專利名稱：：一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，尤其涉及一種水不溶性的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，該凝膠可通過(guò)注射針頭植入到軟組織中，起填充除皺、填充凹陷和豐唇等作用，屬于醫(yī)學(xué)美容和生物醫(yī)療
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景透明質(zhì)酸是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖雙糖相互結(jié)合構(gòu)成的線性高分子多糖，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織、雞冠和鏈球菌的夾膜中。透明質(zhì)酸屬于一種生理性物質(zhì)，具有高度的粘彈性、良好的生物相容性和無(wú)免疫原性，不具有種屬特異性，當(dāng)植入到人體內(nèi)之后不引起異體排斥反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)，所以在醫(yī)療、美容行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。但是天然的外源性透明質(zhì)酸的分子量水溶性高，在體內(nèi)很快被酶和自由基降解，在皮膚組織中的半衰期僅為12小時(shí)，這樣就限制了其在組織填充等方面的應(yīng)用，因?yàn)檫@些應(yīng)用需要透明質(zhì)酸在體內(nèi)有較長(zhǎng)的保留時(shí)間。通過(guò)對(duì)透明質(zhì)酸分子進(jìn)行改構(gòu)，可以在保留透明質(zhì)酸原有生物相容性的同時(shí)，改變透明質(zhì)酸的某些理化屬性，并拓寬其臨床應(yīng)用效果。改構(gòu)透明質(zhì)酸的方法主要有修飾和交聯(lián)。交聯(lián)透明質(zhì)酸的原理是使用一種或多種組合的化學(xué)交聯(lián)劑，利用交聯(lián)劑自身存在的基團(tuán)與透明質(zhì)酸上相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)(羧基、羥基和乙酰基)發(fā)生反應(yīng)，使透明質(zhì)酸分子之間交聯(lián)在一起，而形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)透明質(zhì)酸具有水溶性低、穩(wěn)定性好和粘彈性優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)知道有多種制備交聯(lián)透明質(zhì)酸方法。例如，美國(guó)專利4，582,865公開(kāi)了利用二乙烯基砜作為交聯(lián)劑制備透明質(zhì)酸凝膠的方法；美國(guó)專利5,356，883公開(kāi)了利用碳二亞胺與透明質(zhì)酸或其鹽的羧基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的方法；美國(guó)專利5，827,937公開(kāi)了通過(guò)兩步交聯(lián)反應(yīng)得到交聯(lián)多糖凝膠的方法；中國(guó)專利CN1342171A描述了多重交聯(lián)的透明質(zhì)酸衍生物的生產(chǎn)方法；中國(guó)專利CN1590444描述了透明質(zhì)酸經(jīng)脫蛋白質(zhì)處理后，用縮水甘油醚交聯(lián)制得透明質(zhì)酸凝膠的過(guò)程。但是，上述專利只敘述了交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊的制備過(guò)程，對(duì)凝膠中的雜質(zhì)即未反應(yīng)的交聯(lián)劑的去除、制備成可注射凝膠的工藝以及凝膠生物相容性等方面，未進(jìn)行描述。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能去除凝膠中雜質(zhì)的用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，其歩驟為第一歩.將分子量為50-300萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸原料溶解于pHMO、濃度為0.05-4.0M堿性溶液中，配制成5-20%透明質(zhì)酸堿性溶液，加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸原料重量比為15:1-1:5，在多孔模具容器中，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25'C-5(TC，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)-12小時(shí)，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊；第二步.將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊加入到濃度為0.01-2M、pH值〈5的酸性溶液中，酸性溶液的量與凝膠塊重量比為1:1-10:1，室溫放置2小時(shí)-24小時(shí)，然后倒去鹽酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在至少2天內(nèi)，更換6次以上生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液量為凝膠體積的5-50倍，得到透明質(zhì)酸濃度為0.5%-4.0%凝膠塊；第三歩.利用不銹鋼擠壓裝置，利用2kg—8kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為50um—2000um的多孔濾片擠出，將塊狀凝膠擠碎成高度粘彈性的微粒凝膠。