠粒徑分布為特征。優(yōu)選的非分級樹脂包括具有表面積為500m2/g、孔徑為200-300且粒徑為200-800μm的Diaion HP-20；具有表面積為1,000m2/g，孔徑為50-60且粒徑為250-600μm的SP-825；具有表面積為630m2/g，孔徑為100-200且粒徑為200-800μm的SP-207(HP-20的溴化產(chǎn)品)；以及具有表面積為900m2/g，孔徑為110-175且粒徑為80-160μm的CG-161CD。更加優(yōu)選的是HP-20和SP-825樹脂。
最初提供的是粗溶液或部分純化溶液，其中含有所需的具有至少一個可質子化氨基基團的環(huán)狀肽類化合物。通常，在用乙酸進行梯度洗脫的過程中氨基基團可被質子化，其所涉及pH范圍為5.5-2.5。優(yōu)選氨基為伯胺；然而，氨基也可為仲胺或叔胺，只要氮原子上其它取代基的疏水性不足，使得它們能夠克服帶正電的胺的極性即可。溶液可來自發(fā)酵或合成過程。例如環(huán)肽化合物可用下列合成方法制備得到美國專利No.5,696,084；J.Am.Chem.Soc.，108，6041(1986)；Evans，D.A.等人，J.Am.Chem.Soc.，109，5151(1987)；J.Med.Chem.，35，2843(1992)；以及Kurokawa，N.，等人，Tetrahedron，49，6195(1993)。粗溶液通常是混合肉汁。另外此方法也可用于部分純化物質的進一步純化(或精制)。
根據(jù)所使用的具體發(fā)酵方法，可以對溶液進行預過濾除去干擾層析過程的顆粒。過濾可以采用本領域內專業(yè)人員已知的任意手段進行，包括重力過濾，經(jīng)陶瓷濾器的真空過濾，其可以借助或不借助硅藻土TM濾器的幫助等等。也可經(jīng)離心，然后將液體從固體中傾倒出來，從而除去發(fā)酵肉汁中的固體。
如果需要可以采用本領域內已知的技術將發(fā)酵溶液濃縮，例如蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥等。濃縮物可再次過濾除去濃縮過程中產(chǎn)生的任何沉淀。
將粗品或部分純化的溶液裝填到填有上述疏水層析介質的層析柱上。用連續(xù)的近乎線性的乙酸進行梯度洗脫，將所需的環(huán)肽產(chǎn)品從層析介質上洗脫下來。乙酸濃度范圍為0.1％至10％的水溶液(v/v)，優(yōu)選的是約0.5％(pH＝5.5)至4％的乙酸水溶液(pH＝2.5)。所選擇的乙酸濃度范圍的上限需要根據(jù)所用層析介質的穩(wěn)定性以及被純化化合物在該pH下的穩(wěn)定性來決定。所選擇的乙酸濃度范圍的下限需要根據(jù)氨基被質子化的pH以及從疏水表面洗脫產(chǎn)品需要的乙酸濃度來決定。本領域內的專業(yè)人員將發(fā)現(xiàn)并不需要特別完美的線性梯度。“近乎線性”的含義包括平坦的凸起或凹陷梯度。
在梯度洗脫步驟結束時，典型地是采用額外體積的高濃度的乙酸溶液來完成洗脫。此過程結束時，需要將柱子進行再生以便能夠重復用于另外的純化循環(huán)。典型地，再生步驟包括在中性和堿性pH條件下用有機溶劑和水的混合物洗滌柱子，以去除殘留在柱基質上的物質。合適的溶劑包括乙腈、甲醇、異丙醇和丙酮。線性乙酸洗脫方案不僅提供了良好的選擇性(參見下列實施例1)，而且限制了柱再生操作中有機溶劑的使用。因此使得所使用的有機溶劑的絕對量以及在廢棄前必須處理的柱洗脫液的體積降至最小。
采用各種方法可從洗脫液中回收發(fā)酵產(chǎn)品。合適的回收方法包括結晶、蒸發(fā)濃縮以及冷凍干燥。
藍刺菌素B的發(fā)酵肉汁含有作為副產(chǎn)品的各種濃度的三肽醛(Asn-Gln-Leu-H)，它們具有下列化學結構(Ia)。在酶促脫?；磻^程中，三肽醛副產(chǎn)品以及藍刺菌素B經(jīng)歷了脫?；磻?，形成了相應的脫酰化三肽醛(Ib)。 其中的R為C(O)CH2CH(OH)C9H19(Ia-發(fā)酵副產(chǎn)品)或氫(Ib-從混合肉汁中得到的脫?；碑a(chǎn)品)。
