專利名稱：分子佐劑牛C3d3分子及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型分子佐劑牛C3d3分子及其制備方法。
背景技術：
C3d是補體C3不可再被水解的最小片段，具有與抗原共價結合的特性。在抗原特異性免疫建立之前，C3d可識別非已抗原并與之共價結合，增強了抗原遞呈細胞的遞呈能力、降低了B細胞的活化閾、提高特異性抗體的滴度、促進抗體親和力成熟等。近年來研究顯示，C3d還可以促進抗原特異性細胞免疫應答水平并改變機體免疫應答模式。所以，C3d是連接固有性免疫和獲得性免疫的橋梁。
Dempsey等人最早發(fā)現了C3d分子的佐劑作用1，他們發(fā)現C3d分子偶聯的抗原的免疫原性比單純抗原增強1000倍，大大降低了B細胞激活的活化閾。隨后Ross課題組又將C3d用作于分子佐劑，相繼證明C3d可增強流感病毒HAi、HIVgp120ii和麻疹病毒iii的特異性抗體應答。
C3d作為免疫分子佐劑可能存在以下幾種作用機制(1)C3d作為補體系統(tǒng)的裂解片段能天然地對抗原物質進行選擇，并提供給獲得性免疫系統(tǒng)所識別?？乖悸揅3d能增強CR2細胞(B細胞，FDC等)對抗原的攝取，而且，這種攝取可能是不依賴抗原受體的。(2)C3d/C3dg包裹的抗原被BCR特異性識別產生抗原刺激信號，同時又與B細胞表面的CR2結合形成交聯橋.提供共刺激活化信號.促進B細胞活化，降低B細胞的活化閾。(3)C3d/C3dg包裹的抗原能以Ag-C3d-CR2-FDC方式儲留在生發(fā)中心的FDC表面，對高度增殖和超突變的中央母細胞進行選擇.從而促進抗體親和力的成熟.并誘導記憶性B細胞的產生，維持免疫記憶(4)若干C3d分子的偶聯能增大抗原的分子量，提高抗原尤其是小分子量抗原或與BCR呈低親和性結合抗原的免疫原性。
由此可見，C3d分子有望成為一種新型的分子佐劑，對目前無免疫原性或免疫原性很弱的抗原物質，具有廣闊的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種新型的分子佐劑牛C3d3分子。
本發(fā)明的目的之二在于提供該分子佐劑牛C3d3的編碼基因本發(fā)明的目的之三提供該分子佐劑牛C3d3分子的制備方法。
C3d是補體C3不可再被酶解的最小片段，在抗原特異性免疫建立之前，C3d可識別非已抗原并與之共價結合，增強了抗原遞呈細胞的遞呈能力、降低了B細胞的活化閾、提高特異性抗體的滴度、促進抗體親和力成熟等。近年來研究顯示，3拷貝的C3d(C3d3)可以顯著增強抗原特異性體液以及細胞免疫應答水平并改變機體免疫應答模式。因此，C3d作為連接固有性免疫和獲得性免疫的橋梁，成為了一種新型的分子佐劑，為提高基因疫苗的免疫效果提供了新的途徑，具有廣闊的應用前景。
本發(fā)明的分子佐劑為3個串聯的牛C3d(簡稱C3d3)，以期該分子佐劑與目的抗原基因融合后，可提高該抗原的免疫原性。
為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案一種分子佐劑牛C3d3分子，其特征在于該分子佐劑具有SEQ NO 8所示的氨基酸序列。
上述的分子佐劑以頭尾連接方式串聯3個牛C3d分子，各分子之間通過柔性連接臂(G4S)2GS進行連接。
編碼上述的分子佐劑牛C3d3分子的基因，其特征在于具有SEQ NO 7所示的堿基序列。
上述的分子佐劑牛C3d3分子的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.提取牛肝的總RNA，然后以牛肝的總RNA為模板，根據牛C3d基因序列和連接臂序列，分別設計1#，2#和3#C3d的特異性引物1#C3d上游引物5’TTAGGTACCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTTCTCACCTTATCCAAACCCCCTC3’1#C3d下游引物5’TTAGGATCCGTTGCGGCTGGGCAGTTGG3’3#C3d上游引物5’TTAGGATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTTCTCACCTTATCCAAACCCCCTC3’3#C3d下游引物5’TTAGCGGCCGCTTATCAGTTGCGGCTGGGCAGTTGG3’30℃10min，47℃30min，5℃5min進行反轉錄，然后85℃1min，64℃1min，72℃1min，循環(huán)25次進行PCR擴增得到900bp左右大小的三個C3d片段，分別編號為1#，2#和3#C3d；b.