所述的透明質(zhì)酸原料為細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鹽干粉，可選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀或透明質(zhì)酸鈣；所述的堿性溶液為NaOH、KOH或者化20)3溶液；所述的交聯(lián)劑為雙環(huán)氧化物；所述的雙環(huán)氧化物為乙二醇二縮水甘油醚或丁二醇二縮水甘油醚。所述的多孔模具容器的每孔容積為0.5rnl-10nd，各孔大小一致，形狀相同，其材質(zhì)為玻璃、塑料、聚四氟乙烯或不銹鋼。所述的多孔模具容器可選自細(xì)胞培養(yǎng)用12孔板、24孔板或48孔板。本發(fā)明提供了一種交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中未參加交聯(lián)反應(yīng)的雜質(zhì)的去除方法，即提供了一種在酸性溶液中洗滌這些塊狀凝膠的方法。所述的酸性溶液為鹽酸、硫酸、磷酸或醋酸溶液。其中所述的加入酸性溶液起進(jìn)一歩交聯(lián)反應(yīng)，與"專利CN1342171A描述了多重交聯(lián)的透明質(zhì)酸衍生物的生產(chǎn)方法"中描述多重交聯(lián)的方法有所不同，該專利中所述多重交聯(lián)方法，每一交聯(lián)歩驟均加入交聯(lián)劑起反應(yīng)。而本發(fā)明加入酸性溶液，不用加入交聯(lián)劑，且具有以下作用促進(jìn)未交聯(lián)的交聯(lián)劑與未交聯(lián)的透明質(zhì)酸進(jìn)一步發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，提高凝膠交聯(lián)程度，改善凝膠的機(jī)械特性，增加凝膠的穩(wěn)定性；降低交聯(lián)劑殘留量；去除未反應(yīng)的透明質(zhì)酸；中和堿性溶液。更進(jìn)一步地，本發(fā)明中在酸性條件下，與透明質(zhì)酸羧基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的雙環(huán)氧化物，雙環(huán)氧化物在酸性條件下，可與透明質(zhì)酸的羧基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成含有酯鍵的交聯(lián)透明質(zhì)酸，它是在堿性條件下與透明質(zhì)酸羥基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)后的剩余的、殘留的交聯(lián)劑，所以量少；因交聯(lián)劑量少，故參與交聯(lián)反應(yīng)的透明質(zhì)酸羧基也少，而透明質(zhì)酸羧基是對(duì)多聚糖保留聚陰離子特性起重要作用，即對(duì)保留透明質(zhì)酸的生物相容性起重要作用。交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在生理平衡液中充分膨脹后，透明質(zhì)酸濃度不會(huì)再隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng)而改變，也就是說(shuō)，透明質(zhì)酸濃度因交聯(lián)多聚物在生理平衡液中達(dá)到了平衡而恒定。本發(fā)明具有特殊物理性能，以頻率0.05-10Hz下動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G')為500-2000Pa，耗能模量(G")為50-200Pa，相角(S)小于20°，也就是說(shuō)，微粒凝膠體現(xiàn)為高度粘彈性特征；在頻率0.05-10Hz下，復(fù)數(shù)粘度(n為10-3500Pa"，在推桿的壓力作用下該高粘度的微粒凝膠可以順利地通過(guò)注射針頭。當(dāng)透明質(zhì)酸濃度增加時(shí)，溶液中分子數(shù)目增加，多糖聚合物分子鏈被迫互相靠攏由此增加分子間的交互作用。共價(jià)交聯(lián)是顯著提高聚合物分子鏈交互作用以形成凝膠的一個(gè)方法，這時(shí)凝膠將不會(huì)在外力的作用下輕易變形或改變形狀。儲(chǔ)能(彈性)模量G'和耗能(粘性)模量G"分別表示當(dāng)形變速率(測(cè)試頻率)改變時(shí)材料可以復(fù)原(彈性響應(yīng))或流動(dòng)(粘性響應(yīng))的相對(duì)程度。這兩個(gè)模量6己經(jīng)被證明是聚合物溶液和凝膠結(jié)構(gòu)的靈敏探測(cè)器。對(duì)于高粘彈性凝膠而言，在測(cè)定范圍內(nèi)，G'總是大于G"，而且它們的值對(duì)頻率的依賴不明顯。復(fù)數(shù)模量G*，能夠綜合反映彈性組分G'和粘性組分G"兩者之間的關(guān)系，即它們之間的關(guān)系是G'=G'cosS禾BG"=G*sinS，其中5是相角。S越大，物質(zhì)越接近牛頓流體；S越小，物質(zhì)越接近虎克固體，結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定。其中所述的特殊物理性能，還指微粒凝膠具有假塑性，即剪切薄現(xiàn)象，在頻率0.05-10Hz范圍下微粒凝膠的復(fù)數(shù)粘度(V)在10-3500Pa's之間。所謂假塑性，或剪切薄現(xiàn)象，就是物質(zhì)粘度隨著剪切頻率的增加而降低。物質(zhì)的假塑性，可使物質(zhì)能夠順利地通過(guò)注射針頭。本發(fā)明的穩(wěn)定性好，指微粒凝膠經(jīng)過(guò)高溫高壓作用后，凝膠物理性能未發(fā)生明顯改變，其儲(chǔ)能模量、耗能模量、相角及粘度等指標(biāo)未發(fā)生明顯變化。微粒凝膠耐受高溫高壓作用的性能非常重要，可為凝膠提供一種可行的滅菌方法。另外，穩(wěn)定性好還體現(xiàn)在，往lg凝膠中加入含有33U透明質(zhì)酸酶的磷酸鹽緩沖液中，37。C作用48小時(shí)之后，使用咔唑分析法(Carbazole)測(cè)定透明質(zhì)酸濃度，計(jì)算交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的酶降解率為10-70%。本發(fā)明的生物相容性好，指細(xì)胞毒性低于2級(jí)，符合國(guó)家對(duì)生物材料的安全性要求。本發(fā)明的生物可降解性，指被體內(nèi)固有的酶，如透明質(zhì)酸酶、糖苷酶等降解。