出人意料的是，即使在適宜的條件下，脫?；娜┡cECBN的保留時間在反相液相層析中非常相似，這使得從所需的ECBN中分離脫酰化三肽醛(Ib)變得非常困難。如果不除掉三肽，在脫?；^程中，三肽醛上的游離氨基將與ECBN化合物上的游離氨基進行競爭。結果必須加入過量的?；衔镆员ＷCECBN化合物完全?；?。三肽雜質不僅消耗了需要的起始物質，而且產(chǎn)生了?；母碑a(chǎn)品，后者在隨后的?；疎CB化合物的純化過程中非常難以去除。優(yōu)選的是在ECBN化合物的再?；磻俺ト母碑a(chǎn)品。
在進行層析純化之前，通過使醛與衍生劑反應可以從發(fā)酵混合物或混合肉汁(即脫?；旌衔?中去除三肽醛副產(chǎn)品。衍生劑可以加入到醛功能基上，改變相對所需ECB化合物的三肽醛的層析保留時間。合適的衍生劑包括亞硫酸氫鈉、羥胺和半氨基脲鹽酸鹽。與其它修飾層析保留時間的方法相反，所用衍生劑的優(yōu)勢在于衍生劑對醛功能基的選擇性以及反應發(fā)生所需要的溫和條件。如果衍生劑和三肽醛之間的反應是可逆的，除去衍生劑即可容易地回收醛，回收的三肽可用于其它用途。
實施例在整個實施例使用了下列縮寫來代表相應的所列物質
ACN-乙腈TFA-三氟乙酸HP-20-具有的表面積為500m2/g、孔徑為200-300、粒徑為200-800μm的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂。
SP-825-具有表面積為1,000m2/g、孔徑為50-60、粒徑為250-600μm的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂。
SP-207-具有表面積為630m2/g、孔徑為100-200、粒徑為200-800μm的溴化苯乙烯/二乙烯基苯樹脂。
CG-161CD-具有表面積為900m2/g、孔徑為110-175、粒徑為80-160μm的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂。
層析制備和ECBN純化過程采用體積為0.2-5升的玻璃柱。所研究的層析基質包括HP-20、SP-825和SP-207(均可從Mitsubishi獲得)以及CG-161-DC(可從Toso Haas得到)。基質用50/50的水/ACN、0.1M氫氧化鈉溶液洗滌，最后在裝柱前用純乙腈(ACN)進行批洗滌。利用簡單的漿沉降技術將選擇的基質裝填到合適體積的柱中。對于柱體積小于一升的柱子來說，用常規(guī)的FPLC儀器(可從Pharmacia獲得)進行操作。對于5升柱子的實驗采用Waters Delta Prep3000控制系統(tǒng)進行操作。
在裝填到相應的柱之前，采用Cuno 30S濾器通過過濾澄清ECBN混合物。HP-20和SP-825柱在0.5％乙酸(HOAc)中進行預平衡，用氫氧化鈉調節(jié)pH至5.5，填充澄清的ECBN溶液。在HP-20柱中，每升填充樹脂大約裝填5-5.5g ECBN，而在SP-825柱中，每升填充樹脂大約裝填11-12g ECBN。裝填完畢后，以5倍柱體積(CV)的平衡緩沖液洗滌柱子。然后連續(xù)用5CV洗脫產(chǎn)品，線性梯度范圍為0.5％HOAc(pH＝5.5)至4％HOAc(pH＝2.5)。在梯度洗脫結束時，另外用2CV 4％HOAc溶液完成洗脫。在洗脫產(chǎn)品的過程中，收集到0.2CV的組分?？捎酶鞣N反相HPLC(RP-HPLC)方法對上述組分進行鑒定。合并合適的組分，得到主要產(chǎn)品(mainstream)混合物。依次用3CV 60/40 ACN和水的混合物及3CV 60/40 ACN和0.1N NaOH混合物洗滌柱子，使之再生。在操作期間，裝填、洗滌、再生和再平衡的流速為2CV/小時(150cm/小時)，洗脫的流速為1CV/小時(75cm/小時)。濃縮含有所需產(chǎn)品的洗脫液。