將用KpnI/BamH I雙酶切的上述1#C3d和用BamH I/Not I雙酶切的上述3#C3d與Kpn I/Not I雙酶切的質粒pSecTag2A連接，構成重組質粒pSecTag2A-C3d2，轉化大腸桿菌DH5α構建pSecTag2A-C3d2/DH5α基因工程重組菌；c.將上述重組質粒pSecTag2A-C3d2用BamH I消化，并用堿性磷酸酶CIAP處理，防止其自連，然后與BamH I單酶切的2#C3d片段連接得到重組質粒pSecTag2A-C3d3，轉化大腸桿菌DH5α構建pSecTag2A-C3d3/DH5α基因工程重組菌，即得到所需的分子佐劑牛C3d3分子。
采用本發(fā)明的牛C3d3作為分子佐劑與金黃色葡萄球菌Clfa基因進行融合，構建金黃色葡萄球菌DNA疫苗，在免疫小鼠實驗中發(fā)現融合了牛C3d3的DNA疫苗抗體最高效價為6400，而未融合的為3200，由此證明牛C3d3可以顯著增強目的抗原在小鼠體內的體液免疫應答，同時還有效地刺激小鼠機體產生明顯和持久的特異性淋巴細胞增殖反應，未融合牛C3d3的DNA疫苗刺激指數為1.521±0.3267，而融合的為1.813±0.2567。由此可見牛C3d3作為分子佐劑，能提高抗原在機體內的體液免疫應答和細胞免疫應答。


圖1為本發(fā)明的分子佐劑C3d3的結構圖。
圖2為本發(fā)明的分子佐劑C3d3重組質粒pSecTag2A-C3d3的構建流程圖。
具體實施方案本發(fā)明主要包括兩大部分重組質粒pSecTag2A-C3d2的構建，重組質粒pSecTag2A-C3d3的構建。
具體方案敘述如下1.獲得牛C3d基因先提取牛肝的總RNA，然后以牛肝的總RNA為模板，根據牛C3d基因序列和連接臂序列，分別設計1#，2#和3#C3d的特異性引物1#C3d上游引物
5’TTAGGTACCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTTCTCACCTTATCCAAACCCCCTC3’1#C3d下游引物5’TTAGGATCCGTTGCGGCTGGGCAGTTGG3’2#C3d上游引物5’TTAGGATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTTCTCACCTTATCCAAACCCCCTC3’2#C3d下游引物5’TTAGGATCCGTTGCGGCTGGGCAGTTGG3’3#C3d上游引物5’TTAGGATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTTCTCACCTTATCCAAACCCCCTC3’3#C3d下游引物5’TTAGCGGCCGCTTATCAGTTGCGGCTGGGCAGTTGG3’30℃10min，47℃30min，5℃5min進行反轉錄，然后85℃1min，64℃1min，72℃1min，循環(huán)25次進行PCR擴增得到900bp左右大小的三個C3d片段，DNA序列測定表明擴增片段序列與牛C3d序列相符。
2.重組質粒pSecTag2A-C3d2的構建及鑒定將用KpnI/BamH I雙酶切的1#C3d和用BamH I/Not I雙酶切的3#C3d與KpnI/Not I雙酶切的質粒pSecTag2A連接，構成重組質粒pSecTag2A-C3d2，轉化大腸桿菌DH5α構建pSecTag2A-C3d2/DH5α基因工程重組菌。挑選出抗Ampicillin的陽性克隆，抽提質粒，用Kpn I/BamH I以及BamH I/Not I雙酶切，均得到900bp左右和6kb左右大小的兩個片段，同時還用KpnI和NotI雙酶切，得到1.8kb和5.1kb左右大小的兩個片段，與預期結果相符，證實重組質粒pSecTag2A-C3d2構建正確。