本發(fā)明徹底除去交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的透析液，使用壓力裝置借助機(jī)械壓力將凝膠擠壓通過(guò)多孔濾片，即可獲得可注射的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠，該凝膠經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，預(yù)灌裝于一次性無(wú)菌注射器中，可順利通過(guò)針頭注射到體內(nèi)，可用于組織填充。制備得到的用于組織填充的可注射交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠是這樣植入體內(nèi)的，高溫滅菌后，預(yù)灌裝于有刻度的無(wú)菌一次性注射器中，通過(guò)G27或G30號(hào)針頭，緩慢注入體內(nèi)，根據(jù)凹陷、皺褶的深度決定注射量，從而達(dá)到修復(fù)凹陷、填充除皺和豐唇等美容效果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性好，經(jīng)過(guò)高溫高壓處理后，仍能保留其原本的高度粘彈性，具有抵抗酶降解能力，抵抗酶降解能力對(duì)凝膠導(dǎo)入體內(nèi)后，在體內(nèi)組織中存留的時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)具生物可降解性、具生物相容性。圖l透明質(zhì)酸透明質(zhì)素的結(jié)構(gòu)；圖2在堿性條件下，透明質(zhì)酸與雙環(huán)氧化合物的反應(yīng)式；圖3在酸性條件下，透明質(zhì)酸與雙環(huán)氧化合物的反應(yīng)式；圖4本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的微粒凝膠的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩說(shuō)明。實(shí)施例1將l.Og細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為IOO萬(wàn)道爾頓)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，溶解于10ral的0.2MNaOH溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%"/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，反應(yīng)式如圖2所示，加入丁二醇二縮水甘油醚1.3g，充分?jǐn)嚢琛５谷朊靠兹莘e約為2.9ml的細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，置于35'C恒溫箱6小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，加入到濃度為0.1M的5(kl鹽酸溶液中，室溫放置14小時(shí)，反應(yīng)式如圖3所示，然后倒去鹽酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為400um的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為2.18%。實(shí)施例2將1.0g細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉千粉(分子量為IOO萬(wàn)道爾頓)溶解于10ml的O.5MNaOH溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入丁二醇二縮水甘油醚1.0g，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為2.9tnl的細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，置于35T:恒溫箱6小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊，取出凝膠塊，加入到濃度為O.lM的50ml鹽酸溶液中，室溫放置14小時(shí)。然后倒去鹽酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為400ym的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為2.02%。實(shí)施例3將l.Og細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為120萬(wàn)道爾頓)溶解于10ml的0.2MNaOH溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入乙二醇二縮水甘油醚1.2g，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為2.9ml的細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，置于37'C恒溫箱4小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，加入濃度為O.lM的50ml鹽酸溶液中，室溫放置16小時(shí)。然后倒去鹽酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為400um的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為2.15%。