為了進行比較，除了基質的類型外，還對下列流動相的條件以及梯度洗脫方案進行了研究。
ACN修飾劑實施例1-3采用5CV、線性ACN梯度(用pH＝5.5的乙酸鹽緩沖液)。
乙酸洗脫除了先前描述的條件外，將乙酸的濃度增加到5％(實施例10)。還在HP-20和SP-825柱(實施例13-19)上，將分步梯度以及vonvex梯度與上述連續(xù)的線性梯度進行了比較。
樣品的分析特征采用下列分析方法對ECBN層析樣品的質量和數(shù)量進行了評價。
磷酸鹽(酯)系統(tǒng)用0.2％磷酸/ACN流動相洗脫Zorbox SBC-18，3.5微粒柱(0.46cm ID×15cm)，流速為1.0ml/分鐘。在40℃下操作柱子，并在210nm處檢測洗脫物。柱子用1％ACN平衡。注射樣品后，在9分鐘內用1-18.5％的ACN洗脫ECBN。然后用50％的ACN洗滌，以洗脫任何高度保留的成分。
磷酸/辛磺酸(OSA)系統(tǒng)除了流動相中含有30mM的OSA，此系統(tǒng)與上述討論的磷酸系統(tǒng)相似。柱子用9％ACN平衡。注射樣品后，在9分鐘內用9-24％的ACN洗脫ECBN。然后用50％的ACN洗滌，以洗脫高度保留的成分。柱流速以及檢測波長同上所述，但柱溫為50℃。該系統(tǒng)對于Asn-Gln-Leu-H三肽-醛成分的定量特別有用。
TFA系統(tǒng)采用Vydac C-18，3.5微柱(0.46cm×25cm)進行分析，流動相含有0.1％TFA。在20分鐘內用0-10％的ACN進行線性梯度洗脫，隨后用50％的ACN洗脫。柱流速、溫度以及檢測波長同上述的磷酸系統(tǒng)。
作為測定三肽含量的替代方法，還對樣品進行了氨基酸分析(AAA)。將樣品進行酸水解，用離子交換層析以及茚三酮衍生化作用測定水解物中Asn、Gln以及Thr的摩爾數(shù)。利用Thr的回收率來測定樣品中ECBN的摩爾數(shù)，Gin含量則表示三肽水平。用下列方程計算Asn-Gln-Leu-H三肽對ECBN的摩爾百分比(M％)M％Asn-Gln-Leu-H＝2×[Gln]/[Thr]在指定的波長下對選擇樣品進行了光密度(OD)測定，用來估計相對樣品濁度(OD@550nm)或總蛋白含量(OD@280nm)。
下列實施例將說明本發(fā)明但不限制本發(fā)明。
實施例1實施例1中，將采用乙腈洗脫方案與乙酸洗脫方案在各種非分級樹脂上的RP-HPLC層析進行了比較。表1中總結了采用指定洗脫方案和柱介質所觀察到的結果。
表1
在表1中，*為比較樣品；a為測定到的每升樹脂中ECBN的克數(shù)；b脫甲基雜質是指兩種ECBN化合物的混合物，其中蘇氨酸以及甲基脯氨酸肽單位上的甲基相應地丟失。
ACN修飾劑方案提供了較好的產(chǎn)量、總純度以及良好的脫甲基成分拆分效果；然而，乙腈是有機溶劑。表1中清楚地顯示乙酸方法提供了一種替代傳統(tǒng)有機溶劑洗脫方案的方法。數(shù)據(jù)還顯示，與乙酸分步梯度或臺階梯度相比，連續(xù)的乙酸梯度明顯提高了分辨率。即使實施例5(線性梯度)的產(chǎn)品產(chǎn)量稍微低一些，與實施例4(分步梯度)相比，主要產(chǎn)品洗脫液的體積更大一些，ECBN的總純度更高一些(83％對71％)，并且脫甲基含量更低一些(2％對11％)。
一般認為，采用乙酸洗脫方法從疏水基質中洗脫ECBN有兩種途徑(1)乙酸作為有機修飾劑起作用，從而增強了流動相的洗脫強度；(2)B溶劑(強洗脫溶劑，pH＝2.5)的低pH值可使ECBN胺功能性質子化，從而使得極性更大，并因此降低了其在疏水性的固定相中的保留時間。在實施例8和9的比較中，有機修飾劑以及4％乙酸溶液pH的作用均很明顯。在實施例9中，用100mM磷酸(pH＝2.5)取代4％的HOAc(pH＝2.5)作為B溶劑。如果ECBN的洗脫僅僅依賴于流動相的pH，那么ECBN的洗脫位置和回收率應與在實施例8中觀察到的一樣。實際上，磷酸洗脫的結果是ECBN的回收率僅約為50％，并且產(chǎn)品的洗脫峰顯示出相當程度的拖尾。因此4％的HOAc可以作為有機修飾劑，通過降低流動相的pH以及增加流動相的洗脫強度來完成洗脫。