3.重組質粒pSecTag2A-C3d3的構建及鑒定重組質粒pSecTag2A-C3d2用BamH I消化，并用堿性磷酸酶CIAP處理，防止其自連，然后與BamH I單酶切的2#C3d片段連接得到重組質粒pSecTag2A-C3d3，轉化大腸桿菌DH5α構建pSecTag2A-C3d3/DH5α基因工程重組菌，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆，抽提質粒，用Kpn I/Not I雙酶切，得到2.7kb和5.1kb左右大小的兩個片段，同時還用BamH I單酶切，得到900bp和6.9kb左右大小的兩個片段，與預期結果相符。用Sac I酶切C3d3片段得到1kb，900bp和200bp三個片段，說明第二個C3d為正向插入。
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權利要求
1.一種分子佐劑牛C3d3分子，其特征在于該分子佐劑具有SEQ NO 8所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的分子佐劑牛C3d3分子，其特征在于該分子佐劑以頭尾連接方式串聯3個牛C3d分子，各分子之間通過柔性連接臂(G4S)2GS進行連接。
3.編碼根據權利要求1所述的分子佐劑牛C3d3分子的基因，其特征在于具有SEQ NO 7所示的堿基序列。
4.一種根據權利要求1或2所述分子佐劑牛C3d3分子的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.提取牛肝的總RNA，然后以牛肝的總RNA為模板，根據牛C3d基因序列和連接臂序列，分別設計1#，2#和3#C3d的特異性引物1#C3d上游引物5’TTAGGTACCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTTCTCACCTTATCCAAACCCCCTC3’1#C3d下游引物5’TTAGGATCCGTTGCGGCTGGGCAGTTGG3’3#C3d上游引物5’TTAGGATCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTTCTCACCTTATCCAAACCCCCTC3’3#C3d下游引物5’TTAGCGGCCGCTTATCAGTTGCGGCTGGGCAGTTGG3’30℃10min，47℃30min，5℃5min進行反轉錄，然后85℃1min，64℃1min，72℃1min，循環(huán)25次進行PCR擴增得到900bp左右大小的三個C3d片段，分別編號為1#，2#和3#C3d；b.將用Kpn I/BamH I雙酶切的上述1#C3d和用BamH I/Not I雙酶切的上述3#C3d與Kpn I/Not I雙酶切的質粒pSecTag2A連接，構成重組質粒pSecTag2A-C3d2，轉化大腸桿菌DH5α構建pSecTag2A-C3d2/DH5α基因工程重組菌；c.將上述重組質粒pSecTag2A-C3d2用BamH I消化，并用堿性磷酸酶CIAP處理，防止其自連，然后與BamH I單酶切的2#C3d片段連接得到重組質粒pSecTag2A-C3d3，轉化大腸桿菌DH5α構建pSecTag2A-C3d3/DH5α基因工程重組菌，即得到所需的分子佐劑牛C3d3分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型分子佐劑牛C3d3分子及其制備方法。本發(fā)明的C3d3分子是一種新型分子佐劑，它由三個C3d分子通過柔性連接臂(G
文檔編號A61K39/39GK101066995SQ200710041198
公開日2007年11月7日 申請日期2007年5月24日 優(yōu)先權日2007年5月24日
發(fā)明者陳宇光, 倪繼祖, 陳濤, 沈彥萍 申請人:上海大學