實(shí)施例4將1.0g細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為120萬(wàn)道爾頓)溶解于10ml的0.5MNaOH溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入乙二醇二縮水甘油醚1.0g，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為2.9ml的細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，置于37'C恒溫箱4小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，加入到濃度為O.1M的50ml鹽酸溶液中，室溫放置16小時(shí)。然后倒去鹽酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換IO次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為500ym的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為1.93%。實(shí)施例5將2.0g細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為IOO萬(wàn)道爾頓)溶解于20ml的0.5MNa2C03溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入丁二醇二縮水甘油醚2.6g，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為3.0ml的細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，置于37。C恒溫箱6小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，加入到濃度為0.1M的100ml硫酸溶液中，室溫放置14小時(shí)。然后倒去硫酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為1000ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為500yni的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為2.23%。實(shí)施例6將l.Og細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為100萬(wàn)道爾頓)溶解于10ml的0.5MK0H溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入丁二醇二縮水甘油醚l.Og，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為1.7ml的細(xì)胞培養(yǎng)用48孔板中，置于37'C恒溫箱4小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，加入到濃度為0.1M的50ml磷酸溶液中，37'C放置6小時(shí)。然后倒去磷酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為500ym的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為1.98%。實(shí)施例7將1.0g細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為120萬(wàn)道爾頓)溶解于10ml的0.5MK0H溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入乙二醇二縮水甘油醚1.0g，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為L(zhǎng)7ml的細(xì)胞培養(yǎng)用48孔板中，置于35'C恒溫箱6小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，加入到濃度為0.2M的50ml醋酸溶液中，室溫放置14小時(shí)。然后倒去醋酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為600um的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為1.95%。對(duì)比例1將l.Og細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為IOO萬(wàn)道爾頓)溶解于10ml的0.2MNaOH溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入丁二醇二縮水甘油醚1.3g，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為3.0ml的細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，置于35'C恒溫箱6小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，直接用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500ml。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為400ym的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為1.46%。對(duì)比例2將l.Og細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量為IOO萬(wàn)道爾頓)溶解于10ml的0.5MNaOH溶液中，攪拌，使其徹底溶解，配制成10.0%(w/v)透明質(zhì)酸堿性溶液，加入丁二醇二縮水甘油醚1.0g，充分?jǐn)嚢?。倒入每孔容積約為3.Oml的細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，置于35'C恒溫箱6小時(shí)，即形成大小一致、形狀規(guī)則的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊。取出凝膠塊，直接用生理平衡液清洗、透析，在隨后的5天內(nèi)，更換10次生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液為500inl。除去生理平衡液，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊裝入擠壓裝置中，利用5kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為400pm的多孔濾片擠出，塊狀凝膠變成微粒凝膠。使用咔唑分析法測(cè)定凝膠中透明質(zhì)酸濃度，為1.21%。分析酸溶液處理對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠性能的影響對(duì)實(shí)施例l一實(shí)施例7、對(duì)比例1和對(duì)比例2制備得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠進(jìn)行濃度測(cè)定、流變學(xué)性能測(cè)定和體外透明質(zhì)酸酶降解試驗(yàn)等分析。采用咔唑法測(cè)定糖醛酸含量，可推算得到透明質(zhì)酸凝膠濃度。流變學(xué)性能的測(cè)定，于0.05-10Hz及25'C下，采用流變儀(AR2000e，美國(guó)TA公司)測(cè)定各凝膠的儲(chǔ)能模量G'、耗能模量G"、相角S以及復(fù)數(shù)粘度n*。體外透明質(zhì)酸酶降解試驗(yàn)，各取lg凝膠于含有33U透明質(zhì)酸酶的磷酸鹽緩沖液5ml中，37T:作用48小時(shí)之后，使用咔挫分析法測(cè)定降解液中糖醛酸濃度，推算交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的降解率。結(jié)果見(jiàn)表l。表1酸溶液處理對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠性能的影響實(shí)施例濃度流變性能(0.05—10Hz)酶降解率G'(Pa)G"(Pa)STf(Pa.s)實(shí)施例12.18%1152-1605128-1604.6°-7.9°3080-3223.4%實(shí)施例22.02%901-1256102-1244.7。-7.9°2890-2031.1%實(shí)施例32.15%6卜162222-1674.7。-7.9°3100-3523.2%實(shí)施例41.93%1012-127898-1154.8。-8.0°2634-2334.8%實(shí)施例52.23%1233-1823142-1864.5°-7.8°3300-4018.5%實(shí)施例61.98%968-13774.8。-2987-2433.5%實(shí)施例71.95%885-116588-1204,9。-8.1°2881-1936.7%對(duì)比例11.46%502-766121-795.9。誦13.5°2012-1258.5%對(duì)比例21.21%255-39042-578.3。-11.7°1017-676.7%結(jié)果表明，制備交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠時(shí)，用酸處理凝膠塊可顯著提高交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的終濃度、粘彈性和穩(wěn)定性。另外，流變學(xué)性能結(jié)果還顯示用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠具有高度粘彈性和假塑性。分析高溫處理對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠性能的影響將實(shí)施例l、實(shí)施例2制備得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠進(jìn)行高溫(121°C，30min)處理，于0.05-10Hz及35'C下，采用流變儀測(cè)定滅菌前后凝膠的儲(chǔ)能模量G'、耗能模量G"、相角S以及復(fù)數(shù)粘度11*。同時(shí)，各取lg凝膠于含有33U透明質(zhì)酸酶的磷酸鹽緩沖液5ral中，37'C作用48小時(shí)之后，使用咔唑分析法測(cè)定降解液中糖醛酸濃度，推算交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的降解率。結(jié)果如表2。表2高溫處理對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠性能的影響實(shí)施例1實(shí)施例2高溫處理前高溫處理后高溫處理前高溫處理后流變性能(0.05G，1152-1605Pa1015-1556Pa901-1256Pa855-1179PaG"128-160Pa121-172Pa102-124Pa106-134Pa12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明，高溫處理凝后，交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的流變性性能變化不明顯，抗酶降解能力有所下降，但下降程度仍屬可接受水平。用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的微粒大小及其分布測(cè)定對(duì)實(shí)施例l、實(shí)施例2制備得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠，使用激光散射儀(LS300)測(cè)定其微粒的大小及其分布。并以美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的、以丁二醇二縮水甘油醚制備的的軟組織填充用產(chǎn)品Restylane(Q-MED公司)、Juvederm(LEADerm公司)作為對(duì)照，結(jié)果如表3。表3與國(guó)外市售產(chǎn)品微粒大小及分布的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明，本發(fā)明的微粒凝膠的微粒大小及其分布與市售同類產(chǎn)品一致，具有良好的可注射能力。