乙酸還比乙腈提供了更大的選擇性。當將用于主要產(chǎn)品(從HP-20收集得到，以ACN對HOAc(相應地參見實施例1和5)進行洗脫)的RP-HPLC層析進行比較時，用HOAc洗脫得到的主要產(chǎn)品中沒有觀察到有后部雜質出現(xiàn)。在HOAc洗脫方案中，這些組分不被洗脫，直到柱子進行再生時為止。
實施例2實施例2將采用單柱/線性乙酸洗脫方案(如上所述)與雙柱/臺階乙腈洗脫方案進行了比較。另外，描述了未處理ECBN批次與在柱層析純化前用偏亞硫酸氫鈉處理的ECBN批次(實施例2-7和2-9)之間的比較。向柱裝料中加入10mM的偏亞硫酸氫鈉并將溶液攪拌6-8小時，可完成用偏亞硫酸氫鈉的預處理。單柱方法與上述采用線性乙酸洗脫的方案相同。
比較雙柱方法采用兩根HP-20柱，其采用頭-尾形式。將發(fā)酵肉汁裝填到兩根順序連接的HP-20柱上。任何未被第一根柱保留的ECBN在第二根柱上被濃縮。通常認為分布在兩根柱子上的ECBN的比例大致相等。裝填結束后，將頭柱斷接，用3.8柱體積(CV)的水洗滌。用3.3CV 5％HOAc洗滌完成頭柱的洗脫。調節(jié)來自第一根柱子主流產(chǎn)品的pH至5.0，并將其加裝到部分裝填的第二根(尾)柱上。在洗脫前，用6.3CV的水洗滌柱子。用臺階乙腈梯度(0-9.4％，約5CV并含有0.5％HOAc)來洗脫柱子。分級收集柱洗脫液，將具有所需純度(大于75％反相HPLC主峰純度且脫甲基組分低于10％)的組分進行混合作為主要產(chǎn)品，然后濃縮混合溶液。
表2比較了單柱與雙柱層析過程中以及處理與未處理ECBN發(fā)酵肉汁所觀察到的結果。
表2
在表2中，a報告值代表兩個獨立結晶和分析測定的平均值；b％主峰對總RP-HPLC峰面積；c％脫甲基雜質；bECBN/OD＝ECBN(RP-HPLC)的克數(shù)/總OD克數(shù)；其中的OD克數(shù)為OD@280nm，并假設1.0的E0.1％；e兩個批次之一具有高水含量；因此平均效力降低。
在對主要產(chǎn)品進行濃縮后，得到上述所報告的ECBN純度分析結果。反相HPLC主峰純度以及脫甲基水平均與單一的HP-20及SP-825柱實驗相似。然而，單一HP-20柱操作從頭至尾表現(xiàn)出稍大一些的脫甲基組分降低。通常，單柱方法得到ECBN反相HPLC純度等于或優(yōu)于雙柱方法得到的ECBN純度，因此前者提供了更為經(jīng)濟的純化手段。
尚無柱層析方案能夠顯著地降低三肽的水平；然而，用亞硫酸氫鈉預處理可以明顯地降低三肽雜質的含量。來自單柱研究的產(chǎn)品的ECBN/OD純度等于或優(yōu)于雙柱研究得到的結果。盡管ECBN/OD值不代表純度測量的絕對值，但它提供了很好的來自各種柱操作條件下ECBN純度的相對比較。當將柱裝料溶液的值(數(shù)據(jù)未給出)與那些濃縮的主要產(chǎn)品進行比較時，所有的柱操作給出的ECBN/OD純度均增加了10-15倍。
這里所引證的所有參考文獻均被引入本文。盡管為了闡明和理解的目的，前述的發(fā)明中已經(jīng)通過說明和實施例描述了某些細節(jié)，顯而易見，對于本領域內的專業(yè)人員來說可以進行某些變化和修飾。因此這些描述和實施例不應限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將由附錄的權利要求來界定。
權利要求
1.分離和純化環(huán)肽類產(chǎn)品的方法，其包括(i)提供含有環(huán)肽化合物的混合物，該環(huán)肽化合物具有連在其上的至少一個可質子化的氨基基團；(ii)將所述的混合物吸附到疏水的反相層析介質上；并且(iii)連續(xù)地用的近乎線性的乙酸進行梯度洗脫，乙酸濃度范圍為0.1％至10.0％的水溶液(v/v)。
2.權利要求1中所述的方法，其中的乙酸梯度范圍為0.5％至4.0％的水溶液(v/v)。
3.權利要求1中所述的方法，其中的環(huán)肽化合物由下式代表 其中的R為氫或-C(O)R’，其中的R’為烷基，鏈烯基，鏈炔基芳基，或至少與一個可質子化的氨基基團相連的雜芳基基團；R1為-H或-OH；R2為-H或-CH3；R3為-H，-CH3，-CH2CONH2或-CH2CH2NH2；R4為-H或-OH；R5為-OH，-OPO3H2，或-OSO3H；并且R6為-H或-OSO3H。
4.權利要求3中所述的方法，其中R為氫。
5.權利要求1中所述的方法，其中疏水的反相層析介質為有機聚合物。
6.權利要求5中所述的方法，其中的有機聚合物為苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物或甲基丙烯酸酯聚合物。
7.權利要求5中所述的方法，其中的有機聚合物為苯乙烯/二乙烯基苯樹脂，其具有的表面積為500m2/g，孔徑為200-300，粒徑為200-800μm；或為苯乙烯/二乙烯基苯樹脂，其具有的表面積為1,000m2/g，孔徑為50-60，粒徑為250-600μm。
8.權利要求1中所述的方法，其中所述的混合物為混合的肉汁產(chǎn)品。
9.權利要求1中所述的方法，其進一步包含(iv)回收所述的環(huán)肽化合物。
10.純化含有副產(chǎn)品醛的藍刺菌素-型化合物的方法，其包括(i)提供藍刺菌素-型化合物與副產(chǎn)品醛的混合物；(ii)向所述的混合物中加入衍生劑，生成衍生的醛產(chǎn)品；并且(iii)將所述衍生的醛產(chǎn)品與所述的藍刺菌素-型化合物分離。
11.權利要求10中所述的方法，其中所述的分離步驟(iii)包含權利要求1所述的方法。
12.權利要求10中所述的方法，其中所述藍刺菌素-型化合物由下式代表 其中的R為氫或-C(O)R’，其中R’為烷基，鏈烯基，鏈炔基，芳基，或至少與一個可質子化的氨基基團相連的雜芳基基團；R1為-H或-OH；R2為-H或-CH3；R3為-H，-CH3，-CH2CONH2或-CH2CH2NH2；R4為-H或-OH；R5為-OH，-OPO3H2，或-OSO3H；并且R6為-H或-OSO3H。
13.權利要求12中所述的方法，其中R為氫。
14.權利要求13中所述的方法，其中所述的分離步驟(iii)包含權利要求1所述的方法。
15.權利要求10中所述的方法，其中所述的副產(chǎn)品醛由下式代表 其中的R為-C(O)CH2CH(OH)C19H19或為氫。
16.權利要求10中所述的方法，其中所述的混合物為發(fā)酵肉汁產(chǎn)品。
17.權利要求10中所述的方法，其中所述的混合物為混合發(fā)酵肉汁產(chǎn)品。
18.權利要求10中所述的方法，其中所述的衍生劑選自亞硫酸氫鈉、羥胺和氨基脲鹽酸鹽。
19.權利要求15中所述的方法，其中所述的衍生劑為亞硫酸氫鈉。
20.權利要求15中所述的方法，其中所述的分離步驟(iii)包含權利要求1所述的方法。
全文摘要
本方法描述了含有至少一個可質子化氨基的各種發(fā)酵環(huán)肽產(chǎn)品(包括脫酰基藍刺菌素型化合物)從發(fā)酵或混合肉汁及歷經(jīng)部分純化過程的產(chǎn)品中進行分離和純化的方法,其包括將混合物吸附在疏水性的反相層析介質上,連續(xù)用0.1%至10.0%的乙酸水溶液(v/v)進行線性梯度洗脫。本方法還描述了采用衍生劑從發(fā)酵產(chǎn)品中除去三肽－醛副產(chǎn)品。
文檔編號C07K7/56GK1337968SQ9981551
公開日2002年2月27日 申請日期1999年12月8日 優(yōu)先權日1998年12月9日
發(fā)明者J·R·杜賓斯, E·P·克羅夫, J·T·維森吉 申請人:伊萊利利公司