交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠細(xì)胞相容性的測(cè)定將實(shí)施例1制備得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠經(jīng)過(guò)蒸汽高壓滅菌后，依照國(guó)家醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)規(guī)定的方法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。采用MTT法、浸提液方式，檢測(cè)凝膠的細(xì)胞毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1的透明質(zhì)酸凝膠組的細(xì)胞增殖率接近于陰性對(duì)照組，細(xì)胞毒性為l級(jí)，如圖4所示，表明本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠適用于人體組織填充。權(quán)利要求1.一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，其步驟為第一步.將分子量為50-300萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸原料溶解于pH＞10、濃度為0.05-4.0M堿性溶液中，配制成5-20％透明質(zhì)酸堿性溶液，加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸原料重量份配比為15∶1-1∶5，在多孔模具容器中，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25℃-50℃，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)-12小時(shí)，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊；第二步.將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠塊加入到濃度為0.01-2M、pH值＜5的酸性溶液中，酸性溶液的量與凝膠塊重量份配比為1∶1-10∶1，室溫放置2小時(shí)-24小時(shí)，然后倒去鹽酸溶液，用生理平衡液清洗、透析，在至少2天內(nèi)，更換6次以上生理平衡液，每次用于透析的生理平衡液量為凝膠體積的5-50倍，得到透明質(zhì)酸濃度為0.5％-4.0％凝膠塊；第三步.利用不銹鋼擠壓裝置，利用2kg-8kg的正壓力將凝膠塊通過(guò)孔徑為50μm-2000μm的多孔濾片擠出，將塊狀凝膠擠碎成高度粘彈性的微粒凝膠。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，所述的透明質(zhì)酸原料為細(xì)菌發(fā)酵來(lái)源的透明質(zhì)酸鹽，可選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀或透明質(zhì)酸鈣。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，所述的堿性溶液為NaOH、K0H或者Na2C(V溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，所述的交聯(lián)劑為雙環(huán)氧化物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，所述的雙環(huán)氧化物為l，3-丁二烯二環(huán)氧化物、1，2，7，8-二環(huán)氧辛烷、1，5-己二烯二環(huán)氧化物；乙二醇二縮水甘油醚、丁二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚等二縮水甘油醚。其中特別優(yōu)選使用乙二醇二縮水甘油醚和丁二醇二縮水甘油醚。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，所述的多孔模具容器的每孔容積為0.5ml-10ml，各孔大小一致，形狀相同，其材質(zhì)為玻璃、塑料、聚四氟乙烯或不銹鋼。所述的多孔模具容器可選自細(xì)胞培養(yǎng)用12孔板、24孔板或48孔板。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于組織填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，其特征在于，所述的酸性溶液為鹽酸、硫酸、磷酸或醋酸溶液。全文摘要本發(fā)明涉及一種組織填充用的交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠的制備方法，由透明質(zhì)酸和雙環(huán)氧化物在一特定模具里經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)得到凝膠塊后，進(jìn)一步用酸溶液處理，經(jīng)生理平衡液純化、透析后，被機(jī)械設(shè)備擠碎成微粒凝膠。通過(guò)上述工藝制備得到交聯(lián)透明質(zhì)酸微粒凝膠具備下列特征，具有特殊物理性能以頻率0.05-10Hz下動(dòng)態(tài)粘彈性表示，其儲(chǔ)能模量(G’)為500-2000Pa，耗能模量(G”)為50-200Pa，相角(δ)小于20，復(fù)數(shù)粘度(η*)為10-3500Pa·s；穩(wěn)定性好高壓高溫處理不影響凝膠的性能，抗酶解能力強(qiáng)；具有可注射性微粒大小在50-1000μm之間；生物相容性好無(wú)細(xì)胞毒性；具有生物可降解性可被透明質(zhì)酸酶完全降解。本發(fā)明的凝膠適合用于組織填充及生物醫(yī)療等領(lǐng)域。文檔編號(hào)A61L27/20GK101244290SQ20071017144公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者劉秀杰,彬朱,葛翠蘭,顧其勝申請(qǐng)人:顧其勝;葛翠蘭